KR101233564B1 - 가교 다당 미립자 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

단백질, 펩티드 등의 약물의 생물 활성을 저해하지 않고 고봉입률로 봉입할 수 있고, 주사 가능하며, 완전히 생분해성이고 안전한 단백질 또는 펩티드 등의 약물인 장기 서방 제제를 제공한다.
가교 반응 가능한 관능기를 갖는 히알루론산 등의 다당 유도체 또는 그 염과 약물과의 용액을 미립자 상태에서 가교 반응의 진행이 느린 희박한 상태로부터 가교 반응이 진행하는 농도로 탈수함으로써, 농축 중에 가교 반응을 일으키고, 약물을 다당 가교체 중에 봉입한 약물 담지 미립자로 함으로써, 단백질, 펩티드 등의 약물의 생물 활성을 유지한 상태에서 그것들을 효율성 있게 봉입, 장기간 서방할 수 있는 주사 가능한 서방 제제를 실현할 수 있다.
Figure R1020067009249
서방 제제

Description

가교 다당 미립자 및 그 제조 방법 {CROSSLINKED POLYSACCHARIDE MICROPARTICLES AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은, 약물, 특히 약효를 갖는 단백질 또는 펩티드를 서방(徐放)하는 가교 다당 약물 서방 미립자 담체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
최근, 약효를 갖는 단백질, 펩티드의 제제가 활발히 실용화되고 있지만, 일반적으로 이러한 약물은 혈중 반감기가 짧고, 또한, 그 대부분이 자주 투여하는 주사제이기 때문에, 약제 투여에 있어서의 환자의 부담이 과대해진다. 따라서, 가능한 한 소량으로 약효를 발휘시키고 또한, 투여 회수도 적게할 수 있는 단백질 또는 펩티드 약제의 실용적인 서방형 제제가 요망되고 있다.
약효를 갖는 단백질 또는 펩티드의 서방 제제에 있어서는, 제제 조제시 또는 서방 중의 단백질 또는 펩티드의 변성, 혹은 응집에 의한 회수율 저하가 실용화에 대한 큰 장애가 되고 있다. 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체 (PLGA) 등의 생분해성 고분자를 기재로 한 서방 제제가 시도되고 있지만, 기재의 소수성, 건조 공정, pH 의 저하에 기인하는 단백질의 변성, 응집이 보고되고 있다 (비특허문헌 1 및 2 를 참조). 한편, 이러한 문제가 저감되는 친수성 하이드로겔을 기재에 사용한 서방 제제도 보고되어 있지만, 역시 실용화에는 이르고 있지 않다. 또한, 안전성 면에서는, 서방 기재로 사용하는 소재는, 비항원성, 비변이원성, 무독성, 생분해성을 겸비하는 것이 아니면 안되고, 단백질 또는 펩티드의 봉입률, 회수율 및 안전성 모두에 있어서 실용화 레벨에 달한 서방형 제제의 실현은 어렵다.
최근, 다당을 약물 담체의 기재로서 사용한다는 보고도 있다. 그 중에서도, 히알루론산 (HA) 은, 1934년, K.Meyer 에 의해 소의 눈의 유리체로부터 단리된 생체 재료 (다당) 이며, 세포 외 매트릭스의 주성분으로서 오래전부터 알려져 있다. HA 는, D-글루크론산과 N-아세틸글루코사민이 β(1→3) 글리코시드 결합에 의해 연결된 이당 단위로 이루어지는 글루코사미드글리칸의 일종이다.
HA 는, 화학적, 물리적 구조에 종차가 없고, 인간도 대사계를 가지고 있어, 면역성, 독성이라는 면에서도 가장 안전한 의용 생체 재료 (Biomaterial) 의 하나이다. 최근, 미생물에 의한 고분자량 HA 의 대량 생산이 가능해지고, 변형성 연골 치료약, 화장품 등의 분야에서도 실용화되고 있다.
HA 를 기재에 사용한 가교 방법, HA 겔로부터의 단백질이나 펩티드 약물의 서방도 다수 보고되고 있다. HA 를 화학 가교로 겔화시키는 방법으로는, 카르보디이미드법 (특허문헌 1 참조), 디비닐술폰법 (특허문헌 2 참조), 글리시딜에테르법 (특허문헌 3 참조) 등이 알려져 있다. 일반적으로, 겔 중에 단백질 또는 펩티드를 봉입하는 경우에는, 가교 후에 단백질 또는 펩티드를 도입하는 방법으로는, HA 와 단백질 또는 펩티드의 상용성, 정전 반발 등의 문제로 그 도입률은 낮다. 한편으로, 단백질 또는 펩티드 존재 하에서 in situ 가교를 실시하는 방법에는, 고(高)봉입률로 단백질 또는 펩티드를 담지시킬 수 있는 이점이 있다. 이 러한 in situ 가교에 의해, HA 겔 중에 단백질 또는 펩티드를 봉입하여 서방시키는 제제에 관해서 보고되고 있다 (예를 들어, 특허문헌 4 참조). 그러나, 이러한 방법을 사용하여 단백질 또는 펩티드 존재 하에서 HA 를 in situ 가교함으로써 얻어지는 서방형 제제는, 회수율면에서 문제를 가지고 있다. 예를 들어, 히드라지드기 (HZ) 를 도입한 HA 유도체 (HA-HZ) 를 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 로 이루어지는 가교제로 가교하는 방법 (특허문헌 5 참조) 이 보고되어 있고, 여기서는 생리 조건 하에서의 in situ 가교를 목적으로 하여 pH7.4 ∼ pH8.5 로 가교 형성 반응을 실시하고 있지만, 이 방법으로 얻어지는 HA 겔로부터의 단백질 또는 펩티드의 회수율도 역시 낮은 것이 본 발명자들의 검토에 의해 확인되고 있다. 이 원인은, 가교 반응 중에 단백질 또는 펩티드의 일부 (주로 아미노기) 가 가교제와 반응하여, 단백질이 가교 되어버리는 점에 있다. 또한, 겔 중에 남은 변성된 단백질 또는 펩티드는 생물활성이 저하하고 있어, 오히려 항원성 발현의 원인이 되는 등의 문제가 있다. 봉입한 약물이 고(高)회수율로 방출되는 것은, 의약품으로서 필수적인 조건 임에도 불구하고, 단백질 또는 펩티드를 반응시키지 않고서 HA 를 화학 가교, 겔화시키는 방법은 알려져 있지 않다. 또한, 고회수율로 단백질 펩티드를 봉입하는 방법으로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 을 기재로 하여 불포화 관능기를 구핵 부가 반응으로 가교하는 보고도 있지만 (특허문헌 6 참조), 생분해성이 아닌 PEG 단편이 잔존하는 문제가 있다.
또한, 실제, 이러한 약물 서방성 물질을 주사 가능한 제제로 하기 위해서는, 이것을 미립자화할 필요가 있다. 이러한 검토에 스프레이 드라이어는 널리 사 용되고 있고, 인슐린 (비특허문헌 3, 비특허문헌 4 참조), rh 항 IgE 항체 (비특허문헌 5 참조) 를 미립자화한 보고, 히알루론산의 미립자 중에 약물을 봉입한 보고 (특허문헌 7 참조, 특허문헌 8) 는 있지만, 모두 단시간에 피하에서 용해해 버리기 때문에 약물 서방 기간은 매우 짧고, 서방 목적으로서의 실용성은 낮다. 또한, 스프레이 드라이 중에 키토산의 가교 반응을 실시하여, 저분자 약물을 봉입하는 보고 (비특허문헌 6 참조) 도 있지만, 방출 기간은 몇분으로 짧고, 가교제에 사용하는 알데히드가 아미노기 등의 관능기와 높은 반응성을 갖기 때문에, 단백질, 펩티드, 그 밖의 아미노기 등의 관능기를 갖는 저분자 약물에는 사용할 수 없다.
