JP4745826B2 - 架橋多糖微粒子およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、薬物、特に薬効を有するタンパク質またはペプチドを徐放する架橋多糖薬物徐放微粒子担体、及びその製造方法に関する。

近年、薬効を持つタンパク質、ペプチドの製剤が盛んに実用化されているが、一般にこうした薬物は血中半減期が短く、またその大部分が頻回投与の注射剤であるため、薬剤投与における患者の負担は過大なものとなっている。したがって、できるだけ少量で薬効を発揮させ且つ投与回数も少なくできる、タンパク質またはペプチド薬剤の実用的な徐放型製剤が望まれている。

薬効を持つタンパク質またはペプチドの徐放製剤においては、製剤調製時または徐放中の、タンパク質またはペプチドの変性あるいは凝集による回収率低下が、実用化への大きな障害となっている。ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等の生分解性高分子を基材にした徐放製剤が試みられているが、基材の疎水性、乾燥工程、ｐＨの低下に起因するタンパク質の変性、凝集が報告されている（非特許文献１および２を参照）。一方、こうした問題が低減される親水性のハイドロゲルを基材に用いた徐放製剤も報告されているが、やはり実用化には至っていない。また、安全性の面からは、徐放基材として用いる素材は、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つものでなければならず、タンパク質またはペプチドの封入率、回収率および安全性の全てにおいて、実用化レベルに達している徐放型製剤の実現は難しい。

近年、多糖を薬物担体の基材として用いるという報告もある。その中でも、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグルコサミドグリカンの一種である。

ＨＡは、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトも代謝系を持っており、免疫性、毒性といった面でも最も安全な医用生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）の一つである。近年、微生物による高分子量ＨＡの大量生産が可能となり、変形性軟骨治療薬、化粧品等の分野でも実用化されている。

ＨＡを基材に用いた架橋方法、ＨＡゲルからのタンパク質やペプチド薬物の徐放も多数報告されている。ＨＡを化学架橋でゲル化させる方法としては、カルボジイミド法（特許文献１参照）、ジビニルスルフォン法（特許文献２参照）、グリシジルエーテル法（特許文献３参照）等が知られている。一般に、ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入する場合は、架橋後にタンパク質またはペプチドを導入する方法では、ＨＡとタンパク質またはペプチドとの相溶性、静電反発等の問題でその導入率は低い。一方でタンパク質またはペプチド存在下で、ｉｎ ｓｉｔｕ架橋を行う方法には、高封入率でタンパク質またはペプチドを担持させられる利点がある。こうしたｉｎ ｓｉｔｕ架橋により、ＨＡゲル中にタンパク質またはペプチドを封入し、徐放させる製剤について報告されている（例えば、特許文献４参照）。しかし、こうした方法を用いてタンパク質またはペプチド存在下でＨＡをｉｎ ｓｉｔｕ架橋することにより得られる徐放型製剤は、回収率の点で問題を有している。例えば、ヒドラジド基（ＨＺ）を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＨＺ）をＮ−ハイドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる架橋剤で架橋する方法（特許文献５参照）が報告されており、ここでは生理条件下でのｉｎ ｓｉｔｕ架橋を目的としてｐＨ７．４〜ｐＨ８．５で架橋形成反応を行っているが、この方法で得られるＨＡゲルからのタンパク質またはペプチドの回収率もやはり低いことが本発明者らの検討により確認されている。この原因は、架橋反応中にタンパク質またはペプチドの一部（主にアミノ基）が架橋剤と反応し、タンパク質が架橋してしまう点にある。またゲル中に残った変性したタンパク質またはペプチドは生物活性が低下しており、むしろ抗原性発現の原因になる等の問題がある。封入した薬物が高回収率で放出されることは、医薬品として必須の条件であるにもかかわらず、タンパク質またはペプチドを反応させずにＨＡを化学架橋、ゲル化させる方法は知られていない。また、高回収率でタンパク質ペプチドを封入する方法として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を基材に不飽和官能基を求核付加反応で架橋する報告もあるが（特許文献６参照）、生分解性でないＰＥＧ断片が残存する問題がある。

また、実際、こうした薬物徐放性物質を注射可能な製剤とするには、これを微粒子化する必要がある。こうした検討にスプレードライヤーは広く使用されており、インシュリン（非特許文献３、非特許文献４参照）、ｒｈ抗ＩｇＥ抗体（非特許文献５参照）を微粒子化した報告、ヒアルロン酸の微粒子中に薬物を封入した報告（特許文献７参照、特許文献８）はあるが、共に短時間に皮下で溶解してしまうため薬物徐放期間は非常に短く、徐放目的としての実用性は低い。また、スプレードライ中にキトサンの架橋反応を行い、低分子薬物を封入する報告（非特許文献６参照）もあるが、放出期間は数分と短く、架橋剤に用いるアルデヒドがアミノ基などの官能基と高い反応性を有するため、タンパク質、ペプチド、その他のアミノ基などの官能基を有する低分子薬物には使用することができない。
国際公開 ＷＯ９４／０２５１７号パンフレット 特開昭６１−１３８６０１号公報 特開平５−１４０２０１号公報 米国特許第５８２７９３７号明細書 国際公開 ＷＯ９５／１５１６８号パンフレット 国際公開 ＷＯ００／４４８０８号パンフレット 特許第３４４５２８３号公報 国際公開 ＷＯ９６／１８６４７号パンフレット Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．第８８巻、第１６６−１７３頁、１９９９年 Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ 第１５巻、第６９９−７１３頁、１９９８年 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２３３，２２７−２３７，２００２年 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．９１，３８５−３９４，２００３年 Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．６０，３０１−３０９，１９９８年 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１８７，５３−６５，１９９９年

上述した如く、タンパク質またはペプチド等の薬物の生物活性を維持したままｉｎ ｓｉｔｕで化学架橋、乾燥、微粒子化し、薬物を封入することで、高封入率、高回収率、安全性を満たすインジェクタブルな生分解性ゲル微粒子の調製方法、これを用いたタンパク質またはペプチド等の長期薬物徐放製剤は知られていない。

本発明者は、かかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、架橋形成反応が可能な官能基を有するヒアルロン酸誘導体と薬物との溶液を、架橋反応の進行の遅い希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に濃縮することで、濃縮中にＨＡ間に架橋反応を起こさせ、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入することで、タンパク質またはペプチド等の薬物の生物活性を維持したままこれらを効率よく封入できることを見出した。また、この方法により得られた架橋ヒアルロン酸微粒子はインジェクタブルであり、生分解性で安全な長期薬物徐放微粒子担体としてタンパク質またはペプチド等の薬物を封入するのに最適であることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、タンパク質またはペプチド等の薬物の生物活性を維持したままこれらをｉｎ ｓｉｔｕで架橋、微粒子形成、および乾燥することにより得られる、ゲル中に封入したインジェクタブルなタンパク質またはペプチド等の薬物徐放製剤、及びその製造方法に関する。

すなわち本発明の一つの側面によれば、架橋多糖微粒子の製造方法であって、
ａ）架橋可能な官能基を有する多糖誘導体を含む希薄溶液を調製する工程；
ｂ）当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および
ｃ）当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該多糖誘導体の架橋反応を進行させる工程を含む前記製造方法が提供される。さらに本発明の別の側面によれば、前記工程ｂ）が、前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程である、前記製造方法が提供される。

