KR101343757B1

KR101343757B1 - 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법

Info

Publication number: KR101343757B1
Application number: KR1020077007971A
Authority: KR
Inventors: 겐지 야스기; 데루오 나카무라; 츠요시 시모보지; 미카 사토
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2004-09-07
Filing date: 2007-04-06
Publication date: 2013-12-19
Also published as: US9394379B2; EP1790665A1; KR20070105302A; JP5060131B2; US8143391B2; EP1790665A4; EP1790665B1; US20140011991A1; US20090148534A1; WO2006028110A1; JPWO2006028110A1; TW200612991A; US20120183567A1

Abstract

약물 담체로서 실용적인 수용성 HA 수식물, 및 그 제조 방법을 제공한다.

본 발명은, 비프로톤성 극성 용매 중에서, BOP 계 축합제를 사용하고, 히알루론산 또는 그 유도체의 글루쿠론산의 카르복시기에 아미드 결합에 의해 치환기를 하한이 5몰% 이상으로 도입함으로써 제조되는, 실용적인 레벨까지 그 혈중 체류 시간이 연장된 수용성 히알루론산 수식물, 및 그 제조 방법을 제공한다.

또한, 그 히알루론산 수식물을 가교함으로써, 종래 알려져 있는 겔과 비교하여, 동일한 가교성 관능기 도입률이라도 매우 장기간의 약물 서방이 가능해지는 히알루론산 겔을 제공한다.

Description

수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING WATER-SOLUBLE HYALURONIC ACID MODIFICATION}

본 발명은, 약물 담체로서 유용한 수용성 히알루론산 수식물, 그 히알루론산 수식(修飾)물의 제조 방법, 그 히알루론산 수식물과 약물의 콘쥬게이트, 및 그 히알루론산 수식물로부터 얻어지는 겔에 관한 것이다.

일반적으로 저분자 약물, 펩티드 약물, 단백질 약물 등의 혈중 체류성의 향상, 안정성의 향상, 용해성의 향상, 항원성의 저감 등을 목적으로 하여 약물과 수용성 폴리머의 콘쥬게이션이 시도되고 있다. 특히, 폴리에틸렌글리콜 (이하, 「PEG」라고도 한다) 은, 그 불활성인 성질과 생체내에서의 단백질에 의한 약물의 흡착을 방지하는 효과를 갖는 점에서 널리 사용되고 있으며, PEG 콘쥬게이트화 단백질은 의약품으로서 이미 실용화 단계에 진입해 있다. 그러나, PEG 는 생분해성 폴리머가 아니기 때문에, 장기 투여에 의해 체내에 축적된 경우의 안전성 등의 문제는 불분명하다. 또한, 최근 PEG 콘쥬게이트화 리포솜에 있어서 투여 2회째의 클리어런스가 매우 빠른 현상 (Accerelated Blood Clearance 현상, 이하 「ABC 현상」이라고도 한다) 이 보고되어 있어 (비특허 문헌 1 및 2 를 참조), PEG 콘쥬게이트화 의약품의 안전성, 유효성이 충분히 확립되었다고는 말하기 어렵다.

히알루론산 (이하, 「HA」라고도 한다) 은, 1934년, K. Meyer 에 의해 소의 눈의 유리체로부터 단리된 다당으로, 세포외 매트릭스의 주성분으로서 오래전부터 알려져 있다. HA 는, D-글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민이 β(1→3) 글리코시드 결합에 의해 연결된 2당 단위로 이루어지는 글루코사미노글리칸의 1 종이다. 히알루론산은 그 화학적 및 물리적 구조에 종의 차이가 없고, 인간에 있어서도 히알루론산의 대사계가 존재한다. 또한 면역성 또는 독성의 면에 관해서도 매우 안전한 생체 재료 (Biomaterial) 라고 할 수 있다. 최근, 세포의 접착, 증식, 이동의 유도에 관한 히알루론산의 생리 활성 물질로서의 측면이 주목받고 있다. 또한, 미생물에 의한 고분자량 히알루론산의 대량 생산이 가능해져, 관절 질환 치료약 등의 의약으로서 실용화되어 있고, 화장품 등의 분야에서도 실용화가 진행되고 있다. 그리고, 약물을 히알루론산과 콘쥬게이트함으로써, 약물의 암조직에 대한 타겟팅 (특허 문헌 1 을 참조), 간장에 대한 타겟팅 (특허 문헌 2 를 참조), 항원성의 저감 (특허 문헌 3 을 참조), 혈중 체류 시간의 연장 (특허 문헌 4, 5 및 6 을 참조) 등을 달성할 수 있다는 것이 보고되어 있다.

범용되고 있는 PEG 와 비교하여 약물의 콘쥬게이트 담체로서 히알루론산을 사용할 때의 이점은, 생분해성을 갖는 점, 거대 사이즈화가 가능한 점, 나아가, 1 분자 중에 많은 반응점을 가지기 때문에, 복수의 약물 (동일 약물을 복수, 또는 2 종류 이상의 약물) 을 1 분자 중에 담지할 수 있다는 점이다. 이러한 이점을 갖는 히알루론산을 약물 콘쥬게이트 담체로서 사용하는 것은, 타겟팅, 서방 등, 보다 고도한 약물 동태 제어 기능을 갖는 콘쥬게이트를 설계 개발하는 수단이 된다. 또한, 히알루론산은 생분해성일 뿐만 아니라, 그 화학적 구조에 종차가 없다는 점에서, 안전성이라는 면에서도 PEG 보다 우수한 담체라고 할 수 있다.

그러나, 히알루론산 자체의 혈중 체류 시간이 짧아, 정맥내 주사 (이하, 「iv」라고도 한다) 에서 반감기가 2 분간인 것으로 보고되어 있다 (비특허 문헌 3 을 참조). 본 발명자의 검토에 있어서도, 단지 단순히 히알루론산을 약물에 콘쥬게이트한 것 만으로는, 약물의 혈중 체류 시간의 큰 연장이나, 약효의 지속성 향상은 확인되지 않았다. 히알루론산의 주대사 부위는 간장 및 림프선이고, 그 대사는, 주로 CD44, RHAMM, HARE 등의 히알루론산에 특이적으로 결합하는 세포막 국재 수용체를 통한 세포내로의 도입과 거기에 이어지는 히알루로니다아제에 의한 분해에 의한 것이다. 이들 분자는 함께, 히알루론산의 연속된 유리(遊離) 카르복시기 (6당) 를 주된 인식 부위로 하고 있음이 보고되어 있다 (비특허 문헌 4 을 참조).

따라서, 혈중 체류 시간이 짧다는 히알루론산의 문제를 극복하기 위해, 히알루론산에 치환기를 도입한 히알루론산 수식물을 약물 담체로서 이용하는 시도도 있다 (특허 문헌 4, 5 및 6 을 참조). 일반적으로, 히알루론산에 치환기를 도입하면 그 혈중 체류 시간은 연장되고, 그 정도는 치환기의 도입률과 상관이 있는 것으로 생각된다. 히알루론산의 여러 위치에 치환기가 도입된 히알루론산 수식물이 보고되어 있다. 그 중에서도 히알루론산에 있어서의 글루쿠론산 부분의 카르복시기에 가수분해되기 힘든 아미드 결합을 통하여 치환기를 도입하는 것이, 얻어지는 히알루론산 수식물과 히알루론산 수용체와의 결합 저해에 있어서 효과적이고, 당해 히알루론산 수식물은 혈중 체류 시간의 면에서 우수한 것으로 생각된다.

한편, 히알루론산을 테트라부틸암모늄염으로 하여 디메틸술폭사이드 중에서 치환기와 반응시킴으로써 히알루론산의 카르복시기를 아미드화한 히알루론산 수식물 (특허 문헌 7 을 참조) 도 보고되어 있지만, 이 발명은 가교체 조제를 목적으로 한 것이지, 혈중 체류성 연장을 목표로 한 것이 아니다. 추가로 말하자면, 이 발명에 있어서는 축합제로서 1,1-카르보닐디이미다졸 (이하, 「CDI」라고도 한다) 을 사용하고 있다. 본 발명자들의 검토에서는, 축합제로서 CDI 를 사용하더라도 혈중 체류성이 충분히 연장된 (히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 충분한 내성을 갖는) 히알루론산 유도체를 얻기란 불가능하고, 나아가, 반응 중에 히알루론산 분자량이 크게 저하되는 것이 확인되었다.

이것 이외에도, 물과 극성 유기용매의 혼합 용매 중에서, 히알루론산의 카르복시기에 치환기를 도입한 예도 보고되어 있다 (특허 문헌 8 을 참조). 그러나, 얻어진 히알루론산 수식물에 관해서, 혈중 체류 시간의 연장이 관찰되는지 여부에 대해서는 일체 언급하고 있지 않다.

이와 같이, 약물 담체로서 실용적인 수용성 히알루론산 수식물, 특히 혈중 체류 시간을 실용적인 레벨까지 연장시킨 수용성 히알루론산 수식물은 알려져 있지 않고, 그 제조 방법도 알려져 있지 않았다.

최근 실용화되어 있는 약효를 갖는 단백질, 펩티드의 제제 약물은 일반적으로 혈중 반감기가 짧고, 또한 그 대부분이 빈회 (頻回) 투여의 주사제이기 때문에, 약제 투여에 있어서의 환자의 부담이 과대해져 있어, 가능한 한 소량으로 약효를 발휘시키고 또한 투여 횟수도 적게 할 수 있는, 단백질 또는 펩티드 약제의 실용적인 서방형 제제가 요망되고 있다. 또한, 저분자 화합물로 이루어지는 약물도 그 혈중 반감기가 짧기 때문에 지속 제제에 대한 요구가 높다.

예를 들어, 폴리락트산-글리콜산 공중합체 (이하, 「PLGA」라고도 한다) 등의 생분해성 고분자를 기재로 한 서방 제제가 시도되고 있지만, 기재의 소수성, 건조 공정, pH 의 저하에 기인하는 단백질의 변성, 응집이 보고되어 있다 (비특허 문헌 5 및 6 을 참조). 친수성의 하이드로겔을 기재에 사용한 서방 제제도 보고되어 있지만 역시 실용화에는 이르지 못하여, 단백질 또는 펩티드의 봉입률, 회수율 및 안전성의 모든 면에 있어서 실용화 레벨에 도달해 있는 서방형 제제는 현시점에서 실현되어 있지 않다.

비항원성, 비변이원성, 무독성, 생분해성을 겸비하고, 안전성 면에서 바람직한 것으로 생각되는 HA 를 서방 기재에 사용한 가교 방법, HA 겔로부터의 단백질이나 펩티드 약물의 서방도 다수 보고되어 있다. HA 를 화학 가교에 의해 겔화시키는 방법으로는, 카르보디이미드법 (특허 문헌 9 참조), 디비닐술폰법 (특허 문헌 10 참조), 글리시딜에테르법 (특허 문헌 11 참조) 등이 알려져 있다. 일반적으로, 겔 중에 단백질 또는 펩티드를 봉입할 때, 가교후에 단백질 또는 펩티드를 도입하는 방법에서는, HA 와 단백질 또는 펩티드와의 상용성, 정전 반발 등의 문제로 인해 그 도입률은 낮다. 한편으로 단백질 또는 펩티드 존재 하에서, in situ 가교를 실시하면, 높은 봉입률로 단백질 또는 펩티드가 담지되어지는 이점이 있다. 이러한 in situ 가교에 의해 HA 겔 중에 단백질 또는 펩티드를 봉입하고, 서방 시키는 제제에 관한 보고가 이루어져 있다 (예를 들어, 특허 문헌 12 참조). 그러나, 이러한 방법을 사용하여 단백질 또는 펩티드 존재 하에서 HA 를 in situ 가교하면, 회수율 면에서 문제가 있다. 예를 들어, 히드라지드기 (이하,「HZ」라고도 한다) 를 도입한 HA 유도체 (이하, 「HA-HZ」라고도 한다) 를 N-히드록시숙신이미드 (이하, 「NHS」라고도 한다) 에스테르로 이루어지는 가교제로 가교하는 방법 (특허 문헌 13 참조) 이 보고되어 있는데, 생리 조건 하에서의 in situ 가교를 목적으로 하고 있기 때문에, pH 7.4∼8.5 에서 가교 형성 반응을 실시하고 있지만, 본 발명자들에 의한 검토에서는, 이 방법에 의해 얻어지는 HA 겔로부터의 단백질 또는 펩티드의 회수율은 낮다. 그 원인은, 가교 반응 중에 단백질 또는 펩티드의 일부 (주로 아미노기) 가 가교제와 반응하여, 단백질이 가교되는 점에 있다. 또한 겔 중에 잔존하는 변성된 단백질 또는 펩티드는 생물 활성이 저하되어 있어, 오히려 항원성 발현의 원인이 되는 등의 문제가 있다. 봉입한 약물이 고회수율로 방출되는 것은 의약품으로서 필수적인 조건으로, 단백질 또는 펩티드를 반응시키지 않고서 HA 를 화학 가교, 겔화시키는 방법은 알려져 있지 않다. 또한, 고회수율로 단백질 펩티드를 봉입하는 방법으로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 을 기재에 불포화 관능기를 구핵 부가 반응에 의해 가교하는 보고도 있지만 (특허 문헌 14 참조), 생분해성이 아닌 PEG 단편이 잔존하는 문제가 있다. 또한, 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질, 펩티드와의 반응성을 최대한 억제한 히알루론산 겔도 보고되어 있지만 (특허 문헌 15 참조), 서방 기간은 1주 정도에 그치고 있다.

또, 이러한 약물 서방성 물질을 주사 가능한 제제로 하기 위해서는, 이것을 미립자화할 필요가 있다. 이러한 검토에 스프레이 드라이어가 널리 사용되고 있으며, 인슐린 (비특허 문헌 7, 비특허 문헌 8 참조), rh 항 IgE 항체 (비특허 문헌 9 참조) 을 미립자화한 것, 히알루론산의 미립자 중에 약물을 봉입한 것 (특허 문헌 16, 특허 문헌 17 참조) 은 보고되어 있지만, 모두 단시간에 피하에서 용해되어 버리기 때문에 약물 서방 기간은 매우 짧아, 서방 목적으로서의 실용성은 낮다. 또한, 스프레이 드라이 중에 키토산의 가교 반응을 실시하여 저분자 약물을 봉입하는 보고 (비특허 문헌 10 참조) 도 되어 있지만, 방출 기간이 수 분으로 짧고, 가교제에 사용되는 알데히드가 아미노기 등의 관능기와 높은 반응성을 갖기 때문에, 단백질, 펩티드, 그 밖의 아미노기 등의 관능기를 갖는 저분자 약물에는 사용할 수 없다.

이와 같이, 수용성 히알루론산 수식물을 기재로 한 실용적인 서방형 제제는 알려져 있지 않고, 그 제조 방법도 알려져 있지 않았다.

특허 문헌 1: 국제공개 WO92/06714호 팜플렛

특허 문헌 2: 일본 공개특허공보 2001-81103호

특허 문헌 3: 일본 공개특허공보 평2-273176호

특허 문헌 4: 일본 공개특허공보 평5-85942호

특허 문헌 5: 국제공개 WO01/05434호 팜플렛

특허 문헌 6: 국제공개 WO01/60412호 팜플렛

특허 문헌 7: 일본 공표특허공보 2002-519481호

특허 문헌 8: 국제공개 WO94/19376호 팜플렛

특허 문헌 9: 국제공개 제94/02517호 팜플렛

특허 문헌 10: 일본 공개특허공보 소61-138601호

특허 문헌 11: 일본 공개특허공보 평5-140201호

특허 문헌 12: 미국 특허 제5827937호 명세서

특허 문헌 13: 국제공개 95/15168호 팜플렛

특허 문헌 14: 국제공개 제00/44808호 팜플렛

특허 문헌 15: 국제공개 제04/046200호 팜플렛

특허 문헌 16: 일본 특허 제3445283호

특허 문헌 17: 국제공개 WO96/18647호 팜플렛

비특허 문헌 1: Int. J. Pharm. 제255권, 167-174페이지, 2003년

비특허 문헌 2: J. Control. Rel. 제88권, 35-42페이지, 2003년

비특허 문헌 3: J. Inter. Med. 제242권, 27-33페이지, 1997년

비특허 문헌 4: Exp. Cell Res. 제228권, 216-228페이지, 1996년

비특허 문헌 5: J. Pharm. Sci. 제88권, 166-173페이지, 1999년

비특허 문헌 6: J. Microencapsulation 제15권, 699-713페이지, 1998년

비특허 문헌 7: Int. J. Pharm. 제233권, 227-237페이지, 2002년

비특허 문헌 8: J. Control. Rel. 제91권, 385-394페이지, 2003년

비특허 문헌 9: Biotech. and Bioeng. 제60권, 301-309페이지, 1998년

비특허 문헌 10: Int. J. Pharm. 제187권, 53-65페이지, 1999년

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

발명이 해결하고자 하는 과제는, 약물 담체로서 실용적인 수용성 히알루론산 수식물, 그 히알루론산 수식물의 제조 방법, 그 히알루론산 수식물과 약물의 콘쥬게이트, 및 그 히알루론산 수식물로부터 얻어지는, 단백질, 펩티드, 핵산 또는 저분자 화합물, 또는 그들과 고분자의 콘쥬게이트를 봉입하여, 장기간 서방할 수 있는 안전성이 높은 히알루론산 겔을 제공하는 것에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

히알루론산 수식물을 합성할 때에 있어서, 일반적으로 히알루론산 수식물의 합성에서 범용되고 있는 방법에 따라서, 수중에서의 탈수 축합 반응에 의해 히알루론산에 치환기를 도입한 경우, 히알루론산의 카르복시기의 수식률은 가장 크게 해도 약 70몰% 정도일 뿐만 아니라, 이 히알루론산의 카르복시기를 최대한 수식한 히알루론산 수식물이라도 실용적인 약물 담체로서는 불충분한 것이었다. 예를 들어, 약물 담체로서는 큰 분자량을 갖는 히알루론산 (분자량 58만 달톤(Da)) 을 사용하고, 그 카르복시기의 73몰% 를 수식한 히알루론산 수식물이라도, 래트에 있어서의 평균 혈중 체류 시간 (MRT) 은 16시간 정도밖에 되지 않아, 실용적인 약물 담체로서는 불충분하였다 (본원 명세서 비교예 5-1).

본 발명자는, 이러한 문제점을 해결하기 위해 예의 연구를 진행시킨 결과, 비프로톤성 극성 용매 중에서, 특정한 축합제를 사용하여 히알루론산 또는 그 유도체의 글루쿠론산의 카르복시기에 치환기를 아미드 결합에 의해 도입함으로써 얻어진 수용성 히알루론산 수식물이, 종래의 수용성 히알루론산 수식물에서는 얻어지지 않는 실용적인 레벨까지 그 혈중 체류 시간을 연장시킬 수 있음을 알아내고, 또한, 얻어진 히알루론산 수식물을 가교한 히알루론산 겔이 종래 알려져 있는 방법으로 가교한 겔과 비교하여, 동일한 가교성 관능기 도입률이라도 매우 긴 서방 기능을 나타냄을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.

본 발명의 하나의 측면에 의하면, 비프로톤성 극성 용매 중에서, 식 (Ⅱ):

[화학식 1]

[식 중, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴ 및 R¹⁵ 는, 각각 독립적으로 C₁ _-6 알킬기에서 선택되고, 또는 R¹⁰ 및 R¹¹, R¹² 및 R¹³, 그리고 R¹⁴ 및 R¹⁵ 는, 각각 독립적으로 그들이 결합하는 질소 원자와 함께 질소 함유 헤테로고리를 형성해도 되고, 고리 B 는 치환되어 있어도 되는 단환식 또는 축환식의 질소 함유 헤테로고리기이고, X^－ 는 음이온을 나타낸다]

로 표시되는 축합제를 사용하고, 히알루론산 또는 그 유도체의 글루쿠론산 부분에 함유되는 카르복시기를, 5몰% 이상의 수식률로 치환 아미드기로 변환하는 공정을 포함하는 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법이 제공된다.

당해 측면의 하나의 양태에 있어서, 카르복시기의 변환에 의해 생기는 치환 아미드기의 치환기는, 적어도 1 이상의 관능기를 함유한다. 여기서, 상기 치환기에 관능기가 복수 존재하는 경우, 당해 관능기는 동일 종류여도 되고 상이한 종류여도 된다. 또, 상기 히알루론산 수식물에 함유되는 치환 아미드기는 모두가 동일한 종류여도 되고, 또한 상이한 종류의 치환 아미드기가 상기 히알루론산 수식물에 함유되어 있어도 된다.

치환 아미드기에 함유되는 당해 관능기는, 예를 들어, 치환되어 있어도 되는 아미노기, 수산기, 메르캅토기, 카르복시기, 알데히드기, 메타크릴로일기, 및 아크릴로일기여도 되고, 바람직하게는, 치환되어 있어도 되는 아미노기, 수산기, 메르캅토기, 메타크릴로일기 및 아크릴로일기이다. 여기서, 당해 관능기의 종류는, 바람직하게는 1 또는 2 종류이고, 2 종류인 경우에는 그 중의 1 종류가 수산기인 것이 바람직하다. 치환 아미드기 1개 당 당해 관능기의 총수는, 예를 들어 1∼10개, 바람직하게는 1∼9개, 더욱 바람직하게는 1∼4개이다. 치환 아미드기 1개 당 당해 관능기의 총수가 2개 이상인 경우, 그 중 1개의 관능기가 수산기 이외의 것이고, 그 나머지 관능기는 모두 수산기이거나, 모든 관능기가 수산기인 것이 바람직하다. 당해 치환 아미드기의 치환기는, 예를 들어, 아미노알킬기 (이 아미노알킬기의 알킬렌 사슬은 1개 이상, 예를 들어 1∼9개, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 수산기로 치환되어 있어도 된다. 이하의 모든 「아미노알킬기」에 관해서 이 기재 내용이 부가된다.), 아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기, 아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기, 히드록시알킬기 (이 히드록시알킬기의 알킬렌 사슬은 1개 이상, 예를 들어 1∼9개, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 수산기로 치환되어 있어도 된다. 이하 모든 「히드록시알킬기」에 관해서 이 기재 내용이 부가된다.), 히드록시(폴리알킬렌옥시)알킬기, 히드록시(폴리알킬렌아미노)알킬기, 메르캅토알킬기, 메르캅토(폴리알킬렌옥시)알킬기, 메르캅토(폴리알킬렌아미노)알킬기, 메타크릴로일옥시알킬기, 메타크릴로일아미노알킬기, 메타크릴로일아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기, 메타크릴로일아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기, 메타크릴로일옥시(폴리알킬렌옥시)알킬기, 메타크릴로일옥시(폴리알킬렌아미노)알킬기, 아크릴로일옥시알킬기, 아크릴로일아미노알킬기, 아크릴로일아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기, 아크릴로일아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기, 아크릴로일옥시(폴리알킬렌옥시)알킬기 또는 아크릴로일옥시(폴리알킬렌아미노)알킬기여도 된다.

보다 구체적으로는, 아미노 C₂ _-10 알킬기 (이 아미노 C₂ _-10 알킬기의 알킬렌 사슬은 1개 이상, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 수산기로 치환되어 있어도 된다), 아미노(폴리 C₂ _-10 알킬렌옥시)알킬기, 아미노(폴리 C₂ _-10 알킬렌아미노)알킬기, 히드록시 C₂ _-10 알킬기 (이 히드록시 C₂ _-10 알킬기의 알킬렌 사슬은 1개 이상, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 수산기로 치환되어 있어도 된다), 히드록시(폴리 C₂ _-10 알킬렌옥시)알킬기, 히드록시(폴리 C_2-10 알킬렌아미노)알킬기, 메르캅토 C₂ _-10 알킬기, 메르캅토(폴리 C₂ _-10 알킬렌옥시)알킬기, 메르캅토(폴리 C_2-10알킬렌아미노)알킬기, 메타크릴로일옥시 C₂ _-6 알킬기, 메타크릴로일아미노 C₂ _-6 알킬기, 메타크릴로일아미노(폴리 C₂ _-10 알킬렌옥시)알킬기, 메타크릴로일아미노(폴리 C₂ _-10 알킬렌아미노)알킬기, 메타크릴로일옥시(폴리 C_2-10 알킬렌옥시)알킬기, 메타크릴로일옥시(폴리 C₂ _-10 알킬렌아미노)알킬기, 아크릴로일옥시 C₂ _-6 알킬기, 아크릴로일아미노 C₂ _-6 알킬기, 아크릴로일아미노(폴리 C_2-10 알킬렌옥시)알킬기, 아크릴로일아미노(폴리 C₂ _-10 알킬렌아미노)알킬기, 아크릴로일옥시(폴리 C₂ _-10 알킬렌옥시)알킬기 또는 아크릴로일옥시(폴리 C_2-10 알킬렌아미노)알킬기여도 된다.