특허문헌 1: 국제 공개 WO94/02517호 팜플렛
특허문헌 2: 일본 공개특허공보 소61-138601호
특허문헌 3: 일본 공개특허공보 평5-140201호
특허문헌 4: 미국특허 제5827937호 명세서
특허문헌 5: 국제 공개 WO95/15168호 팜플렛
특허문헌 6: 국제 공개 WO00/44808호 팜플렛
특허문헌 7: 특허 제3445283호 공보
특허문헌 8: 국제 공개 WO96/18647호 팜플렛
비특허문헌 1: J. Pharm. Sci. 제 88 권, 제 166-173 페이지, 1999년
비특허문헌 2: J. Microencapsulation 제 15 권, 제 699-713 페이지, 1998년
비특허문헌 3: Int. J. Pharm. 233, 227-237, 2002년
비특허문헌 4: J. Control. Rel. 91, 385-394, 2003년
비특허문헌 5: Biotech. and Bioeng. 60, 301-309, 1998년
비특허문헌 6: Int. J. Pharm. 187, 53-65, 1999년
발명이 해결하고자 하는 과제
상기 기술한 바와 같이, 단백질 또는 펩티드 등의 약물의 생물 활성을 유지한 상태에서 in situ 에서 화학 가교, 건조, 미립자화하여 약물을 봉입함으로써, 고봉입률, 고회수율, 안전성을 만족하는 주사 가능한 생분해성 겔 미립자의 조제 방법, 이것을 사용한 단백질 또는 펩티드 등의 장기 약물 서방 제제는 알려져 있지 않다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자는, 이러한 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 진행시킨 결과, 가교 형성 반응이 가능한 관능기를 갖는 히알루론산 유도체와 약물과의 용액을 가교 반응의 진행이 느린 희박한 상태로부터 가교 반응이 진행하는 농도로 농축함으로써, 농축 중에 HA 사이에 가교 반응을 일으키고, 약물을 히알루론산 가교체 내에 봉입함으로써, 단백질 또는 펩티드 등의 약물의 생물활성을 유지한 상태에서 이들을 효율적으로 봉입할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 이 방법에 의해 얻어진 가교 히알루론산 미립자는 주사 가능하고, 생분해성이며 안전한 장기 약물 서방 미립자 담체로서 단백질 또는 펩티드 등의 약물을 봉입하는 데에 최적인 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은, 단백질 또는 펩티드 등의 약물의 생물활성을 유지한 상태에서 이들을 in situ 에서 가교, 미립자 형성 및 건조시킴으로써 얻어지는, 겔 중에 봉입한 주사 가능한 단백질 또는 펩티드 등의 약물 서방 제제 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명의 하나의 측면에 의하면, 가교 다당 미립자의 제조 방법으로,
a) 가교 가능한 관능기를 갖는 다당 유도체를 함유하는 희박 용액을 조제하는 공정;
b) 당해 용액을 미립자 형상의 액적(液滴)에 분산시키는 공정; 및
c) 당해 액적에 함유되는 용액의 농축에 의해 당해 다당 유도체의 가교 반응을 진행시키는 공정을 포함하는 상기 제조 방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 별도의 측면에 의하면, 상기 공정 b) 가 상기 용액을 분무함으로써 미립자 형상의 액적에 분산시키는 공정인 상기 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 그 밖의 측면에 의하면, 상기 제조 방법에 의해 조제할 수 있는 가교 다당 미립자도 또한 제공된다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 사용되는 다당 유도체는, 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 다당 유도체이면 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는, 글리코사미드글리칸 (산성 무코다당; 예를 들어, 히알루론산, 콘드로이틴, 콘드로이틴 4-황산, 콘드로이틴 6-황산, 더마탄황산, 헤파린, 헤파란황산, 케라탄황산 등) 의 유도체 중 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 것이며, 특히 바람직하게는, 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 히알루론산 유도체이다.
따라서, 본 발명의 별도의 측면에 의하면, 가교 히알루론산 미립자의 제조 방법으로서,
a) 가교 가능한 관능기를 갖는 히알루론산 유도체를 함유하는 희박 용액을 조제하는 공정;
b) 당해 용액을 미립자 형상의 액적에 분산시키는 공정; 및
c) 당해 액적에 함유되는 용액의 농축에 의해 당해 히알루론산 유도체의 가교 반응을 진행시키는 공정을 포함하는 상기 제조 방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 별도의 측면에 의하면, 상기 공정 b) 가, 상기 용액을 분무함으로써 미립자 형상의 액적에 분산시키는 공정인 상기 제조 방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 그 밖의 측면에 의하면, 상기 제조 방법에 의해 조제할 수 있는 가교 히알루론산 미립자도 또한 제공된다.
본 발명의 공정 a) 에 있어서의 희박 용액은, 가교 반응에 필요한 기질 및 시약 등을 포함하는 용액이지만 용매에 의해 고도로 희석되어 있기 때문에 반응이 진행하지 않거나 또는 진행이 매우 느린 용액으로서, 그 농도는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 0.1％ ∼ 5％, 특히 0.2％ ∼ 3％ 이다. 또한, 본 발명에 사용하는 용매로는, 당해 기술 분야에서 통상 사용되고 있는 용매 또는 그들의 혼합물을 사용할 수 있고, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 물, DMSO, 에탄올, N-메틸피롤리돈, 초경계 탄산액 등이다.
본 발명의 공정 b) 에 있어서의 희박 용액을 미립자 형상의 액적에 분산시키는 방법으로는, 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 방법이면 특별히 한정되지 않고, 당해 희박 용액을 분무하는 방법, 당해 희박 용액을 별도의 액체와 혼합함으로써 에멀전을 형성하는 방법 등이 포함된다. 여기서 미립자 형상의 액적은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 0.04㎛ ∼ 1.5㎜, 바람직하게는 0.1㎛ ∼ 500㎛ 의 평균 입자 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 공정 c) 에 있어서의 용액의 농축 방법은, 가교 반응의 진행을 보다 빠르게 하는 농도까지 농축할 수 있는 수단이면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 당해 농축에는, 예를 들어, 당해 가교 반응이 고상 반응으로서 진행하는 것과 같은 용매가 완전히 제거된 상태도 포함된다.
또한, 상기 공정 b) 및 c) 는 일련의 공정으로 실시해도 된다. 구체적으로는, 상기 공정 b) 및 c) 를 일련의 공정으로서, 스프레이 드라이, 에멀전액중 건조법, 용매 확산법 등에 의해 실시할 수 있다. 이 중에서도, 상기 공정 b) 및 c) 를 일련의 공정으로서 스프레이 드라이에 의해 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 가교 다당 미립자는, 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 다당 유도체를 함유하는 용액을, 가교 반응의 진행이 느린 희박한 상태에서 가교 반응이 진행하는 농도로 농축함으로써, 농축 중에 다당 유도체를 가교하는 것에 의해 제조할 수 있다. 또한, 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 다당 유도체와 약물을 함유하는 용액을, 가교 반응의 진행이 느린 희박한 상태에서 가교 반응이 진행하는 농도로 농축함으로써 농축 중에 가교 반응을 일으키고, 가교 반응과 건조를 동시에 실시함으로써 약물을 다당 가교체 내에 봉입한 약물 담지 미립자로 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의해 제공되는 제조 방법 및 당해 제조 방법에 의해 얻어진, 예를 들어, 가교 히알루론산 미립자 등의 가교 다당 미립자는, 바람직하게는 이하에 나타내는 특징을 가지고 있다.
1. 완전 생분해성이며, 생체에 대한 높은 안전성을 확보할 수 있다.
2. HA 등의 다당에 가교 형성이 가능한 관능기를 그래프트함으로써, 가교점간 거리를 매우 작게 (예를 들어, HA 의 경우, 글루크론산당 33몰％ 그래프트로 약 3㎚) 하는 것이 가능하고, 장기 서방을 실현하는 데에 있어서 유리하다.
3. 고가교 밀도이다.
4. 단백질을 약제로서 사용하는 경우, 단백질의 변성을 막을 수 있다.
5. 미립자화, 건조화, 가교화를 1 제조 공정에서 실시할 수 있다.
본 발명에서 말하는 가교 또는 화학 가교란, 공유 결합에 의한, 분자간 또는 분자내 가교 결합을 포함하는 것이며, 동시에 분자간 및 분자내 가교 결합을 갖는 경우도 있다.
본 발명에서 사용되는 가교 반응은, 약물, 예를 들어, 단백질이나 펩티드의 공존 하에서 가교를 형성하더라도 약물을 변성시키지 않는 가교 결합 형성 방법이면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 반응으로는, 예를 들어, 메르캅토기 사이의 디술피드 결합 형성, 메르캅토기와 불포화 결합 사이의 부가 반응, 히드라지드기와 활성 카르복실산 에스테르 사이의 반응 등을 들 수 있다.
가교시의 pH 는 특별히 한정되지 않고, 단백질 또는 펩티드를 변성시키지 않고서 가교 형성을 촉진하며, 단백질 또는 펩티드 등의 약물의 함유 아미노기와의 반응을 막는 pH 가 바람직하다. 그러한 pH 는 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하지만, 예를 들어, pH3.0 ∼ pH9.0, 바람직하게는 pH4.5 ∼ pH9.0 이다.
본 발명에 사용하는 다당 유도체는, 상기한 바와 같은 가교 반응이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않는데, 구체적으로는 HA 에 가교 가능한 관능기를 도입한 히알루론산 유도체 (HA 유도체) 를 들 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 가교 가능한 관능기는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 메르캅토기, 불포화 결합을 갖는 기 (예를 들어, 메타크릴기, 아크릴기, 비닐술폰기, 아세틸렌카르보닐기등), 히드라지드기 (HZ 기) 등을 들 수 있다.
가교 반응이, 메르캅토기끼리의 디술피드 결합 형성에 유래되는 경우에는, 예를 들어, 메르캅토기를 도입한 HA 유도체 등의 다당 유도체만을 사용하여 가교를 형성할 수 있고, 혹은, 이것에 가교제로서 메르캅토기를 2 개 이상 갖는 화합물 (예를 들어, 디티오트레이톨 (DTD), 부탄디티올, 폴리에틸렌글리콜디티올, 시스테인을 2 개 이상 포함하는 펩티드 등) 을 첨가하여 가교를 형성할 수도 있다. 또한, 가교 반응 속도를 높일 목적으로, 테트라티온산나트륨 (Sodium tetrathionate: STT), 디피리딜디설파이드 (Dipyridyl disulfide), 엘만 시약 (Ellman's reagent: DTNB) 등의 화합물을 첨가해도 된다. 이때, 미반응의 메르캅토기가 겔 중에 잔존하면 단백질이나 펩티드의 변성으로 이어질 가능성이 있기 때문에, 반응 효율을 가능한 한 올리기 위해서 이들 화합물을 반응성을 갖는 메르캅토기에 대하여 0.1몰배 ∼ 2몰배, 더욱 바람직하게는 0.5몰배 ∼ 1.5몰배 첨가하는 것이 바람직하다.