本発明のさらにその他の側面によれば、前記製造方法により調製することができる架橋多糖微粒子もまた提供される。

以下、本発明を更に具体的に説明する。

本発明で用いられる多糖誘導体は、架橋反応可能な官能基を有する多糖誘導体であれば特に制限されないが、好ましくは、グリコサミドグリカン（酸性ムコ多糖；例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸など）の誘導体のうち架橋反応可能な官能基を有するものであり、特に好ましくは、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸誘導体である。

従って、本発明のさらに別の側面によれば、架橋ヒアルロン酸微粒子の製造方法であって、
ａ）架橋可能な官能基を有するヒアルロン酸誘導体を含む希薄溶液を調製する工程；
ｂ）当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および
ｃ）当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該ヒアルロン酸誘導体の架橋反応を進行させる工程を含む前記製造方法が提供される。さらに本発明の別の側面によれば、前記工程ｂ）が、前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程である、前記製造方法が提供される。また、本発明のさらにその他の側面によれば、前記製造方法により調製することができる架橋ヒアルロン酸微粒子もまた提供される。

本発明の工程ａ）における希薄溶液は、架橋反応に必要な基質および試薬などを含む溶液であるが溶媒により高度に希釈されているために反応の進行しないかまたは進行が極めて遅い溶液であり、その濃度は特に限定はされないが、例えば０．１％〜５％、特に０．２％〜３％である。また本発明に用いる溶媒としては、当該技術分野において通常用いられている溶媒またはそれらの混合物を用いることができ、特に限定はされないが、例えば水、ＤＭＳＯ、エタノール、Ｎ−メチルピロリドン、超臨界炭酸液などである。

本発明の工程ｂ）における希薄溶液を微粒子状の液滴に分散する方法には、当該技術分野で通常用いられる方法であれば特に限定されないが、当該希薄溶液を噴霧する方法、当該希薄溶液を別の液体と混合することによりエマルジョンを形成する方法などが含まれる。ここで微粒子状の液滴は、特に限定されないが例えば０．０４μｍ〜１．５ｍｍ、好ましくは０．１μｍ〜５００μｍの平均粒子径を有することができる。

本発明の工程ｃ）における溶液の濃縮の方法は、架橋反応の進行をより早める濃度まで濃縮することができる手段であれば特に限定されない。また当該濃縮には、例えば、当該架橋反応が固相反応として進行するような溶媒が完全に除去された状態も含まれる。

なお、前記工程ｂ）及びｃ）は一連の工程として行ってもよい。具体的には、前記工程ｂ）及びｃ）を一連の工程として、スプレードライ、エマルション液中乾燥法、溶媒拡散法などにより行うことができる。この中でも、前記工程ｂ）及びｃ）を一連の工程としてスプレードライにより行うのが好ましい。

本発明の架橋多糖微粒子は、架橋反応可能な官能基を有する多糖誘導体を含む溶液を、架橋反応の進行の遅い希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に濃縮することで、濃縮中に多糖誘導体を架橋することにより製造することができる。また、架橋反応可能な官能基を有する多糖誘導体と薬物とを含む溶液を、架橋反応の進行の遅い希薄な状態から架橋反応が進行する濃度に濃縮することで、濃縮中に架橋反応を起こさせ、架橋反応と乾燥を同時に行うことで薬物を多糖架橋体中に封入した薬物担持微粒子とすることを特徴とする。

本発明により提供される、製造方法および当該製造方法により得られた、例えば架橋ヒアルロン酸微粒子などの架橋多糖微粒子は、好ましくは以下に示す特徴を有している。
１．完全生分解性であり、生体に対する高い安全性を確保できる。
２．ＨＡなどの多糖に架橋形成が可能な官能基をグラフトすることで、架橋点間距離を非常に小さく（例えばＨＡの場合、グルクロン酸当たり３３モル％グラフトで約３ｎｍ）することが可能であり、長期徐放を実現する上で有利である。
３．高架橋密度である。
４．タンパク質を薬剤として用いる場合、タンパク質の変性を防ぐことができる。
５．微粒子化、乾燥化、架橋化を一製造工程で行える。

本発明でいう架橋または化学架橋とは、共有結合による、分子間または分子内架橋結合を含むものであり、同時に分子間および分子内架橋結合を有する場合もある。

本発明で使用される架橋反応は、薬物、例えば、タンパク質やペプチドの共存下で架橋を形成しても薬物を変性させない架橋結合形成方法であれば特に限定されない。こうした反応としては、例えば、メルカプト基間のジスルフィド結合形成、メルカプト基と不飽和結合との間の付加反応、ヒドラジド基と活性カルボン酸エステル間の反応等が挙げられる。

架橋時のｐＨは特に限定されないが、タンパク質またはペプチドを変性させずに架橋形成の促進し、タンパク質またはペプチド等の薬物の含有アミノ基との反応を防ぐｐＨが好ましい。そのようなｐＨは当業者が適宜選択することが可能であるが、例えばｐＨ３．０〜ｐＨ９．０、好ましくはｐＨ４．５〜ｐＨ９．０である。

本発明に用いる多糖誘導体は、上記したような架橋反応が可能なものであれば特に限定されないが、具体的にはＨＡに架橋可能な官能基を導入したヒアルロン酸誘導体（ＨＡ誘導体）が挙げられる。本発明において用いられる架橋可能な官能基は、特に限定されないが、例えば、メルカプト基、不飽和結合を有する基（例えば、メタクリル基、アクリル基、ビニルスルフォン基、アセチレンカルボニル基等）、ヒドラジド基（ＨＺ基）等が挙げられる。

架橋反応が、メルカプト基同士のジスルフィド結合形成に由来する場合は、例えばメルカプト基を導入したＨＡ誘導体などの多糖誘導体のみを用いて架橋を形成することができ、もしくはこれに架橋剤としてメルカプト基を２つ以上有する化合物（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール、システインを２つ以上含むペプチド等）を添加して架橋を形成することもできる。また、架橋反応速度を高める目的で、テトラチオン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ：ＳＴＴ）、ジピリジルジスルヒド（Ｄｉｐｙｒｉｄｙｌ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、エルマン試薬（Ｅｌｌｍａｎ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ：ＤＴＮＢ）等の化合物を添加しても良い。この際、未反応のメルカプト基がゲル中に残存するとタンパク質やペプチドの変性に繋がる可能性があるため、反応効率をできるだけ上げるためにこれら化合物を反応性を有するメルカプト基に対して０．１モル倍〜２モル倍、さらに好ましくは０．５モル倍〜１．５モル倍添加するのが好ましい。

メルカプト基を導入した多糖誘導体の調製方法は、特に限定されないが、例えば、ＨＡを３級アンモニウム塩にして、ＤＭＳＯ等の極性有機溶媒に溶解し、カップリング剤存在下、メルカプト基を有するアミンまたはヒドラジドと反応させる方法などにより、調製することができる。メルカプト基を有するアミンは、特に限定されないが、例えば、２−アミノエタン−１−チオール、３−アミノプロパン−１−チオール、チオグリコール酸ヒドラジド、などを挙げることができる。

また、ＨＡにメルカプト基を導入する場合、まずアミノ基やヒドラジド基を導入し、その後このアミノ基やヒドラジド基にメルカプト基を導入する方法も好ましい。例えばＨＡのカルボン酸と、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）またはエチレンジアミン、エチレンジオキシビスエチルアミン等の２価のＨＺまたはアミノ基含有化合物とをカップリング剤で縮合させ、ヒドラジド基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＨＺ）またはアミノ基を導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−アミノ基）を合成し、これに例えばＮ−スクシンイミジル ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ）を反応させ、ＤＴＴ等の還元剤で還元、メルカプト基とする方法、あるいは２−イミノチオラン（Ｔｒｏｕｔ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）をヒドラジド基、あるいはアミノ基と反応させる方法などが挙げられる。