여기서, 카르복시기의 변환에 의해 생기는 치환 아미드기의 종류는, 단일 종류여도 되고 복수여도 된다. 복수의 종류란 2∼4종류, 바람직하게는 2 또는 3종류, 더욱 바람직하게는 2 종류를 의미한다. 카르복시기의 변환에 의해 생기는 복수 종류의 치환 아미드기를 갖는 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법으로는, 미리 아미노기를 갖는 화합물을 복수 혼합해 두고, 이 혼합물과 히알루론산 및 그 유도체의 글루쿠론산 부분에 함유되는 카르복시기를 축합시키는 방법을 들 수 있다. 또는, 히알루론산 및 그 유도체의 글루쿠론산 부분에 함유되는 카르복시기가 모두 반응하지 않을 정도의 양, 예를 들어 5∼95몰% 의 제 1 아미노기를 갖는 화합물을 축합시키고, 이어서, 잔존하는 카르복시기에 대하여 제 2 아미노기를 갖는 화합물을 축합시키고, 이후 필요한 횟수의 동일 조작을 반복해도 된다. 카르복시기의 변환에 의해 생기는 치환 아미드기의 종류가 복수인 경우에는, 각각의 치환 아미드기로의 변환시의 수식률을 합산하여 히알루론산 및 그 유도체의 글루쿠론산 부분에 함유되는 카르복시기의 수식률로 한다. 복수의 치환 아미드기의 조합의 구체예로는, 치환되어 있어도 되는 아미노기로 치환된 아미드기와 수산기로 치환된 아미드기; 치환되어 있어도 되는 아미노기로 치환된 아미드기와 메르캅토기로 치환된 아미드기; 치환되어 있어도 되는 아미노기로 치환된 아미드기와 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 치환된 아미드기; 수산기로 치환된 아미드기와 메르캅토기로 치환된 아미드기; 수산기로 치환된 아미드기와 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 치환된 아미드기: 메르캅토기로 치환된 아미드기와 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 치환된 아미드기; 치환되어 있어도 되는 아미노기로 치환된 아미드기와 수산기로 치환된 아미드기와 메르캅토기로 치환된 아미드기; 치환되어 있어도 되는 아미노기로 치환된 아미드기와 수산기로 치환된 아미드기와 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 치환된 아미드기; 치환되어 있어도 되는 아미노기로 치환된 아미드기와 메르캅토기로 치환된 아미드기와 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 치환된 아미드기; 수산기로 치환된 아미드기와 메르캅토기로 치환된 아미드기와 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 치환된 아미드기; 치환되어 있어도 되는 아미노기로 치환된 아미드기와 수산기로 치환된 아미드기와 메르캅토기로 치환된 아미드기와 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 치환된 아미드기의 조합을 들 수 있지만, 치환되어 있어도 되는 아미노기로 치환된 아미드기와 수산기로 치환된 아미드기, 수산기로 치환된 아미드기와 메르캅토기로 치환된 아미드기 및 수산기로 치환된 아미드기와 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기로 치환된 아미드기의 조합이 바람직하고, 치환되어 있어도 되는 아미노기로 치환된 아미드기와 수산기로 치환된 아미드기의 조합이 더욱 바람직하다.

보다 구체적으로는, 이하의 i)∼iv) 의 4개의 군에 관해서, i) 와 ii), i) 와 iii), i) 와 iv), ii) 와 iii), ii) 와 iv), iii) 와 iv); i) 와 ii) 와 iii), i) 와 ii) 와 iv), i) 와 iii) 와 iv), ii) 와 iii) 와 iv); i) 와 ii) 와 iii) 와 iv) 의 조합을 제작하고, 각각의 군으로부터 임의의 1개의 기를 선택함으로써 형성되는 조합을 들 수 있다:

i) 아미노알킬기로 치환된 아미드기, 아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기로 치환된 아미드기 및 아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기로 치환된 아미드기;

ii) 히드록시알킬기로 치환된 아미드기, 히드록시(폴리알킬렌옥시)알킬기로 치환된 아미드기 및 히드록시(폴리알킬렌아미노)알킬기로 치환된 아미드기;

iii) 메르캅토알킬기로 치환된 아미드기, 메르캅토(폴리알킬렌옥시)알킬기로 치환된 아미드기 및 메르캅토(폴리알킬렌아미노)알킬기로 치환된 아미드기; 및

iv) 메타크릴로일옥시알킬기로 치환된 아미드기, 메타크릴로일아미노알킬기로 치환된 아미드기, 메타크릴로일아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기로 치환된 아미드기, 메타크릴로일아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기로 치환된 아미드기, 메타크릴로일옥시(폴리알킬렌옥시)알킬기로 치환된 아미드기, 메타크릴로일옥시(폴리알킬렌아미노)알킬기로 치환된 아미드기, 아크릴로일옥시알킬기로 치환된 아미드기, 아크릴로일아미노알킬기로 치환된 아미드기, 아크릴로일아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기, 아크릴로일아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기, 아크릴로일옥시(폴리알킬렌옥시)알킬기 및 아크릴로일옥시(폴리알킬렌아미노)알킬기로 치환된 아미드기.

그 중에서도, i) 와 ii), ii) 와 iii) 및 ii) 와 iv) 의 조합이 바람직하고, 또한, 아미노알킬기로 치환된 아미드기와 히드록시알킬기로 치환된 아미드기, 아미노알킬기로 치환된 아미드기와 히드록시(폴리알킬렌옥시)알킬기로 치환된 아미드기, 아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기로 치환된 아미드기와 히드록시알킬기로 치환된 아미드기 및 아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기로 치환된 아미드기와 히드록시(폴리알킬렌옥시)알킬기로 치환된 아미드기의 조합이 바람직하며, 나아가서는, 아미노알킬기로 치환된 아미드기와 히드록시알킬기로 치환된 아미드기의 조합이 특히 바람직하다.

카르복시기의 변환에 의해 생기는 치환 아미드기의 종류로는, 단일 종류이거나 2 종류인 것이 바람직하다.

카르복시기의 변환에 의해 생기는 치환 아미드기 및 그 조합으로는, 상기 i), iii) 및 iv) 의 각 군 중에 기재된 치환 아미드기 단독, 그리고, 이들과, 히드록시알킬기로 치환된 아미드기의 조합, 히드록시(폴리알킬렌옥시)알킬기로 치환된 아미드기의 조합이 바람직하다.

히알루론산 또는 그 유도체와 반응시키는 화합물의 예에는, 식:

[식 중, m, l, p, j 및 q 는, 각각 독립적으로 2∼10 에서 선택되는 정수이고, n, r, z, t 및 y 는, 각각 독립적으로 1∼200 에서 선택되는 정수이고, R⁵ 및 R⁶은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 수산기이고, R⁷ 은, 수소 원자, 보호기 또는 -S-(CH₂)_j-NH₂ 이고, R⁸ 은, 수소 원자, 보호기 또는 -S-(CH₂-CH₂-Y³)_z-CH₂-CH₂-NH₂ 이고, R¹⁶, R¹⁷, R¹⁸, 및 R¹⁹ 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기이고, Y¹, Y², Y³, Y⁴ 및 Y⁵ 는, 각각 독립적으로, 산소 원자 또는 -NH- 이다]

으로 표시되는 화합물이 포함된다.

상기 식 중의 -(CHR⁵)_m-2- 에 있어서 m 이 4 이상인 경우의 R⁵ 는 수소 원자 또는 수산기로부터 각각 독립적으로 선택되는 것으로, -(CHR⁵)_m-2- 는 예를 들어 (m-2) 개의 -CHR⁵- 가 임의의 비율 및 순서로 -CH₂- 와 -CHOH- 가 혼재하고 있는 상태를 나타낸다. (m-2) 개의 -CHR⁵- 가 임의의 비율 및 순서로 -CH₂- 와 -CHOH- 가 혼재하고 있는 상태에는, (m-2) 개의 -CHR⁵- 모두가 -CH₂- 및 -CHOH- 인 경우도 포함된다. m 이 2 일 때에는 -(CHR⁵)_m-2- 는 단결합을 의미한다.

상기 식 중의 -(CHR⁶)_p-2- 에 있어서 p 가 4 이상인 경우의 R⁶ 은 수소 원자 또는 수산기로부터 각각 독립적으로 선택되는 것으로, -(CHR⁶)_p-2- 는 예를 들어 (p-2) 개의 -CHR⁶- 이 임의의 비율 및 순서로 -CH₂- 와 -CHOH- 가 혼재하고 있는 상태를 나타낸다. (p-2) 개의 -CHR⁶- 이 임의의 비율 및 순서로 -CH₂- 와 -CHOH- 가 혼재하고 있는 상태에는, (p-2) 개의 -CHR⁶- 모두가 -CH₂- 및 -CHOH- 인 경우도 포함된다. p 가 2 일 때에는 -(CHR⁶)_p-2- 는 단결합을 의미한다.

R⁷ 및 R⁸의 정의에 포함되는 보호기는, 메르캅토기의 보호가 가능한 보호기를 의미하고, 그 구체예는, 예를 들어 T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999 에 기재되어 있다. 그 중에서도 기 중에 1 급 아미노기를 갖지 않은 기가 바람직하고, 나아가 에틸티오기 및 t-부틸티오기 등의 C₁ _-6 알킬티오기, 그리고 2-니트로페닐티오기, 2-카르복시페닐티오기 등의 치환 페닐티오기가 바람직하다. 그리고 또한, 2-피리딜티오기 등의 헤테로아릴티오기도 바람직하다.

R⁷ 로는, -S-(CH₂)_j-NH₂ 및 2-피리딜티오기가 바람직하고, R⁸로는, -S-(CH₂-CH₂-Y³)_z-CH₂-CH₂-NH₂ 및 2-피리딜티오기가 바람직하다.

여기서, 반응시키는 화합물의 종류는 단일이어도 되고 복수여도 된다. 반응시키는 화합물의 종류로는, 단일이거나 2 종류인 것이 바람직하다.

복수의 반응시키는 화합물 조합의 구체예로는, 이하의 i)∼iv) 의 4개의 군에 관해서, i) 와 ii), i) 와 iii), i) 와 iv), ii) 와 iii), ii) 와 iv), iii) 와 iv); i) 와 ii) 와 iii), i) 와 ii) 와 iv), i) 와 iii) 와 iv), ii) 와 iii) 와 iv); i) 와 ii) 와 iii) 와 iv) 의 조합을 제작하고, 각각의 군으로부터 임의의 1개의 화합물을 선택함으로써 형성되는 조합을 들 수 있다:

그 중에서도, i) 와 ii), ii) 와 iii) 및 ii) 와 iv) 의 조합이 바람직하고, 또한,

의 조합이 바람직하며, 더 나아가서 H₂N-CH₂-(CHR⁵)_m-2-CH₂-NH₂ 와 H₂N-CH₂-(CHR⁶)_p-2-CH₂-OH 의 화합물의 조합이 특히 바람직하다.

반응시키는 화합물 및 그 조합으로는, 상기 i), iii) 및 iv) 의 각 군 중에 기재된 화합물 단독, 그리고, 이들과, H₂N-CH₂-(CHR⁶)_p-2-CH₂-OH 의 조합, H₂N-CH₂-CH₂-(Y²-CH₂-CH₂)_r-OH 의 조합이 바람직하다.

본 발명의 별도 측면에 있어서, 상기 수용성 히알루론산 수식물이 식 (Ⅰ):

[화학식 2]

[식 중, R¹, R², R³ 및 R⁴ 는, 각각 독립적으로, 수소 원자, C₁ _-6 알킬기 또는 C₁ _-6 알킬카르보닐기에서 선택되고,

Ra 는, 수소 원자 또는 C₁ _-6 알킬기이고,

Rb 는, 수소 원자, C₁ _-6 알킬기 또는 기 -CO-C(R²⁰)=CH₂ 이고,

A 는,

이고,

여기서, m, l, p, j 및 q 는, 각각 독립적으로 2∼10 에서 선택되는 정수이고, n, r, z, t 및 y 는, 각각 독립적으로 1∼200 에서 선택되는 정수이고, R⁵ 및 R⁶ 은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 수산기이고, R²⁰ 은, 수소 원자 또는 메틸기이고, Y¹, Y², Y³, Y⁴ 및 Y⁵ 는, 각각 독립적으로, 산소 원자 또는 -NH- 이다]

로 표시되는 반복 단위를 분자내에 적어도 1 이상 함유하는, 상기 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법이 제공된다.

여기서, -A-Rb 의 종류는 단일이어도 되고 복수여도 되며, -A-Rb 의 종류로는, 단일이거나 2 종류인 것이 바람직하다. 복수의 -A-Rb 조합의 구체예로는, 이하의 i)∼iv) 의 4개의 군에 관해서, i) 와 ii), i) 와 iii), i) 와 iv), ii) 와 iii), ii) 와 iv), iii) 와 iv); i) 와 ii) 와 iii), i) 와 ii) 와 iv), i) 와 iii) 와 iv), ii) 와 iii) 와 iv); i) 와 ii) 와 iii) 와 iv) 의 조합을 제작하고, 각각의 군으로부터 임의의 1개의 화합물을 선택함으로써 형성되는 조합을 들 수 있다:

의 조합이 바람직하며, 더 나아가서 -CH₂-(CHR⁵)_m-2-CH₂-NH₂ 와 -CH₂-(CHR⁶)_p-2-CH₂-OH 의 -A-Rb 의 조합이 특히 바람직하다.

-A-Rb 및 그 조합으로는, 상기 i), iii) 및 iv) 의 각 군 중에 기재된 -A-Rb 의 각 구체예 단독, 그리고, 이들과, -CH₂-(CHR⁶)_p-2-CH₂-OH 의 조합, -CH₂-CH₂-(Y²-CH₂-CH₂)_r-OH 와의 조합이 바람직하다.

당해 측면의 하나의 양태에 있어서, 상기 식 (Ⅰ) 로 표시되는 반복 단위를 분자내에 적어도 1 이상 함유하는 수용성 히알루론산 수식물은, 예를 들어, 이하의 식 (Ⅲ):

[화학식 3]

[식 중, R¹, R², R³, R⁴ 및 Ra 는, 이미 정의된 바와 같고, 각각 독립적으로, 수소 원자, C₁ _-6 알킬기 또는 C₁ _-6 알킬카르보닐기에서 선택되고,

Rc 는, 수소 원자 또는 C₁ _-6 알킬기이고,

G 는, -(CH₂)_m- 또는 -CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂)_n'- 이고,

m 은 2∼10 에서 선택되는 정수이고, n' 는 1∼10 에서 선택되는 정수이다] 로 표시되는 화합물이여도 된다.

본 발명의 하나의 양태에 있어서, 수식률은, 예를 들어 30몰% 이상이고, 바람직하게는 55몰% 이상일 수 있다. 또한, 별도의 양태에 있어서, 당해 수식률은, 예를 들어 70몰% 이하이고, 바람직하게는 60몰% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하일 수 있다.

상기 수용성 히알루론산 수식물은, 예를 들어 약물 담체로서 사용되어도 된다. 당해 수식물에는, 히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는 것도 포함된다. 당해 수용성 히알루론산 수식물의 포유동물에 있어서의 평균 혈중 체류 시간은, 예를 들어 17시간 이상, 바람직하게는 18시간 이상, 더욱 바람직하게는 30시간 이상이다.

본 발명의 별도 측면에 의하면, 식 (Ⅰ) 의 -A-Rb 의 말단이 C₁ _-6 알킬기로 치환되어 있어도 되는 아미노기인 수용성 히알루론산 수식물에 있어서, 당해 히알루론산 수식물의 아미노기를 디카르복실산으로 아미드화하고, 치환기의 말단에 카르복시기를 도입하는 공정을 추가로 포함하는, 상기 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법이 제공된다. 여기서 디카르복실산은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 옥살산, C₁ _-10 알킬렌디카르복실산 또는 C₁ _-10 알케닐렌디카르복실산 등을 사용할 수 있고, 바람직한 카르복실산은, 숙신산, 말레산, 글루탈산 또는 아디프산이다. 당해 아미드화는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 상기 히알루론산 수식물의 아미노기와 디카르복실산 무수물을 반응시킴으로써 실시할 수 있다.

본 발명의 별도 측면에 의하면, 상기의 제조 방법에 의해 얻어지는 수용성 히알루론산 수식물이 제공된다. 당해 수용성 히알루론산 수식물은 특별히 한정되지 않지만, 히알루론산을 그 구성 유닛의 2당까지 분해할 수 있고 또한 분해 산물의 비환원 말단에 Δ-4,5-글루쿠론산 잔기를 갖는 불포화 2당 분해물을 생성시키는 히알루로니다아제로 그 수용성 히알루론산 수식물을 분해하고, 얻어지는 분해 산물의 232㎚ 에 있어서의 흡수를 측정한 경우에, 분해 산물에서 유래하는 전체 피크 에어리어에 대한 2당에서 유래하는 피크 에어리어의 분율이 30% 이하가 되는 것이 바람직하다.

본 발명의 별도 측면에 의하면, 상기 수용성 히알루론산 수식물을 함유하는 약물 담체가 제공된다. 당해 약물 담체는, 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어, 상기 수용성 히알루론산 수식물에 의해 표면 수식된 미립자 약물 담체여도 된다.

본 발명의 다른 별도 측면에 의하면, 상기의 수용성 히알루론산 수식물을 함유하는 의약 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 별도 측면에 의하면, 상기의 수용성 히알루론산 수식물과 약물로 이루어지는 수용성 히알루론산 수식물-약물 콘쥬게이트가 제공된다.

또한 본 발명의 별도 측면에 의하면, 상기의 히알루론산 수식물을 가교함으로써 얻어지는 히알루론산 겔이 제공된다. 당해 히알루론산 겔은, 예를 들어, 약물의 봉입에 사용될 수 있다. 여기서, 봉입할 수 있는 약물은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 고분자와 약물의 콘쥬게이트여도 된다. 이 히알루론산 겔을 건조시킴으로써, 봉입하는 약물의 서방성을 더욱 높이는 것도 가능하다.

본 발명의 또 다른 별도 측면에 의하면, 상기의 히알루론산 겔을 함유하는 의약 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 별도 측면에 의하면, 상기의 수용성 히알루론산 수식물을 함유하는 의료용 디바이스가 제공된다. 당해 의료용 디바이스는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 상기의 수용성 히알루론산 수식물로 표면 수식을 실시한 것이어도 된다.

또한 본 발명의 별도 측면에 의하면, 상기의 히알루론산 수식물로 이루어지는 히알루론산 겔 미립자의 제조 방법으로서,

a) 당해 히알루론산 수식물을 함유하는 희박 용액을 조제하는 공정;

b) 당해 용액을 미립자상의 액적으로 분산시키는 공정; 및

c) 당해 액적에 함유되는 용액의 농축에 의해 당해 다당 유도체의 가교 반응을 진행시키는 공정을 포함하는 히알루론산 겔 미립자 제조 방법이 제공된다. 여기서, 상기 공정 b) 는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 상기 용액을 분무함으로써 미립자상의 액적으로 분산시키는 공정이어도 된다.

또 본 발명의 별도 측면에 의하면, 상기의 히알루론산 수식물로부터 히알루론산 겔 미립자를 제조하는 방법으로서,

a) 히알루론산 겔을 건조시키는 공정;

b) 얻어진 건조물을 동결시키는 공정; 및

c) 얻어진 동결물을 분쇄하는 공정을 포함하는 히알루론산 겔 미립자 제조 방법이 제공된다. 여기서, 히알루론산 겔은, 본 발명의 히알루론산 수식물을 가교함으로써 얻어지는 것이다.

또한, 얻어지는 미립자의 평균 입자 직경은 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 0.01㎛∼150㎛, 바람직하게는 0.1㎛∼50㎛ 이다. 여기서, 얻어지는 미립자는 예를 들어 약물 담체, 특히 약물 서방 담체여도 된다.

당해 측면의 하나의 양태에 있어서, 상기 제조 방법의 가교 반응전의 희박 용액이 약물을 함유하고, 당해 약물이 가교 반응후에 얻어지는 미립자 중에 담지되어 있어도 된다.

본 발명의 별도 측면에 의하면, 상기 방법으로 제조된 히알루론산 겔 미립자, 및 당해 히알루론산 겔 미립자를 함유하는 의약 조성물이 제공된다.

발명의 효과

본 발명의 수용성 히알루론산 수식물을 사용함으로써, 종래의 수용성 히알루론산 수식물에서는 얻어지지 않는 실용적인 레벨까지 그 혈중 체류 시간을 연장시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물을 담체에 사용하고, 약물을 콘쥬게이트화하는 것, 또는, 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물을 약물을 함유한 미립자, 겔 등의 적어도 표면 근방에 국재화시킴으로써, 종래의 기술에서는 달성할 수 없었던, 실용적이면서 또한 안전한 의약 조성물을 제공하는 것이 가능하다.

또, 본 발명의 히알루론산 수식물을, 가교하고, 겔화함으로써, 단백질, 펩티드, 저분자 화합물, 핵산 또는 그들과 고분자의 콘쥬게이트 등의 약물을 봉입, 장기간 서방할 수 있는 안전성이 높은 히알루론산 겔 서방 제제의 제공을 가능하게 한다.

도 1 은 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물을 히알루로니다아제 처리한 후의 GPC 데이터의 일례이다.

도 2 는 비교예의 수용성 히알루론산 수식물 및 히알루론산을 히알루로니다아제 처리한 후의 GPC 데이터의 일례로, 종축 방향의 스케일은 도 1 과 동일하다.

도 3 은 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 NMR 데이터의 일례이다.

도 4 는 CDI 를 사용한 도입 (비교예 1-14) 에 있어서의, 반응 전후에서의 GPC 데이터의 일례이다.

도 5 는 BOP 의 첨가량에 의한 디아민 화합물의 도입률의 제어에 관한 NMR 데이터의 일례이다 (실시예 2).

도 6 은 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 아미노기를 변환하고 카르복시기를 도입한 수용성 히알루론산 수식물의 NMR 데이터의 일례이다 (실시예 3-2).

도 7 은 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 아미노기를 변환하고 카르복시기를 도입한 수용성 히알루론산 수식물의 히알루로니다아제 처리후의 GPC 데이터의 일례이다.

도 8 은 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 NMR 데이터의 일례이다.

도 9 는 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 NMR 데이터의 일례이다.

도 10 은 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 GPC 차트의 일례이다.

도 11 은 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 NMR 데이터의 일례이다.

도 12 는 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물을 히알루로니다아제 처리한 후의 GPC 데이터의 일례이다.

도 13 은 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물을 히알루로니다아제 처리한 후의 GPC 데이터의 일례이다.

도 14 는 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 NMR 데이터의 일례이다.

도 15 는 분자량이 상이한 형광 표지 HA 수식물 HA-AM-SUC 및 HA-HZ-SUC 의 혈중 농도 추이를 나타낸 도면이다.

도 16 은 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 NMR 데이터의 일례이다.

도 17 은 분자량 200kDa 의 HA 로부터 합성한, 아미노기 수식률이 상이한 형광 표지 HA 수식물의 혈중 농도 추이를 나타낸 도면이다.

도 18 은 HA 수식물의 아미노기 도입률과 평균 혈중 체류 시간 (MRT) 과의 상관 및 아미노기 도입률과 히알루로니다아제에 의해 분해되는 2당의 분율과의 상관을 나타낸 도면이다.

도 19 는 분자량 200kDa HA 로부터 합성한 치환 아미드기 상의 치환기가 상이한 형광 표지 HA 수식물의 혈중 농도 추이를 나타낸 도면이다.

도 20 은 본 발명의 AEMA 기 도입 히알루론산 수식물의 NMR 데이터의 일례이다.