메르캅토기를 도입한 다당 유도체의 조제 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, HA 를 3급 암모늄염으로 하여, DMSO 등의 극성 유기 용매에 용해하고, 커플링제 존재 하, 메르캅토기를 갖는 아민 또는 히드라지드와 반응시키는 방법 등에 의해 조제할 수 있다. 메르캅토기를 갖는 아민은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 2-아미노에탄-1-티올, 3-아미노프로판-1-티올, 티오글리콜산히드라지드 등을 들 수 있다.
또한, HA 에 메르캅토기를 도입하는 경우, 우선 아미노기나 히드라지드기를 도입하고, 그 후 이 아미노기나 히드라지드기에 메르캅토기를 도입하는 방법도 바람직하다. 예를 들어, HA 의 카르복실산과, 아디프산디히드라지드 (ADH) 또는 에틸렌디아민, 에틸렌디옥시비스에틸아민 등의 2 가의 HZ 또는 아미노기 함유 화합물을 커플링제로 축합시키고, 히드라지드기를 도입한 HA 유도체 (HA-HZ) 또는 아미노기를 도입한 HA 유도체 (HA-아미노기) 를 합성하고, 이것에 예를 들어, N-숙신이미딜 3-[2-피리딜디티오]프로피오네이트 (SPDP) 를 반응시켜, DTT 등의 환원제로 환원, 메르캅토기로 하는 방법, 혹은 2-이미노티오란 (Trout's Reagent) 을 히드라지드기, 또는 아미노기와 반응시키는 방법 등을 들 수 있다.
커플링제로는, 예를 들어, 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP), N,N'-카르보닐디이미다졸 (CDI), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 (EDC), EDC/3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HODhbt), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린 (EEDQ), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리움 클로리드 n-수화물 (DMT-MM), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 가교 가능한 관능기는, 예를 들어, 다당의 분자 내에 함유되는 카르복실기를 이하와 같은 메르캅토기, 불포화 결합, 아미노기 또는 히드라질기를 함유하는 에스테르기 또는 치환 아미드기로 변환함으로써 도입할 수 있다:
-CO-N(-R1)-Y1-Q1-Y2-N(-R2)-Y3-Q2-SH;
-CO-N(-R1)-N(-R2)-Y3-Q2-SH;
-CO-N(-R1)-Y1-Q1-Y2-N(-R2)-Y3-Q4;
-CO-N(-R1)-N(-R2)-Y3-Q4; 또는
-CO-N(-R1)-Y1-Q1-Y2-NH2;
(식 중, R1 은, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1-10 히드록시알킬기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 또는 폴리에스테르기이고,
Y1 은, 단결합, -N(-R3)CO-, -N(-R3)-, -CO-, 또는 -CH2CO- 이고,
Y2 는, 단결합, -CON(-R4)-, 또는 -N(-R4)-, 이고,
Q1 은, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬렌기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬렌기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 또는 폴리에스테르기이고,
R2, R3 및 R4 는, 각각 독립하여, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기 또는 폴리에스테르기이고,
Y3 은, 단결합, -CO-, -CO2-, -CH2-CH(OH)-, 또는 -CONH- 이고,
Q2 는, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬렌기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬렌기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 또는 폴리에스테르기이고,
Q4 는, 직쇄 혹은 분지 C2 -10 알케닐기, 또는, 직쇄 혹은 분지 C2 -10 알키닐기이다).
메르캅토기를 도입한 다당 유도체의 예로는, 바람직하게는 식 (I):
Figure 112006033214755-pct00001
(식 중, X2 는, -Y1-Q1-Y2-N(-R2)-Y3-Q2-SH, 또는 -N(-R2)-Y3-Q2-SH 이고,
R1 은, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 또는 폴리에스테르기이고,
Ra2, Ra3, Ra4, Ra5 및 Ra6 은, 각각 독립하여, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알케닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알키닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알킬카르보닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알케닐카르보닐기, 직쇄 또는 분지 C1-6 알키닐카르보닐기, 또는 -SO2OH 이고,
Y1 은, 단결합, -N(-R3)CO-, -N(-R3)-, -CO-, 또는 -CH2CO- 이고,
Y2 는, 단결합, -CON(-R4)-, 또는 -N(-R4)- 이고,
Q1 은, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬렌기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬렌기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 또는 폴리에스테르기이고,
R2, R3 및 R4 는, 각각 독립하여, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 또는 폴리에스테르기이다.
Y3 은, 단결합, -CO-, -CO2-, -CH2-CH(OH)-, 또는 -CONH- 이고,
Q2 는, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬렌기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬렌기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 또는 폴리에스테르기이다) 로 나타내어지는 반복 구조를 적어도 1 이상 분자 내에 갖는 히알루론산 유도체가 포함된다.
또한, 식 (I) 중, 폴리알킬렌옥사이드기란, -(CH(-R)CH2O)n-H (식 중, R 은 수소 원자, 또는 C1 -5 알킬기) 로 나타내어지는 기이고, 바람직하게는, 폴리에틸렌옥사이드기, 폴리프로필렌옥사이드기이며, 또한, 바람직하게는 n 은, 1 ∼ 20 의 정수이다. 또한, 폴리펩티드기는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 아미노산 1 ∼ 20 개로 이루어지는 것이다. 또한, 폴리에스테르기는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 폴리글리콜산기, 폴리락트산기이다.
나아가, 식 (I) 에 있어서, R1 은 바람직하게는 수소 원자이고, X2 는 바람직하게는 -Y1-Q1-Y2-N(-R2)-Y3-Q2-SH 이다. 또한, 식 (Ⅱ) 에 있어서, Y1 은 바람직하게는 단결합 또는, -N(-R3)- 이고, Y2 는 바람직하게는 단결합이며, Q1 은 바람직하게는 직쇄 또는 분지 C1 -4 알킬렌기이다. 또한, 식 (Ⅱ) 에 있어서, R2 및 R3 은 바람직하게는 수소 원자이고, Y3 은 바람직하게는 -CO- 이며, 바람직하게는 Q2 는 직쇄 또는 분지 C1 -4 알킬렌기이다.
메르캅토기와 불포화 결합 간의 부가 반응을 가교 반응으로서 이용하는 경우에는, 불포화 결합을 갖는 기를 도입한 HA 유도체 등의 다당 유도체와 메르캅토기를 2 개 이상 갖는 화합물 (예를 들어, 디티오트레이톨 (DTT, 부탄디티올, 폴리에틸렌글리콜디티올, 시스테인을 2 개 이상 함유하는 펩티드, 메르캅토기를 도입한 HA 유도체 등) 을 혼화해도 되고, 반대로, 메르캅토기를 도입한 다당 유도체와 불포화 결합을 갖는 기를 2 개 이상 갖는 화합물 (예를 들어, 에틸렌글리콜디메타크릴레이트, 에틸렌비스아크릴아미드, 트리스-2-말레이미도에틸아민, 1,8-비스말레이미도트리에틸렌글리콜, 1,4-비스말레이미딜-2,3-디히드록시부탄, 불포화 결합을 도입한 HA 유도체 등) 을 혼화해도 된다. 또한, 이 경우, 가교 반응시의 단백질 또는 펩티드의 안정성 향상, 반응 속도의 향상을 위해 트리에탄올아민 등의 염기성 화합물을 첨가하는 것이 바람직하다. 이때, 바람직한 농도로는, 10㎕/mL ∼ 20㎕/mL 이다. 메르캅토기를 2 개 이상 갖는 화합물로는, 예를 들어, 직쇄 또는 분지쇄의 C2 -10 알킬렌디티올 (여기서, 알킬렌 부분은 1 이상의 산소 원자가 삽입되어 있어도 되고, 및/또는 1 이상의 수산기로 치환되어 있어도 된다) 도 포함된다.
불포화기를 도입한 다당 유도체의 조제 방법은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 메타크릴산글리시딜에테르나, 무수메타크릴산 등을 HA 의 수산기에 직접 반응시키는 방법 (J. Biomed. Mat. Res. 54, 115-121, 2001) 으로는 높은 도입률은 얻기 어렵다. 이것은, HA 가 수용액 속에서 수소 결합, 소수성 상호 작용에 의한 고차 구조를 형성하여, 히드록실기, 카르복실산기 등의 관능기의 반응성이 낮기 때문이라고 생각된다. 단백질이나 펩티드의 서방 기간을 늘이기 위해서는 높은 가교 밀도가 바람직하다. 이를 위해서는, 글루크론산 부분의 카르복실기에 치환기를 도입하는 것이 바람직하다. 예를 들어, HA 를 3 급 암모늄염, DMSO 등의 극성 유기 용매에 용해하고, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP), 벤조트리아졸-1-일옥시트리스피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP) 등의 커플링제 존재 하, 불포화 결합을 갖는 아민 또는 히드라지드와 반응시키는 방법 등에 의해 조제할 수 있다. 불포화 결합을 갖는 아민은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 알릴아민, 디알릴아민, 4-아미노-1-부텐, 아크릴히드라지드, 메타크릴히드라지드 등을 들 수 있다.