カップリング剤としては、例えば、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ＥＤＣ／３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリウム クロリド ｎ−水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）等を挙げることができる。

本発明における架橋可能な官能基は、例えば多糖の分子内に含まれるカルボキシル基を以下のようなメルカプト基、不飽和結合、アミノ基またはヒドラジル基を含むエステル基もしくは置換アミド基に変換することにより導入することができる：
−ＣＯ−Ｎ（−Ｒ_１）−Ｙ_１−Ｑ_１−Ｙ_２−Ｎ（−Ｒ_２）−Ｙ_３−Ｑ_２−ＳＨ；
−ＣＯ−Ｎ（−Ｒ_１）−Ｎ（−Ｒ_２）−Ｙ_３−Ｑ_２−ＳＨ；
−ＣＯ−Ｎ（−Ｒ_１）−Ｙ_１−Ｑ_１−Ｙ_２−Ｎ（−Ｒ_２）−Ｙ_３−Ｑ_４；
−ＣＯ−Ｎ（−Ｒ_１）−Ｎ（−Ｒ_２）−Ｙ_３−Ｑ_４；または
−ＣＯ−Ｎ（−Ｒ_１）−Ｙ_１−Ｑ_１−Ｙ_２−ＮＨ_２；
（式中、Ｒ_１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｙ_１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ_３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ_３）−、−ＣＯ−、または−ＣＨ_２ＣＯ−であり、
Ｙ_２は、単結合、−ＣＯＮ（−Ｒ_４）−、または−Ｎ（−Ｒ_４）−、であり、
Ｑ_１は、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｙ_３は、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＨ）−、または−ＣＯＮＨ−であり、
Ｑ_２は、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｑ_４は、直鎖もしくは分枝Ｃ_２−１０アルケニル基、または、直鎖もしくは分枝Ｃ_２−１０アルキニル基である。）。

メルカプト基を導入した多糖誘導体の例には、好ましくは式（Ｉ）：

（式中、Ｘ_２は、−Ｙ_１−Ｑ_１−Ｙ_２−Ｎ（−Ｒ_２）−Ｙ_３−Ｑ_２−ＳＨ、または−Ｎ（−Ｒ_２）−Ｙ_３−Ｑ_２−ＳＨであり、
Ｒ_１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ_ａ２、Ｒ_ａ３、Ｒ_ａ４、Ｒ_ａ５およびＲ_ａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ_２ＯＨであり、
Ｙ_１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ_３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ_３）−、−ＣＯ−、または−ＣＨ_２ＣＯ−であり、
Ｙ_２は、単結合、−ＣＯＮ（−Ｒ_４）−、または−Ｎ（−Ｒ_４）−であり、
Ｑ_１は、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。

Ｙ_３は、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＨ）−、または−ＣＯＮＨ−であり、
Ｑ_２は、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基である。）で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体が含まれる。

また式（Ｉ）中、ポリアルキレンオキサイド基とは、−（ＣＨ（−Ｒ）ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｈ（式中、Ｒは水素原子、またはＣ_１−５アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくはｎは、１〜２０の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸１〜２０個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

さらに、式（Ｉ）において、Ｒ_１は、好ましくは水素原子であり、Ｘ_２は、好ましくは−Ｙ_１−Ｑ_１−Ｙ_２−Ｎ（−Ｒ_２）−Ｙ_３−Ｑ_２−ＳＨである。さらに式（ＩＩ）において、Ｙ_１は、好ましくは単結合または、−Ｎ（−Ｒ_３）−であり、Ｙ_２は、好ましくは単結合であり、Ｑ_１は、好ましくは直鎖または分枝Ｃ_１−４アルキレン基である。さらに式（ＩＩ）において、Ｒ_２およびＲ_３は、好ましくは水素原子であり、Ｙ_３は、好ましくは−ＣＯ−であり、好ましくはＱ_２は、直鎖または分枝Ｃ_１−４アルキレン基である。

メルカプト基と不飽和結合との間の付加反応を架橋反応として利用する場合は、不飽和結合を有する基を導入したＨＡ誘導体などの多糖誘導体とメルカプト基を２つ以上有する化合物（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール、システインを２つ以上含むペプチド、メルカプト基を導入したＨＡ誘導体等）を混和してもよいし、逆に、メルカプト基を導入した多糖誘導体と不飽和結合を有する基を２つ以上有する化合物（例えば、エチレングリコールジメタクリレート、エチレンビスアクリルアミド、トリス−２−マレイミドエチルアミン、１，８−ビスマレイミドトリエチレングリコール、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン、不飽和結合を導入したＨＡ誘導体等）を混和してもよい。また、この場合、架橋反応時のタンパク質またはペプチドの安定性向上、反応速度の向上の為にトリエタノールアミン等の塩基性化合物を添加することが好ましい。この際好ましい濃度としては、１０μＬ／ｍＬ〜２０μＬ／ｍＬである。メルカプト基を２つ以上有する化合物には、例えば、直鎖または分枝鎖のＣ_２−１０アルキレンジチオール（ここでアルキレン部分は１以上の酸素原子が挿入されていてもよく、および／または１以上の水酸基で置換されていてもよい）も含まれる。

不飽和基を導入した多糖誘導体の調製方法は、特に限定されないが、例えば、メタクリル酸グリシジルエーテルや、無水メタクリル酸等をＨＡの水酸基に直接反応させる方法（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．５４，１１５−１２１，２００１）では高い導入率は得難い。これは、ＨＡが水溶液中で水素結合、疎水性相互作用による高次構造を形成し、ヒドロキシル基、カルボン酸基等の官能基の反応性が低いためと考えられる。タンパク質やペプチドの徐放期間を延ばすには、高い架橋密度が望ましい。このためには、グルクロン酸部分のカルボキシル基に置換基を導入するのが望ましい。例えば、ＨＡを３級アンモニウム塩にして、ＤＭＳＯ等の極性有機溶媒に溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）等のカップリング剤存在下、不飽和結合を有するアミンまたはヒドラジドと反応させる方法などにより、調製することができる。不飽和結合を有するアミンは、特に限定されないが、例えば、アリルアミン、ジアリルアミン、４−アミノ−１−ブテン、アクリルヒドラジド、メタクリルヒドラジド等を挙げることができる。

また上述の、アミノ基やヒドラジド基を導入し、その後、このアミノ基やヒドラジド基に不飽和結合を有する基を導入する方法も好ましい。例えばＨＡのカルボン酸と、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）またはエチレンジアミン、エチレンジオキシビスエチルアミン等の２価のＨＺまたはアミノ基含有化合物とを、ＥＤＣ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ等の縮合剤で縮合させ、ヒドラジド基修飾されたＨＡ誘導体（ＨＡ−ＨＺ）またはアミノ基修飾されたＨＡ誘導体（ＨＡ−アミノ基）を合成し、これに不飽和結合を有するカルボン酸誘導体、例えばＲ_１０−ＣＯＯＨの酸無水物または活性化エステル（ここで、Ｒ_１０は直鎖または分枝Ｃ_２−１０アルケニル基である）、好ましくは無水メタクリル酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化アクリル酸またはメタクリル酸等を反応させる方法などが挙げられる。