도 21 은 본 발명의 APMA 기 도입 히알루론산 수식물의 NMR 데이터의 일례이다.

도 22 는 본 발명의 메타크릴로일기 도입 히알루론산 수식물의 NMR 데이터의 일례이다.

도 23 은 HA 겔로부터의 형광 표지 HA-HZ 의 방출성을 나타낸 도면이다.

도 24 는 형광 표지 HA-HZ 를 봉입한 HA-AEMA 가교 겔 미립자의 현미경 사진의 일례이다.

도 25 는 형광 표지 HA-AM-SUC 을 봉입한 HA-AEMA 가교 겔 미립자의 현미경 사진의 일례이다.

도 26 은 HA 겔로부터의 형광 표지 HA-AM-SUC 의 방출성을 나타낸 도면이다.

도 27 은 래트에 HA-플루오레세인 이소티오시아네이트(이하,「FITC」라고도 한다)-표지 Fab 콘쥬게이트 및 FITC 표지 Fab 를 단회 정맥내 투여하였을 때의 혈장 중 농도 추이를 나타낸 도면이다.

도 28 은 HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트를 래트에 정맥내 투여하였을 때의 혈장 중 농도 추이를 나타낸 도면이다.

발명의 실시형태

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명은, 비프로톤성 극성 용매 중에서, 특정한 축합제를 사용하고, 히알루론산 또는 그 유도체의 글루쿠론산의 카르복시기에 치환기를 아미드 결합에 의해 하한이 5몰% 이상 도입하는, 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법에 관한 것이다.

용매는 극성 유기용매이어야 하고, 특히 비프로톤성 극성 용매가 바람직하다. 비프로톤성 극성 용매와 물의 혼합 용매, 또는 물을 용매에 사용한 경우에는, 어떠한 축합제를 사용하더라도 실용상 충분한 혈중 체류성을 부여하기 위해서 필요한 수식률이 얻어지지 않고, 또한, 지금까지 없었던 장기간의 약물 서방을 실현하는, 보다 균일한 가교성 관능기의 도입이 불가능하다. 사용 가능한 비프로톤성 극성 용매는, 디메틸포름아미드 (이하, 「DMF」라고도 한다), 디메틸아세트아미드 (이하, 「DMAc」라고도 한다), 디메틸술폭사이드 (이하, 「DMSO」라고도 한다), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논 (이하, 「DMI」라고도 한다), 술포란 (이하, 「SF」라고도 한다), N-메틸피롤리돈 (이하, 「NMP」라고도 한다) 또는 그들의 2종 이상의 혼합 용매 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, 디메틸술폭사이드, N-메틸피롤리돈 또는 그것들의 2종 이상의 혼합 용매이고, 특히 바람직하게는 디메틸술폭사이드이다.

본 발명의 제조 방법에는, 식 (Ⅱ):

[화학식 4]

[식 중, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³, R¹⁴, R¹⁵, 고리 B 및 X^- 는 앞서 정의한 바와 동일하다]

로 표시되는 축합제가 사용된다. 여기서, 고리 B 는, 산성 프로톤을 갖지 않은 질소 함유 헤테로고리기이면 특별히 한정되지 않고, C₁ _-6 알킬기 또는 할로겐 원자 등의 치환기에 의해 치환되어 있어도 된다. 고리 B 에는, 예를 들어 피롤리딘-2,5-디온-1-일, 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진, 벤조트리아졸-1-일 등이 포함된다. X^－ 에는, 예를 들어 불화물 이온, 염화물 이온, 브롬화물 이온, 요오드화물 이온 등의 할로겐화물 이온, CF₃SO₃ ^-, BF₄ ^-, PF₆ ^- 등이 포함된다.

R¹⁰ 및 R¹¹, R¹² 및 R¹³, 그리고 R¹⁴ 및 R¹⁵가, 그들이 결합하는 질소 원자와 함께 형성하는 질소 함유 헤테로고리로는, 5∼7 원자 포화 질소 함유 헤테로고리 등이 바람직하고, 구체적으로는 피롤리딘, 피페리딘, 호모피페리딘 등이 포함된다.

바람직하게는, 당해 축합제는 고리 B 가 벤조트리아졸-1-일인 BOP 계 축합제이다. 바람직한 BOP 계 축합제로는, 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (이하, 「BOP」라고도 한다), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (이하, 「PyBOP」 라고도 한다), 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. BOP 계 축합제는 단독으로 또는 적절히 조합하여 이용할 수 있다.

또, 상기 이외의 다른 축합제, 예를 들어 N,N'-카르보닐디이미다졸 (이하, 「CDI」라고도 한다), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (이하, 「DCC」라고도 한다), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 (이하, 「EDC」라고도 한다), EDC/3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (이하, 「HODhbt」라고도 한다), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린 (이하, 「EEDQ」라고도 한다), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴륨클로라이드 n-수화물 (이하, 「DMT-MM」이라고도 한다), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (이하, 「TBTU」라고도 한다) 등에서는, 실용상 충분한 혈중 체류성 (예를 들어 평균 혈중 체류 시간 (이하, 「MRT」라고도 한다) 으로 18시간 이상) 을 갖는 히알루론산 수식물이 얻어지지 않고, 또는 히알 루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 부여하기 위해서 필요한 높은 도입률이 얻어지지 않는다. 그리고 또, 축합제로서 CDI 를 사용한 경우에는, 축합 반응 중에 HA 분자량이 저하되기 때문에 실용적이지 않다. 또한, 지금까지 없던 장기간의 약물 서방을 실현하는, 보다 균일한 관능기의 도입이 불가능하다.

본 발명에 사용되는 히알루론산 (HA) 은 HA 골격을 갖고 있으면 특별히 한정되지 않고, HA 의 일부를 유도체화한 HA 유도체나, 효소, 열분해 등으로 저분자화한 HA, HA 및 HA 유도체의 염 (나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 알루미늄염 등) 등도 포함된다. 본 발명에 사용되는 HA 는 어떠한 방법으로 얻어진 HA 라도 상관없이, 동물 조직으로부터 추출된 HA, 발효법에 의해 얻어진 HA, 화학 합성에 의해 얻어진 HA 등, 그 유래는 한정되지 않는다. 또한, HA 를 유기용매에 가용화하기 위하여, 테트라부틸암모늄염 등의 소수성이 높은 상대 이온으로 이온 교환한 것을 사용해도 된다.

본 발명의 수용성 HA 수식물에 있어서, 치환 아미드기로 변환되어 있는 카르복시기의 비율은, 카르복시기 수식률로서 이하의 식:

[화학식 5]

에 의해 산출된다. 본 발명의 수용성 HA 수식물의 카르복시기 수식률의 하한은 5% 이상이면 되지만, 약물과의 콘쥬게이트로 하였을 때에 실용적인 혈중 체류 시간을 얻기 위한 히알루론산 수식물로서의 관점에서는, 수식률의 하한은 30몰% 이상인 것이 바람직하고, 50몰% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 55몰% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 60몰% 이상인 것이 더욱 바람직하다. 또, 수식률의 상한은 100몰% 이하이면 된다. 예를 들어, 단백질 및 펩티드와 결합시켜 콘쥬게이트를 형성하기 위해서 사용되는 수용성 히알루론산 수식물의 수식률의 구체예로는, 30∼100몰%, 50∼100몰% 및 60∼100몰% 를 들 수 있다. 한편, 장시간의 약물 서방을 실현하기 위한 겔이 되는 히알루론산 수식물로서의 관점에서는, 수식률의 하한은, 5% 몰 이상이 바람직하고, 10% 몰 이상이 더욱 바람직하다. 또, 수식률의 상한은, 피하에서의 분해성을 유지하기 위해서는 70% 몰 이하가 바람직하고, 60% 몰 이하가 더욱 바람직하며, 그 중에서도 40몰% 이하가 더더욱 바람직하고, 30몰% 이하가 특히 바람직하다. 예를 들어, 단백질 및 펩티드를 봉입하기 위한 하이드로겔의 기재로서 사용되는 수용성 히알루론산 수식물의 수식률 범위의 구체예로는, 5∼70몰%, 5∼60몰%, 5∼40몰%, 5∼30몰%, 10∼70몰%, 10∼60몰%, 10∼40몰% 및 10∼30몰% 를 들 수 있다.

여기서, 카르복시기 수식률은, 프로톤 NMR 에 의해 정량할 수 있다. 구체적으로는, 프로톤 NMR 에 의해 얻어지는 아미노화 (이하, 「AM 화」라고도 한다) 또는 메타크릴로일화 (이하, 「MA 화」라고도 한다) 된 HA 유도체 중의 아미노 화합물의 양과, HA 유래의 피크와의 비교로부터 구할 수 있다. 예를 들어, 에틸렌디아민 (이하, 「EDA」라고도 한다) 에 의해 아미노기를 도입한 히알루론산 수식물 (이하, 「HA-AM」이라고도 한다) 의 프로톤 NMR 로부터 얻어지는 아민 화합물 유래의 피크 (2.9∼3.1ppm: 측정 용매 D₂O) 와 HA 유래의 피크 (1.8∼1.9ppm: 측정 용매 D₂O) 의 비, 또는 아미노에틸메타크릴레이트 (이하, 「AEMA」라고도 한다) 에 의해 메타크릴로일기를 도입한 HA-AEMA 의 프로톤 NMR 로부터 얻어지는 메타크릴로일 화합물 유래의 피크 (5.5∼6.1, 1.8ppm) 와 HA 유래의 피크 (1.8∼1.9ppm) 의 비를 실측한다.

또한, 약물과의 콘쥬게이트로 하였을 때에 실용적인 혈중 체류 시간을 얻기 위한 히알루론산 수식물로서의 관점에서는, 본 발명의 수용성 HA 수식물의 분자량도 그 체내 동태를 좌우한다. 본 발명의 수용성 HA 수식물의 혈중 체류 시간은 HA 의 분자량에도 의존하여, 분자량이 큰 HA 일수록 그 혈중 체류 시간은 길다. 따라서, 수용성 HA 수식물의 분자량과 수용성 HA 수식물의 카르복시기의 수식률을 변화시킴으로써, 수용성 HA 수식물의 혈중 체류 시간을 제어하는 것이 가능하다. 본 발명에 사용되는 원료 HA 의 분자량은 특별히 제한되지 않지만, 지나치게 저분자량에서는 얻어진 수용성 HA 수식물의 혈중 체류 시간이 짧아진다. 반대로, 지나치게 고분자량이 되면 얻어진 수용성 HA 수식물의 점도가 매우 높아져, 고농도에서의 투여가 어렵게 된다. 또한, 본 발명의 수용성 HA 수식물의 혈중 체류 시간은 분자량이 일정 이상 커지면 거의 변화하지 않게 되므로, 통상, 원료 HA 의 분자량은 점도 평균 분자량으로 5000 달톤∼100만 달톤인 것이 바람직하고, 1만 달톤∼30만 달톤인 것이 보다 바람직하고, 8만 달톤∼30만 달톤인 것이 더욱 바람직하다.

한편, 장시간의 약물 서방을 실현하기 위한 겔의 기재로서 히알루론산 수식물이 사용되는 경우에는, 본 발명에 사용되는 원료 HA 의 분자량은 특별히 한정되지 않고 어떠한 분자량의 원료 HA 라도 사용하는 것이 가능하지만, 예를 들어 5000∼350만 달톤, 바람직하게는 1만∼200만 달톤, 더욱 바람직하게는 2만∼30만 달톤의 HA 를 사용해도 된다.

또, HA 중량 평균 분자량의 측정 방법에 관해서는, 예를 들어, 나카하마 세이이치 외 저의 「엣센셜 고분자 과학」 (고단샤 발행, ISBN4-06-153310-X) 에 기재된 광산란법, 삼투압법, 점도법 등, 각종 공지된 방법을 이용할 수 있고, 본 명세서에 있어서 표시되는 점도 평균 분자량도 우벨로데 점도계를 사용하는 등, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 측정할 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 수용성 HA 수식물의 혈중 체류 시간은, 원료 HA 의 혈중 체류 시간에 비하여 연장되어 있는 것이 바람직하다. 여기서, 혈중 체류 시간은, 평균 혈중 체류 시간 (예를 들어, 본 명세서 실시예 5-3 에 기재된 MRT 로서 산출된다), 혈중 반감기 (이하, 「t1/2」라고도 한다), 혈중 클리어런스 (이하, 「Cl」이라고도 한다) 등의 공지된 대표적인 파라미터를 이용하여 적절히 비교할 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 수용성 HA 수식물의 인간을 포함한 포유동물에 있어서의 혈중 체류 시간은, 실용면에서 평균 혈중 체류 시간 (이하, 「MRT」라고도 한다) 의 하한이 18시간 이상인 것이 바람직하고, 30시간 이상인 것이 보다 바람직하다. 상한은, 약물 농도 제어의 관점에서 1개월 이하, 바람직하게는 2주 이하이다.

또한, 본 발명의 별도 측면에 의하면, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 수용성 HA 수식물은, 원료 HA 에 비하여 히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는 것이 바람직하다. 여기서, 「히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는다」란, 원료 HA 와 본 발명의 수용성 HA 수식물을 각각 히알루로니다아제에 의해 효소 분해시켰을 때에, 원료 HA 보다 분해 속도가 느리거나 또는 분해가 진행되지 않는 성질을 갖는 것을 가리킨다. 예를 들어, 일정 시간 히알루로니다아제 처리하였을 때에, 원료 HA 에서는 관찰되는 2당 분해 피크가 관찰되지 않으면 「분해가 진행되지 않는」성질을 갖는 것 (즉, 히알루로니다아제에 의한 분해에 대하여 내성을 갖는 것) 으로 판정할 수 있다. 또, HA 의 분해 속도나 분해 상태는 겔 침투 크로마토그래피 (이하, 「GPC」라고도 한다) 등의 통상적인 방법을 사용하여 관찰할 수 있다.

본 발명에 있어서, 글루쿠론산 부분의 카르복시기를 변환하여 도입되는 아미드기의 치환기로는, 당해 변환 후에 얻어지는 HA 수식물이 수용성이면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 HA 수식물이 갖는 치환기는 어떠한 치환기여도 되지만, 얻어진 HA 수식물의 수용성을 유지하기 위해서 친수성의 치환기 또는 소수성이 낮은 치환기를 도입하는 것이 바람직하다.

상기한 아미드화시에 히알루론산 또는 그 유도체와 반응시키는 화합물의 구체예는, 1분자 중에 1종류이면서 또한 1개 이상의 관능기를 가지고, 질소 원자 상에 치환기를 갖고 있어도 되는 아미노기를 갖는 아민류이다. 여기서, 질소 원자 상의 치환기를 갖고 있어도 되는 아미노기를 제외한 관능기란 치환되어 있어도 되는 아미노기, 수산기, 메르캅토기, 카르복시기, 알데히드기, 메타크릴로일기, 아크릴로일기에서 선택된다. 그 관능기의 종류는 바람직하게는 1 및 2 종류이다. 관능기가 1종류이면서 또한 1개인 경우, 히알루론산 또는 그 유도체의 글루쿠론산의 카르복시기에 아미드 결합하는 화합물은, 알킬렌디아민 화합물 또는 아미노(폴리알킬렌옥시)알킬아민 화합물 등의 2개의 아미노기를 갖는 화합물 (이하, 「디아민 화합물」이라고도 한다); 아미노기와 수산기를 갖는 화합물; 아미노기와 메르캅토기를 갖는 화합물; 아미노산, 펩티드 등의 아미노기와 카르복시기를 갖는 화합물; 아미노기와 알데히드기를 갖는 화합물, 아미노기와 메타크릴로일기를 갖는 화합물; 또는, 아미노기와 아크릴로일기를 갖는 화합물에서 선택된다. 상기 화합물은 아미노기에 치환기를 갖고 있어도 되고, 당해 치환기에는 예를 들어 C_1-6 알킬기, C_1-6 알킬카르보닐기 등이 포함된다.

또, 이들 화합물에 있어서는, 화합물 중의 임의의 탄소 원자가, 예를 들어 1∼9개, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 수산기로 치환되어 있어도 된다. 단, 동일 탄소 원자가 복수의 수산기로 치환되는 것이나, 이미 산소 원자, 질소 원자 등의 헤테로 원자가 결합하고 있는 탄소 원자가 추가로 수산기로 치환되어 있는 일은 없다.

전술한 바와 같이, 아미드화시에 히알루론산 또는 그 유도체와 반응시키는 화합물의 종류는 단일이어도 되고 복수여도 된다. 즉, 단품이거나 혼합품이거나 상관없으며, 단품을 단계적으로 반응시켜 나가도 된다.

또한, 이들 화합물에서, 히알루론산의 카르복시기를 변환하여 생기는 치환 아미드기의 치환기로는, 아미노알킬기 (이 아미노알킬기의 알킬렌 사슬은 1개 이상, 예를 들어 1∼9개, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 수산기로 치환되어 있어도 된다), 아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기, 아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기, 히드록시알킬기 (이 히드록시알킬기의 알킬렌 사슬은 1개 이상, 예를 들어 1∼9개, 바람직하게는 1∼8개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 수산기로 치환되어 있어도 된다), 히드록시(폴리알킬렌옥시)알킬기, 히드록시(폴리알킬렌아미노)알킬기, 메르캅토알킬기, 메르캅토(폴리알킬렌옥시)알킬기, 메르캅토(폴리알킬렌아미노)알킬기, 메타크릴로일옥시알킬기, 메타크릴로일아미노알킬기, 메타크릴로일아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기, 메타크릴로일아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기, 메타크릴로일옥시(폴리알킬렌옥시)알킬기, 메타크릴로일옥시(폴리알킬렌아미노)알킬기, 아크릴로일옥시알킬기, 아크릴로일아미노알킬기, 아크릴로일아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기, 아크릴로일아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기, 아크릴로일옥시(폴리알킬렌옥시)알킬기 또는 아크릴로일옥시(폴리알킬렌아미노)알킬기 등을 들 수 있다.

특정한 실시양태에 있어서, 히알루론산 또는 그 유도체의 글루쿠론산의 카르복시기에 아미드 결합하는 화합물의 구체예는,

식: H₂N-CH₂-(CHR⁵)_m-2-CH₂-NH₂ 및 H₂N-CH₂-CH₂-(Y¹-CH₂-CH₂)_n-NH₂ 로 표시되는 디아민 화합물;

식: H₂N-CH₂-(CHR⁶)_p-2-CH₂-OH 및 H₂N-CH₂-CH₂-(Y²-CH₂-CH₂)_r-OH 로 표시되는 아미노기와 수산기를 갖는 화합물;

식: H₂N-(CH₂)_j-SR⁷ 및 H₂N-CH₂-CH₂-(Y³-CH₂-CH₂)_z-SR⁸로 표시되는 아미노기와 메르캅토기를 갖는 화합물; 그리고

식: H₂N-(CH₂)_l-O-CO-C(R¹⁶)=CH₂, H₂N-(CH₂)_q-NHCO-C(R¹⁷)=CH₂, H₂N-CH₂-CH₂-(Y⁴-CH₂-CH₂)_t-NHCO-C(R¹⁸)=CH₂ 및 H₂N-CH₂-CH₂-(Y⁵-CH₂-CH₂)_y-O-CO-C(R¹⁹)=CH₂ 로 표시되는 아미노기와 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기를 갖는 화합물이고, 상기 식 중에 있어서, m, l, p, j 및 q 는, 각각 독립적으로 2∼10 에서 선택되는 정수이고, n, r, z, t 및 y 는, 각각 독립적으로 1∼200 에서 선택되는 정수이고, R⁵ 및 R⁶ 은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 수산기이며, 또한, (m-2) 개의 -CHR⁵- 및 (p-2) 개의 -CHR⁶- 이 임의의 비율 및 순서로 -CH₂- 와 -CHOH- 가 혼재하고 있는 상태를 나타내고 있고, R⁷ 은, 수소 원자, 보호기 또는 -S-(CH₂)_j-NH₂ 이고, R⁸ 은, 수소 원자, 보호기 또는 -S-(CH₂-CH₂-Y³)_z-CH₂-CH₂-NH₂ 이고, R¹⁶, R¹⁷, R¹⁸, 및 R¹⁹ 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기이고, Y¹, Y², Y³, Y⁴ 및 Y⁵ 는, 각각 독립적으로 산소 원 자 또는 -NH- 이다] 이다.

여기서, 분자 중에서 R⁵ 및 R⁶ 이 수산기인 CHR⁵ 및 CHR⁶의 갯수는, 각각 0∼8 이지만, 바람직하게는 0∼3, 더욱 바람직하게는 0 및 1 이다. R⁵ 및 R⁶ 이 수산기인 CHR⁵ 및 CHR⁶의 갯수를 조절함으로써, 본 발명의 수용성 HA 수식물의, 물에 대한 용해도를 조절할 수 있다. R⁵ 가 모두 수소 원자인 경우, m 으로서는 2∼6 이 바람직하고, 그 구체예로서 2 및 6 을 들 수 있다. R⁵의 하나가 수산기인 경우, m 의 구체예로는 3 을 들 수 있다. Y¹ 이 산소 원자인 경우, n 의 구체예로는 2 를 들 수 있다. Y¹ 이 -NH- 인 경우, n 의 구체예로는 1 을 들 수 있다. l 의 구체예로는 1 을 들 수 있다. p, q 의 구체예로는 3 을 들 수 있다. r 의 구체예로는 1 및 3 을 들 수 있다.

H₂N-CH₂-(CHR⁵)_m-2-CH₂-NH₂ 의 바람직한 구체예로는, 예를 들어,

가 바람직하다.

H₂N-CH₂-(CHR⁶)_p-2-CH₂-OH 의 바람직한 구체예로는, 예를 들어,

가 바람직하다.

또, 이들 화합물은 예를 들어 시그마 알드리치사 등으로부터 시판되고 있고, 적절히 구입하여 이용할 수 있다. 또한, 문헌에 기재된 방법에 따라서, 또는 문헌에 기재된 방법을 참고하여 합성해도 된다.

히알루론산 또는 그 유도체와 반응시키는 화합물은, 담지되는 약물이 단백질 및 펩티드일 때, 약물을 본 발명의 수용성 HA 수식물로부터 얻어지는 겔 중에 봉입하는 경우에는, 아미노기와 메타크릴로일기를 갖는 화합물, 아미노기와 아크릴로일기를 갖는 화합물, 아미노기와 메르캅토기를 갖는 화합물, 아미노기와 메타크릴로일기를 갖는 화합물 및 아미노기와 수산기를 갖는 화합물의 조합, 아미노기와 아크릴로일기를 갖는 화합물 및 아미노기와 수산기를 갖는 화합물의 조합, 그리고 아미노기와 메르캅토기를 갖는 화합물 및 아미노기와 수산기를 갖는 화합물의 조합이 바람직하다. 또한, 약물과 본 발명의 수용성 HA 수식물을 콘쥬게이트로 하는 경우에는, 디아민 화합물, 아미노기와 메르캅토기를 갖는 화합물, 디아민 화합물 및 아미노기와 수산기를 갖는 화합물의 조합, 그리고 아미노기와 메르캅토기를 갖는 화합물 및 아미노기와 수산기를 갖는 화합물의 조합이 바람직하다.

아미노기와 수산기를 갖는 화합물은, 반응성 관능기인, 아미노기, 메르캅토기, 메타크릴로일기, 및 아크릴로일기의 카르복시기로의 도입률 제어에 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 「알킬기」란, 탄소수 1 이상의 직쇄상, 분기쇄상의 알킬기를 의미하고, 예를 들어 이하에 정의하는 「C₁ _-6 알킬기」등이다.

본 발명에 있어서 「C₁ _-6 알킬기」란, 탄소수 1∼6 의 직쇄상, 분기쇄상의 알킬기를 의미하고, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸 등의 「C₁ _-4 알킬기」가 포함되고, 또한, n-펜틸, 3-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, n-헥실, 4-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 3-에틸부틸, 및 2-에틸부틸 등이 포함된다.

본 발명에 있어서 「C₁ _-6 알킬카르보닐기」란, 탄소수 1∼6 의 직쇄상, 분기쇄상의 알킬기를 갖는 알킬카르보닐기를 의미하고, 예를 들어, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 피발로일, 발레릴, 이소발레릴, 헥사노일 등이 포함된다.