또한, 상기 기술한 아미노기나 히드라지드기를 도입하고, 그 후, 이 아미노기나 히드라지드기에 불포화 결합을 갖는 기를 도입하는 방법도 바람직하다. 예를 들어, HA 의 카르복실산과, 아디프산디히드라지드 (ADH) 또는 에틸렌디아민, 에틸렌디옥시비스에틸아민 등의 2 가의 HZ 또는 아미노기 함유 화합물을, EDC, BOP, PyBOP 등의 축합제로 축합시켜, 히드라지드기 수식된 HA 유도체 (HA-HZ) 또는 아미노기 수식된 HA 유도체 (HA-아미노기) 를 합성하고, 이것에 불포화 결합을 갖는 카르복실산 유도체, 예를 들어, R10-COOH 의 산무수물 또는 활성화 에스테르 (여기서, R10 은 직쇄 또는 분지 C2 -10 알케닐기이다), 바람직하게는 무수메타크릴산, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 활성화 아크릴산 또는 메타크릴산 등을 반응시키는 방법 등을 들 수 있다.
HA 등의 다당에 불포화 결합을 갖는 기를 도입 후, 메르캅토기에 의해 가교하는 경우, 메르캅토기의 불포화 결합을 갖는 기에 대한 비율은 특별히 한정되지 않고, 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하지만, 단백질, 펩티드와의 반응을 최소로 하고, 또한, 불포화기의 겔 중의 잔존을 막으며, 또한, 빠르게 반응시키기 위해, 메르캅토기:불포화 결합을 갖는 기 = 3:1 ∼ 1:2 가 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 2:1 ∼ 1:1 이다.
HA 에 메르캅토기를 도입 후, 불포화 결합을 갖는 기에 의해 가교하는 경우, 불포화 결합을 갖는 기의 메르캅토기에 대한 비율은 특별히 한정되지 않고, 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하지만, 단백질, 펩티드와의 반응을 최소로 하고, 또한, 불포화기의 겔 중의 잔존을 막으며, 또한, 빠르게 반응시키기 위해, 불포화 결합을 갖는 기: 메르캅토기 = 3:1 ∼ 1:2 가 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 2:1 ∼ 1:1 이다.
불포화 결합을 갖는 기를 도입한 다당 유도체의 예로는, 바람직하게는 식 (Ⅱ):
Figure 112006033214755-pct00002
(식 중, X3 은, -Y1-Q1-Y2-N(-R2)-Y3-Q4, 또는, -N(-R2)-Y3-Q4 이고,
R1 은, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 또는 폴리에스테르기이고,
Ra2, Ra3, Ra4, Ra5 및 Ra6 은, 각각 독립하여, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알케닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알키닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알킬카르보닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알케닐카르보닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알키닐카르보닐기, 또는 -SO2OH이고,
Y1 은, 단결합, -N(-R3)CO-, -N(-R3)-, -CO-, 또는, -CH2CO- 이고,
Y2 는, 단결합, -CON(-R4)-, 또는 -N(-R4)- 이고,
Y3 은, 단결합, -CO-, 또는, -CH2CO- 이고,
Q1 은, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬렌기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬렌기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 또는 폴리에스테르기이고,
R2, R3 및 R4 는, 각각 독립하여, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기 또는 폴리에스테르기이고,
Q4 는, 직쇄 또는 분지 C2 -10 알케닐기, 혹은, 직쇄 또는 분지 C2 -10 알키닐기이다)
로 나타내어지는 반복 구조를, 적어도 1 이상 분자 내에 갖는 히알루론산 유도체 등이 포함된다.
여기서 식 (Ⅱ) 중, 폴리알킬렌옥사이드기란, -(CH(-R)CH2O)n-H (식 중, R 은 수소 원자, 또는 C1 -5 알킬기) 로 나타내어지는 기이고, 바람직하게는, 폴리에틸렌옥사이드기, 폴리프로필렌옥사이드기이며, 또한, 바람직하게는 n 은 1 ∼ 20 의 정수이다. 또한, 폴리펩티드기는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 아미노산 1개 ∼ 20개로 이루어지는 것이다. 또한, 폴리에스테르기는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 폴리글리콜산기, 폴리락트산기이다.
나아가, 식 (Ⅱ) 에 있어서, R1 은 바람직하게는 수소 원자이고, X3 은 바람직하게는 -Y1-Q1-Y2-N(-R2)-Y3-Q4 이다. 또한, 식 (Ⅱ) 에 있어서, Y1 은 바람직하게는 단결합, N(-R3)CO-, 또는, -N(-R3)- 이고, 더욱 바람직하게는 -N(-R3)CO- 이다. 또한, Y2 는 바람직하게는 단결합, -CON(-R3)- 이고, 더욱 바람직하게는 CON(-R3)- 이며, Y3 은 바람직하게는 단결합, -CO-, 또는, -N(-R3)- 이며, 더욱 바람직하게는 -CO- 이다. 나아가, 식 (Ⅱ) 에 있어서, Q1 은 바람직하게는 직쇄 또는 분지 C1 -4 알킬렌기이며, R2 및 R3 은 바람직하게는 수소 원자이며, Q4 는 바람직하게는 직쇄 또는 분지 C2 -10 알케닐기이다.
또한, 메르캅토기를 도입한 다당 유도체의 예로는, 상기 기술한 식 (I) 로 나타내어지는 반복 구조를, 적어도 1 이상 분자 내에 갖는 히알루론산 유도체 등이 포함된다.
가교 반응에, 히드라지드기를 도입한 HA 산 유도체 등의 다당 유도체와 활성 카르복실산의 반응을 이용할 수도 있다. 다당에 대한 히드라지드기의 도입은 당업자에게 공지된 방법으로 실시할 수 있고, 예를 들어, 히알루론산의 카르복실기와 2 가의 히드라지드 함유 화합물 (디히드라지드 화합물) 을 축합제를 사용하여 축합시킴으로써 합성할 수 있다. 디히드라지드 화합물로는, 숙신산디히드라지드, 글루타르산디히드라지드, 아디프산디히드라지드, 피멜린산디히드라지드를 들 수 있다. 또한, 축합제로는, 1,3-디시클로헥실카르보디이미드, 1,3-디이소프로필카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 등을 들 수 있다. 예를 들어, 히알루론산의 카르복실산과 아디프산디히드라지드 (ADH) 를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 로 축합시켜, 히드라지드기로 수식된 히알루론산 (HA-HZ) 을 합성하는 것이 가능하다. 가교제로는, HZ 기와 반응할 수 있는 관능기이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, NHS 에서 활성화된 에스테르기, 펜타플루오로페녹시카르보닐기, p-니트로페녹시카르보닐기, 이미다졸릴카르보닐기, 이소티오시아네이트기, 술포닐클로리드기, 술포닐플루오리드기, 포르밀기, 비닐술포닐기, 산무수물, 4-니트로페닐포르메이트기 등의 관능기를 동일 분자 내에 2 개 이상 갖는 분자를 들 수 있다. 당해 가교제의 예로는, 비스[술포숙신이미딜]수베레이트, 디숙신이미딜글루타레이트, 디숙신이미딜타르타레이트, 에틸렌글리콜비스[숙신이미딜숙시네이트] 등이 포함된다.
아미노기에 대한 HZ 기와의 선택적 반응성, 단백질의 변성 등을 고려하면, 가교시의 pH 는, pH3.0 ∼ pH6.0 이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, pH4.0 ∼ pH6.0 이다. 가교 반응 중의 pH 를 이 범위로 유지하기 위해서, 사용하는 버퍼는 휘발성이 낮은 것, 예를 들어, 시트르산 등이 바람직하다. 가교제 중의 히드라지드기와 반응하는 화합물 관능기는, 겔 조제액 중의 히드라지드 기에 대하여 40몰％ 이하인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 20몰％ 이하, 특히 바람직하게는 10몰％ 이하이다.
가교 반응 가능한 관능기의 HA 로의 도입률은, 특별히 한정되지 않고, 생체 내에서 유동성이 없는 겔을 얻기 위해서 HA 의 글루크론산 당 5몰％ 이상이 바람직하고, 10몰％ 이상이 특히 바람직하다. 또한, 약물의 서방 성능은 가교된 HA 유도체의 가교 밀도에 크게 의존하기 때문에, 이 도입률을 제어함으로써 약물의 서방 기간을 제어할 수 있다.
히드라지드기가 도입된 다당산 유도체의 예로는, 식(Ⅲ):
Figure 112006033214755-pct00003
(식 중, R1 은, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 폴리에스테르기이고,
X1 은, -Y1-Q1-Y2-NHNH2 이고,
Ra2, Ra3, Ra4, Ra5 및 Ra6 은, 각각 독립하여, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알케닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알키닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알킬카르보닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알케닐카르보닐기, 직쇄 또는 분지 C1 -6 알키닐카르보닐기, 또는 -SO2OH 이고,
Y1 은, 단결합, -N(-R3)CO-, -N(-R3)-, -CO-, 또는 -CH2CO- 이며,
Q1 은, 단결합, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬렌기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬렌기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 폴리에스테르기이고,
Y2 는, 단결합, -N(-R4)CO-, -CO-, 또는, -CH2CO- 이고,
R3 및 R4 는, 각각 독립하여, 수소 원자, 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬기, 직쇄 또는 분지 C1 -10 히드록시알킬기, 폴리알킬렌옥사이드기, 폴리펩티드기, 폴리에스테르기이다)
로 나타내어지는 반복 구조를, 적어도 1 이상 분자 내에 갖는 히알루론산 유도체가 포함된다.