ＨＡなどの多糖に不飽和結合を有する基を導入後、メルカプト基で架橋する場合、メルカプト基の不飽和結合を有する基に対する比率は特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能であるが、タンパク質、ペプチドとの反応を最小にし、且つ、不飽和基のゲル中の残存を防ぎ、且つ、速やかに反応させるため、メルカプト基：不飽和結合を有する基＝３：１〜１：２が好ましい。更に好ましくは、２：１〜１：１である。

ＨＡにメルカプト基を導入後、不飽和結合を有する基で架橋する場合、不飽和結合を有する基のメルカプト基に対する比率は特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能であるが、タンパク質、ペプチドとの反応を最小にし、且つ、不飽和基のゲル中の残存を防ぎ、且つ、速やかに反応させるため、不飽和結合を有する基：メルカプト基＝３：１〜１：２が好ましい。更に好ましくは、２：１〜１：１である。

不飽和結合を有する基を導入した多糖誘導体の例には、好ましくは式（ＩＩ）：

（式中、Ｘ_３は、−Ｙ_１−Ｑ_１−Ｙ_２−Ｎ（−Ｒ_２）−Ｙ_３−Ｑ_４、または−Ｎ（−Ｒ_２）−Ｙ_３−Ｑ_４であり、
Ｒ_１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ_ａ２、Ｒ_ａ３、Ｒ_ａ４、Ｒ_ａ５およびＲ_ａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ_２ＯＨであり、
Ｙ_１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ_３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ_３）−、−ＣＯ−、または、−ＣＨ_２ＣＯ−であり、
Ｙ_２は、単結合、−ＣＯＮ（−Ｒ_４）−、または−Ｎ（−Ｒ_４）−であり、
Ｙ_３は、単結合、−ＣＯ−、または、−ＣＨ_２ＣＯ−であり、
Ｑ_１は、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、またはポリエステル基であり、
Ｑ_４は、直鎖もしくは分枝Ｃ_２−１０アルケニル基、または、直鎖もしくは分枝Ｃ_２−１０アルキニル基である。）
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体などが含まれる。

ここで式（ＩＩ）中、ポリアルキレンオキサイド基とは、−（ＣＨ（−Ｒ）ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｈ（式中、Ｒは水素原子、またはＣ_１−５アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくはｎは、１〜２０の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸１個〜２０個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

さらに、式（ＩＩ）において、Ｒ_１は、好ましくは水素原子であり、Ｘ_３は、好ましくは−Ｙ_１−Ｑ_１−Ｙ_２−Ｎ（−Ｒ_２）−Ｙ_３−Ｑ_４である。さらに式（ＩＩ）において、Ｙ_１は、好ましくは単結合、−Ｎ（−Ｒ_３）ＣＯ−、または、−Ｎ（−Ｒ_３）−であり、さらに好ましくは−Ｎ（−Ｒ_３）ＣＯ−である。またＹ_２は、好ましくは単結合、−ＣＯＮ（−Ｒ_３）−であり、さらに好ましくは−ＣＯＮ（−Ｒ_３）−であり、Ｙ_３は好ましくは単結合、−ＣＯ−、または、−Ｎ（−Ｒ_３）−であり、さらに好ましくは、−ＣＯ−である。さらに式（ＩＩ）において、Ｑ_１は好ましくは直鎖または分枝Ｃ_１−４アルキレン基であり、Ｒ_２およびＲ_３は、好ましくは水素原子であり、Ｑ_４は好ましくは直鎖または分枝Ｃ_２−１０アルケニル基である。

また、メルカプト基を導入した多糖誘導体の例には、上述の式（Ｉ）で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体などが含まれる。

架橋反応に、ヒドラジド基を導入したＨＡ酸誘導体などの多糖誘導体と活性カルボン酸の反応を利用することもできる。多糖へのヒドラジド基の導入は当業者に公知の方法で行うことができ、例えばヒアルロン酸のカルボキシル基と２価のヒドラジド含有化合物（ジヒドラジド化合物）を、縮合剤を用いて縮合させることにより合成することができる。ジヒドラジド化合物としては、コハク酸ジヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、ピメリン酸ジヒドラジドが挙げられる。また、縮合剤としては、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどが挙げられる。例えば、ヒアルロン酸のカルボン酸とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で縮合させ、ヒドラジド基で修飾されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を合成することが可能である。架橋剤としては、ＨＺ基と反応しうる官能基であれば特に限定されないが、例えば、ＮＨＳで活性化されたエステル基、ペンタフルオロフェノキシカルボニル基、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル基、イミダゾリルカルボニル基、イソチオシアナト基、スルホニルクロリド基、スルホニルフルオリド基、ホルミル基、ビニルスルホニル基、酸無水物、４−ニトロフェニルホルメート基等の官能基を同一分子内に２つ以上持つ分子が挙げられる。当該架橋剤の例には、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジスクシンイミジルタルトレート、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］などが含まれる。

アミノ基に対するＨＺ基との選択的反応性、タンパク質の変性等を考慮すれば、架橋時のｐＨは、ｐＨ３．０〜ｐＨ６．０が好ましい。さらに好ましくは、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．０である。架橋反応中のｐＨをこの範囲に保つため、用いるバッファーは揮発性の低いもの、例えばクエン酸等が好ましい。架橋剤中のヒドラジド基と反応する化合物官能基は、ゲル調製液中のヒドラジド基に対して４０モル％以下であることが好ましく、さらに好ましくは２０モル％以下、特に好ましくは１０モル％以下である。

架橋反応可能な官能基のＨＡへの導入率は、特に限定されないが、生体内で流動性のないゲルを得るためにＨＡのグルクロン酸当たり５モル％以上が好ましく、１０モル％以上が特に好ましい。また、薬物の徐放性能は架橋されたＨＡ誘導体の架橋密度に大きく依存するため、この導入率を制御することで薬物の徐放期間を制御することができる。

ヒドラジド基が導入された多糖酸誘導体の例には、式（ＩＩＩ）：

（式中、Ｒ_１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、
Ｘ_１は、−Ｙ_１−Ｑ_１−Ｙ_２−ＮＨＮＨ_２であり、
Ｒ_ａ２、Ｒ_ａ３、Ｒ_ａ４、Ｒ_ａ５およびＲ_ａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ_１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ_２ＯＨであり、
Ｙ_１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ_３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ_３）−、−ＣＯ−、または−ＣＨ_２ＣＯ−であり、
Ｑ_１は、単結合、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、
Ｙ_２は、単結合、−Ｎ（−Ｒ_４）ＣＯ−、−ＣＯ−、または、−ＣＨ_２ＣＯ−であり、
Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ_１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基である。）
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体が含まれる。

さらに、式（ＩＩＩ）において、Ｒ_１は、好ましくは水素原子であり、Ｒ_ａ２、Ｒ_ａ３、Ｒ_ａ４、Ｒ_ａ５およびＲ_ａ６は、好ましくは水素原子であり、Ｙ_１は、好ましくは単結合、または、−ＣＯ−であり、Ｑ_１は、好ましくは直鎖または分枝Ｃ_１−１０アルキレン基であり、Ｙ_２は、好ましくは、単結合、または、−ＣＯ−であり、Ｒ_３は、好ましくは水素原子であり、Ｒ_４は、好ましくは水素原子である。

また式（ＩＩＩ）中、ポリアルキレンオキサイド基とは、−（ＣＨ（−Ｒ）ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＯＨ（式中、Ｒは水素原子、または直鎖または分枝Ｃ_１−５アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、またｎは、好ましくは１〜２０の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸１〜２０個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。