본 발명에 있어서 「알킬렌옥시기」란, 탄소수 가 1 이상인 알킬렌 사슬을 포함하고, 탄소 원자와 산소 원자로 연결하는 2가의 기로, 예를 들어 이하에 정의하는 「C₂ _-10 알킬렌옥시기」등이다.

「C₂ _-10 알킬렌옥시기」란, 탄소수가 2∼10 인 알킬렌 사슬을 포함하는 탄소 원자와 산소 원자로 연결하는 2가의 기로, 예를 들어 에틸렌옥시기, 프로필렌옥시기, 부틸렌옥시기 등이 포함된다.

본 발명에 있어서 도입되는 치환기의 도입량은, 축합제의 HA 에 대한 첨가량에 의해 조절할 수 있다.

또한, 본 발명의 수용성 HA 수식물의 전하에 관해서, 도입된 치환기가 양이온성이었던 경우, 토탈 전하가 플러스측으로 치우치고, 혈중 체류 시간의 단축으로 연결되기 때문에, 본 발명의 수용성 HA 수식물을 약물과의 콘쥬게이트로 하여 혈중 체류 시간을 연장하는 경우에는 수식 전하는 비이온성이나 음이온성인 것이 바람직하다.

본 발명의 수용성 HA 수식물의 조제 방법에서는, 예를 들어, 테트라부틸암모늄 (TBA) 염화한 HA 를 DMSO 에 용해하고, 분자의 양 말단에 아미노기를 1개씩 갖 는 디아미노계 화합물을 첨가, HA 의 카르복시기에 BOP 계 축합제로 축합시켜, 아미노기를 도입한 HA (이하, 「HA-AM」이라고도 한다) 를 합성할 수 있다.

또한, 본 발명의 수용성 HA 수식물 중, 카르복시기의 변환에 의해 생기는 치환 아미드기의 치환기가 치환되어 있어도 되는 아미노기인 경우, 이 치환되어 있어도 되는 아미노기를 추가로 수식함으로써, 메르캅토기, 아크릴로일기, 메타크릴기 등의 관능기를 도입할 수 있다. 이 때, 잔존한 아미노기는, 예를 들어 무수 숙신산, 무수 말레산, 무수 글루탈산 및 무수 아디프산 등의 디카르복실산 무수물 등으로 처리하거나, 말레산, 글루탈산 및 아디프산 등의 디카르복실산을 축합제 공존하에서 반응시킴으로써, 말단의 관능기를 카르복시기로 되돌려 토탈 전하를 음이온성으로 하는 편이 혈중 체류 시간의 연장에는 바람직하다. 여기서 사용되는 축합제는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, N,N'-카르보닐디이미다졸, N,N'-디시클로헥실카르보디미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염, EDC/3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진, N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴륨클로라이드 n-수화물, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 그리고 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다. 얻어지는 히알루론산 수식물의 토탈 전하의 관점에서는, 아미노산 또는 펩티드 등의 아미노기를 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복시기와 반응시킨 화합물, 또는 a) 아미노기; b) 메르캅토 기, 아크릴로일기 및 메타크릴기 등의 관능기에서 선택되는 관능기라는 a) 와 b) 의 양쪽을 갖는 아민류를 히알루론산 또는 그 유도체의 카르복시기와 반응시킨 화합물 등도 바람직하다.

또, 본 발명은, 상기 서술한 제조 방법에 의해 얻어진 수용성 히알루론산 수식물 자체에도 관한 것이다.

이 수용성 히알루론산 수식물은, 약물과의 콘쥬게이트로 하였을 때에 실용적인 혈중 체류 시간을 얻기 위한 히알루론산 수식물로서의 관점에서는, 바람직하게는, 히알루론산을 그 구성 유닛의 2당까지 분해할 수 있고 또한 분해 산물의 비환원 말단에 Δ-4,5-글루쿠론산 잔기를 갖는 불포화 2당 분해물 (예를 들어, 식 Ⅳ 의 화합물을 포함한다):

[화학식 6]

을 생성시키는 히알루로니다아제로 그 수용성 히알루론산 수식물을 분해하고, 얻어지는 분해 산물의 232㎚ 에 있어서의 흡수를 측정한 경우에, 분해 산물에서 유래하는 전체 피크 에어리어에 대한 2당에서 유래하는 피크 에어리어의 분율의 상한이 30% 이하라는 특징을 갖는다. 이 피크 에어리어의 분율의 상한은, 바람직하게는 20% 이하, 더욱 바람직하게는 13% 이하이다. 또한, 하한은 0% 이상이 면 된다. 당해 측정은, 통상의 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 당해 기술 분야에 있어서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 실시할 수 있고, 예를 들어 GPC 칼럼 (예를 들어 Superdex200 10/300 GL, Superdex75HR 10/30 및 Superdex PeptideHR 10/30 (모두 아마샴 바이오사이언스 주식회사 제조) 등) 을 사용할 수 있다. 또한 사용하는 용리액은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 PBS (예를 들어, 시그마 알드리치사 제조 Phosphate Buffered Saline Tablets 2정을 취하여 정제수 400mL 에 용해시켜서 얻은 것) 를 사용할 수 있다.

여기서, 분해 산물에서 유래하는 전체 피크 에어리어에 대한 2당에서 유래하는 피크 에어리어의 분율은, 이하의 식:

[화학식 7]

에 의해 구할 수 있다. 또한, 히알루로니다아제로는, 예를 들어 히알루로니다아제 SD (세이카가쿠 공업 주식회사 제조) 등을 사용할 수 있다.

약물과의 콘쥬게이트로 하였을 때에 실용적인 혈중 체류 시간을 얻기 위한 히알루론산 수식물로서의 관점에서는, 본 발명의 수용성 HA 수식물은 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 10mg/mL∼1000mg/mL 의 물에 대한 용해도를 갖는다. 실제로 치료를 목적으로 하여 투여될 때의 HA 수식물의 농도는 10∼500mg/mL 정도이기 때문에, 본 발명의 수용성 HA 수식물의 용해도는 바람직하게는 실온에 있어서 생리 식염수에 대하여 10mg/mL 이상이다.

본 발명의 수용성 HA 수식물은 약물 담체로서 사용할 수 있다. 담지되는 약물은 특별히 한정되지 않고, 저분자 화합물, 단백질, 펩티드 및 핵산 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 약물을 담지시키는 데에 있어서는, 공지된 각종 방법을 사용할 수 있고, 약물을 본 발명의 수용성 HA 수식물로부터 얻어지는 겔 중에 봉입해도 되고, 약물과 본 발명의 수용성 HA 수식물을 콘쥬게이트로 해도 된다.

본 발명의 수용성 HA 수식물과 약물로 이루어지는 콘쥬게이트의 조제 방법은, 기지의 폴리머의, 약물과의 콘쥬게이트화에서 사용되고 있는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 수용성 HA 수식물의 아미노기와, 약물의 카르복시기와의 탈수 축합 반응; 약물의 아미노기와, 수용성 HA 수식물의 카르복시기와의 탈수 축합 반응;

수용성 HA 수식물의 아미노기와, 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실아지드, N-히드록시숙신산이미드 (이하, 「NHS」라고도 한다) 에스테르 및 에폭사이드 등으로서 수식기가 도입된 약물의 반응; 약물의 아미노기와, 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실아지드, NHS 에스테르 및 에폭사이드 등으로서 수식기가 도입된 수용성 HA 수식물의 반응;

수용성 HA 수식물의 아미노기와, 알데히드 및 케톤 등의 카르보닐화물로서 수식기가 도입된 약물의 시프 염기 형성 및 환원 아미노화 반응; 약물의 아미노기와, 알데히드 및 케톤 등의 카르보닐화물로서 수식기가 도입된 수용성 HA 수식물의 시프 염기 형성 및 환원 아미노화 반응;

수용성 HA 수식물에 도입한 메르캅토기와, 말레이미드, 아크릴에스테르, 아크릴아미드, 메타크릴에스테르, 메타크릴아미드, 알릴화물, 비닐술폰 및 메르캅토화물 등으로서 수식기가 도입된 약물의 반응; 약물에 도입한 메르캅토기와, 말레이미드, 아크릴에스테르, 아크릴아미드, 메타크릴에스테르, 메타크릴아미드, 알릴화물, 비닐술폰 및 메르캅토화물 등으로서 수식기가 도입된 수용성 HA 수식물의 반응;

수용성 HA 수식물에 도입한 아비딘과, 약물에 도입한 비오틴의 결합; 약물에 도입한 아비딘과, 수용성 HA 수식물에 도입한 비오틴의 결합;

등을 이용할 수 있다. 수용성 HA 수식물 또는 약물에 이들의 수식기 (아비딘 및 비오틴 유래의 기를 포함한다) 를 도입하기 위해서는, 이들 수식기 및 카르복시기 (이 카르복시기는 NHS 에스테르 등의 활성 에스테르로 되어 있어도 된다) 로부터 임의로 선택되는 2개 이상, 바람직하게는 2개의 기를 분자내에 갖는 화합물이 사용되고, 이 화합물에 있어서는 이들 기 이외의 분자내 구조는, 콘쥬게이트를 조제하기까지의 사이에 부적당한 반응이 진행되지 않는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 그 화합물은 시약으로서 입수 가능하거나, 또는 문헌에 공지된 방법을 참고하여 합성해도 된다.

구체적으로는, 치환 아미드기의 치환기가 아미노기를 포함하는 본 발명의 수용성 HA 수식물을 합성하고, 여기서, 아미노기의 일부를 N-숙신이미딜 3-[2-피리딜디티오]프로피오네이트 (N-Succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]propinate; SPDP) 와 반응시켜, 메르캅토기를 도입한 HA (이하, 「HA-SH」라고도 한다) 를 조제한다.

이 때, 잉여 아미노기는, 예를 들어 무수 숙신산 등으로 처리, 카르복시기로 되돌려 토탈 전하를 음이온성으로 하는 편이 바람직하다. 한편에서, 단백질에 메르캅토기와 특이적으로 반응하는 수식기를 도입하여, 말레이미드, 비닐술폰 등으로 한다. 이것을 HA-SH 와 반응시켜 콘쥬게이트를 조제해도 된다. 또 반대로, 예를 들어, 치환 아미드기의 치환기가 아미노기를 포함하는 본 발명의 수용성 HA 수식물의 아미노기를 말레이미드부티릴옥시술포숙신이미드와 반응시켜 말레이미드기가 도입된 수용성 HA 수식물 (이하, 「HA-AM-MI」라고도 한다) 로 하고, 추가로, 메르캅토기 함유 단백질 또는 펩티드 등의 약물과 반응시켜 콘쥬게이트를 조제해도 된다. 또는, 치환 아미드기의 치환기가 아미노기를 포함하는 본 발명의 수용성 HA 수식물의 아미노기의 일부를 Sulfo-KMUS (도진도 화학사, PIERCE (피어스) 사 등에 의해 판매) 등의 말레이미드기 함유 화합물과 반응시켜 HA-AM-MI 로 하고, 잉여의 AM 기는 예를 들어 무수 숙신산등으로 처리한다. 한편에서 단백질에 시스테인을 도입하거나, 또는 메르캅토기를 갖는 링커를 반응시켜 두고, 이것을 HA-AM-MI 와 반응시켜 콘쥬게이트를 조제해도 된다.

여기서, 당해 콘쥬게이트의 생물 활성을 유효하게 유지하기 위해서는, 약물과 수용성 HA 수식물 주쇄 사이의 스페이서 길이를 조절하는 것, 또는 부위 특이적인 콘쥬게이트로 할 수도 있다.

또한, 본 발명은, 상기 수용성 히알루론산 수식물을 가교함으로써 얻어지는 히알루론산 겔에도 관한 것이다. 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물을 사용한 약물 서방 겔은, 예를 들어, 약물 공존하의 용액 중에서 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기를 도입한 히알루론산 유도체를 메르캅토기 함유 화합물로 가교함으로 써, 약물을 봉입할 수 있다. 여기서 가교란, 공유 결합에 의한 분자간 또는 분자내 가교를 포함하는 것으로, 동시에 분자간 및 분자내 가교를 갖는 경우도 있다.

가교시의 pH 는 특별히 한정되지 않지만, 단백질 또는 펩티드를 변성시키지 않고서 불포화기와 메르캅토기의 선택적 반응을 우선시켜, 단백질 또는 펩티드 함유 아미노기와의 반응을 막는 pH 가 바람직하다. 그와 같은 pH 는 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능한데, 예를 들어 pH 6.0∼9.5, 바람직하게는 pH 7.0∼9.5 이다.

HA 에 메타크릴로일기를 도입한 본 발명의 수용성 HA 수식물에 사용되는 가교제로는, 불포화 결합과 구핵 부가 반응에서 반응하는 메르캅토기를 2개 이상 동일 분자에 함유하는 화합물이 사용된다. 예를 들어, 디티오트레이톨 (이하, 「DTT」라고도 한다), 부탄디티올, 폴리에틸렌글리콜디티올, 시스테인을 2개 이상 함유하는 펩티드 등을 들 수 있다.

약물을 공존시키는 용액에 있어서의 용매로는, 본 발명의 HA 수식물 및 봉입하는 약물이 용해되고, 또한 봉입하는 약물이 변성되지 않는 용매이면 되고, 예를 들어, 물, 에탄올, 아세톤, 이소프로필알코올 및 아세토니트릴 그리고 이들의 혼합 용매를 들 수 있고, 바람직하게는 물과 에탄올의 혼합 용매 및 물 등을 들 수 있다.

메르캅토기의 불포화 결합을 갖는 기에 대한 비율은 특별히 한정되지 않고 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하지만, 단백질, 펩티드와의 반응을 최소로 하고, 또한 불포화기의 겔 중의 잔존을 막으며, 또, 빠르게 반응시키기 위해서 메르 캅토기:불포화 결합을 갖는 기=3:1∼1:3 이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 2:1∼1:2 이다.

또한, 가교 반응시의 단백질 또는 펩티드의 안정성 향상, 반응 속도의 향상을 위해 트리에탄올아민 등의 염기성 화합물을 첨가하는 것이 바람직하다. 이 때 바람직한 농도로는, 10∼20μL/mL 이다.

그리고, 본 발명은, 본 발명의 히알루론산 수식물로 이루어지는 히알루론산 겔 미립자에도 관한 것이다. 본 발명의 히알루론산 수식물을 사용하여, 가교 히알루론산 겔 미립자를 제조하는 방법으로는,

a) 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물을 함유하는 희박 용액을 조제하는 공정;

b) 당해 용액을 미립자상의 액적으로 분산시키는 공정; 및

c) 당해 액적에 함유되는 용액의 농축에 의해 당해 히알루론산 수식물의 가교 반응을 진행시키는 공정을 포함하는 제조 방법이 바람직하다. 당해 제조 방법의 공정 a) 에 있어서의 희박 용액은, 가교 반응에 필요한 기질 및 시약 등을 함유하는 용액이지만 용매에 의해 고도로 희석되어 있기 때문에 반응이 진행되지 않거나 또는 진행이 매우 느린 용액으로, 그 농도는 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 0.1%∼5%, 바람직하게는 0.2%∼3% 이다. 또한 본 발명에 사용하는 용매로는, 당해 기술 분야에 있어서 통상적으로 사용되고 있는 용매 또는 그들의 혼합물을 사용할 수 있고, 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 물, DMSO, 에탄올, N-메틸피롤리돈, 초임계 탄산액 등이다. 이 제조 방법에 의해 얻어진 가교 히알루 론산 겔 미립자는, 바람직하게는 인젝터블인 것이다.

상기 제조 방법의 공정 b) 의 희박 용액을 미립자상의 액적으로 분산시키는 방법에는 당해 기술 분야에 있어서 통상적으로 사용되는 방법이면 특별히 한정되지 않지만, 당해 희박 용액을 분무하는 방법, 당해 희박 용액을 별도의 액체와 혼합함으로써 에멀션을 형성하는 방법 등이 포함되고, 당해 희박 용액을 분무하는 방법이 바람직하다. 여기서 미립자상의 액적은 특별히 한정되지 않지만 예를 들어 0.01㎛∼1.5㎜, 바람직하게는 0.1㎛∼500㎛ 의 평균 입자 직경을 가질 수 있다.

상기 제조 방법의 공정 c) 에 있어서의 용액의 농축의 방법은, 가교 반응의 진행을 보다 빠르게 하는 농도까지 농축할 수 있는 수단이면 특별히 한정되지 않는다. 또한 당해 농축에는, 예를 들어, 당해 가교 반응이 고상 반응으로서 진행하는 용매가 완전히 제거된 상태도 포함된다.

본 발명의 가교 히알루론산 겔 미립자는, 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 히알루론산 수식물을 함유하는 용액을, 가교 반응의 진행이 느린 희박한 상태로부터 가교 반응이 진행되는 농도로 농축하는 것에 의해, 농축 중에 가교함으로써 제조할 수 있다. 또한, 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 히알루론산 수식물과 약물을 함유하는 용액을, 가교 반응의 진행이 느린 희박한 상태로부터 가교 반응이 진행되는 농도로 농축함으로써 농축 중에 가교 반응을 일으켜, 가교 반응과 건조를 동시에 실시함으로써 약물을 히알루론산 가교체 내에 봉입한 약물 담지 미립자로 하는 것을 특징으로 한다.

더욱 구체적으로는, 본 발명의 가교 히알루론산 겔 미립자의 제조 방법으로 는, 미립자의 용매 증류 제거에 의한 건조와 가교 반응이 동시에 진행되는 제조 방법이면 된다. 예를 들어, 액체를 분무 건조시키는 스프레이 드라이어를 사용하여, 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 히알루론산 수식물과 약물을 함유하는 용액을 분무 건조시킴으로써, 농축 건조 중에 히알루론산 수식물을 가교하고, 약물을 히알루론산 가교체 내에 봉입한 약물 담지 미립자를 얻으면 된다. 스프레이 드라이를 사용한 경우에는, 약물의 변성을 막기 위해서 건조 온도는 100℃ 이하인 것이 바람직하다.

이렇게 해서, 가교 반응전의 희박 용액이 약물을 함유하고, 당해 약물이 가교 반응후에 얻어지는 미립자 중에 담지되어 있는, 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물을 기재로 한 히알루론산 겔 미립자를 얻을 수 있다.

또는, 가교 반응 가능한 HA 수식물 (테트라부틸암모늄염) 과 약물을 DMSO 등의 극성 유기용매에 녹여 두고, 이산화탄소 등의 초임계 액체의 첨가에 의해 극성 유기용매를 추출하여 히알루론산 수식물을 농축함으로써 히알루론산 수식물의 가교 반응을 일어나게 하여 미립자를 얻어도 된다. 이들 미립자화 방법을 사용할 때에는, Tween-20, Tween-80 등의 계면 활성제를 첨가 (1%∼2% 정도) 함으로써, 생성된 미립자의 회수율을 높일 수 있다. 당해 제조 방법에 있어서는, 농축전의 히알루론산 수식물의 용액은 가교 반응을 일으키지 않을 정도의 농도이어야 하고, 구체적으로는 히알루론산 수식물의 농도는 0.1%∼5% 가 바람직하다.

또한, 별도 방법으로는, 가교 반응 가능한 관능기를 갖는 히알루론산 수식물과 약물을 함유하는 수용액을 탈수성을 갖는 액체 (예를 들어, 분자량 400달톤의 폴리에틸렌글리콜 등) 중에 에멀션화함으로써, 탈수 농축 중에 히알루론산을 가교하고, 약물을 히알루론산 가교체 내에 봉입한 약물 담지 미립자를 얻을 수도 있다. 이 방법을 사용할 때에는, 봉입 효율을 높이기 위해, 양이온성이거나 비이온성의 약물이 바람직하다.

또한, 미립자 형성후에 열처리함으로써 더욱 함수율을 저하시키고, 가교 반응을 완전히 종료시키는 편이 바람직하다. 이 경우, 가교 밀도도 높아져, 서방 기간의 연장도 기대할 수 있다.

또,

a) 본 발명의 히알루론산 수식물을 가교하여, 히알루론산 겔을 얻는 공정;

b) 얻어진 히알루론산 겔을 건조시키는 공정;

c) 얻어진 건조물을 동결시키는 공정; 및

d) 얻어진 동결물을 분쇄하는 공정을 포함하는 제조 방법에 의해, 가교 히알루론산 겔 미립자를 제조할 수 있다.

당해 제조 방법의 공정 a) 에 있어서의 가교시에 약물을 봉입함으로써 약물 담지 겔을 얻을 수 있고, 당해 겔을 사용함으로써, 약물을 히알루론산 가교체 내에 봉입한 약물 담지 겔 미립자를 얻을 수도 있다.

당해 제조 방법의 공정 b) 에 있어서의 건조 방법으로는, 예를 들어 통풍 건조, 일광 조사에 의한 건조, 항온조 중에서의 건조, 감압 하에서의 건조, 열풍 순환식 건조 등을 들 수 있으며, 겔 중에 봉입하는 약물의 성질 등을 고려하여 적절히 선택된다. 풍속, 건조 시간, 온도, 압력은 본 발명의 히알루론산 겔이 분해 나 변질을 일으키지 않는 범위에서 적절히 선택되는데, 항온조 중에서의 건조의 경우, 온도는 30∼60℃ 가 바람직하고, 30∼45℃ 가 더욱 바람직하다. 공정 b) 에 의해, 공정 a) 에서 얻어진 히알루론산 겔의 서방성을 더욱 향상시킬 수도 있다.

당해 제조 방법의 공정 c) 에 있어서의 동결 방법은, 건조된 히알루론산 겔의 동결을 달성할 수 있는 방법이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 드라이 아이스, 액체 질소, 액체 산소, 액체 헬륨과 접촉시키는 방법을 들 수 있고, 또한, 이들에 의해 냉각된 금속과 접촉시켜도 된다. 접촉시키는 시간은 특별히 한정되지는 않지만, 3∼30분간이 바람직하고, 10∼15분간이 더욱 바람직하다.

당해 제조 방법의 공정 d) 에 있어서의 분쇄 방법으로는, 막자사발을 사용하는 분쇄나 밀을 사용하는 분쇄를 들 수 있지만, 밀을 사용하는 분쇄가 바람직하다. 밀 분쇄 장치로는, 원심식 분쇄기 (니혼 세이키 제작소) 및 임팩트밀 (주식회사 달톤) 등의 회전 원판형의 분쇄 장치, 아토마이저 (도쿄 아토마이저 제조 주식회사), 샘플 밀 (도쿄 아토마이저 제조 주식회사), 밴텀 밀 (도쿄 아토마이저 제조 주식회사), 및 SK 밀 (토켄) 등의 스크린 밀 분쇄 장치, 초미소량 라보젯 밀 (A-0 젯밀, 세이신 기업) 등의 젯 분쇄 장치, 그리고, 초저온에서의 분쇄가 가능한 린렉스 밀 (리퀴드 가스 주식회사) 등을 들 수 있지만, SK 밀 및 린렉스 밀이 바람직하다.

또한, 공정 c) 의 동결과 공정 d) 의 분쇄 공정을 2∼10회, 바람직하게는 3∼5회 반복해도 된다.

이들 방법에 따라서 얻어진 히알루론산 겔 미립자의 미립자 직경은 용도에 따라서 최적화하면 되지만, 인젝터블로 하기 위해서 통상, 0.01㎛∼150㎛ 가 바람직하다. 경피 투여시에는 0.01㎛∼150㎛ 가 바람직하고, 경비, 경폐 투여시에는 0.01㎛∼5㎛ 가 흡입 효율의 면에서 바람직하며, 정맥 주사 투여시에는 0.01㎛∼0.2㎛ 정도가 혈중 동태의 면에서 바람직하다.