나아가, 식 (Ⅲ) 에 있어서, R1 은 바람직하게는 수소 원자이고, Ra2, Ra3, Ra4, Ra5 및 Ra6 은 바람직하게는 수소 원자이고, Y1 은 바람직하게는 단결합, 또는, -CO- 이고, Q1 은 바람직하게는 직쇄 또는 분지 C1 -10 알킬렌기이고, Y2 는 바람직하게는, 단결합, 또는, -CO- 이고, R3 은 바람직하게는 수소 원자이며, R4 는 바람직하게는 수소 원자이다.
또한, 식 (Ⅲ) 중, 폴리알킬렌옥사이드기란, -(CH(-R)CH2O)n-OH (식 중, R 은 수소 원자, 또는 직쇄 또는 분지 C1 -5 알킬기) 로 나타내어지는 기이고, 바람직하게는, 폴리에틸렌옥사이드기, 폴리프로필렌옥사이드기이고, 또한, n 은, 바람직하게는 1 ∼ 20 의 정수이다. 또한, 폴리펩티드기는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 아미노산 1 ∼ 20개로 이루어지는 것이다. 또한, 폴리에스테르기는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 폴리글리콜산기, 폴리락트산기이다.
본 발명의 가교 히알루론산 미립자의 제조 방법으로는, 미립자의 용매 증류 제거에 의한 건조와 가교 반응이 동시에 진행하는 제조 방법이면 된다. 예를 들어, 액체를 분무 건조하는 스프레이 드라이어를 사용하여, 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 히알루론산 유도체와 약물을 함유하는 용액을 분무 건조시킴으로써, 농축 건조 중에 히알루론산 유도체를 가교하여, 약물을 히알루론산 가교체 내에 봉입한 약물 담지 미립자를 얻으면 된다. 스프레이 드라이를 사용하는 경우에는, 약물의 변성을 막기 위해서, 건조 온도는 100℃ 이하인 것이 바람직하다.
또는, 가교 반응 가능한 HA 유도체 (테트라부틸암모늄염) 와 약물을 DMSO 등의 극성 유기 용매에 녹여두고, 이산화탄소 등의 초경계 액체를 첨가, DMSO 를 추출함으로써 히알루론산 농축 중에 가교 반응을 일으켜, 미립자를 얻어도 된다. 이들의 미립자화 방법을 사용할 때는, Tween-20, Tween-80 등의 계면 활성제를 첨가 (1％ ∼ 2％ 정도) 함으로써, 생성된 미립자의 회수율을 높일 수 있다. 또한, 이들의 제조 방법을 취하는 경우, 농축 전의 가교 반응을 일으키지 않은 조제액을 사용할 필요가 있다. 가교제 혼합으로부터 농축까지의 시간, 가교성 관능기의 도입률, 히알루론산 분자량, 농도에 따라 다르나, 가교성 관능기의 도입률은 5몰％ ∼ 70몰％, 히알루론산 분자량은 1만 돌턴 ∼ 200만 돌턴, 히알루론산 농도는, 0.1％ ∼ 5％ 가 바람직하다.
또한, 다른 방법으로는, 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 히알루론산 유도체와 약물을 함유하는 수용액을 탈수성을 갖는 액체 (예를 들어, 분자량 400돌턴의 폴리에틸렌글리콜 등) 의 중에 에멀전화함으로써, 탈수 농축 중에 히알루론산을 가교하고, 약물을 히알루론산 가교체 내에 봉입한 약물 담지 미립자를 얻는 것도 가능하다. 이 방법을 사용할 때는, 봉입 효율을 올리기 위해서, 양이온성이나 음이온성의 약물이 바람직하다.
또한, 미립자 형성 후에 열처리를 함으로써 추가로 함수율을 저하시켜, 가교 반응을 완전히 종료시키는 편이 바람직하다. 이 경우, 가교 밀도도 오르고, 서방 기간의 연장도 기대할 수 있다. 여기서, 열처리의 온도는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 30 ∼ 110℃, 바람직하게는 30 ∼ 60℃ 에서 실시할 수 있다.
건조 후의 미립자 직경은, 용도에 따라 최적화하면 되지만, 주사 가능하게 하기 위해서 통상, 0.01㎛ ∼ 150㎛ 가 바람직하다. 경비(經鼻), 경폐(經肺) 투여시에는, 0.01㎛ ∼ 5㎛ 이 흡입 효율면에서 바람직하고, 정주(靜注) 투여시에는, 0.01㎛ ∼ 0.2㎛ 정도가 혈중 움직임면에서 바람직하다.
본 발명에 사용되는 HA 는, 어떻게 하여 얻어진 HA 여도 되고, 동물 조직으로부터 추출된 HA, 발효법으로 얻어진 HA, 화학 합성으로 얻어진 HA 등, 그 유래는 한정되지 않는다. 나아가, 가수 분해 처리 등, HA 에 한층 더 처리를 실시해도 된다. 본 발명의 HA 에는, 여러가지 방법으로 수식된 수식 HA 나, 나트륨, 칼륨, 리튬 등의 알칼리 금속염 등도 함유된다. HA 는 카르복실기와 하이드록실기가 수식되는 경우가 많지만, 본 발명에 있어서 수식 HA 는 어떤 부분이 수식되어 있어도 된다. 수식 HA 는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 수식이 되어 있어도 되지만, 예를 들어, 황산화된 HA (WO95/25751), N-황산화된 HA (WO98/45335), 에스테르화된 HA (EP0216453, WO98/08876, EP0341745), 과옥소산 산화된 HA, 아미드 수식된 HA 등을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 원료 HA 의 분자량은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 분자량의 HA 라도 사용하는 것이 가능하지만, 통상 5000돌턴 ∼ 350만 돌턴, 바람직하게는 1만 돌턴 ∼ 100만 돌턴의 HA 를 사용할 수 있다. 또한, HA 의 분자량과 농도는, 제조 후의 입자 직경에 영향을 주기 때문에, 목적으로 하는 입자 직경에 따라 선택하면 된다.
약효를 갖는 단백질, 펩티드로서는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 에리스로포이에틴 (EPO), 인간 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 인터페론-α, β, γ, (INF-α, β, γ), 트롬보포이에틴 (TPO), 시리아리뉴트로픽펙터 (CNTF), 츄마네크로시스펙터 결합 단백질 (TNFbp), 인터류신 -10(IL-10), FMS 유사 티로신카이네스 (Flt-3), 성장 호르몬 (GH), 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자 -1(IGF-1), 혈소판 유래 성장 인자 (PDFG), 인터류신-1 리셉터 안타고니스트 (IL-1ra), 브레인 유래 뉴트로픽펙터 (BDNF), 케라티노사이트 성장 인자 (KGF), 줄기 세포 인자 (SCF), 혈소판 생성 세포 유래 성장 분화 인자 (MGDF), 오스테오프로테제린 (OPG), 레프틴, 부갑상선 호르몬 (PTH), 염기성 피브로브라스트 성장 인자 (b-FGF), 뼈 형성 단백질 (BMP), 심방성 나트륨 이뇨펩티드 (ANP), 뇌성 나트륨 이뇨펩티드 (BNP), C 형 나트륨 이뇨펩티드 (CNP), 글루카곤 모양 펩티드 -1(GLP-1), 항체, 다이아바디 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 서방 담체는, 저분자량 화합물의 약제에도 사용할 수 있다. 저분자 약제로는, 제암제(制癌劑) (예를 들어, 알킬화제, 대사 길항제, 알칼로이드), 면역 억제제, 항염증제 (예를 들어, 스테로이드제, 비(非)스테로이드제계 항염증제), 항류머티즘제, 항균제 (예를 들어, β-락탐계 항생 물질, 아미노글리코시드계 항생 물질, 마크로라이드계 항생 물질, 테트라사이클린계 항생 물질, 신(新)퀴놀론계 항생 물질, 설파제) 등을 들 수 있다.
본 발명의 서방 담체는, 1 종 또는 그 이상의 약학적으로 허용할 수 있는 희석제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보조제, 방부제, 완충제, 결합제, 안정제 등을 포함하는 약학적 조성물로서, 목적으로 하는 투여 경로에 따라, 적당한 임의의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 비경구적 경로여도 되고 경구적 경로여도 된다.
도 1 은, 가교 HA-SH 마이크로하이드로겔 미립자를 현미경으로 촬영한 사진 의 일례이다.
도 2 는, PBS 중에서의 팽창 후의 가교 HA-SH 마이크로하이드로겔 미립자를 현미경으로 촬영한 사진의 일례이다.
도 3 은, EPO 를 봉입한 가교 HA-SH 마이크로히드로겔에 관해서 열중량 분석을 실시한 결과의 일례이다.
도 4 는, 실시예 1-4 에 있어서 얻어진 가교 HA-SH 마이크로하이드로겔 미립자로부터 회수된 EPO 의 양을 나타내는 RP-HPLC 분석의 결과의 일례를 나타내는 그래프이고, 아래로부터 각각 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4 에서 얻어져 미립자를 나타내는 것이다.