本発明の架橋ヒアルロン酸微粒子の製造方法としては、微粒子の溶媒留去による乾燥と架橋反応が同時に進行する製造方法であれば良い。例えば、液体を噴霧乾燥するスプレードライヤーを用い、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸誘導体と薬物とを含む溶液を噴霧乾燥することで、濃縮乾燥中にヒアルロン酸誘導体を架橋し、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子を得ればよい。スプレードライを用いる場合は、薬物の変性を防ぐために、乾燥温度は１００℃以下であることが好ましい。

あるいは、架橋反応可能なＨＡ誘導体（テトラブチルアンモニウム塩）と薬物をＤＭＳＯ等の極性有機溶媒に溶かしておき、二酸化炭素等の超臨界液体を添加、ＤＭＳＯを抽出することでヒアルロン酸濃縮中に架橋反応を起こさせ、微粒子を得ても良い。これらの微粒子化方法を用いる時は、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０等の界面活性剤を添加（１％〜２％程度）することで、生成された微粒子の回収率を上げることができる。また、これらの製造方法を取る場合、濃縮前の架橋反応を起こさない調製液を用いる必要がある。架橋剤混合から濃縮までの時間、架橋性官能基の導入率、ヒアルロン酸分子量、濃度によって異なるが、架橋性官能基の導入率は、５モル％〜７０モル％、ヒアルロン酸分子量は、１万ダルトン〜２００万ダルトン、ヒアルロン酸濃度は、０．１％〜５％が好ましい。

また、別法としては、架橋反応可能な官能基を有するヒアルロン酸誘導体と薬物とを含む水溶液を脱水性を有する液体（例えば、分子量４００ダルトンのポリエチレングリコール等）の中にエマルジョン化することで、脱水濃縮中にヒアルロン酸を架橋し、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子を得ることもできる。この方法を用いる時は、封入効率を上げるため、カチオン性かノニオン性の薬物が好ましい。

また、微粒子形成後に熱処理をすることでさらに含水率を低下させ、架橋反応を完全に終了させたほうが好ましい。この場合、架橋密度も上がり、徐放期間の延長も期待できる。ここで、熱処理の温度は特に限定はされないが、例えば３０〜１１０℃、好ましくは３０〜６０℃で行うことができる。

乾燥後の微粒子径は、用途によって最適化すればよいが、インジェクタブルにするために通常、０．０１μｍ〜１５０μｍが好ましい。経鼻、経肺投与の時は、０．０１μｍ〜５μｍが吸入効率の点で好ましく、静注投与の時には、０．０１μｍ〜０．２μｍ程度が血中動態の点から好ましい。

本発明に用いられるＨＡは、どのようにして得られたＨＡでもよく、動物組織から抽出されたＨＡ、発酵法で得られたＨＡ、化学合成で得られたＨＡなど、その由来は限定されない。さらに、加水分解処理など、ＨＡにさらなる処理を行ってもよい。本発明のＨＡには、様々な方法で修飾された修飾ＨＡや、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩なども含有される。ＨＡはカルボキシル基とハイドロキシル基が修飾されることが多いが、本発明において修飾ＨＡはどの部分が修飾されていてもよい。修飾ＨＡは特に限定されず、どのような修飾がされていてもよいが、例えば、硫酸化されたＨＡ（ＷＯ９５／２５７５１）、Ｎ−硫酸化されたＨＡ（ＷＯ９８／４５３３５）、エステル化されたＨＡ（ＥＰ０２１６４５３、ＷＯ９８／０８８７６、ＥＰ０３４１７４５）、過沃素酸酸化されたＨＡ、アミド修飾されたＨＡなどを挙げることができる。

本発明に用いられる原料ＨＡの分子量は特に限定されず、いかなる分子量のＨＡでも使用することが可能であるが、通常５０００ダルトン〜３５０万ダルトン、好ましくは１万ダルトン〜１００万ダルトンのＨＡを用いることができる。また、ＨＡの分子量と濃度は、製造後の粒子径に影響するため、目的とする粒子径に応じて選択すればよい。

薬効を持つタンパク質、ペプチドとしては特に限定されないが、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、β、γ、（ＩＮＦ−α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ−３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＦＧ）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、抗体、ダイアボディー等が挙げられる。また本発明の薬物徐放担体は、低分子量化合物の薬剤にも使用することができる。低分子薬剤としては、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド）、免疫抑制剤、抗炎症剤（例えば、ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤）、抗リウマチ剤、抗菌剤（例えば、β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤）などを挙げることができる。

本発明の徐放担体は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む薬学的組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。

架橋ＨＡ−ＳＨ マイクロハイドロゲル微粒子を顕微鏡で撮影した写真の一例である。 ＰＢＳ中での膨潤後の架橋ＨＡ−ＳＨ マイクロハイドロゲル微粒子を顕微鏡で撮影した写真の一例である。 ＥＰＯを封入した架橋ＨＡ−ＳＨ マイクロヒドロゲルについて熱重量分析を行った結果の一例である。 実施例１−４において得られた架橋ＨＡ−ＳＨ マイクロハイドロゲル微粒子から回収されたＥＰＯの量を示すＲＰ−ＨＰＬＣ分析の結果の一例を示すグラフであり、下からそれぞれ実施例１、実施例２、実施例３、実施例４で得られて微粒子を示すものである。 実施例３と比較例１で得られたＨＡゲルからのＥＰＯの放出性を示すグラフである。 実施例９−１で得られたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ）の^１Ｈ−ＮＭＲの測定結果の一例である。 実施例９−２で得られたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ−ＳＨ）の^１Ｈ−ＮＭＲの測定結果の一例である。 実施例１０で得られたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ−ＭＡ）の^１Ｈ−ＮＭＲの測定結果の一例である。 実施例１１−１で得られたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＡＭ）の^１Ｈ−ＮＭＲの測定結果の一例である。 実施例１１−２で得られたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＡＭ−ＳＨ）の^１Ｈ−ＮＭＲの測定結果の一例である。 実施例１１−１で得られたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＡＭ−ＭＡ）の^１Ｈ−ＮＭＲの測定結果の一例である。 実施例１２により得られた粒子のキュアリングによる水分量の変化を示すグラフである。 実施例１２により得られた粒子のキュアリングによる膨潤抑制効果を示すものである。

ＥＰＯ封入架橋ヒアルロン酸微粒子の調製
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

ＮＭＲ測定は、核磁気共鳴装置 ＪＮＭ−ＥＣＡ５００（日本電子株式会社製）を用いて重水（Ｄ_２Ｏ）を溶媒に用いて測定した。また置換基の導入率の決定は、導入した置換基特有のピークとヒアルロン酸由来のピークの積分比より決定した。
［実施例１］
〔実施例１−１〕 ヒドラジド基（ＨＺ基）が導入されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ）の合成

分子量１．９×１０^５ダルトンのヒアルロン酸（ＨＡ）（電気化学工業株式会社製）２００ｍｇを０．５％濃度で蒸留水に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調製した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を、ＨＡ：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．３：４０（バッチ１−１）、１：１：４０（バッチ１−２）、１：５：４０（バッチ１−３）モル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で攪拌下２時間反応させた。１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール溶液で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）し、凍結乾燥して標題のＨＡ−ＨＺを得た。