또한, 본 발명의 수용성 HA 수식물은 약물과의 콘쥬게이트 이외에도, 고분자 미셀, 리포솜, 나노 미립자 등의 미립자성 약물 캐리어에 있어서, 그 혈중 체류 시간의 연장을 목적으로 하여 표면 수식에 사용할 수도 있다. 여기서 표면 수식이란 다른 합성 고분자, 천연 고분자, 지질, 금속, 세라믹스 또는 그들의 복합체 등으로 이루어지는 물질의 표면에, 본 발명의 수용성 HA 수식물을 화학적으로 결합 또는 물리적으로 흡착시키고, 또는 화학적으로 결합 또는 물리적으로 흡착시킨 본 발명의 수용성 HA 수식물을 추가로 가교함으로써, 당해 물질의 최표면에 본 발명의 수용성 HA 수식물 또는 그 가교체가 존재하고 있는 상태를 가리킨다. 예를 들어, 본 발명의 수용성 HA 수식물과 PLGA 등의 소수성 고분자를 결합시킨 화합물을 함유하는 고분자 미셀이나, 본 발명의 수용성 HA 수식물을 인지질에 결합시킨 리포솜, 또는, 본 발명의 수용성 HA 수식물에 소수성 분자를 결합시키고, 소수성 상호 작용에 의해 소수성 미립자 표면을 코트한 미립자, 또는 상기 코트후 추가로 가교한 미립자 약물 담체 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 히알루론산 겔 미립자는, 본 발명의 히알루론산 수식물과 마찬가지로, 약물 담체로서도 사용할 수 있다. 여기서, 본 발명의 히알루론산 겔 미립자로 이루어지는 약물 담체란, 질환의 치료 또는 진단을 위해 사용되는 미립자상의 약물 담체를 의미한다. 당해 담체의 입경은 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어 1㎚∼200㎛ 이다.

본 발명의 히알루론산 겔 미립자는, 바람직하게는 약물 서방 담체이다.

담지되는 약물의 서방 성능은, 가교된 본 발명의 수용성 히알루론산 수식물의 가교 밀도에 크게 의존하기 때문에, 카르복시기 수식률을 제어함으로써 약물의 서방 성능을 제어할 수 있다.

또한, 본 발명의 수용성 HA 수식물 및 그것을 가교하여 얻어지는 HA 겔을 외과 수술후의 유착 방지제 등의 의료용 디바이스의 성분으로 할 수도 있다. 본 발명에 있어서의 의료용 디바이스란, 질환의 치료 또는 진단, 또는 그들의 보조에 사용되는 디바이스이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 인공 장기, 임플란트, 카테터, 약물 내포 겔, 약물 내포 펠릿 등이 포함된다.

상기 의료용 디바이스의 구체예로는, 본 발명의 수용성 HA 수식물로 표면 수식을 실시한 의료용 디바이스를 들 수 있다.

또, 본 발명의 히알루론산 수식물과 결합시키는 약물 및 본 발명의 히알루론산 겔에 봉입하는 약물 (저분자 화합물, 단백질, 펩티드, 및 핵산) 의 예로는, 이하의 것을 들 수 있다.

저분자 화합물의 예로는, 예를 들어 제암제 (예를 들어, 알킬화제, 대사 길항제, 알칼로이드 등), 면역 억제제, 항염증제 (스테로이드제, 비스테로이드제계 항염증제 등), 항류머티즘제, 항균제 (β-락탐계 항생 물질, 아미노글리코시드계 항생 물질, 매크로라이드계 항생 물질, 테트라사이클린계 항생 물질, 신(新)퀴놀론계 항생 물질, 설파제 등) 등을 들 수 있다.

단백질, 펩티드의 예로는, 예를 들어 에리스로포이에틴 (EPO), 그래뉼로사이토콜로니 자극 인자 (G-CSF), 인터페론-α, β, γ, (INF-α, β, γ), 트롬보포이에틴 (TPO), 시리얼리뉴트로픽 팩터 (CNTF), 튜머네크로시스 팩터 (TNF), 튜머네크로시스 팩터 결합 단백질 (TNFbp), 인터루킨-10 (IL-10), FMS 유사 티로신카이네스 (Flt-3), 성장 호르몬 (GH), 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인터루킨-1 리셉터 앤타고니스트 (IL-1ra), 브레인 유래 뉴로트로픽 팩터 (BDNF), 케라티노사이트 성장 인자 (KGF), 줄기세포 인자 (SCF), 메가카리오사이트 성장 분화 인자 (MGDF), 오스테오프로테게린 (OPG), 렙틴, 부갑상선 호르몬 (PTH), 염기성 피브로블라스트 성장 인자 (b-FGF), 골 형성 단백질 (BMP), 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 (ANP), 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드 (BNP), C 형 나트륨 이뇨 펩티드 (CNP), 글루카곤 유사 펩티드-1 (GLP-1), 항체, 다이아 보디, 미니 보디, 단편화 항체 등을 들 수 있다.

핵산의 예로는, 예를 들어, DNA, RNA, 안티센스, 디코이, 리보자임, small interfering RNA 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 히알루론산 겔에 봉입하는 약물로는, 상기 서술한 약물과 고분자의 콘쥬게이트가 바람직하다. 이 경우에 사용되는 고분자로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, PEG, HA, HA 수식물, 덱스트란, 풀루란, 폴리글루타메이트, 폴리시알산 등을 들 수 있다.

본 발명의 수용성 HA 수식물, 히알루론산 겔 및 히알루론산 겔 미립자는, 약물과의 콘쥬게이트로서, 또는 약물을 봉입하여, 1종 또는 그 이상의 약학적으로 허용할 수 있는 희석제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보조제, 방부제, 완충제, 결합제, 안정제 등을 함유하는 의약 조성물로서, 목적으로 하는 투여 경로에 따라서 적당한 임의의 형태로 하여 투여할 수 있다. 투여 경로는 비경구적 경로이거나 경구적 경로일 수도 있다.

본 발명에 의해, 종래의 방법에서는 얻어지지 않던, 실용적인 레벨까지 혈중 체류 시간이 연장된 수용성 HA 수식물을 제조하는 것이 가능해진다. 그리고 본 발명에 의해 제공되는 수용성 HA 수식물을 담체에 사용하고, 약물을 콘쥬게이트화함으로써, 종래의 기술에서는 달성할 수 없었던, 실용적이고 또한 안전한 의약 조성물을 제공하는 것이 가능하다.

또, 본 발명의 수용성 HA 수식물을 사용함으로써, 종래의 HA 수식물에서는 얻어지지 않던, 단백질, 펩티드, 핵산, 저분자 화합물, 또는 그들과 고분자의 콘쥬게이트를 봉입하여, 장기간 서방할 수 있는 안전성이 높은 히알루론산 겔 서방 제제, 의약 조성물을 제공하는 것이 가능하다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 관해서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

NMR 측정은, 핵자기 공명 장치 JNM-ECA500 (닛폰 전자 주식회사 제조) 을 사용하여 측정하였다. NMR 의 측정 조건을 이하에 나타낸다.

NMR 측정 조건

Data point: 16384

Spectral width (X sweep): 15ppm

Acquisition time (X acq time): 1.749s

Pulse delay (Relaxation delay): 30s

Transients (Scans): 64

온도: 실온

측정 용매: D₂O

또한, 이하의 기재 중의 HA 유닛이란, 히알루론산 중의 N-아세틸글루코사민-글루쿠론산의 반복 단위 (1 유닛) 를 의미한다.

[실시예 1]

비프로톤성 극성 용매 중에서의 히알루론산 수식물의 합성 (축합제, 용매 혼합 비율, 효소 분해성)

비극성 용매 중에 있어서의 다양한 합성 조건을 검토하여, 각 조건에서 얻어진 히알루론산 수식물의 효소 내성을 평가하였다.

(실시예 1-1)

테트라부틸하이드로옥사이드 (시그마 알드리치사 제조) 로 테트라부틸암모늄 (TBA) 염화한 DOWEX 50WX8-400 (시그마 알드리치사 제조) 을 사용하여, 분자량 200kDa 의 히알루론산나트륨 (HA; 덴키 화학 공업 주식회사 제조) 을 TBA 염화하였 다. 얻어진 테트라부틸암모늄염화히알루론산 (이하, 「HA-TBA」라고도 한다) 29.1㎎ 을 2.0㎎/mL 농도가 되도록 DMSO (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 에 용해하였다. HA 유닛/BOP (와코 쥰야쿠 주식회사 제조)/에틸렌디아민 (이하, 「EDA」라고도 한다; 시그마 알드리치사 제조)=1/2.5/100 (㏖/㏖/㏖) 의 당량비로 EDA, BOP 의 순으로 첨가하여, 실온하에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 1M NaCl 수용액을 10mL 첨가한 후, 5N HCl 을 첨가하여 pH 를 3 까지 저하시키고, 또 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 대과잉량의 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (이하, 「MWCO」라고도 한다):12k-14kDa), 한외 여과후 (YM-10, MILLIPORE 사 제조), 동결 건조시켜 표제의 아미노기가 도입된 히알루론산 (이하, 「HA-AM」이라고도 한다) 25.8㎎ 을 얻었다.

(실시예 1-2)

에틸렌디아민 대신에 2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민) (이하, 「EDOBEA」라고도 한다; 시그마 알드리치사 제조) 을 사용하고, HA-TBA 35.1㎎ 을 사용하여, HA 유닛/BOP/EDOBEA=1/2.5/50 (㏖/㏖/㏖) 의 당량비로 반응시킨 것 이외에는 실시예 1-1 과 동일한 방법으로 실시하여, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 27.2㎎ 을 얻었다.

(실시예 1-3)

EDOBEA 대신에 헥사메틸렌디아민 (HMDA; 시그마 알드리치사 제조) 을 사용하고, HA-TBA 62.0㎎ 을 사용한 것 외에는 실시예 1-2 와 동일한 방법으로 실시하여, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 41.1㎎ 을 얻었다.

(실시예 1-4)

BOP 대신에 PyBOP (코쿠산 화학 주식회사 제조) 를 사용하고, HA-TBA 51.8㎎ 을 사용한 것 외에는 실시예 1-2 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 39.0㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-1)

DMSO 대신에 물을 사용하고, BOP 대신에 EDC (시그마 알드리치사 제조) 를 사용하고, 50.0㎎ 의 HA (나트륨염) 를 1.0㎎/mL 농도로 하고, HA 유닛/EDC/에틸렌디아민ㆍ2HCl (이하, 「EDAㆍ2HCl」이라고도 한다; 와코 쥰야쿠 주식회사 제조)=1/4/100 (㏖/㏖/㏖) 의 당량비로 하였다. pH 는 7.0 으로 조정하여 하룻밤 반응시켰다. 그 이외에는 실시예 1-1 과 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 36.1㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-2)

DMSO 대신에 물/에탄올 (90/10) 을 사용한 것 외에는 비교예 1-1 과 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 36.0㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-3)

DMSO 대신에 물/에탄올 (70/30) 을 사용한 것 외에는 비교예 1-1 과 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 38.3㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-4)

EDC 대신에 EDC/HODhbt (와타나베 화학 공업 주식회사 제조) 를 사용하고, HA 유닛/EDC/HODhbt/EDAㆍ2HCl=1/4/4/100 (㏖/㏖/㏖/㏖) 의 당량비로 한 것 외에는 비교예 1-3 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 49.3㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-5)

DMSO 대신에 물/DMSO (60/40) 를 사용하고, HA 유닛/EDC/EDAㆍ2HCl=1/2/50 (㏖/㏖/㏖) 의 당량비로 한 것 외에는 비교예 1-1 과 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 44.0㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-6)

EDC 대신에 BOP 를 사용한 것 외에는 비교예 1-5 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 42.1㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-7)

EDAㆍ2HCl 대신에 헥사메틸렌디아민ㆍ2HCl (HMDAㆍ2HCl; 도쿄 화성 공업 주식회사 제조) 을 사용한 것 외에는 비교예 1-1 과 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 35.2㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-8)

EDAㆍ2HCl 대신에 HMDAㆍ2HCl 을 사용한 것 외에는 비교예 1-3 과 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 33.3㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-9)

EDAㆍ2HCl 대신에 HMDAㆍ2HCl 을 사용하고, 물/에탄올 (60/40) 을 사용한 것 외에는 비교예 1-3 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 33.6㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-10)

EDAㆍ2HCl 대신에 HMDAㆍ2HCl 을 사용하고, 물/에탄올 (60/40) 을 사용한 것 외에는 비교예 1-4 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 48.4㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-11)

물/DMSO (60/40) 대신에 물/DMSO (50/50) 를 사용하고, 51.9㎎ 의 HA 를 사용한 것 외에는 비교예 1-5 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 47.5㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-12)

BOP 대신에 DCC (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 를 사용하고, 69.9㎎ 의 HA-TBA 를 4.0㎎/mL 농도로 하고, HA 유닛/DCC/EDOBEA=1/4/100 (㏖/㏖/㏖) 의 당량비로 한 것 외에는 실시예 1-2 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 54.5㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-13)

BOP 대신에 DCC 를 사용하고, 54.1㎎ 의 HA-TBA 를 사용한 것 외에는 실시예 1-1 과 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 40.7㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-14)

BOP 대신에 CDI (시그마 알드리치사 제조) 를 사용하고, 50.0㎎ 의 HA-TBA 를 사용한 것 외에는 실시예 1-1 과 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론 산 (HA-AM) 31.6㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-15)

BOP 대신에 EDC 를 사용하고, 46.4㎎ 의 HA-TBA를 사용한 것 외에는 실시예 1-2 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 30.4㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-16)

BOP 대신에 EEDQ (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 를 사용하고, 58.4㎎ 의 HA-TBA 를 사용한 것 외에는 실시예 1-2 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 39.5㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-17)

EEDQ 대신에 DMT-MM (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 을 사용하고, 53.5㎎ 의 HA-TBA 를 사용한 것 외에는 실시예 1-2 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 33.2㎎ 을 얻었다.

(비교예 1-18)

DMT-MM 대신에 TBTU (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 를 사용하고, 56.0㎎ 의 HA-TBA 를 사용한 것 외에는 실시예 1-2 와 동일한 방법으로, 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 30.0㎎ 을 얻었다.

(시험예 1) 효소 분해성 평가

실시예 1-1∼1-4 및 비교예 1-1∼1-18 에서 얻어진 HA-AM 을 2㎎/mL 농도로 증류수 (밀리 Q 워터) 에 용해하였다. 이 용액 55μL 에 0.2M 인산 완충액 (pH 6.2) 132μL 및 물 77μL 를 첨가하고, 히알루로니다아제 SD (세이카가쿠 공업 주식회사 제조) 1U/mL 용액 (0.01% BSA 를 함유하는 0.05M 인산 완충액 (pH 6.2)) 44μL 를 첨가하여 37℃ 에서 24시간 인큐베이트하였다. 각 샘플 100μL 를 분취하고, 50mM 아세트산 용액을 720μL 첨가하여 반응을 정지시켰다. 대조로서 효소 비첨가군도 동일하게 실시하였다 (데이터 생략). 각각 겔 침투 크로마토그래피 (이하, 「GPC」라고도 한다) 를 실시하여 HA-AM 의 분자량 변화, 분해 산물의 생성 패턴을 관찰하였다 (232㎚ 의 흡수). GPC 의 조건을 이하에 나타낸다.

GPC 측정 조건

GPC Column: Superdex200 10/300 GL, Superdex75HR 10/30, Superdex PeptideHR 10/30 (아마샴 바이오사이언스 주식회사 제조) (3개 연결)

Eluent: PBS (pH 7.4)

Flow Rate: 0.4mL/min

Injection Volume: 50μL

Detection: UV (232㎚)

2당 분해 피크 (Retention Time: 130분) 가 관찰된 것을 ×, 관찰되지 않은 것을 ○ 로 평가하여, 표 1 에 나타낸다. 또한, 전형적인 GPC 데이터를 도 1 및 도 2 에 나타낸다 (실시예 1-1∼1-4, 비교예 1-3, 1-5, 1-6, 1-14, 참고예).

또한, 실시예 1-1∼1-4 의 아미노기 도입률을 프로톤 NMR 법으로 정량하였다 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.8∼1.9ppm, AM: 에틸렌디아민 부분의 메틸렌프로톤, 2.9∼3.1ppm). 프로톤 NMR 데이터를 도 3 에 나타낸다. 아미노기 도입 률은 각각 97.5, 75.5, 88.3, 84.5% 였다.

또, CDI 를 사용한 도입 (비교예 1-14) 에 있어서의, 반응 전후에서의 겔 침투 크로마토그램을 도 4 에 나타낸다. 또한, 이하에 GPC 조건을 나타낸다.

GPC 의 측정 조건

GPC Column: TSKgel G6000PW_XL (TOSOH 사 제조)

Eluent: PBS (pH 7.4)

Flow Rate: 0.5mL/min

Injection Volume: 50μL

Detection: UV (210㎚)

축합제로서 CDI 를 사용한 경우, 분명한 분해가 관찰되어, CDI 를 사용하는 축합에서는 HA 의 분자량이 극단적으로 저하된 것이 확인되었다. 또, 히알루로니다아제에 의한 분해에 대한 내성이 얻어지지 않았기 때문에, HA 로의 아미노 화합물의 도입에는 부적합하다는 것이 분명해졌다.

또, 본 시험예에 있어서는, a) 용매로서 DMSO 단독을 사용한다, b) 축합제로서 BOP 또는 PyBOP 를 사용한다, 는 조건의 양쪽을 만족하지 않는 경우에도, 히알루로니다아제에 의한 분해에 대한 내성이 얻어지지 않았기 때문에, HA 로의 아미노 화합물의 도입에는 부적합하다는 것이 분명해졌다.

[표 1]

합성 결과

[실시예 2]

BOP의 첨가율에 의한 디아민 화합물의 도입률 제어

디아민 화합물의 도입률을 제어하기 위해서 여러가지 비율로 축합제를 첨가하고, 효소 내성을 평가하였다.

HA (200kDa)-TBA 를 2.0㎎/mL 로 DMSO 에 용해한 용액을 3개 준비하고, 각 용액에 HA 유닛/에틸렌디아민 (EDA)=1/50 (㏖/㏖) 의 당량비로 EDA 를 첨가하고, BOP 시약을 HA 유닛에 대하여 각각 1.08, 1.5 또는 2.0 의 당량비로 첨가하여, 하룻밤 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물 용량의 절반량의 1M NaCl 수용액을 첨가한 후, 5N HCl 로 pH 를 3 까지 저하시킨 후, 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 그 후 대과잉량의 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 한외 여과후 (YM-10, MILLIPORE 사 제조), 동 결 건조를 실시하였다.

또한, HA (23kDa)-TBA 를 2.0㎎/mL 로 DMSO 에 용해한 용액을 3개 준비하고, 각 용액에 HA 유닛/2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민) (EDOBEA)=1/50 (㏖/㏖) 의 당량비로 EDOBEA 를 첨가하고, BOP 시약을 HA 유닛에 대하여 각각 1.0, 1.5 또는 2.0 의 당량비로 첨가하여, 하룻밤 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물 용량의 절반량의 1M NaCl 수용액을 첨가한 후, 5N HCl 로 pH 를 3 까지 저하시킨 후, 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 그 후 대과잉량의 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 한외 여과후 (YM-10, MILLIPORE 사 제조), 동결 건조를 실시하였다.

실시예 2 의 아미노기 도입률을 프로톤 NMR 법으로 정량하였다 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.8∼1.9ppm, AM: EDA 부분의 메틸렌프로톤, 2.9∼3.1ppm, EDOBEA 부분의 메틸렌프로톤, 2.9∼3.1ppm). 프로톤 NMR 데이터를 도 5 에 나타낸다. 또한, 각 HA 수식물의 히알루로니다아제 내성은 시험예 1 과 동일한 방법으로 평가하였다. 아미노기 도입률 및 히알루로니다아제 내성 평가의 결과를 표 2 에 나타낸다. 아미노기의 도입률은 BOP 의 첨가에 의해 제어 가능하여, 비프로톤 극성 유기용매 중에서 BOP 계 시약을 축합제로서 사용함으로써, 균일하면서 또한 높은 도입률까지의 도입이 가능하다는 것이 분명해졌다.

[표 2]

아미노기의 도입률 및 히알루로니다아제 내성 평가

HA 는 수중에서 분자내 수소 결합과, 분자내 및 분자밖의 소수성 상호 작용에 의해 2차 구조, 3차 구조를 형성하고 있음이 알려져 있어 (The Biology of Hyaluronan. Chiba Foundation Symposium 제143권, 6-14페이지 (1989년)), 균일한 화학 수식이 어려워져 있는 것으로 생각된다. 이 때문에, 수 중에서 HA 의 카르복시기의 다수를 수식하더라도, HA 수용체에 인식될 수 있는 연속한 4-6당의 미수식 도메인이 일부 잔존하고 있어, 여기가 체내의 HA 수용체에 결합됨으로써 비교적 단기간에 혈중으로부터 클리어되어 버리는 것으로 예상된다.

비프로톤성 극성 용매 중에서는 HA 의 수소 결합, 소수성 상호 작용이 적어지고 약해짐으로써 HA 의 고차 구조가 붕괴되어, 고차 구조 형성에 기초하는 카르복시기 주변 환경의 불균일성이 해소되어, 보다 균일한 화학 수식이 달성되고, 효소 내성이 얻어지는 것으로 생각된다.

[실시예 3]

카르복실산 변환한 HA 수식물의 히알루로니다아제 내성 평가

효소 내성을 보다 상세히 평가하기 위해, 도입한 1 급 아민을 카르복실산으로 변환한 HA 수식물 (HA-AM-SUC) 의 합성을 실시하여, 얻어진 HA 수식물의 효소 내성을 평가하였다.

(실시예 3-1) HA-AM 의 합성

HA (200kDa)-TBA 를 4.0㎎/mL 로 DMSO 에 용해한 용액을 6개 준비하고, 각 용액에 HA 유닛/EDOBEA=1/50 (㏖/㏖) 의 당량비로 2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민) (EDOBEA) 을 첨가하고, BOP 시약을 HA 유닛에 대하여, 0.4, 0.6, 1.0, 1.5, 1.85 또는 2.5 의 당량비로 첨가하여, 하룻밤 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물 용량의 절반량의 1M NaCl 수용액을 첨가하고, 5N HCl 로 pH 를 3 까지 저하시킨 후, 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 그 후 0.3M NaCl 수용액에 대하여 투석을 실시하고, 다음으로 대과잉량의 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 동결 건조를 실시하여, EDOBEA 도입 HA 수식물을 얻었다.

(실시예 3-2) 1 급 아민의 카르복실산으로의 변환

상기 (실시예 3-1) 에서 얻어진 샘플을 증류수 (밀리 Q 워터) 로 20.0㎎/mL 의 용액으로 하고, 이것에 0.2M 탄산 완충액 (pH 9.0) 을 첨가하여, 10.0㎎/mL 로 하였다. 이 용액에 HA 유닛 (1 유닛=반복 단위인 N-아세틸글루코사민-글루쿠론산) 에 대하여 20몰 배의 무수 숙신산 (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 을 HA-AM 용액의 1/10 용량의 DMSO 용액으로서 첨가하여 실온에서 30분간 교반하였다. 그 후 0.3M NaCl 수용액에 대하여 투석을 실시하고, 다음으로 대과잉량의 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 동결 건조를 실시하여, HA-AM-SUC 를 얻었다. NMR 스펙트럼을 도 6 에 나타내었다. 아미노기에 이웃하는 메틸렌의 피크 (2.9∼3.1) 가 완전히 소실되고, 새롭게 숙신산 유래의 피크 (2.4∼2.6ppm) 가 관찰되어, 아미노기가 카르복실산으로 변환되어 있음이 분명해졌다.

(실시예 3-3) 효소 분해성 평가

실시예 3-2 에서 얻어진 HA-AM-SUC 를 4㎎/mL 농도로 증류수 (밀리 Q 워터) 에 용해하였다. 이 용액 25μL 에 0.1M 인산 완충액 (pH 6.2) 200μL 및 물 25μL 를 첨가하고, 히알루로니다아제 SD (세이카가쿠 공업 주식회사 제조) 1U/mL 용액 (0.2M 인산 완충액; pH 6.2) 50μL 를 첨가하여 37℃ 에서 24시간 인큐베이트하였다. 각 샘플 100μL 를 분취하고, 50mM 아세트산 용액을 700μL 첨가하여 반응을 정지시켰다. 대조로서 효소 비첨가군도 동일하게 실시하였다 (데이터 생략). 각각 겔 침투 크로마토그래피 (이하, 「GPC」라고도 한다) 를 실시하여 HA-AM-SUC 의 분자량 변화, 분해 산물의 생성 패턴을 관찰하였다 (232㎚ 의 흡수). 결과를 도 7 및 표 3 에 나타낸다. 또한, GPC 의 조건을 이하에 나타낸다.