도 5 는, 실시예 3 과 비교예 1 에서 얻어진 HA 겔로부터의 EPO 의 방출성을 나타내는 그래프이다.
도 6 은, 실시예 9-1 에서 얻어진 히알루론산 유도체 (HA-HZ) 의 1H-NMR 의 측정 결과의 일례이다.
도 7 은, 실시예 9-2 에서 얻어진 히알루론산 유도체 (HA-HZ-SH) 의 1H-NMR 의 측정 결과의 일례이다.
도 8 은, 실시예 10 에서 얻어진 히알루론산 유도체 (HA-HZ-MA) 의 1H-NMR 의 측정 결과의 일례이다.
도 9 는, 실시예 11-1 에서 얻어진 히알루론산 유도체 (HA-AM) 의 1H-NMR 의 측정 결과의 일례이다.
도 10 은, 실시예 11-2 에서 얻어진 히알루론산 유도체 (HA-AM-SH) 의 1H-NMR 의 측정 결과의 일례이다.
도 11 은, 실시예 11-1 에서 얻어진 히알루론산 유도체 (HA-AM-MA) 의 1H-NMR 의 측정 결과의 일례이다.
도 12 는, 실시예 12 에 의해 얻어진 입자의 큐어링에 의한 수분량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13 은, 실시예 12 에 의해 얻어진 입자의 큐어링에 의한 팽창 제어 효과를 나타내는 것이다.
EPO 봉입 가교 히알루론산 미립자의 조제
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 관해서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
NMR 측정은, 핵자기 공명 장치 JNM-ECA500 (닛폰 전자 주식회사 제조) 을 사용하여 중수 (D2O) 를 용매에 사용하여 측정하였다. 또한, 치환기의 도입률의 결정은, 도입한 치환기 특유의 피크와 히알루론산 유래의 피크의 적분비로부터 결정하였다.
[실시예1]
[실시예1-1] 히드라지드기 (HZ 기) 가 도입된 히알루론산 유도체 (HA-HZ) 의 합성
Figure 112006033214755-pct00004
분자량 1.9×105돌턴의 히알루론산 (HA) (전기 화학 공업 주식회사 제조) 200㎎ 을 0.5％ 농도로 증류수에 용해하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7 ∼ 4.8 로 조제하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 와 아디프산디히드라지드 (ADH) 를, HA:EDC:ADH = 1:0.3:40 (뱃치 1-1), 1:1:40 (뱃치 1-2), 1:5:40 (뱃치 1-3) 몰비가 되도록 첨가하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7 ∼ 4.8 로 유지하면서 실온에서 교반하 2 시간 반응시켰다. 100mM 염화나트륨 용액, 25％ 에탄올 용액으로 투석 (스펙트라포아 7, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14k 돌턴) 하고, 동결 건조시켜 표제의 HA-HZ 를 얻었다.
얻어진 HA-HZ 중의 HZ 기 도입률을 프로톤 NMR 법으로 정량한 결과, 각각 HA 의 카르복실산의 26％ (뱃치 1-1), 46％ (뱃치 1-2), 69％ (뱃치 1-3) 가 HZ 화되어 있었다 (HA 및 HA-HZ 의 N-아세틸기 (1.9ppm, 3H), HA-HZ 의 아디프산 유래 부분의 메틸렌기 (1.6ppm, 2.3ppm, 각 2H) 를 비교).
[실시예 1-2] 메르캅토기 (SH) 가 도입된 히알루론산 유도체 (HA-SH) 의 합성
Figure 112006033214755-pct00005
실시예 1-1 의 뱃치 1 ∼ 3 의 HA-HZ, 각각 100㎎ 을 5mL 의 100mM 인산 버퍼 pH8 에 녹여 (HA-HZ: 2％ w/v), 이미노티오란 (ITL) 을 첨가하여 (HZ/ITL = 1/2몰비), 실온에서 교반 하 2 ∼ 4시간 반응시켰다. 에탄올로 침전, 3 회 세정하여 건조시켰다. 또한, 얻어진 HA-SH 중의 SH 기 도입률을 프로톤 NMR 법으로 정량한 결과를 표 1 에 나타낸다. (HA 및 HA-SH 의 N-아세틸기 (1.9ppm, 3H), HA-SH 의 ITL 유래 부분의 메틸렌기 (2.1ppm 과 2.7ppm, 각 2H) 를 비교).
대조 뱃치 1 뱃치 2 뱃치 3
HZ기의 도입률 0％ 26％ 46％ 69％
SH기의 도입률 0％ 20％ 35％ 56％
[실시예 1-3] EPO 봉입 가교 히알루론산 미립자의 조제
실시예 1-2 의 뱃치 1 의, SH 기의 도입률이 20몰％ 인 HA-SH 200㎎ 과, 에리스로포이에틴 (EPO) 2㎎ 을 20mL 의 10mM 인산 버퍼 pH8 (PB) 에 녹였다 (실온, 1 시간 교반). 이것에, 4㎎ 의 Tween-20, SH 기에 대하여 1몰배의 테트라티온산 나트륨 (Sodium tetrathionate: STT) 22.3㎎ 을 첨가하였다. 이 용액을 이하의 조건에서 스프레이 드라이하여 미립자를 얻었다.
스프레이 드라이어: 뷰티사 제조, 미니 스프레이 드라이어 B-191
So1ution feed rate: 1.5mL/min (Tygon tube, Pump speed = 15％)
Feed solution concentration: 10㎎/mL
Atomizing air flow rate: 650L/hr
Drying air flow rate: 40kL/hr (Aspiration speed = 65％)
Inlet temperature: 85 ∼ 95℃
Outlet temperature: 50 ∼ 60℃
[실시예 2]
실시예 1-3 의 실험 조작에 있어서, 뱃치 2 의 SH 기의 도입률이 35몰％ 인 HA-SH 를 200㎎ 과, 테트라티온산 나트륨 (Sodium tetrathionate: STT) 39.0㎎ (SH 기에 대하여 1몰배) 을 사용한 것 이외에는 실시예 1-3 과 같은 방법으로 EPO 봉입 가교 히알루론산 미립자를 조제하였다.
[실시예 3]
실시예 1-3 의 실험 조작에 있어서, 뱃치 3 의 SH 기의 도입률이 56몰％ 인 HA-SH 를 200㎎ 과, 테트라티온산 나트륨 (Sodium tetrathionate: STT) 62.4㎎ (SH 기에 대하여 1몰배) 을 사용한 것 이외에는 실시예 1-3 과 같은 방법으로 EPO 봉입 가교 히알루론산 미립자를 조제하였다.
[실시예 4]
실시예 1-3 의 실험 조작에 있어서, 뱃치 3 의 SH 기의 도입률이 56몰％ 인 HA-SH 를 200㎎ 과, SH 기에 대하여 0.7몰배의 테트라티온산 나트륨 (Sodium tetrathionate: STT) 38.9㎎ 을 사용한 것 이외에는 실시예 1-3 과 같은 방법으로 EPO 봉입 가교 히알루론산 미립자를 조제하였다.
[실시예 5]
실시예 1-3 의 실험 조작에 있어서, 뱃치 3 의 SH 기의 도입률이 56몰％ 인 HA-SH 를 200㎎ 과, SH 기에 대하여 0.5몰배의 테트라티온산 나트륨 (Sodium tetrathionate: STT) 27.8㎎ 을 사용한 것 이외에는 실시예 1-3 과 같은 방법으로 EPO 봉입 가교 히알루론산 미립자를 조제하였다.
[실시예 6]
실시예 3 의 실험 조작에 있어서, 4㎎ 의 Tween-20 대신에, Tween-80 을 4㎎ 사용한 것 이외에는 실시예 3 과 같은 방법으로 EPO 봉입 가교 히알루론산 미립자를 조제하였다.
[실시예 7]
실시예 3 의 실험 조작에 있어서, Tween-20 을 첨가하지 않고서 실시한 것 이외에는 실시예 3 과 같은 방법으로 EPO 봉입 가교 히알루론산 미립자를 조제하였다.
[실시예 8]
실시예 3 의 실험 조작에 있어서, STT 를 첨가하지 않고서 실시한 것 이외에는 실시예 3 과 같은 방법으로 EPO 봉입 가교 히알루론산 미립자를 조제하였다.
[비교예 1]
실시예 1-2 에서 조제한 뱃치 3 의 SH 기의 도입률이 56몰％ 인 HA-SH 33㎎ 을 690㎕ 의 10mM 인산 버퍼 (pH8.0) 에 녹여, 30㎕ 의 EPO 수용액 (10㎎/mL) 을 첨가하여, 10분 교반하였다. 이것에, SH 기에 대하여 1몰배의 Sodium tetrathionate (STT) 9.3㎎ 을 30㎕ 의 10mM 인산 버퍼 pH8.0 에 녹인 용액을 첨가하여, 250㎕ 을 1mL 시린지에 채워 37℃ 에서 5시간 반응시킴으로써, 원주상의 HA 겔을 얻었다.
[비교예 2]
실시예 8 에서, HA-SH 가 아니라 HA 를 사용한 것 이외에는 실시예 8 과 같은 방법으로 EPO 봉입 HA 미립자를 조제하였다.
또한, 실시예 1 ∼ 8 및 비교예 2 에 있어서의 각 미립자의 회수율은 50％-65％ 였다.