得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量したところ、それぞれ、ＨＡのカルボン酸の２６％（バッチ１−１）、４６％（バッチ１−２）、６９％（バッチ１−３）がＨＺ化されていた（ＨＡおよびＨＡ−ＨＺのＮ−アセチル基（１．９ｐｐｍ、３Ｈ）、ＨＡ−ＨＺのアジピン酸由来部分のメチレン基（１．６ｐｐｍ、２．３ｐｐｍ、各２Ｈ）を比較）。
〔実施例１−２〕 メルカプト基（ＳＨ）が導入されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＳＨ）の合成

実施例１−１のバッチ１〜３のＨＡ−ＨＺ、各々１００ｍｇを５ｍＬの１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８に溶かし（ＨＡ−ＨＺ：２％ｗ／ｖ）、イミノチオラン（ＩＴＬ）を添加し（ＨＺ／ＩＴＬ＝１／２モル比）、室温で攪拌下 ２〜４時間反応させた。エタノールで沈殿、３回洗浄し、乾燥させた。また、得られたＨＡ−ＳＨ中のＳＨ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した結果を表１に示す。（ＨＡおよびＨＡ−ＳＨのＮ−アセチル基（１．９ｐｐｍ、３Ｈ）、ＨＡ−ＳＨのＩＴＬ由来部分のメチレン基（２．１ｐｐｍと２．７ｐｐｍ、各２Ｈ）を比較）。

〔実施例１−３〕 ＥＰＯ封入架橋ヒアルロン酸微粒子の調製
実施例１−２のバッチ１の、ＳＨ基の導入率が２０モル％であるＨＡ−ＳＨ２００ｍｇと、エリスロポエチン（ＥＰＯ）２ｍｇを２０ｍＬの１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ８（ＰＢ）に溶かした（室温、１時間攪拌）。これに、４ｍｇのＴｗｅｅｎ−２０、ＳＨ基に対して１モル倍のテトラチオン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ：ＳＴＴ）２２．３ｍｇを加えた。この溶液を以下の条件でスプレードライし、微粒子を得た。
スプレードライヤー：ビュッヒ社製、ミニスプレードライヤー Ｂ−１９１
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｅｅｄ ｒａｔｅ：１．５ｍＬ／ｍｉｎ（Ｔｙｇｏｎ ｔｕｂｅ，Ｐｕｍｐ ｓｐｅｅｄ＝１５％）
Ｆｅｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：１０ｍｇ／ｍＬ
Ａｔｏｍｉｚｉｎｇ ａｉｒ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：６５０Ｌ／ｈｒ
Ｄｒｙｉｎｇ ａｉｒ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：４０ｋＬ／ｈｒ（Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ＝６５％）
Ｉｎｌｅｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：８５〜９５℃
Ｏｕｔｌｅｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：５０〜６０℃
［実施例２］
実施例１−３の実験操作において、バッチ２のＳＨ基の導入率が３５モル％であるＨＡ−ＳＨを２００ｍｇと、テトラチオン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ：ＳＴＴ）３９．０ｍｇ（ＳＨ基に対して１モル倍）を使用したこと以外は実施例１−３と同様の方法でＥＰＯ封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。
［実施例３］
実施例１−３の実験操作において、バッチ３のＳＨ基の導入率が５６モル％であるＨＡ−ＳＨを２００ｍｇと、テトラチオン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ：ＳＴＴ）６２．４ｍｇ（ＳＨ基に対して１モル倍）を使用したこと以外は実施例１−３と同様の方法でＥＰＯ封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。
［実施例４］
実施例１−３の実験操作において、バッチ３のＳＨ基の導入率が５６モル％であるＨＡ−ＳＨを２００ｍｇと、ＳＨ基に対して０．７モル倍のテトラチオン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ：ＳＴＴ）３８．９ｍｇを使用したこと以外は実施例１−３と同様の方法でＥＰＯ封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。
［実施例５］
実施例１−３の実験操作において、バッチ３のＳＨ基の導入率が５６モル％であるＨＡ−ＳＨを２００ｍｇと、ＳＨ基に対して０．５モル倍のテトラチオン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ：ＳＴＴ）２７．８ｍｇを使用したこと以外は実施例１−３と同様の方法でＥＰＯ封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。
［実施例６］
実施例３の実験操作において、４ｍｇのＴｗｅｅｎ−２０の代わりに、Ｔｗｅｅｎ−８０を４ｍｇ使用したこと以外は実施例３と同様の方法でＥＰＯ封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。
［実施例７］
実施例３の実験操作において、Ｔｗｅｅｎ−２０を加えずに行ったこと以外は実施例３と同様の方法でＥＰＯ封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。
［実施例８］
実施例３の実験操作において、ＳＴＴを加えずに行ったこと以外は実施例３と同様の方法でＥＰＯ封入架橋ヒアルロン酸微粒子を調製した。
［比較例１］
実施例１−２で調製したバッチ３のＳＨ基の導入率が５６モル％であるＨＡ−ＳＨ ３３ｍｇを６９０μＬの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶かし、３０μＬのＥＰＯ水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、１０分攪拌した。これに、ＳＨ基に対して１モル倍のＳｏｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ（ＳＴＴ）９．３ｍｇを３０μＬの１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０に溶かした溶液を加え、２５０μＬを１ｍＬシリンジに詰めて３７℃で５時間反応させることで、円柱状のＨＡゲルを得た。
［比較例２］
実施例８で、ＨＡ−ＳＨではなくＨＡを使用したこと以外は実施例８と同様の方法でＥＰＯ封入ＨＡ微粒子を調製した。

なお、実施例１〜８および比較例２における各微粒子の回収率は５０％−６５％であった。
［試験例１］粒子径、粒子含水率測定
実施例３において調製した微粒子の顕微鏡写真を図１に示す（３０００倍）。この微粒子をＰＢＳ中に分散させた時の顕微鏡写真を図２に示す（３０００倍）。当該微粒子の乾燥時の粒子径は約１．２μｍであり、水膨潤時の粒子径は約１．８μｍであった。

熱重量分析（ＴＧＡ）を行い、実施例３で製造した微粒子の含水率を測定した（図３）含水率は約１５％であった。
［試験例２］ＥＰＯ封入架橋ヒアルロン酸微粒子のＥＰＯ回収率測定
実施例１〜８、比較例２の微粒子５ｍｇを０．５ｍＬのＰＢＳに分散させ、Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ＳＤ（生化学工業製：ＨＡｓｅ）０．２５ユニットを添加、２５℃で３時間、酵素処理を行い、微粒子を完全に分解させた。また、比較例１のゲル（０．２５ｍＬゲル）にＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ＳＤ（生化学工業製）０．５ユニットを含むＰＢＳｐＨ７．４を０．７５ｍＬ加え、２５℃で１日、酵素処理を行い、ゲルを完全に分解させた。酵素処理後の溶液０．１５ｍＬを、試料溶液とした。試料溶液は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）測定を行い、０．１ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ水溶液を標準溶液として、標準溶液と試料溶液のピークエリア比から試料溶液中ＥＰＯ濃度を算出した。添加したＥＰＯ量（０．１ｍｇ／ゲル１個）に対してＲＰ−ＨＰＬＣより求めたＥＰＯ量を回収率として算出した。

逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析は、Ｗａｔｅｒｓ６００Ｓコントローラ、７１７ｐｌｕｓオートサンプラー、４８６赤外光吸収測定器（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、以下の測定条件より行った。
カラム：Ｃ４（粒子径 ５μｍ、サイズ ４．６×２５０ｍｍ）
移動相：
Ａ：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝４００／１００／１
Ｂ：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝１００／４００／１
流速：１ｍＬ／分、移動相Ａ／Ｂ＝６５／３５〜０／１００のグラジエント溶出
カラム温度：室温付近
サンプル温度：４℃
検出波長：ＵＶ ２８０ｎｍ
解析ソフト：Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ｖｅｒ．３．２１
上記方法で測定されたＥＰＯを仕込みに対する回収率は、以下のとおりであった。
実施例１〜４：９０％−９５％
実施例５および６：８０％−８５％
実施例７および８：７５％−８０％
比較例１および２：９０％−９５％
以上の結果より、ＳＴＴ、界面活性剤を添加することで回収率が改善されることが確認された。
［試験例３］ＥＰＯ封入ＨＡヒドロゲル調製からのＥＰＯ徐放
実施例３のマイクロハイドロゲル２０ｍｇと比較例１のバルクゲル（２５０μＬ）を２ｍＬのＰＢＳ中、３７℃でインキュベートし、経時的に２００μＬサンプリングした。ＲＰ−ＨＰＬＣでバッファー中に放出されたＥＰＯを定量した。

ゲル調製直後にヒアルロニダーゼで分解、回収されたＥＰＯを１００％とした時のゲルからのＥＰＯ放出性を図１に示す。尚、９日後にヒアルロニダーゼ（ＨＡｓｅ）を添加した。

ゲル内のＥＰＯは変性せず、比較例１のゲルは、架橋密度が低い為ＥＰＯの放出が早く、実施例３のマイクロゲルは架橋密度が高い為、３０％程度が５日程度で徐放され、４０％のＥＰＯが拡散では放出されずに酵素分解によって初めて放出されることが分かる。

上記実施例に例示された、薬物をヒアルロン酸架橋体中に封入した薬物担持微粒子を用いることで、タンパク質またはペプチド等の薬物の生物活性を維持したままこれらをｉｎ ｓｉｔｕ架橋、乾燥し、ゲル微粒子の中に封入したタンパク質またはペプチド等を長期間放出するインジェクタブルな薬物徐放製剤を調製することが可能である。
［実施例９］
〔実施例９−１〕 ヒドラジド基（ＨＺ）が導入されたヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＨＺの合成（混合溶媒法）

分子量２×１０^５ダルトンのＨＡ（電気化学工業株式会社製）７６．０ｍｇを、０．１％濃度で蒸留水／ＥｔＯＨ＝５０／５０に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調整した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を、ＨＡのユニット（１ユニット＝繰り返し単位であるＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸）：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：４：４０モル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。大過剰量の１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール溶液、蒸留水に対して順に透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）し、凍結乾燥して標題のヒドラジド基（ＨＺ基）が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）５７．０ｍｇを得た。得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ基導入率をＡＤＨ導入率としてプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基（１．８５ｐｐｍ）、ＨＺ：ＡＤＨ由来の４つのメチレン（１．５、２．１および２．２５ｐｐｍ）を比較）。ＨＺ導入率は４７％であった。
〔実施例９−２〕 メルカプト基（ＳＨ）が導入されたヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＨＺ−ＳＨの合成

実施例９−１と同様の方法で合成したＨＡ−ＨＺ、１００ｍｇを５ｍＬの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８）に溶かし（ＨＡ−ＨＺ：２％ｗ／ｖ）、イミノチオラン（ＩＴＬ）を添加し（ＨＺ／ＩＴＬ＝１／２モル比）、室温で攪拌下２時間反応させた。エタノールで沈殿、３回洗浄し、乾燥させた。得られたＨＡ−ＨＺ−ＳＨ中のＳＨ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した結果、ＳＨ導入率は３７．５モル％であった。（ＨＡおよびＨＡ−ＨＺ−ＳＨのＮ−アセチル基（１．９ｐｐｍ、３Ｈ）、ＨＡ−ＨＺ−ＳＨのＩＴＬ由来部分のメチレン基（２．１ｐｐｍと２．７ｐｐｍ、各２Ｈ）を比較）。
［実施例１０］メタクリロイル基（ＭＡ）が導入されたヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＨＺ−ＭＡの合成

ＨＡの分子量を２×１０^４ダルトンとしたこと以外は、実施例１−１のバッチ３と同様の方法で合成されたＨＡ−ＨＺ（ＨＡのカルボン酸が６３％ＨＺ化）を蒸留水に溶解した後に、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．８）を添加し、ＨＡ濃度５０ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液を調製した。メタクリル酸無水物をＨＺの２０倍当量を滴下して添加し、室温で攪拌下一晩反応させた。テトラヒドロフランで沈殿後、回収し乾燥させた。沈殿物を蒸留水に溶解し、再びテトラヒドロフランで沈殿、乾燥させた後、乾燥物を蒸留水に溶解し、凍結乾燥して標題のＨＡ−ＨＺ−ＭＡを得た。

メタクリロイル基の導入率はプロトンＮＭＲにより算出した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン（１．８〜１．９ｐｐｍ）、ＭＡ：メタクリロイル基のＣＨ_２＝（５．５〜６．１ｐｐｍ）を比較）。ＭＡ導入率は２２％であった。
［実施例１１］
〔実施例１１−１〕 アミノ基（ＡＭ）が導入されたヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＡＭの合成

分子量２．０×１０^５ダルトンのヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）（電気化学工業株式会社製）をテトラブチルアンモニウムハイドロオキサイド（シグマーアルドリッチ社）によりテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩化したＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ８−４００（シグマーアルドリッチ社）を用いてＴＢＡ塩化を行った。

ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩（ＨＡ−ＴＢＡ）を２．０ｍｇ／ｍＬ濃度となるようＤＭＳＯ（和光純薬株式会社）に溶解後、ＨＡユニット／ＢＯＰ（和光純薬株式会社）／エチレンジアミン（ＥＤＡ）（シグマ−アルドリッチ社）＝１／２．５／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の当量比でＥＤＡ、ＢＯＰの順で添加し、室温下で一晩反応させた。その後１Ｍ 塩化ナトリウム水溶液を反応溶液の１／２量加えた後、５Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨを３まで低下させ、さらに２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。大過剰量の０．３Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、蒸留水の順に透析精製し（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）、限外ろ過後、凍結乾燥して標題のアミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）を得た。

アミノ基の導入率はプロトンＮＭＲにより算出した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン（１．８〜１．９ｐｐｍ）、ＡＭ：エチレンジアミン部分のメチレンプロトン（２．９〜３．１ｐｐｍ）を比較）。導入率はそれぞれ８８．５％であった。
〔実施例１１−２〕 メルカプト基（ＳＨ）が導入されたヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＡＭ−ＳＨの合成

上記で得られたＨＡ−ＡＭを炭酸緩衝溶液（ｐＨ９）に２ｍｇ？ｍＬで溶解させた後、イミノチオラン（ピアス社）をＨＡユニットに対して０．５、もしくは１倍等量加え、４５分間室温で反応させた。反応後、０．００５Ｎ ＨＣｌ水溶液で平衡化したＰＤ−１０カラム（アムシャム・バイオサイエンス株式会社）にて精製を行った。その後凍結乾燥により溶媒を除いた後、得られたポリマーを過剰のエタノールで洗浄し減圧乾燥を行いＨＡ−ＡＭ−ＳＨを得た。