GPC 측정 조건

GPC Column: Superdex200 10/300 GL, Superdex PeptideHR 10/30 (아마샴 바이오사이언스 주식회사 제조) (2개 연결)

Eluent: PBS (pH 7.4)

Flow Rate: 0.4mL/min

Injection Volume: 50μL

Detection: UV (232㎚)

[표 3]

아미노기 수식률과 히알루로니다아제 내성의 상관

여기서 분해 산물 중의 2당 분율은 용매 유래의 피크 (Retention Time: 90분) 를 제외한 범위에서 100×(2당의 피크 에어리어)/(전체 피크 에어리어－효소 비첨가시 전체 피크 에어리어) (%) 로서 산출하였다. 효소 내성은 아민의 도입률, 즉 HA 의 카르복실산의 수식률에 대응하여 효소 내성이 향상되는 것이 분명해졌다.

[실시예 4]

다양한 관능기를 도입한 HA 수식물의 합성과 2성분의 관능기 도입률 제어

다양한 관능기의 도입에 대해 검토하였다. 또한 장기간의 혈중 체류성을 유지하고 반응성 관능기의 도입률 제어를 실시하기 위해 2개의 화합물을 도입하였다.

(실시예 4-1) 수산기를 도입한 HA 수식물 (HA-OH) 의 합성

(실시예 4-1-1) 아미노에탄올 (AEtOH) 도입 HA 수식물의 합성

HA (200kDa)-TBA 를 DMSO 에 용해하고 5.0㎎/mL 의 용액을 조제하고, 거기에 HA 유닛/1 급 아민=1/50 (㏖/㏖) 의 당량비로 아미노에탄올 (이하, 「AEtOH」라고도 한다; 시그마 알드리치사 제조) 을 첨가하고, 추가로 BOP 시약을 HA 유닛에 대하여 2.5의 당량비로 첨가하여 하룻밤 교반하였다. 그 후 반응 혼합물 용량의 절반량의 1M NaCl 수용액을 첨가한 후, 5N HCl 로 pH 를 3 까지 저하시킨 후, 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 그 후 대과잉량의 0.3M NaCl 수용액, 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 동결 건조를 실시하였다. 얻어진 샘플의 NMR 차트를 도 8 에 나타내었다.

(실시예 4-1-2) 2-(2-아미노에틸아미노)에탄올 (AEAEtOH) 을 도입한 HA 수식물의 합성

AEtOH 대신에 2-(2-아미노에틸아미노)에탄올 (이하, 「AEAEtOH」라고도 한다; 시그마 알드리치사 제조) 을 사용한 것 외에는 실시예 4-1-1 과 동일한 방법으로 실시하였다. 얻어진 샘플의 NMR 차트를 도 8 에 나타내었다.

실시예 4-1-1 및 4-1-2 에 있어서의 샘플의 ¹H-NMR 측정에서는, 각각에 있어 새로운 피크가 관찰되어 목적하는 변환이 달성되었음이 확인되었다. 그러나, 도입 화합물의 피크가 HA 유래의 피크와 겹치기 때문에 AEtOH 및 OH 및 AEAEtOH 의 도입률의 산출은 불가능하였다.

(실시예 4-2) 2 급 아민 및 수산기를 갖는 아민 화합물의 도입

(실시예 4-2-1) 디에틸렌트리아민 (DETA) 을 갖는 HA 수식물의 합성

HA (200kDa)-TBA 를 DMSO 에 용해하여 5.0㎎/mL 의 용액을 조제하고, 거기에 디에틸렌트리아민 (이하, 「DETA」라고도 한다; 시그마 알드리치사 제조) 을 HA 유닛/디에틸렌트리아민=1/100 (㏖/㏖) 의 당량비로 첨가하고, 추가로 BOP 시약을 HA 유닛에 대하여 1.5 의 당량비로 첨가하여 3시간 교반하였다. 그 후 반응 혼합물 용량의 절반량의 1M NaCl 수용액을 첨가하고, 5N HCl 로 pH 를 3 까지 저하시켜서, 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 그 후 대과잉량의 0.3M NaCl 수용액, 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 동결 건조를 실시하였다. 도입률은 프로톤 NMR 법에 의해 정량하였다. (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.8∼1.9ppm, AM: 디에틸렌트리아민 부분의 3개의 메틸렌프로톤, 2.6∼3.1ppm) 도입률은 89.8% 였다. 얻어진 샘플의 NMR 차트를 도 8 에 나타내었다.

(실시예 4-2-2) 1,3-디아미노-2-히드록시프로판 (DAHP) 을 갖는 HA 수식물의 합성

DETA 대신에 1,3-디아미노-2-히드록시프로판 (이하, 「DAHP」라고도 한다; 시그마 알드리치사 제조) 을 사용하고, DAHP 를 HA 유닛/DAHP=1/50 (㏖/㏖) 의 당량비로 첨가하고, 추가로 BOP 시약을 HA 유닛에 대하여 2.5 의 당량비로 첨가하여 하룻밤 교반한 것 외에는 실시예 4-2-1 과 동일한 방법으로 실시하였다. 도입률은 프로톤 NMR 법에 의해 정량하였다. (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.8∼1.9ppm, AM: 1,3-디아미노-2-히드록시프로판 부분의 메틴프로톤, 2.6∼2.8ppm) 도입률은 99.0% 였다. 얻어진 샘플의 NMR 차트를 도 8 에 나타내었다.

실시예 4-2-1 및 4-2-2 에 있어서의 ¹H-NMR 측정에 의해 알킬에 수산기가 부가된 디아민 화합물, 및 2 급 아민을 갖는 아민 화합물도 도입 가능한 것이 분명해졌다.

(실시예 4-3) 수산기 및 아미노기를 도입한 (HA-AM/OH) 의 합성

(실시예 4-3-1) 3-아미노프로판올 및 1,3-디아미노부탄을 도입한 HA 수식물의 합성

HA (200kDa)-TBA 를 5.0㎎/mL 의 농도로 DMSO 에 용해한 용액을 5개 준비하였다. 반응 시약은 3-아미노프로판올 (이하, 「APrOH」라고도 한다; 시그마 알드리치사 제조), 1,3-디아미노프로판 (이하, 「DAP」라고도 한다; 시그마 알드리치사 제조) 을 사용하고, HA 유닛/반응 시약의 아미노기 (APrOH＋DAP)=1/50 (㏖/㏖) 의 당량비로 고정하고, APrOH:DAP (㏖:㏖) 가 100:0, 95:2.5, 90:5, 80:10, 0:100 의 몰 비가 되도록 각 용액에 첨가하였다. 그 후, BOP 시약을 HA 유닛에 대하여 2.5 의 당량비로 각 용액에 첨가하였다. 그 후 반응 혼합물 용량의 절반량의 1M NaCl 수용액을 첨가하고, 5N HCl 로 pH 를 3 까지 저하시킨 후, 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 그 후 대과잉량의 0.3M NaCl 수용액, 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 동결 건조를 실시하였다. 아미노기 및 수산기의 도입률은 프로톤 NMR 법에 의해 정량하였다. NMR 차트를 도 9 에 나타낸다 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.8∼1.9ppm; AM: 디아미노프로판 부분의 메틸렌프로톤, 1.7∼1.8, 2.9∼3.0ppm; OH: 아미노프로판올의 메틸렌프로톤, 1.55∼1.65ppm).

각각 도입률은 100:0 (APrOH:DAP)=100몰%, 95:2.5 (APrOH:DAP)=88.4:10.7몰%, 90:5 (APrOH:DAP)=78.9:19.2몰%, 80:10 (APrOH:DAP)=63.8:36.0몰%, 0:100 (APrOH:DAP)=93.2몰% 였다 (이하, 도입률이 0:100 (APrOH:DAP)=93.2몰% 인 HA 수식물을 「HA-DAP」라고도 한다). 또한, GPC 차트를 도 10 에 나타내었다 (대조: 200kDa 의 히알루론산나트륨 (HA-Na)). 이온성기가 아닌 관능기를 도입함으로써, GPC 차트 상에서 피크가 저분자측으로 시프트하여 외관상 분자량이 저하되는 현상이 관찰되고, 정전적 또는 수소 결합적인 분자내의 상호 작용이 변화하였을 가능성이 시사되었다. 또한, AM 의 도입에 따라서 칼럼과의 상호 작용에 의해 피크가 저분자량측으로 시프트하는 것이 관찰되었다. 실시예 4-3-1 에 의해, 아미노기와 수산기를 갖는 수용성 HA 수식물의 합성이 가능하고, 그 도입률이 제어 가능한 것이 분명해졌다.

(실시예 4-3-2) (2-아미노에톡시)에탄올 (AEEtOH) 및 에틸렌디아민 (EDA) 을 도입한 HA 수식물의 합성

반응 시약인 아미노프로판올 (APrOH), 디아미노프로판 (DAP) 대신에 (2-아미노에톡시)에탄올 (이하, 「AEEtOH」라고도 한다; 시그마 알드리치사 제조), 에틸렌디아민 (EDA; 시그마 알드리치사 제조) 을 사용하고, HA 유닛/반응 시약의 아미노기 (AEEtOH＋EDA)=1/50 (㏖/㏖) 의 당량비로 고정하고, AEEtOH:EDA (㏖:㏖) 가 95:2.5, 90:5, 80:10 의 몰 비가 되도록 각 용액에 첨가하여, 반응시킨 것 외에는 실시예 4-3-1 과 동일한 방법으로 실시하였다. 아미노기의 도입률은 프로톤 NMR 법에 의해 정량하였다. NMR 차트를 도 11 에 나타낸다 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.8∼1.9ppm, AM: 에틸렌디아민 부분의 메틸렌프로톤, 2.9∼3.1ppm). 각각 AM (EDA) 의 도입률은 95:2.5 (AEEtOH:EDA)=13.0몰%, 90:5 (AEEtOHH:EDA)=20몰%, 80:10 (AEEtOH:EDA)=33.0몰% 였다. 또한, GPC 차트를 도 10 에 나타내었다. 실시예 4-3-1 과 동일하게 이온성기가 아닌 관능기를 도입함으로써, GPC 차트 상에서 피크가 저분자측으로 시프트하여 외관상 분자량이 저하되는 감소가 관찰되고, 정전적 또는 수소 결합적인 분자내의 상호 작용이 변화하였을 가능성이 시사되었다. 또한, AM 의 도입에 따라서 칼럼과의 상호 작용에 의해 피크가 저분자량측으로 시프트하는 것이 관찰되었다.

(실시예 4-4) 효소 분해성 평가

실시예 4-1 및 4-3 에서 얻어진 샘플을 4㎎/mL 의 농도로 증류수 (밀리 Q 워터) 에 용해한 것 외에는 실시예 3-3 과 동일하게 실시하였다. 또한, 해석에 관해서는 AM 기의 영향이 있기 때문에 2당 분율의 평가는 실시하지 않았다. 결과를 도 12, 13 에 나타낸다.

모든 샘플에 있어서, 2당의 분해물은 관찰되지 않고, 전하 및 반응성 관능기의 도입률 제어가 가능한 효소 내성을 갖는 HA 수식물이 합성 가능하다는 것이 시사되었다. 또, 2당의 분해물이 관찰되지 않았다는 것은, 히알루로니다아제로 분해하여 얻어지는 분해 산물의 232㎚ 에 있어서의 흡수를 측정한 경우, 분해 산물에서 유래하는 전체 피크 에어리어에 대한 2당에서 유래하는 피크 에어리어의 분율이 30% 이하였음을 의미한다.

[실시예 5]

히알루론산 수식물 (HA-AM-SUC) 의 분자량과 혈중 체류 시간과의 상관 (분자량 의존성)

히알루론산 수식물 (HA-AM-SUC) 의 혈중 체류성을 분자량의 관점에서 해석하기 위해, 23k, 100k 및 200kDa 의 HA 로 HA 수식물을 합성하고, 형광 색소인 FITC 를 도입한 샘플을 조제하여, 각각의 혈중 체류성을 관찰하였다.

(실시예 5-1) HA-AM 의 합성

HA (23kDa)-TBA 를 2㎎/mL 의 농도로 DMSO 에 용해하고, 또한 HA (100kDa)-TBA 및 HA (200kDa)-TBA 를 4㎎/mL 의 농도로 DMSO 에 용해한 용액을 조제하였다. HA 유닛/BOP/2,2'-(에틸렌디옥시)비스(에틸아민) (EDOBEA)=1/2.5/50 (㏖/㏖/㏖) 의 당량비로 EDOBEA, BOP 의 순으로 각 용액에 첨가하고, 실온하에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 반응 혼합물 용량의 절반량의 1M NaCl 수용액을 첨가한 후, 5N HCl 을 첨가하여 pH 를 3 까지 저하시키고, 추가로 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 대과잉량의 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 한외 여과후 (YM-10, MILLIPORE 사 제조), 동결 건조시켜 표제의 아미노기가 도입된 히알루론산 (HA-AM) 을 얻었다. 아미노기 도입률은 프로톤 NMR 법에 의해 정량하였다. NMR 차트를 도 14 에 나타낸다 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.8∼1.9ppm, AM: EDOBEA 부분의 메틸렌프로톤, 2.9∼3.1ppm). 각각 도입률은 23kDa:87몰%, 100kDa:92.5몰%, 200kDa:93.5몰% 였다.

(실시예 5-2) 형광 표지 HA 수식물의 합성

상기 (실시예 5-1) 에서 얻어진 HA-AM 을 증류수 (밀리 Q 워터) 로 용해하여 20.0㎎/mL 의 용액으로 하고, 이것에 0.2M 탄산 완충액 (pH 9.0) 을 첨가하여, 농도를 10.0㎎/mL 로 하였다. 이 용액에 HA 의 유닛 (1 유닛=반복 단위인 N-아세틸글루코사민-글루쿠론산) 에 대하여 0.07몰 배의 플루오레세인 이소티오시아네이트 (피어스사 제조) 를 HA-AM 용액의 1/10 용량의 DMSO 용액으로서 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 그 후, HA 의 유닛에 대하여 40몰 배의 무수 숙신산 (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 을 HA-AM 용액의 1/10 용량의 DMSO 용액으로서 첨가하여 실온에서 30분간 교반하였다. PD-10 칼럼 (아마샴 바이오사이언스 주식회사 제조) 에 의한 겔 여과에 의해 조정제한 후, 대과잉량의 0.5M NaCl 수용액에 대하여 투석 정제하였다 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa). 투석 외액을 증류수 (밀리 Q 워터) 로 치환하여 추가로 투석 정제하고, 얻어진 수용액을 동결 건조시켜 형광 표지 HA-AM-SUC 를 얻었다.

여기서 얻어진 각 형광 표지 HA-AM-SUC 를 0.25㎎/mL 농도로 50mM 탄산 완충액 (pH 9.0) 에 용해하고, 그 용액의 494㎚ 에서의 흡광도로부터 FITC 유래의 N-플루오로세이닐 티오카르바모일기의 몰 농도를 정량하여, 이하의 식에 따라서 각 유닛의 농도를 산출하였다. 또한, 몰 분율로의 변환, HA 수식물 중의 HA 유래 중량 분율 산출을 실시하였다.

미수식 HA 유닛: xμ㏖/mL

HA-AM-SUC 유닛: y㎛ol/mL (AM 이 무수 숙신산 처리된 유닛)

으로 정의하고, 이하의 식에서 산출하였다.

[화학식 8]

식 1 : (401.3 ×x) + ( 631.58 ×y) + ( 544.97 × (잔존 AM conc.)) +(898.9 × (FITC conc.)) = 250 mg

식 2 : x / (y + (잔존 AM conc.) + (FITC conc.)) = (100- AM(%))/ AM(%)

또, 식 중의 잔존 AM conc. 란 미반응의 아미노기를 갖는 유닛의 몰 농도를 의미하고, FITC conc. 란 FITC 기를 갖는 유닛의 몰 농도를 의미한다.

얻어진 결과를 표 4 에 정리하였다.

[표 4]

약물 동태 시험용 FITC 표지 HA-AM-SUC

-: 정량 한계 이하

(비교예 5-1) 형광 표지 HA-HZ-SUC 의 합성

580kDa 의 히알루론산나트륨 (덴키 화학 공업 주식회사 제조) 을 0.25% 농도 (w/v) 로 증류수에 용해하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7∼4.8 로 조정하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 와 아디프산디히드라지드 (이하, 「ADH」라고도 한다) 를, HA 의 유닛:EDC:ADH=1:5:40 의 몰 비가 되도록 첨가 하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7∼4.8 로 유지하면서 실온에서 2시간 반응시켰다. 대과잉량의 100mM 염화나트륨 용액, 25% 에탄올수용액, 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 순차로 투석 (스펙트라포어 7, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa) 하고, 동결 건조시켜 히드라지드기가 도입된 히알루론산 (HA-HZ) 을 얻었다. HA-HZ 중의 HZ 도입률을 ADH 도입률로 하여 프로톤 NMR 법에 의해 정량한 결과, HA 의 카르복시기의 73% 였다.

이 HA-HZ 를 증류수 (밀리 Q 워터) 에 용해시킨 후, 등량의 100mM 탄산 완충액 (pH 9.0) 을 첨가하여 최종 농도를 1㎎/mL 로 조정하였다. 여기에 FITC/HA 의 유닛=3.0㏖/㏖ 의 주입비로, HA-HZ 용액의 1/10 용량의 DMSO 에 용해시킨 FITC 를 첨가하고, 실온, 차광하에 1시간 반응시켰다. 반응 용액 25mL 를 미리 50mM 탄산 완충액 (pH 9.0) 으로 평형화한 PD-10 칼럼 (10개) 에 투입하여, 미반응의 FITC 를 제거하였다. 이 조(租)정제한 용액에 무수 숙신산/HZ=250㏖/㏖ 의 주입비로 DMSO 에 용해시킨 무수 숙신산을 첨가하고 (3.5mL), 동일하게 반응시켰다. 반응 혼합물을 대과잉량의 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고, 동결 건조시켜 HA-HZ 를 FITC 표지한 형광 표지 HA-HZ-SUC 를 얻었다.

얻어진 각 형광 표지 HA-HZ 를 0.25㎎/mL 농도로 50mM 탄산 완충액 (pH 9.0) 에 용해하고, 그 용액의 494㎚ 에서의 흡광도로부터 FITC 농도를 정량하여, 이하의 식에 따라서 각 유닛의 농도를 산출하였다. 또한, 몰 분율로의 변환, HA 수식물 중의 HA 유래 중량 분율 산출을 하였다.

미수식 HA 유닛: xμ㏖/mL

HA-HZ-SUC 유닛: yμ㏖/mL (HZ 가 무수 숙신산 처리된 유닛) 으로 정의하고, 이하의 식에서 산출하였다.

[화학식 9]

식 1 : (379.3 ×x) + ( 635.57 ×y) + ( 924.88 × (FITC conc.)) = 250 mg

식 2 : x / (y + (FITC conc.)) = (100- HZ(%))/ HZ(%)

또, 식 중 FITC conc. 란 FITC 기를 갖는 유닛의 몰 농도를 의미한다. 얻어진 결과를 표 5 에 정리하였다.

[표 5]

약물 동태 시험용 FITC 표지 HA-HZ-SUC

-: 정량 한계 이하

(실시예 5-3) 혈중 체류 시간 평가

HA 투여 래트 혈장 샘플

실시예 5-2 및 비교예 5-1 의 형광 표지 HA 수식물을 10㎎/㎏ 의 용량으로 래트 정맥내 (iv) 및 피하 (sc) 에 단회 투여하고, 투여전 및 투여후 0.0833, 0.25, 0.5, 1.2, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72, 96, 168시간에 채혈 (헤파린 처리) 하여, 원심분리에 의해 혈장을 얻었다 (0.25, 1.2, 6, 10, 12 는 비교예 5-1 의 샘플에 관해서만). 이 혈장 샘플은 측정때까지 -20℃ 이하에서 동결 저장하 였다.

측정 방법

GPC 에 의해 검량선용 표준 시료 및 측정용 시료의 분석을 실시하였다. 이하에 조건을 나타낸다.

GPC Column: TSKgel G6000PW_XL (TOSOH 사 제조)

Mobile phase: PBS (pH 7.4)

Elution mode: Isocratic

Flow Rate: 0.5mL/min

Injection Volume: 40μL

Detection: Fluorescence (EX: 494㎚, EM: 518㎚)

측정 시료의 조제

ㆍ검량선용 시료 ;

각 형광 표지 HA 수식물을 PBS (pH 7.4) 를 사용해서 희석하여, 1, 5, 10, 50, 100, 500㎍/mL 및 0㎍/mL (대조, PBS (pH 7.4)) 의 표준액을 조제하였다. 이 표준액에 등용량의 정상 래트 혈장을 첨가하여 검량선용 시료를 조제하였다.

ㆍ측정용 시료의 조제;

HA 수식물 투여 래트 혈장 샘플에 등용량의 PBS (pH 7.4) 를 첨가하여 측정용 시료를 조제하였다.

ㆍ혈장 중의 HA 수식물 농도의 산출;

해석 소프트 Millenium Ver 3.21 (Waters 사 제조) 을 사용하여 피크 면적을 산출하였다. 각 표준 시료의 피크 면적으로부터 얻어진 검량선으로부터 혈장 중 HA 수식물 농도를 산출하였다.

약물 동태 데이터

실시예 5-2 및 비교예 5-1 의 형광 표지 HA 수식물의 혈중 농도 추이의 데이터에 관해서, WinNonlin Ver 4.0.1 (Pharsight 사 제조) 로 약물 동태학적 파라미터를 산출하였다. 각 개체의 최종 측정점 3점의 데이터를 사용하여 모델 비의존적 해석을 실시하고, 반감기 (t1/2), 평균 혈중 체류 시간 (MRT) 을 산출하였다. 또한, 피하 투여후의 BA (Bioavailability) 는 피하 투여후의 혈장 중 농도 하면적 (AUCsc) 과 정맥내 투여후의 혈장 중 농도 하면적 (AUCiv) 으로부터 이하의 식에 따라서 산출하였다.

[화학식 10]

BA (%) = AUCsc / AUCiv × 100

형광 표지 HA 수식물의 혈중 농도 추이를 도 15 에 나타내고, 산출한 약물 동태학적 파라미터를 표 6 에 나타낸다.

[표 6]

FITC 표지화 HA 수식물의 약물 동태학적 파라미터

형광 표지 HA 수식물을 사용한 약물 동태 시험에 의해, 비프로톤 극성 유기용매 중에서 합성한 본 발명의 HA 수식물 (실시예 5-2) 은 HA 및 지금까지 보고된 HA 유도체 (특허 문헌 4, 5 및 6 을 참조) 와 비교하여, 래트 단회 정맥내 투여후의 혈중 체류 시간이 대폭 개선되는 것이 확인되었다. 또한, 비교예 5-1 (분자량 580kDa 의 HA 수식물 (73몰% 수식 (HZ)) 의 래트 단회 정맥내 투여후의 평균 혈중 체류 시간 (MRT) 은 16시간 정도이지만, 이것에 대해서도 본 발명의 HA 수식물은 혈중 체류성이 5.5배 정도 연장되어 있음이 분명해졌다. 23kDa HA 수식물에 관해서는, 초기 단계에서 혈중 농도가 감소하는 경향이 관찰되고, 일부 저분자 HA 수식물이 신(腎)배설되어 있을 가능성이 시사되었다. 100kDa 및 200kDa 의 HA 수식물에 관해서는, 혈중 체류성에 관한 특성 (CL, MRT, t1/2) 은 거의 동일한 값이 되었다. 그러나, 분자량 의존적으로, 피하 투여후의 BA (Bioavailability) 는 감소하여 고분자량의 HA 수식물일수록 혈중에 대한 이행이 되기 어렵다는 결과가 나타났다.

[실시예 6]

히알루론산 수식물 (HA-AM-SUC) 의 수식률과 혈중 체류 시간과의 상관

히알루론산 수식물 (HA-AM-SUC) 의 혈중 체류성을 수식률의 관점에서 해석하기 위해, 200kDa 의 HA 로부터 여러가지 수식률의 HA 수식물을 합성하고, 형광 색소인 FITC 를 도입한 샘플을 조제하여, 각각의 혈중 체류성을 관찰하였다.