[시험예 1] 입자 직경, 입자 함수율 측정
실시예 3 에 있어서 조제한 미립자의 현미경 사진을 도 1 에 나타낸다 (3000배). 이 미립자를 PBS 중에 분산시켰을 때의 현미경 사진을 도 2 에 나타낸다 (3000배). 당해 미립자의 건조시의 입자 직경은 약 1.2㎛ 이고, 수팽윤시의 입자 직경은 약 1.8㎛ 였다.
열중량 분석 (TGA) 을 실시하여, 실시예 3 에서 제조한 미립자의 함수율을 측정한 (도 3) 함수율은 약 15％ 였다.
[시험예 2] EPO 봉입 가교 히알루론산 미립자의 EPO 회수율 측정
실시예 1 ∼ 8, 비교예 2 의 미립자 5㎎ 을 0.5mL 의 PBS 에 분산시키고, Hyaluronidase SD (생화학 공업 제조: HAse) 0.25유닛을 첨가하고, 25℃ 에서 3시간, 효소 처리를 실시하여, 미립자를 완전히 분해시켰다. 또한, 비교예 1 의 겔 (0.25mL 겔) 에 Hyaluronidase SD (생화학 공업 제조) 0.5 유닛을 함유하는 PBS pH7.4 를 0.75mL 첨가하고, 25℃ 에서 1일, 효소 처리를 실시하여 겔을 완전히 분해시켰다. 효소처리 후의 용액 0.15mL 을 시료 용액으로 하였다. 시료 용액은, 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC) 측정을 실시하고, 0.1㎎/mL 의 EPO 수용액을 표준 용액으로 하여, 표준 용액과 시료 용액의 피크에어리어비로부터 시료 용액 중 EPO 농도를 산출하였다. 첨가한 EPO 량 (0.1㎎/겔 1개) 에 대하여 RP-HPLC 에서 구한 EPO 량을 회수율로서 산출하였다.
역상 칼럼에 의한 고속 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 분석은, Waters600S 컨트롤러, 717 plus 오토 샘플러, 486 적외 광흡수 측정기 (Waters 사 제조) 를 사용하여, 이하의 측정 조건에서 실시하였다.
칼럼: C4 (입자 직경 5㎛, 사이즈 4.6×250㎜)
이동상:
A: 물/아세토니트릴/트리플루오로아세트산 = 400/100/1
B: 물/아세토니트릴/트리플루오로아세트산 = 100/400/1
유속: 1mL/분, 이동상 A/B = 65/35 ∼ 0/100 의 그라디언트 용출
칼럼 온도: 실온 부근
샘플온도: 4℃
검출 파장: UV 280nm
해석 소프트: Millenium 32ver.3.21
상기 방법으로 측정된 EPO 를 준비에 대한 회수율은 이하와 같았다.
실시예 1 ∼ 4: 90％-95％
실시예 5 및 6: 80％-85％
실시예 7 및 8: 75％-80％
비교예 1 및 2: 90％-95％
이상의 결과로부터, STT 계면 활성제를 첨가함으로써 회수율이 개선되는 것이 확인되었다.
[시험예 3] EPO 봉입 HA 히드로겔 조제로부터의 EPO 서방
실시예 3 의 마이크로하이드로겔 20㎎ 과 비교예 1 의 벌크 겔 (250㎕) 을 2mL 의 PBS 중, 37℃ 에서 인큐베이트하여, 경시적으로 200㎕ 샘플링하였다. RP-HPLC 에서 버퍼 중에 방출된 EPO 를 정량하였다.
겔 조제 직후에 히알루로니다아제로 분해, 회수된 EPO 를 100％ 로 하였을 때의 겔로부터의 EPO 방출성을 도 1 에 나타낸다. 한편, 9 일 뒤에 히알루로니다아제 (HAse) 를 첨가하였다.
겔 내의 EPO 는 변성하지 않고, 비교예 1 의 겔은, 가교 밀도가 낮기 때문에 EPO 의 방출이 빠르고, 실시예 3 의 마이크로겔은 가교 밀도가 높기 때문에, 30％ 정도가 5일 정도로 서방되며, 40％ 의 EPO 가 확산에서는 방출되지 않고 효소 분해에 의해서 비로소 방출되는 것을 알 수 있다.
상기 실시예에 예시된 약물을 히알루론산 가교체 내에 봉입한 약물 담지 미립자를 사용함으로써, 단백질 또는 펩티드 등의 약물의 생물 활성을 유지한 상태에서 이들을 in situ 가교, 건조시켜, 겔 미립자의 속에 봉입한 단백질 또는 펩티드 등을 장기간 방출하는 주사 가능한 약물 서방 제제를 조제하는 것이 가능하다
[실시예 9]
[실시예 9-1] 히드라지드기 (HZ) 가 도입된 히알루론산 유도체 HA-HZ 의 합성 (혼합 용매법)
Figure 112006033214755-pct00006
분자량 2×105돌턴의 HA (전기 화학 공업 주식회사 제조) 76.0㎎ 을, 0.1％ 농도로 증류수/EtOH = 50/50 에 용해하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7 ∼ 4.8 로 조정하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 와 아디프산디히드라지드 (ADH) 를, HA 의 유닛 (1 유닛 = 반복 단위인 N-아세틸글루코사민-글루크론산):EDC:ADH = 1:4:40몰비가 되도록 첨가하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7 ∼ 4.8 로 유지하면서 실온에서 2 시간 반응시켰다. 대과잉량의 100mM 염화나트륨 용액, 25％ 에탄올 용액, 증류수에 대하여 순서대로 투석 (스펙트라포아 7, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14k돌턴) 하고, 동결 건조시켜 표제의 히드라지드기 (HZ 기) 가 도입된 히알루론산 (HA-HZ) 57.0㎎ 을 얻었다. 얻어진 HA-HZ 중의 HZ 기 도입률을 ADH 도입률로서 프로톤 NMR 법으로 정량하였다. (HA: N-아세틸기 (1.85ppm), HZ: ADH 유래의 4개의 메틸렌 (1.5, 2.1 및 2.25ppm) 을 비교). HZ 도입률은 47％ 였다.
[실시예 9-2] 메르캅토기 (SH) 가 도입된 히알루론산 유도체 HA-HZ-SH 의 합성
Figure 112006033214755-pct00007
실시예 9-1 과 같은 방법으로 합성한 HA-HZ, 100㎎ 을 5mL 의 100mM 인산 버퍼 (pH8) 에 녹여 (HA-HZ: 2％w/v), 이미노티오란 (ITL) 을 첨가하여 (HZ/ITL = 1/2몰비), 실온에서 교반 하 2시간 반응시켰다. 에탄올로 침전, 3회 세정하여 건조시켰다. 얻어진 HA-HZ-SH 중의 SH 기 도입률을 프로톤 NMR 법으로 정량한 결과, SH 도입률은 37.5몰％ 였다. (HA 및 HA-HZ-SH 의 N-아세틸기 (1.9ppm, 3H), HA-HZ-SH 의 ITL 유래 부분의 메틸렌기 (2.1ppm 과 2.7ppm, 각 2H) 를 비교).
[실시예 10] 메타크릴로일기 (MA) 가 도입된 히알루론산 유도체 HA-HZ-MA 의 합성
Figure 112006033214755-pct00008
HA 의 분자량을 2×104돌턴으로 한 것 이외에는, 실시예 1-1 의 뱃치 3 과 같은 방법으로 합성된 HA-HZ (HA 의 카르복실산이 63％ HZ 화) 를 증류수에 용해한 후에, 1M 인산 완충액 (pH8.8) 을 첨가하고, HA 농도 50㎎ ? mL 의 0.1M 인산 완충액을 조제하였다. 메타크릴산 무수물을 HZ 의 20배 당량을 적하하여 첨가하여, 실온에서 교반 하 밤새 반응시켰다. 테트라히드로푸란으로 침전 후, 회수하여 건조시켰다. 침전물을 증류수에 용해하여, 다시 테트라히드로푸란으로 침전, 건조시킨 후, 건조물을 증류수에 용해하고, 동결 건조시켜 표제의 HA-HZ-MA 를 얻었다.
메타크릴로일기의 도입률은 프로톤 NMR 에 의해 산출하였다 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤 (1.8 ∼ 1.9ppm), MA: 메타크릴로일기의 CH2 = (5.5 ∼ 6.1ppm) 를 비교). MA 도입률은 22％ 였다.
[실시예 11]
[실시예 11-1] 아미노기 (AM) 가 도입된 히알루론산 유도체 HA-AM 의 합성
Figure 112006033214755-pct00009
분자량 2.0×105돌턴의 히알루론산나트륨 (HA) (전기 화학 공업 주식회사 제조) 을 테트라부틸암모늄하이드로옥사이드 (시그마알드리치사) 에 의해 테트라부틸암모늄 (TBA) 염화한 DOWEX 50WX8-400 (시그마알드리치사) 을 사용하여 TBA 염화를 실시하였다.