メルカプト基の導入率は還元剤であるトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）塩酸塩（ＴＣＥＰ）を含んだ状態でのプロトンＮＭＲにより算出した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン（１．８〜１．９ｐｐｍ）、ＳＨ：メルカプト基の隣のメチレンプロトン（２．４〜２．７ｐｐｍ）を比較）。導入率はそれぞれ１６．５％、２３．５％であった。
〔実施例１１−３〕 メタクリロイル基（ＭＡ）が導入されたヒアルロン酸誘導体ＨＡ−ＡＭ−ＭＡの合成

上記で得られたＨＡ−ＡＭをリン酸緩衝溶液（ｐＨ７）に１０ｍｇ？ｍＬで溶解させた後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で活性化したメタクリル酸をＨＡユニットに対し０．５、１．０、２．０倍当量添加し２時間室温で反応させた。反応後、０．３Ｍ 塩化ナトリウム水溶液、蒸留水の順に透析を行い（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）、精製を行った。その後、凍結乾燥を行い上記のポリマーを得た。

メタクリロイル基の導入率はプロトンＮＭＲにより算出した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン（１．８〜１．９ｐｐｍ）、ＭＡ：メタクリロイル基のＣＨ_２＝（５．５〜６．１ｐｐｍ）を比較）。導入率はそれぞれ１４．８％、３１．９％、６８．９％であった。
［実施例１２］微粒子の熱処理効果（Ｓｗｅｌｌ抑制）
実施例９−２で合成したＳＨ基の導入率が３７．５モル％であるＨＡ−ＨＺ−ＳＨ１００ｍｇを８．５ｍＬの蒸留水に溶解した。これに、１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ７（ＰＢ）１ｍＬを添加し、さらに５ｍｇのＴｗｅｅｎ−８０を溶解し、ＳＨ基に対して１／１０モル倍のＳＴＴ２．３ｍｇを加えた。この溶液を実施例１−３と同様の条件（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｅｅｄ ｒａｔｅ ０．５ｍＬ／ｍｉｎ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ＝１００％）でスプレードライし、微粒子を得た。この微粒子を５０℃恒温槽（ヤマト科学製 ＤＮ−４２）でキュアリングし２４時間後、７２時間後にサンプリングした。
［試験例４］
実施例１２においてサンプリングした各試料の粒子の水分量をＴＧＡにより計測した。この結果を図１２に示す。また、顕微鏡を用いた画像解析により、各試料の３０個の粒子をランダムに選択し、そのフェレー径を計測した（乾燥時の粒子径）。さらに、サンプリングした粒子にＴｗｅｅｎ−８０（０．０５％）を含むＰＢＳ溶液を添加して膨潤させ、湿潤時の粒子の粒子径を同様に計測した。この結果を図１３に示す。その結果、２４時間のインキュベーションにより膨潤率が抑制されることが確認された。これは、５０℃、２４時間のインキュベーションで粒子内の架橋が増加したことによると考えられる。
［実施例１３］ＨＡ−ＨＺ−ＭＡ架橋マイクロゲルの調製
実施例１０で合成したＨＡ−ＨＺ−ＭＡ１００ｍｇを６ｍＬの蒸留水に溶解し、これにＤＴＴを１１ｍｇ、ＴＥＡを３２．５μＬ溶解させた１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．５（ＰＢ）を１ｍＬ加え、さらに蒸留水３ｍＬを加えて混合した。この溶液を実施例１２と同様の条件（排気温度６５℃）でスプレードライし、微粒子を得た。この微粒子を５０℃恒温槽（ヤマト化学 ＤＮ−４２）で約７２時間キュアリングし、粒子を得た。
［試験例５］
実施例１３により得られた粒子をプレパラート上に置き、これにｐＨ７のＰＢＳ溶液を添加してその粒子状態を顕微鏡で観察したところ、粒子はＰＢＳ溶液には溶解しなかった。この観察結果より、実施例１３において得られた微粒子における、メルカプト基と不飽和結合との間の付加反応による架橋の形成が確認された。

本発明の薬物徐放担体は、タンパク質またはペプチド等の薬物の生物活性を維持したままこれらをｉｎ ｓｉｔｕ化学架橋、乾燥、ＨＡゲル中に封入でき、優れた回収率でタンパク質、ペプチド等の薬物の長期徐放を可能にするインジェクタブルな微粒子を提供する。

Claims (21)

1. 架橋多糖微粒子の製造方法であって、
   ａ）架橋可能な官能基を有する多糖誘導体を含む希薄溶液を調製する工程；
   ｂ）当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および
   ｃ）当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該多糖誘導体の架橋反応を進行させる工程
   を含む前記製造方法。
2. 多糖がヒアルロン酸である請求項１に記載の製造方法。
3. 前記工程ｂ）が、前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程である、請求項１または２に記載の製造方法。
4. 得られる微粒子の平均粒子径が０．０１μｍ〜１５０μｍである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 得られる微粒子が薬物担体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
6. 得られる微粒子が薬物徐放担体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
7. 架橋反応前の希薄溶液が薬物を含み、当該薬物が架橋反応後に得られる微粒子中に担持されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
8. 前記架橋反応が、薬物共存下でも薬物を変性させない架橋方法である請求項７に記載の製造方法。
9. 前記架橋可能な官能基がメルカプト基であり、前記架橋反応がジスルフィド結合形成により架橋を形成する反応である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
10. 前記架橋反応がメルカプト基と不飽和結合との間の付加反応により架橋を形成する反応である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
11. 前記架橋反応がヒドラジド基と活性カルボン酸エステルとの間の反応により架橋を形成する反応である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
12. 架橋多糖微粒子であって、
    ａ）架橋可能な官能基を有する多糖誘導体を含む希薄溶液を調製する工程；
    ｂ）当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および
    ｃ）当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該多糖誘導体の架橋反応を進行させる工程
    を含む製造方法により調製することができ、前記架橋可能な官能基がメルカプト基であり、前記架橋反応がジスルフィド結合形成により架橋を形成する反応である前記架橋多糖微粒子。
13. 架橋多糖微粒子であって、
    ａ）架橋可能な官能基を有する多糖誘導体を含む希薄溶液を調製する工程；
    ｂ）当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および
    ｃ）当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該多糖誘導体の架橋反応を進行させる工程
    を含む製造方法により調製することができ、前記架橋反応がメルカプト基と不飽和結合との間の付加反応により架橋を形成する反応である前記架橋多糖微粒子。
14. 架橋多糖微粒子であって、
    ａ）架橋可能な官能基を有する多糖誘導体を含む希薄溶液を調製する工程；
    ｂ）当該溶液を微粒子状の液滴に分散する工程；および
    ｃ）当該液滴に含まれる溶液の濃縮により当該多糖誘導体の架橋反応を進行させる工程
    を含む製造方法により調製することができ、前記架橋反応がヒドラジド基と活性カルボン酸エステルとの間の反応により架橋を形成する反応である前記架橋多糖微粒子。
15. 多糖がヒアルロン酸である請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の架橋多糖微粒子。
16. 前記工程ｂ）が、前記溶液を噴霧することにより微粒子状の液滴に分散する工程である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の微粒子。
17. 平均粒子径が、０．０１μｍ〜１５０μｍである請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の微粒子。
18. 薬物担体である請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の微粒子。
19. 薬物徐放担体である請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の微粒子。
20. 架橋反応前の希薄溶液が薬物を含み、当該薬物が架橋反応後に得られる微粒子中に担持されている、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の微粒子。
21. 前記架橋反応が、薬物共存下でも薬物を変性させない架橋方法である請求項２０に記載の微粒子。

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