(실시예 6-1) HA-AM 의 조제

HA (200kDa)-TBA 를 4.0㎎/mL 의 농도로 DMSO 에 용해한 용액을 5개 조제하고, 각 용액에 HA 유닛/EDOBEA=1/50 (㏖/㏖) 의 당량비로 EDOBEA 를 첨가하고, BOP 시약을 HA 유닛에 대하여, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 또는 1.5 의 당량비로 각각의 용액에 첨가하여, 하룻밤 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물 용량의 절반량의 1M NaCl 수용액을 첨가하고, 5N HCl 로 pH 를 3 까지 저하시킨 후, 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 그 후 대과잉량의 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 한외 여과후 (YM-10, MILLIPORE 사 제조), 동결 건조를 실시하였다. 아미노기 도입률은 프로톤 NMR 법에 의해 정량하였다. NMR 차트를 도 16 에 나타낸다 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.8∼1.9ppm, AM: EDOBEA 부분의 메틸렌프로톤, 2.9∼3.1ppm). 각각 도입률은 BOP 시약 비율 0.25:20.0몰%, 0.5:36.5몰%, 0.75:54.5몰%, 1.0:69.0몰%, 1.5:90.5몰% 였다.

(실시예 6-2) 형광 표지 HA 수식물의 합성

상기 (실시예 6-1) 에서 얻어진 HA-AM 의 각각을, 증류수 (밀리 Q 워터) 로 20.0㎎/mL 의 농도로 용해하고, 여기에 0.2M 탄산 완충액 (pH 9.0) 을 첨가하여 농도를 10.0㎎/mL 로 하였다. 이들 용액에 HA 의 유닛 (1 유닛=반복 단위인 N-아세틸글루코사민-글루쿠론산) 에 대하여 0.07몰 배 (69% 및 90.5% 아민 수식 HA 의 용액), 0.175몰 배 (54.5% 아민 수식 HA 의 용액), 0.28몰 배 (36.5% 아민 수식 HA 의 용액) 및 0.63몰 배 (20.0% 아민 수식 HA 의 용액) 의 플루오레세인 이소티오시아네이트를 HA-AM 용액의 1/10 용량의 DMSO 용액으로서 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 그 후, HA 의 유닛 (1 유닛=반복 단위인 N-아세틸글루코사민-글루쿠론산) 에 대하여 40몰 배의 무수 숙신산을 HA-AM 용액의 1/10 용량의 DMSO 용액으로서 첨가하여 실온에서 추가로 30분간 교반하였다. 20% 아민 수식물은 대과잉량 DMSO 로 투석한 후, 또한 그 밖의 샘플은 직접, 대과잉량의 25% EtOH 수용액에 대하여 투석하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 그 후, 0.5M NaCl 수용액에 대하여 투석 정제하였다. 투석 외액을 증류수 (밀리 Q 워터) 로 치환하여 추가로 투석 정제하고, 얻어진 수용액을 동결 건조시켜 형광 표지 HA-AM-SUC 를 얻었다.

여기서 얻어진 각 형광 표지 HA-AM-SUC 를 0.25㎎/mL 농도로 50mM 탄산 완충액 (pH 9.0) 에 용해하고, 그 용액의 494㎚ 에서의 흡광도로부터 FITC 농도를 정량하여, 이하의 식에 따라서 각 유닛의 농도를 산출하였다. 또한, 몰 분율로의 변환, HA 수식물 중의 HA 유래 중량 분율 산출을 실시하였다.

미수식 HA 유닛: xμ㏖/mL

HA-AM-SUC 유닛: y㎛ol/mL (AM 이 무수 숙신산 처리된 유닛)

으로 정의하고, 이하의 식에서 산출하였다.

[화학식 11]

식 1 : (401.3 ×x) + ( 631.58 ×y) + ( 544.97 × (잔존 AM conc.)) + (898.9 × (FITC conc.)) = 250 mg

식 2 : x / (y + (잔존 AM conc.) + (FITC conc.)) = (100- AM(%))/ AM(%)

또, 식 중 FITC conc. 란 FITC 기를 갖는 유닛의 몰 농도를 의미한다. 얻어진 결과를 표 7 에 정리하였다.

[표 7]

약물 동태 시험용 FITC 표지 HA-AM-SUC

-: 정량 한계 이하

(실시예 6-3) 혈중 체류 시간 평가

HA 투여 래트 혈장 샘플

실시예 6-2 의 형광 표지 HA 수식물을 10㎎/㎏ 의 용량으로 래트 정맥내에 단회 투여하고, 투여전 및 투여후 0.5, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 및 168시간에 채혈 (헤파린 처리) 하여, 원심분리에 의해 혈장을 얻었다. 이 혈장 샘플은 측정때까지 -20℃ 이하에서 동결 저장하였다.

측정 방법

96 웰 플레이트에 검량선용 표준 시료 및 측정용 시료를 분주하고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 분석을 실시하였다. 이하에 조건을 나타낸다.

마이크로플레이트 리더: SPECTRA MAX GEMINI (Molecular Devices 사 제조)

Sample volume: 100μL/well

Detection: Fluorescence (EX: 485㎚, EM: 538㎚)

측정 시료의 조제

ㆍ검량선용 시료 ;

ㆍ측정용 시료의 조제;

ㆍ혈장 중의 HA 수식물 농도의 산출;

해석 소프트 SOFTmax PRO (Molecular Devices 사 제조) 를 사용하여 각 표준 시료의 형광 강도로부터 얻어진 검량선으로부터 혈장 중의 HA 수식물 농도를 산출하였다.

약물 동태 데이터

실시예 6-2 의 형광 표지 HA 수식물의 혈중 농도 추이의 데이터에 관해서, WinNonlin Ver 4.0.1 (Pharsight 사 제조) 로 약물 동태학적 파라미터를 산출하였다. 각 개체의 혈장 중 농도 추이에 관해서 모델 비의존적 해석을 실시하여, 평균 혈중 체류 시간 (MRT) 을 산출하였다. 반감기 (t1/2) 는 각 개체의 측정 가능한 최종 3점의 데이터를 사용하여 산출하였다. 형광 표지 HA 수식물의 혈중 농도 추이를 도 17 에 나타내고, AM 도입률과 MRT 의 관계를 도 18 에 나타낸다. 또한, 산출한 약물 동태학적 파라미터를 표 8 에 나타낸다.

[표 8]

FITC 표지화 HA 수식물의 약물 동태학적 파라미터

도 18 에 나타내는 AM 의 수식률과 MRT 의 관계로부터, 수식률이 50% 의 후반에서부터 급격히 MRT 의 증가 즉 혈중 체류성의 연장이 일어남이 시사되었다. 즉 수식률이 55몰% 이상, 바람직하게는 65몰% 이상, 더욱 바람직하게는 69몰% 이상인 경우, 18시간 이상의 MRT 를 갖는 혈중 체류 시간의 면에서 바람직한 HA 수식물이 얻어질 가능성이 높다는 결과가 나타났다.

효소 내성을 획득한 HA 수식물은, CD44 로의 인식도 크게 저하되어 있기 때문에 장기간의 혈중 체류성이 얻어지는 것으로 생각된다.

[실시예 7]

여러가지 화합물로 수식한 히알루론산 수식물의 혈중 체류 시간

히알루론산 수식물 (HA-AM-SUC) 의 혈중 체류성에 있어서의 수식의 영향을 해석하기 위해서, 200kDa 의 HA 를 여러가지 디아민 화합물로 수식하고, 추가로 형 광 색소인 FITC 를 도입한 HA 수식물의 샘플을 조제하여, 각각의 혈중 체류성을 관찰하였다.

(실시예 7-1) 형광 표지 HA 수식물의 합성

실시예 4-2 및 4-3-1 에서 얻어진 HA-DETA, HA-DAHP, HA-DAP 를 증류수 (밀리 Q 워터) 에 용해하여 20.0㎎/mL 의 용액을 조제하고, 여기에 0.2M 탄산 완충액 (pH 9.0) 을 첨가하여, 농도를 10.0㎎/mL 로 하였다. 이 용액에 HA 의 유닛에 대하여 0.07몰 배의 플루오레세인 이소티오시아네이트를 HA-AM 수식물 용액의 1/10 용량의 DMSO 용액으로서 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 그 후, HA 의 유닛에 대하여 40몰 배의 무수 숙신산을 HA-AM 용액의 1/10 용량의 DMSO 용액으로서 첨가하여 실온에서 30분간 교반하였다. 각 샘플은 대과잉량의 0.5M NaCl 수용액에 대하여 투석 정제한 후, 투석 외액을 증류수 (밀리 Q 워터) 로 치환하여 추가로 투석 정제를 실시하였다 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa). 얻어진 수용액을 동결 건조시켜 형광 표지 HA 수식물을 얻었다.

여기서 얻어진 각 형광 표지 HA-AM-SUC 의 농도 0.25㎎/mL 에서의 494㎚ 에 있어서의 흡광도로부터 FITC 농도를 정량하여, 이하의 식에 따라서 각 유닛의 농도를 산출하였다. 또한, 몰 분율로의 변환, HA 수식물 중의 HA 유래 중량 분율 산출을 실시하였다.

미수식 HA 유닛: xμ㏖/mL

HA-AM-SUC 유닛: y㎛ol/mL (AM 이 무수 숙신산 처리된 유닛)

HA-AM-SUC 유닛 분자량: M₁g/㏖

HA-AM-FITC 유닛 분자량: M₂g/㏖

으로 정의하고, 이하의 식에서 산출하였다.

[화학식 12]

식 1 : (401.3 ×x) + ( M₁ ×y) + ( M₂ × (FITC conc.)) = 250 mg

식 2 : x / (y + (FITC conc.)) = (100- AM(%))/ AM(%)

또, 식 중 FITC conc. 란 FITC 기를 갖는 유닛의 몰 농도를 의미한다. 또한, DETA: M₁=586.5, M₂=853.9, DAHP: M₁=573.5, M₂=840.8,

DAP: M₁=557.5, M₂=824.8 로 산출을 실시하였다.

얻어진 결과를 표 9 에 정리하였다.

[표 9]

약물 동태 시험용 FITC 표지 HA 수식물

(실시예 7-2) 혈중 체류 시간 평가

HA 투여 래트 혈장 샘플

실시예 7-1 의 형광 표지 HA 수식물을 10㎎/㎏ 의 용량으로 래트 정맥내에 단회 투여하고, 투여전 및 투여후 0.5, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96 및 168시간에 채혈 (헤파린 처리) 하여, 원심분리에 의해 혈장을 얻었다. 이 혈장 샘플은 측정때까지 -20℃ 이하에서 동결 저장하였다.

측정 방법

96 웰 플레이트에 검량선용 표준 시료 및 측정용 시료를 분주하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 분석을 실시하였다. 이하에 조건을 나타낸다.

Sample volume: 100μL/well

Detection: Fluorescence (EX: 485㎚, EM: 538㎚)

측정 시료의 조제

ㆍ검량선용 시료 ;

ㆍ측정용 시료의 조제;

ㆍ혈장 중의 HA 수식물 농도의 산출;

해석 소프트 SOFTmax PRO (Molecular Devices 사 제조) 를 사용하여 각 표준 시료의 형광 강도로부터 얻어진 검량선으로부터 혈장 중의 HA 수식물 농도를 산출 하였다.

약물 동태 데이터

실시예 7-1 의 형광 표지 HA 수식물의 혈중 농도 추이의 데이터에 관해서, WinNonlin Ver 4.0.1 (Pharsight 사 제조) 로 약물 동태학적 파라미터를 산출하였다. 각 개체의 혈장 중 농도 추이에 관해서 모델 비의존적 해석을 실시하여, 평균 혈중 체류 시간 (MRT) 을 산출하였다. 반감기 (t1/2) 는 각 개체의 측정 가능한 최종 3점의 데이터를 사용하여 산출하였다. 형광 표지 HA 수식물의 혈중 농도 추이를 도 19 에 나타내었다. 또한, 산출한 약물 동태학적 파라미터를 표 10 에 나타낸다.

[표 10]

FITC 표지화 HA 수식물의 약물 동태학적 파라미터

실시예 5 에 나타내는 히알루론산 유도체의 수식과 동일하게 MRT 의 증가 즉 혈중 체류성의 연장이 일어남이 시사되었다. 여러가지 아미노기 함유 화합물에서의 수식에 관해서도 동일하게 18시간 이상의 MRT 를 가지고 있어, 용도에 따라 도입하는 아미노기 함유 화합물을 변화시키는 것이 가능하다는 것이 분명해졌다.

[실시예 8]

메타크릴로일기를 도입한 HA 수식물의 합성

겔 조제용의 기재로서 메타크릴로일기를 갖는 HA 수식물의 합성을 실시하였다.

(실시예 8-1) HA-AEMA 의 합성

분자량 200kDa 의 히알루론산나트륨 (HA; 덴키 화학 공업 주식회사 제조) 을 테트라부틸하이드로옥사이드 (시그마 알드리치사 제조) 로 테트라부틸암모늄 (TBA) 염화한 DOWEX 50WX8-400 (시그마 알드리치사 제조) 을 사용해서 TBA 염화하고, 얻어진 테트라부틸암모늄염화히알루론산 (HA-TBA) 을 2.0㎎/mL 농도가 되도록 DMSO (와코 쥰야쿠 주식회사 제조) 에 용해한 용액을 2개 조제하였다. HA 유닛/BOP (와코 쥰야쿠 주식회사 제조)/아미노에틸메타크릴레이트 (AEMA; 시그마 알드리치사 제조)=1/2.5/50 (㏖/㏖/㏖) 의 당량비 및 1/0.5/50 (㏖/㏖/㏖) 의 당량비로 AEMA, BOP 의 순으로 각각의 용액에 첨가하고, 실온하에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물 용량의 절반량의 1M NaCl 수용액을 첨가한 후, 5N HCl 을 첨가하여 pH 를 3 까지 저하시키고, 다시 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 대과잉량의 0.3M NaCl 수용액, 계속해서 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa) 한 후, 동결 건조시켜 표제의 메타크릴로일기가 도입된 히알루론산 (HA-AEMA) 을 얻었다.

얻어진 HA-AEMA 중의 AEMA 도입률을 프로톤 NMR 법에 의해 정량한 결과, 각각, 56.5% (BOP: 2.5배 당량), 38.0% (BOP: 0.5배 당량) 가 AEMA 화되어 있었다 (HA 및 HA-AEMA 의 N-아세틸기, (1.9∼2.1ppm) (3H), HA-AEMA 의 메타크릴로일기 유래 부분, 5.5∼6.1ppm (각 2H) 을 비교, 도 20 을 참조).

(실시예 8-2) HA-APMA 의 합성

AEMA 대신에 아미노프로필메타크릴아미드 (APMA; 폴리사이언스사 제조) 를 사용하고, HA 유닛/BOP (와코 쥰야쿠 주식회사 제조)/APMA=1/2.0/5 (㏖/㏖/㏖) 의 당량비로 반응시켰다. 그 이외에는 실시예 8-1 과 동일한 방법으로 HA-APMA 를 얻었다.

얻어진 HA-APMA 중의 APMA 도입률을 프로톤 NMR 법에 의해 정량한 결과, 475% 가 APMA 화되어 있었다 (HA 및 HA-APMA 의 N-아세틸기, (1.9∼2.1ppm) (3H), HA-APMA 의 메타크릴로일기 유래 부분, 5.2∼5.8ppm (각 2H) 을 비교, 도 21 을 참조).

[실시예 9] BOP 첨가량에 의한 메타크릴로일기 도입 제어

메타크릴로일기의 도입률을 제어하기 위해서, 여러가지 비율로 축합제를 첨가하여 합성하고, 도입률의 해석을 실시하였다.

HA (200kDa)-TBA 를 5.0㎎/mL (AEMA 용) 또는 4.0㎎/mL (APMA 용) 로 DMSO 에 용해한 용액을 조제하고, HA 유닛/AEMA (폴리사이언스사 제조) 또는 APMA (폴리사이언스사 제조)=1/5 (㏖/㏖) 의 당량비로 AEMA 또는 APMA 를 첨가하고, BOP 시약을 HA 유닛에 대하여 0.2, 0.25, 0.4, 또는 10 의 당량비로 첨가하여 하룻밤 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물 용량의 절반량의 1M NaCl 수용액을 첨가하고, 5N HCl 로 pH 를 3 까지 저하시킨 후, 2N NaOH 로 중화를 실시하였다. 그 후, 대과잉의 0.3M NaCl 수용액, 계속해서 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 동결 건조를 실시하였다.

메타크릴로일기 도입률을 프로톤 NMR 법에 의해 정량하였다 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤, 1.8∼1.9ppm, MA: 메타크릴로일기 유래, 5.5∼6.1ppm (AEMA), 5.2∼5.8ppm (APMA)). 프로톤 NMR 데이터를 도 22 에 나타낸다. 메타크릴로일기 도입률을 표 11 에 나타낸다. 메타크릴로일기의 도입률은 BOP 의 첨가에 의해 제어 가능함을 알 수 있었다.

[표 11]

BOP 의 첨가량과 메타크릴로일기 도입률의 관계

[실시예 10] 형광 표지 HA-HZ 합성

겔내 봉입 샘플로서 사용하기 위해서, 형광 표지화한 HA-HZ 의 합성을 실시하였다.

(실시예 10-1) HA-HZ 의 합성

분자량 200kDa 의 히알루론산 (HA; 덴키 화학 공업 주식회사 제조) 을 0.5% 농도로 증류수 (밀리 Q 워터) 에 용해하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7∼4.8 로 조정하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 와 아디프산디히 드라지드 (ADH) 를, HA 유닛/EDC/ADH=1/0.05/40 (㏖/㏖/㏖) 의 몰 비가 되도록 첨가하고, 5N 염산으로 pH 를 4.7∼4.8 로 유지하면서 실온에서 교반하 2시간 반응시켰다. 100mM 염화나트륨 용액, 25% 에탄올 수용액, 계속해서 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 동결 건조시켜 히드라지드가 도입된 히알루론산 (HA-HZ) 을 얻었다.

얻어진 HA-HZ 중의 HZ 도입률을 프로톤 NMR 법에 의해 정량한 결과, 각각, HA 의 카르복실산의 3.75% 가 HZ 화되어 있었다 (HA 및 HA-HZ 의 N-아세틸기, 2.1ppm (3H), HA-HZ 의 아디프산 유래 부분의 메틸렌기, 1.7ppm, 24ppm (각 2H) 을 비교).

(실시예 10-2) HA-HZ 의 형광 표지화

상기 (실시예 10-1) 에서 얻어진 HA-HZ 를 증류수 (밀리 Q 워터) 로 20.0㎎/mL 의 농도로 용해하고, 여기에 0.25M 탄산 완충액 (pH 9.0, 4.84mL) 및 101.3㎎/mL 의 FITC 의 DMSO 용액 (2.42mL) 을 첨가하여 차광하, 실온에서 1시간, 천천히 진탕하였다. 그 후, 대과잉량의 PBS 에 대하여 투석 정제하였다. 투석 외액을 증류수 (밀리 Q 워터) 로 치환하여 추가로 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, 분획 분자량 (MWCO): 12k-14kDa), 얻어진 수용액을 동결 건조시켜 형광 표지 HA-HZ (227.63㎎) 를 얻었다.

[실시예 11] 형광 표지 HA-HZ 봉입 HA-AEMA 가교 겔 조제

메타크릴로일기를 도입한 HA 수식물을 사용하고, 메타크릴로일기와 메르캅토기의 마이클 부가 반응을 이용해서, 형광 표지한 HA-HZ 를 봉입한 벌크상 겔을 제 작하여, 그 서방성을 평가하였다.

실시예 8-1 에서 얻어진 AEMA 의 도입률이 56.5% 인 HA-AEMA 3.97㎎ 과, 실시예 10-2 에서 얻어진 형광 표지 HA-HZ (107㎍) 를 증류수 (밀리 Q 워터, 60μL) 에 용해시켰다. 여기에 트리에탄올아민 (TEA, 1.3μL), 디티오트레이톨 (DTT) 용액 (9.25㎎/mL 200mM 인산 완충액 (pH 8.3), 40μL) 을 첨가하였다. 차광하, 37℃ 에서 1시간 반응시키면 겔이 되었다.

또한, BOP 시약을 HA 유닛에 대하여 0.4 의 당량비로 첨가하여 하룻밤 반응시킨 것 외에는 실시예 9 와 동일한 방법으로 합성한 도입률 18.8% 의 HA-AEMA (3.92㎎) 와, 실시예 5-2 에서 얻어진 형광 표지 HA-AM-SUC (410㎍) 를 증류수 (밀리 Q 워터, 60μL) 에 용해시켰다. 여기에 디티오트레이톨 (DTT) 용액 (9.25㎎/mL 200mM 인산 완충액 (pH 8.3), 40μL) 을 첨가하였다. 차광하, 37℃ 에서 1시간 반응시키면 겔이 되었다 (HA-AEMA 4% gel). 여기서, HA-AEMA 4% gel 이란, 수분량 100μL 에 관하여 4㎎ 의 HA-AEMA 가 함유되어 있는 겔임을 의미한다.

(비교예 11-1) 비교 대조용의 겔 기재 합성 (HA-HZ-SH) 및 겔 조제

실시예 10-1 과 동일한 방법으로 HA 유닛/EDC/ADH=1/0.2/40 (㏖/md/㏖) 의 몰 비로 합성한 HZ 의 도입률이 26.0% 인 HA-HZ (369.81㎎) 를 증류수 (밀리 Q 워터) 에 의해 20.0㎎/mL 의 농도로 용해하고, 2-이미노티오란 염산염 (ITL: 피어스사 제조) 을 HZ/ITL=1/2몰 비가 되도록 200mM 인산 완충액 (pH 8.3) 에 용해, 첨가하여, 실온에서 교반하 2시간 반응시켰다. 에탄올로 침전, 3회 세정하고, 건조시켜 메르캅토기가 도입된 히알루론산 (HA-HZ-SH, 321.68㎎) 을 얻었다. 얻어 진 HA-HZ-SH 중의 SH 기 도입률을 프로톤 NMR 법에 의해 정량한 결과, HA 의 카르복실산의 22.0% 가 SH 화되어 있었다 (HA 및 HA-HZ-SH 의 N-아세틸기 (1.9ppm, 3H), HA-HZ-SH 의 ITL 유래 부분의 메틸렌기 (2.1ppm 과 2.7ppm, 각 2H) 를 비교). 다음으로, 여기에서 합성한 HA-HZ-SH 를 1.99㎎ (HA-HZ-SH 2% gel) 및 4.08㎎ (HA-HZ-SH 4% gel) 과 실시예 10-2 의 형광 표지 HA-HZ 를 98㎍ 및 105㎍ 을 증류수 (밀리 Q 워터, 60μL) 에 용해시켰다. 여기에 4티온산나트륨 2수화물 (이하, 「STT」라고도 한다)/SH=0.1/1몰 비가 되도록 STT 용액 (200mM 인산 완충액 (pH 8.3), 40μL) 을 첨가하고, 차광하, 37℃ 에서 1시간 반응시키면 겔이 되었다. 여기서, HA-HZ-SH 2% gel이란, 수분량 100μL 에 관하여 2㎎ 의 HA-HZ-SH 가 함유되어 있는 겔임을 의미한다. HA-HZ-SH 4% gel 이란, HA-HZ-SH 2% gel 에서의 HA-HZ-SH 가 4㎎ 임을 의미한다.