히알루론산테트라부틸암모늄염 (HA-TBA) 을 2.0㎎/mL 농도가 되도록 DMSO (와코순약 주식회사) 에 용해 후, HA 유닛/BOP (와코순약 주식회사)/에틸렌디아민 (EDA) (시그마알드리치사) = 1/2.5/50 (mol/mol/mol) 의 당량비로 EDA, BOP 의 순으로 첨가하여, 실온 하에서 밤새 반응시켰다. 그 후 1M 염화나트륨 수용액을 반응 용액의 1/2량 첨가한 후, 5N HCl 을 첨가하여 pH 를 3까지 저하시키고, 추가로 2N NaOH 에서 중화를 실시하였다. 대과잉량의 0.3M 염화나트륨 수용액, 증류수의 순으로 투석 정제하여 (스펙트라포아 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14k 돌턴), 한외 여과 후, 동결 건조시켜 표제의 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 을 얻었다.
아미노기의 도입률은 프로톤 NMR 에 의해 산출한 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤 (1.8 ∼ 1.9ppm), AM: 에틸렌디아민 부분의 메틸렌프로톤 (2.9 ∼ 3.1ppm) 을 비교). 도입률은 각각 88.5％ 였다.
[실시예 11-2] 메르캅토기 (SH) 가 도입된 히알루론산 유도체 HA-AM-SH 의 합성
Figure 112006033214755-pct00010
상기에서 얻어진 HA-AM 을 탄산 완충 용액 (pH9) 에 2㎎ ? mL 으로 용해시킨 후, 이미노티오란 (피아스사) 를 HA 유닛에 대하여 0.5, 또는 1배 등량 첨가하여, 45분간 실온에서 반응시켰다. 반응 후, 0.005N HCl 수용액에서 평형화한 PD-10 칼럼 (아무샴·바이오사이언스 주식회사) 으로 정제를 실시하였다. 그 후 동결 건조에 의해 용매를 제거한 후, 얻어진 폴리머를 과잉의 에탄올로 세정하고 감압 건조를 실시하여 HA-AM-SH 를 얻었다.
메르캅토기의 도입률은 환원제인 트리스(2-카르복시에틸포스핀)염산염 (TCEP) 을 함유한 상태에서의 프로톤 NMR 에 의해 산출한 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤 (1.8 ∼ 1.9ppm), SH: 메르캅토기의 이웃한 메틸렌프로톤 (2.4 ∼ 2.7ppm) 을 비교). 도입률은 각각 16.5％, 23.5％ 였다.
[실시예 11-3] 메타크릴로일기 (MA) 가 도입된 히알루론산 유도체 HA-AM-MA 의 합성
Figure 112006033214755-pct00011
상기에서 얻어진 HA-AM 을 인산 완충 용액 (pH7) 에 10㎎/mL 으로 용해시킨 후, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르복시디이미드 (EDC) 로 활성화한 메타크릴산을 HA 유닛에 대해 0.5, 1.0, 2.0 배 당량 첨가하고 2시간 실온에서 반응시켰다. 반응 후, 0.3M 염화 나트륨 수용액, 증류수의 순서로 투석 (스펙트라포아 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14k돌턴) 하고, 정제하였다. 그 후, 동결 건조를 실시하여 상기의 폴리머를 얻었다.
메타크릴로일기의 도입률은 프로톤 NMR 에 의해 산출한 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤 (1.8 ∼ 1.9ppm), MA: 메타크릴로일기의 CH2= (5.5 ∼ 6.1ppm) 을 비교). 도입률은 각각 14.8％, 31.9％, 68.9％ 였다.
[실시예 12] 미립자의 열처리 효과 (Swell 억제)
실시예 9-2 에서 합성한 SH 기의 도입률이 37.5몰％ 인 HA-HZ-SH 100㎎ 을 8.5mL 의 증류수에 용해하였다. 이것에, 100mM 인산 버퍼 pH7 (PB) 1mL 를 첨가하고, 또한, 5㎎ 의 Tween-80 을 용해하고, SH 기에 대하여 1/10몰배의 STT 2.3㎎ 을 첨가하였다. 이 용액을 실시예 1-3 과 동일한 조건 (Solution feed rate 0.5mL/min Aspiration speed = 100％) 에서 스프레이 드라이하여, 미립자를 얻었다. 이 미립자를 50℃ 항온조 (야마토 과학 제조 DN-42) 에서 큐어링하여 24시간 후, 72시간 후에 샘플링하였다.
[시험예 4]
실시예 12 에 있어서 샘플링한 각 시료의 입자의 수분량을 TGA 에 의해 계측하였다. 이 결과를 도 12 에 나타낸다. 또한, 현미경을 사용한 화상 해석에 의해, 각 시료의 30개의 입자를 랜덤으로 선택하여, 그 페레 직경을 계측하였다 (건조시의 입자 직경). 나아가, 샘플링한 입자에 Tween-80 (0.05％) 을 함유하는 PBS 용액을 첨가하여 팽윤시키고, 습윤시의 입자의 입자 직경을 동일하게 계측하였다. 이 결과를 도 13 에 나타낸다. 그 결과, 24시간의 인큐베이션에 의해 팽윤율이 억제되는 것이 확인되었다. 이것은, 50℃, 24시간의 인큐베이션에서 입자 내의 가교가 증가한 것에 의한 것으로 생각된다.
[실시예 13] HA-HZ-MA 가교 마이크로겔의 조제
실시예 10 에서 합성한 HA-HZ-MA 100㎎ 을 6mL 의 증류수에 용해하고, 이것에 DTT 를 11㎎, TEA 를 32.5㎕ 용해시킨 100mM 인산 버퍼 pH8.5 (PB) 를 1mL 첨가하고, 또한, 증류수 3mL 을 첨가하여 혼합하였다. 이 용액을 실시예 12 와 동일한 조건 (배기 온도 65℃) 에서 스프레이 드라이하여 미립자를 얻었다. 이 미립자를 50℃ 항온조 (야마토 화학 DN-42) 에서 약 72시간 큐어링하여, 입자를 얻었다.
[시험예 5]
실시예 13 에 의해 얻어진 입자를 프레파라트 상에 두고, 이것에 pH7 의 PBS 용액을 첨가하여 그 입자 상태를 현미경으로 관찰한 바, 입자는 PBS 용액에는 용해하지 않았다. 이 관찰 결과로부터, 실시예 13 에서 얻어진 미립자에 있어서의, 메르캅토기와 불포화 결합 사이의 부가 반응에 의한 가교의 형성이 확인되었다.
본 발명의 약물 서방 담체는, 단백질 또는 펩티드 등의 약물의 생물 활성을 유지한 상태에서 이들을 in situ 화학 가교, 건조, HA 겔 중에 봉입할 수 있고, 뛰어난 회수율로 단백질, 펩티드 등의 약물의 장기 서방을 가능하게 하는 주사 가능한 미립자를 제공한다.

Claims (22)

  1. 불포화 결합을 갖는 기를 도입한 히알루론산과 메르캅토기를 2 개 이상 갖는 화합물의 부가 반응, 또는 메르캅토기를 도입한 히알루론산과 불포화 결합을 갖는 기를 2 개 이상 갖는 화합물의 부가 반응에 의한 가교 히알루론산 미립자의 제조 방법으로서,
    a) 불포화 결합을 갖는 기 또는 메르캅토기를 도입한 히알루론산을 함유하는 희박 용액을 조제하는 공정; 및
    b) 당해 용액을 스프레이 드라이함으로써 당해 히알루론산의 가교 반응을 진행시키는 공정을 포함하고,
    상기 가교 반응이 메르캅토기와 불포화 결합 사이의 부가 반응에 의해 가교를 형성하는 반응이며, 상기 희박 용액이 0.1 % 내지 5 %(w/v)의 농도로 상기 히알루론산을 함유하고, 얻어지는 미립자의 평균 입자 직경이 0.01㎛ ∼ 150㎛ 인 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    얻어지는 미립자가 약물 담체인 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    얻어지는 미립자가 약물 서방 담체인 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    가교 반응 전의 희박 용액이 약물을 포함하고, 당해 약물이 가교 반응 후에 얻어지는 미립자 중에 담지되어 있는 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 불포화 결합을 갖는 기를 도입한 히알루론산과 메르캅토기를 2 개 이상 갖는 화합물의 부가 반응, 또는 메르캅토기를 도입한 히알루론산과 불포화 결합을 갖는 기를 2 개 이상 갖는 화합물의 부가 반응에 의한 가교 히알루론산 미립자로서,
    a) 불포화 결합을 갖는 기 또는 메르캅토기를 도입한 히알루론산을 함유하는 희박 용액을 조제하는 공정; 및
    b) 당해 용액을 스프레이 드라이함으로써 당해 히알루론산의 가교 반응을 진행시키는 공정을 포함하는 제조 방법에 의해 조제할 수 있고,
    상기 가교 반응이 메르캅토기와 불포화 결합 사이의 부가 반응에 의해 가교를 형성하는 반응이며, 상기 희박 용액이 0.1 % 내지 5 %(w/v)의 농도로 상기 히알루론산을 함유하고, 평균 입자 직경이 0.01㎛ ∼ 150㎛ 인 가교 히알루론산 미립자.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 12 항에 있어서,
    약물 담체인 미립자.
  17. 제 12 항에 있어서,
    약물 서방 담체인 미립자.
  18. 제 12 항에 있어서,
    가교 반응 전의 희박 용액이 약물을 함유하고, 당해 약물이 가교 반응 후에 얻어지는 미립자 중에 담지되어 있는 미립자.
  19. 삭제
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