(비교예 11-2) 비교 대조용의 겔 기재 합성 (HA-HZ-MA) 과 겔 조제

HA/EDC/ADH=1/5/40 (㏖/㏖/㏖) 의 몰 비로 한 것 외에는 실시예 10-1 과 동일한 방법으로 합성하여, HA 의 카르복실산이 63% HZ 화된 HA-HZ 를 얻었다. 다음으로 얻어진 HA-HZ (207.46㎎) 를 증류수 (밀리 Q 워터, 9mL) 에 용해한 후, 1M 인산 완충액 (pH 8.8) 을 첨가하여, HA 농도 20㎎/mL 로 조정하였다. 메타크릴산 무수물을 HZ 의 20배 당량을 적하하여 첨가하고, 실온에서 4시간 반응시켰다. 테트라히드로푸란으로 침전시킨 후, 회수하여 건조시켰다. 침전물을 증류수 (밀리 Q 워터) 에 용해하고, 다시 테트라히드로푸란으로 침전, 건조시킨 후, 건조물을 증류수 (밀리 Q 워터) 에 용해하고, 동결 건조시켜 HA-HZ-MA 를 얻었 다. 얻어진 HA-HZ-MA 중의 MA 기 도입률을 프로톤 NMR 법에 의해 정량한 결과, HA 의 카르복실산의 17.0% 가 MA 화되어 있었다 (HA: N-아세틸기의 메틸프로톤 (1.8∼1.9ppm), MA: 메타크릴로일기의 CH₂=(5.5∼6.1ppm) 을 비교). 다음으로, 여기서 합성한 HA-HZ-MA 를 4.07㎎ (HA-HZ-MA 4% gel) 과 실시예 10-2 에서 얻어진 형광 표지 HA-HZ 99㎍ 을 증류수 (밀리 Q 워터, 60μL) 에 용해시켰다. 여기에 트리에탄올아민 (TEA, 1.3μL) 과 DTT 용액 (2.71㎎/mL 200mM 인산 완충액 (pH 8.3), 40μL) 을 첨가하였다. 차광하, 37℃ 에서 하룻밤 반응시키면 겔이 되었다.

(시험예2) HA-AEMA 가교 겔로부터의 형광 표지 HA-HZ 서방 성능 평가

실시예 11, 비교예 11-1 및 비교예 11-2 에서 얻어진 겔을 1mL 의 PBS 중, 37℃ 에서 인큐베이트하고, 경시적으로 전체량을 샘플링하였다. GPC 에 의해 버퍼 중에 방출된 형광 표지 HA-HZ 를 정량하였다. GPC 의 측정 조건은 하기에 나타낸다. 겔 중에 봉입한 형광 표지 HA-HZ 를 100% 로 하였을 때의 겔로부터의 형광 표지 HA-HZ 방출성을 도 23 에 나타낸다. 또, 비교예 11-1 및 비교예 11-2 에서 얻어진 겔은 5주 후까지 샘플링하고, 실시예 11 에서 얻어진 HA-AEMA 겔에 관해서는 약 10주 후에 히알루로니다아제를 0.25U 를 첨가하여 분해하여 모든 봉입물을 방출시켰다.

GPC Column: TSKgel G6000PW_XL (TOSOH 사 제조)

Mobile phase: PBS (pH 7.4)

Elution mode: Isocratic

Flow Rate: 1mL/min

Injection Volume: 25μL

Detection: UV (494㎚)

도 23 으로부터 HA-AEMA 로부터 제작한 겔은 AEMA 의 도입률에 상관없이, 방출 거동은 크게 변화하지 않고, 반응하는 관능기는 18.8% 정도에서도 동일한 방출 프로파일을 취하여, 충분히 장기의 서방이 가능함이 시사되었다. 또한, 본 발명의 HA-AEMA 로부터 제작한 겔은 디술파이드 형성에 의한 겔 (비교예 11-1) 과 비교하여 매우 장기간의 서방이 가능하다는 것이 분명해졌다. 또한, 메타크릴산을 직접 아미드 결합에 의해 도입한 HA-HZ-MA (비교예 11-2) 와 비교하더라도 마찬가지로 장기간의 서방이 가능해졌다. 메타크릴로일기의 결합 양식에 기인하는 반응성의 차이나 수식 관능기의 균일성 등에 의한 결과로 생각되며, 에스테르에 의한 메타크릴산의 결합 양식을 갖는 AEMA 의 HA 수식물을 사용함으로써, 보다 장기의 서방이 가능한 겔의 조제가 가능해졌다.

[실시예 12] 스프레이 드라이어에 의한 형광 표지 HA-HZ 봉입 HA-AEMA 가교 겔 미립자 조제

HA-AEMA 를 사용하고, 스프레이 드라이어를 사용하여 주사 가능한 마이크로겔의 조제를 실시하였다.

실시예 9 및 실시예 8-1 에서 얻어진 AEMA 기의 도입률이 11몰%, 19몰%, 38몰% 인 HA-AEMA 의 각각 50㎎ 과, 실시예 10-2 에서 얻어진 형광 표지 HA-HZ 5㎎ 을 증류수 (밀리 Q 워터, 5mL) 에 용해시켰다 (하룻밤). 여기에 DTT 를 AEMA/SH=1/1 몰 비가 되도록 DTT 용액 (200mM 인산 완충액 (pH 8.3) 250μL) 을 첨가하고, 이하의 조건으로 스프레이 드라이하여, 미립자를 얻었다. 얻어진 미립자의 입자 직경은 1∼3㎛ 였다. 각 시료의 입자를 프레파라아트 상에 놓고, 건조 상태 및 PBS (pH 7.4) 를 첨가하여 팽윤시킨 상태를 현미경으로 관찰하였다. 현미경 사진을 도 24 에 나타낸다. PBS 를 첨가하였을 때에 AEMA 기의 도입률이 11몰%, 19몰% 의 미립자는 용해되었다. 이들 미립자는, 50℃ 항온조 (야마토 과학사 제조 DN-42) 에서 큐어링하고, 72시간 후에 샘플링하였다. 이들 미립자를 프레파라아트 상에 놓고, 여기에 pH 7.4 의 PBS 를 첨가하여 그 입자 상태를 현미경으로 관찰한 결과, 미립자는 PBS 에 용해하지 않았다. 이상의 조작에 의해 AEMA 기의 도입률이 11몰%, 19몰%, 38몰% 인 형광 표지 HA-HZ 봉입 HA-AEMA 가교 겔 미립자가 얻어졌다 (도 24 를 참조).

스프레이 드라이 조건

스프레이 드라이어: 부치 (Buchi) 사 제조, 미니 스프레이 드라이어 B-191

Solution feed rate: 0.5mL/min (Tygon tube, Pump speed=15%)

Feed solution conc.: 10㎎/mL

Atomizing air flow rate: 650L/hr

Drying air flow rate: 40kL/hr (Aspiration speed=100%)

Inlet temp.: 90℃

Outlet temp.: 55∼65℃

[실시예 13] 동결 분쇄에 의한 형광 표지 HA-AM-SUC 봉입 HA-AEMA 가교 겔 미립자 조제

HA-AEMA 를 사용하고, 동결 분쇄법에 의해 주사 가능한 마이크로겔의 조제를 하였다.

실시예 9 에서 얻어진 AEMA 기의 도입률이 19몰% 인 HA-AEMA 4㎎ 과, 실시예 5-2 에서 얻어진 형광 표지 HA-AM-SUC 0.4㎎ 을 증류수 (밀리 Q 워터, 50μL) 에 용해하였다 (하룻밤). 여기에 AEMA/SH=1/1몰 비가 되도록 DTT 용액 (200mM 인산 완충액 (pH 8.3), 50μL) 을 첨가하고, 차광하, 37℃ 에서 1시간 반응시키면 겔이 되었다. 이 겔을 37℃ 항온조 (야마토 과학사 제조 Incubator IS42) 에서 건조시켜, 형광 표지 HA-AM-SUC 봉입 HA-AEMA 가교 건조 겔 (이하, 「건조 겔」이라고도 한다) 이 얻어졌다. 추가로 여기서 얻어진 건조 겔을 액체 질소로 동결, SK 밀 (토켄 제조 SK-100) 로 분쇄를 반복하였다. 이상의 조작에 의해 형광 표지 HA-AM-SUC 봉입 HA-AEMA 가교 동결 분쇄 겔 미립자 (이하, 「동결 분쇄 겔」이라고도 한다) 이 얻어졌다. 각 시료의 입자를 프레파라아트 상에 놓고, 건조 상태를 현미경으로 관찰하였다. 현미경 사진을 도 25 에 나타낸다. 얻어진 동결 분쇄 겔의 입자 직경은 2∼6㎛ 였다.

(시험예 3) HA-AEMA 가교 겔로부터의 형광 표지 HA-AM-SUC 서방 성능 평가

실시예 13 에서 얻어진 건조 겔 및 동결 분쇄 겔을 1mL 의 PBS 중, 37℃ 에서 인큐베이트하여, 경시적으로 200μL 샘플링하였다. GPC 에 의해 버퍼 중에 방출된 형광 표지 HA-AM-SUC 를 정량하였다. GPC 의 측정 조건은 시험예 2 와 동일하다. 겔 중에 봉입한 형광 표지 HA-AM-SUC 를 100% 로 하였을 때의 겔로부터의 형광 표지 HA-AM-SUC 방출성을 도 26 에 나타낸다.

도 26 으로부터 본 발명의 건조 겔은, 장기간의 서방이 가능하다는 것이 분명해졌다. 또한, 동결 분쇄 겔은, 건조 겔과 비교하여 미립자화에 의한 표면적의 증대에 의해 초기 버스트(burst)가 커지는 경향이 보이지만, 충분히 장기간의 서방이 가능하다는 것이 분명해져, 주사 가능한 미립자로 장기의 서방이 가능한 마이크로겔을 조제할 수 있음이 분명해졌다.

[실시예 14]

수용성 HA 수식물-Fab 콘쥬게이트 및 Fab 의 조제

(실시예 14-1) IgG Fab 의 조제

인산 완충액에 용해된 IgG 용액 (54.0㎎/mL, 0.85mL) 에 PBS (1.445mL) 를 첨가하여 희석하였다. 이 액의 0.5mL 에 관해서, IgG Fab 조제 키트 (ImmunoPure (등록상표) Fab Preparation kit, 소화 효소로서 Papain 을 함유한다, PIERCE (피어스)사 제조) 에 적용시켜, 첨부 문서에 기재된 대로 조작하여, Protein A 칼럼 (조제 키트에 함유) 에 의한 비흡착 분획을 얻었다. 또, Papain 에 의한 소화는 37℃ 에서 15시간 실시하였다. 얻어진 용액을 원심식 한외 여과기 (Amicon Ultra-4, 아미콘 제조) 를 사용하여 농축후, PBS 로 재희석하여, 최종적으로 약 1.5mL 로 하였다. 또한, IgG Fab 조제 키트에 의한 조작으로부터 농축까지의 조작은 동일 조건에서 합계 4 회 실시하였다. 4 회의 조제에서 얻어진 액을 혼합하여, 약 11.8㎎ 의 IgG Fab (이하, 「Fab」라고도 한다) (1.96㎎/mL, 6.0mL) 를 얻었다. 또, Fab 의 농도 정량은 자외 가시 흡광도 측정법에 의해 결정하였다.

(실시예 14-2) Fab 의 FITC 표지

실시예 14-1 에서 얻어진 Fab PBS 용액 (1.96㎎/mL, 6.0mL) 중의 5mL 를 탈염 칼럼 (PD-10, 아마샴 바이오사이언스 주식회사 제조) 에 의해 150mM NaCl 및 10mM EDTA 함유 50mM 탄산 완충액 (pH 9.5, 이하「FITC 버퍼」라고도 한다) (7mL) 으로 용매 치환하였다. 원심식 한외 여과 (Centricon-30, 아미콘 제조) 에 의해 약 5mL 로 농축하고, 이 중 4.78mL 에, FITC 농도가 2㎎/mL 인 1% DMSO 함유 FITC 버퍼 용액 (342μL) 을 첨가하여 실온, 차광하에 2시간 반응시켰다. 반응 용액을 4℃, 차광하에 1L 의 PBS 에 대하여 투석 정제 (Slide-A-Lyzer MWCO: 10000, 피어스사 제조) 하였다. 투석 외액은 2, 4, 6, 15시간 후에 전량 교환하고, 추가로 실온, 차광하에 2시간 투석한 후에 FITC 표지 Fab 용액을 회수하였다. 탈염 칼럼에 의해 FITC 버퍼로 용매 치환하고, 원심식 한외 여과 (Centricon-30) 에 의해 약 4.5mL 로 농축하여, FITC 표지 Fab 의 FITC 버퍼 용액으로 하였다.

(실시예 14-3) 약동학 (PK: pharmacokinetics) 시험용 FITC 표지 Fab 용액의 조제

실시예 14-2 에서 얻어진 FITC 표지 Fab 의 FITC 버퍼 용액 약 4.5mL 중의 약 1.75mL 를 탈염 칼럼 (PD-10) 에 의해 PBS (3.5mL) 로 용매 치환하였다. 원심식 한외 여과 (Centricon-30) 에 의해 약 0.5mL 까지 농축하여, PK 시험용 FITC 표지 Fab 용액을 얻었다. 얻어진 용액으로부터 2.5μL 취하고 PBS 에 의해 40배 희석하여 280 및 495㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 이하의 2개의 식에서 Fab 농도 및 FITC/Fab 비를 산출한 결과, Fab: 5.97㎎/mL, FITC/Fab: 3.24 (㏖/㏖) 였다.

[화학식 13]

(실시예 14-4) 메르캅토기를 도입한 FITC 표지 Fab (FITC 표지 Fab-SH) 의 조제

실시예 14-2 에서 얻어진 FITC 표지 Fab 용액 약 4.5mL 중의 2.75mL 에 2-이미노티오란 염산염 (2-IminothiolaneㆍHCl; ITL; 피어스사 제조) FITC 버퍼 용액 (2㎎/mL, 283μL) 을 첨가하고, 실온, 차광하에 30분간 반응시켰다. 탈염 칼럼 (PD-10) 에 의해 미반응 저분자량 성분을 제거함과 함께 1mM EDTA 함유 PBS 로 용매 치환하였다. 얻어진 용액을 원심식 한외 여과 (Centricon-30) 에 의해 약 1.2mL 로 농축하여, FITC 표지 Fab-SH 용액으로 하였다. 얻어진 FITC 표지 Fab-SH 용액으로부터 2.5μL 취하고, PBS 에 의해 40배 희석하여 280 및 495㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 실시예 14-3 과 동일하게 Fab-SH 농도 및 FITC/Fab-SH 비를 산출한 결과, Fab-SH: 1.05㎎/mL, FITC/Fab-SH: 3.20 (㏖/㏖) 이었다. 또한, 얻어진 액으로부터 15μL 취하여, Ellman 시약으로 메르캅토기를 정량하였다. 메르캅토기 및 Fab-SH 농도로부터 메르캅토기 도입률을 산출한 결과, 메르캅토기/Fab-SH: 1.97 (㏖/㏖) 이었다. 이하에 Ellman 시약에 의한 메르캅토기의 정량법을 나타낸다.

엘만 ( Ellman ) 시약을 사용한 메르캅토기의 정량 방법

[시약]

반응 용매: 1mM EDTA 함유 0.1M 인산 완충액 (pH 8.0)

엘만 시약 용액: 엘만 시약 40㎎/mL DMSO 용액을 반응 용매에 의해 10배 희석

[표준 물질]

시스테인 염산염 1수화물 (이하, 「Cys」라고도 한다) 을 반응 용매에 용해하여 10.54㎎/mL (60mM) 로 조제하였다.

이 액 100μL 를 반응 용매에 의해 10배 희석하고, 또 희석된 액 200μL 를 반응 용매에 의해 5배 희석하였다 (최종 농도 Cys 1.2mM).

Cys 1.2mM 용액으로부터 2배 희석열을 조제하였다 (농도 8점: 0.0094∼1.2mM).

[정량]

반응 용매 150μL 에 엘만 시약 용액 3μL 를 첨가하였다. 엘만 시약을 함유하는 반응 용매에 표준 물질 또는 시료 용액 15μL 를 첨가하여 교반 혼화하였다. 실온에서 15분간 정치한 후 412㎚ 에서의 흡광도를 측정하였다. 표준 물질의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 시료 용액 중의 메르캅토기를 정량하였 다.

(실시예 14-5) HA-AM-MI/SUC 의 조제

BOP 시약을 HA 유닛에 대하여 2.5 로 한 것 외에는 실시예 3-1 과 동일한 방법으로 얻은 HA-AM (EDOBEA 도입률: 95.5%) 수용액 (10㎎/mL, 8.5mL) 에 0.2M 인산 완충액 (pH 7.0, 10.625mL) 을 첨가하였다. N-[κ-말레이미드운데카노일옥시]-술포숙신이미드 에스테르 (N-[κ-Maleimidoundecanoyloxy]-sulfosuccinimide ester; Sulfo-KMUS; 피어스사 제조) 의 DMSO 용액 (1.074㎎/mL, 2.125mL) 을 첨가하고, 실온에서 30분간 진탕하였다. 무수 숙신산 DMSO 용액 (283.95㎎/mL, 2.125mL) 을 첨가하고 추가로 실온에서 1.5시간 진탕하였다. 4℃ 에서 대과잉량의 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, MWCO: 12k-14kDa), 얻어진 용액을 동결 건조시켜 HA-AM-MI/SUC (98.15㎎) 를 얻었다.

(실시예 14-6) PK 시험용 HA-FITC 표지 Fab 콘쥬게이트 용액의 조제

실시예 14-5 에서 얻어진 HA-AM-MI/SUC 수용액 (20㎎/mL, 2.2mL) 에 실시예 14-4 에서 얻어진 FITC 표지 Fab-SH 용액 약 1.2mL 중의 1.1mL 및 1mM EDTA 함유 PBS (1.1mL) 를 첨가하여 37℃ 에서 2시간 인큐베이트하였다. 요오드아세트산의 1mM EDTA 함유 PBS 용액 (55.8㎍/mL, 1.1mL) 을 첨가하고, 다시 1시간 인큐베이트하였다. 반응 혼합액을 하기 조건으로 GPC 에 적용시켜 콘쥬게이트 분획을 분취하였다. GPC 조건을 하기에 나타낸다. 분취한 용액에 1/10 용량의 10mM 글리신 함유 PBS 를 첨가하고, 원심식 한외 여과 (Vivaspin20, MWCO: 50000, 후나코시 주식회사 제조) 에 의해 약 3.0mL 까지 농축하여, HA-FITC 표지 Fab 콘쥬 게이트 용액으로 하였다. 얻어진 HA-FITC 표지 Fab 콘쥬게이트 용액으로부터 10μL 를 취하고, PBS 에 의해 10배 희석하여 280 및 495㎚ 에서의 흡광도를 측정하였다. 실시예 14-4 에서 측정한 FITC 표지 Fab-SH 의 (495㎚ 에서의 흡광도)/(280㎚ 에서의 흡광도) 비를 사용하여 Fab 농도를 산출한 결과, Fab: 1.05㎎/mL 였다.

GPC 조건

System: FPLC 또는 AKTA explorer (모두, 아마샴 바이오사이언스 주식회사 제조)

GPC Column: HiLoad 16/60 Superdex 200prep grede (아마샴 바이오사이언스 주식회사 제조)

Mobile phase: PBS (pH 7.4)

Flow rate: 1.0mL/min

Detection: UV (280㎚)

[시험예 4] 래트에 HA-FITC 표지 Fab 콘쥬게이트 및 FITC 표지 Fab 를 단회 정맥내 투여하였을 때의 혈장 중 농도 추이

웅성 래트 (slc: SD, Japan SLC (주)) 에, 실시예 14-6 에서 얻어진 HA-FITC 표지 Fab 콘쥬게이트 용액 및 실시예 14-3 에서 얻어진 PK 시험용 FITC 표지 Fab 용액 (모두, 10mM 글리신 함유 PBS 로 희석하여, Fab 농도 1㎎/mL 로 하였다) 을 3㎎/㎏ 로 단회 꼬리정맥 내 투여하였다 (n=3). 투여 15, 30분, 1, 2, 4, 6, 8, 24시간 후에 경정맥으로부터 헤파린 처리한 25G 주사바늘이 장착된 테르모 시린지 (Terumo syringe) 를 사용하여 채혈하였다. 또한, HA-FITC 표지 Fab 콘쥬게이트 투여군에 관해서는, 투여 48, 72, 96 및 168시간 후에도 채혈하였다. 채취한 혈액은 즉시 4℃, 15,000rpm 으로 5분간 원심하여, 혈장을 분리하였다.

혈장 시료 50μL 에 Tween 20 0.05% 함유 PBS 50μL 를 첨가 후, 용액의 형광 강도를 형광 검출기로 측정하였다. 또한, 투여액을 사용하여 표준 곡선을 작성하고, 그것을 기초로 총형광 강도에 기초하는 혈장 중 농도를 산출하였다. 형광 강도 측정후, 혈장 시료를 하기 조건으로 GPC 에 적용하고, 총형광 강도에 대한 HA-FITC 표지 Fab 콘쥬게이트 및 FITC 표지 Fab 의 형광 강도의 비율을 측정하였다. 총형광 강도에 기초하는 혈장 중 농도에 상기 비율을 곱하여 혈장 중 HA-FITC 표지 Fab 콘쥬게이트 및 FITC 표지 Fab 농도를 산출하였다.

HA-FITC 표지 Fab 콘쥬게이트 및 FITC 표지 Fab 투여군 모두 혈장 중 농도는 2상성(二相性)으로 감소하였다 (도 27). FITC 표지 Fab 의 소실상(相)의 반감기는 1.50시간으로, FITC 표지 Fab 는 빠르게 순환혈로부터 소실된 데에 대하여, HA-FITC 표지 Fab 콘쥬게이트의 반감기는 38.89시간으로, HA-FITC 표지 Fab 콘쥬게이트의 혈중 체류성의 대폭적인 연장이 확인되었다.

GPC 조건

System: LC-10A (시마즈 제작소) 또는 Waters 600S (Waters)

형광 검출기: L-7480 (히타치 제작소) 또는 Waters 474 (Waters)

GPC Column: TSKgel G6000PW_XL (TOSOH 사 제조)

Mobile phase: Tween 20 0.05% 함유 PBS

Flow Rate: 0.5mL/min

Detection: 490㎚ 여기에 의한 518㎚ 의 형광 강도

[실시예 15]

수용성 HA 수식물-GLP-1 콘쥬게이트의 조제

(실시예 15-1) HA-AM-MI/SUC 의 조제

BOP 시약을 HA 유닛에 대하여 2.5 의 등량비로 한 것 외에는 실시예 3-1 과 동일한 방법으로 얻은 HA-AM (EDOBEA 도입률: 95.5%) 수용액 (10㎎/mL, 17.66mL) 에 0.2M 인산 완충액 (pH 7.0, 22.075mL) 을 첨가하였다. N-[κ-말레이미드운데카노일옥시]-술포숙신이미드 에스테르 (Sulfo-KMUS; 피어스사 제조) 의 DMSO 용액 (0.573㎎/mL, 4.415mL) 을 첨가하고, 실온에서 30분간 진탕하였다. 무수 숙신산 DMSO 용액 (283.95㎎/mL, 4.415mL) 을 첨가하여, 다시 실온에서 1.5시간 진탕하였다. 4℃ 에서 대과잉량의 증류수 (밀리 Q 워터) 에 대하여 투석 정제하고 (스펙트라포어 4, MWCO: 12k-14kDa), 얻어진 용액을 동결 건조시켜, 말레이미드기 및 숙신산이 도입된 히알루론산 수식물 (이하, 「HA-AM-MI/SUC」라고도 한다, 177.80㎎) 을 얻었다.

(실시예 15-2) HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트 용액의 조제

천연형의 GLP-1 (Human, 7-37; 일본 공표특허공보 평7-504679호 기재) 의 2번째 (8 위치) 의 알라닌을 글리신으로, 31번째 (37 위치) 의 글리신을 시스테인으로 변경한 변이체 (이하, 「GLP-1 변이체」라고도 한다) 를 고상법 펩티드 합성법 에 의해 얻었다 (펩티드 연구소사 (주) 제조). GLP-1 변이체의 0.2M 인산 완충액 (pH 7.0) 의 용액 (2.0㎎/mL) 에 트리스[2-카르복시에틸]포스핀염산염 (이하, 「TCEP」라고도 한다) 수용액 (20mM) 을 1/20 용량 첨가하였다. 이 TCEP 를 함유하는 GLP-1 변이체 용액 (1.3263mL) 을 실시예 15-1 에서 얻은 HA-AM-MI/SUC 수용액 (20㎎/mL, 1.2mL) 에 첨가하고, 37℃ 에서 2시간 인큐베이트하였다. 동일한 TCEP 를 함유하는 GLP-1 변이체 용액 (1.3263mL) 을 재차 첨가하여, 동일하게 인큐베이트하였다. 시스테인염산염 1수화물의 0.1M 인산 완충액 (pH 7.0) 용액 (3.6㎎/mL, 0.3853mL) 을 첨가하고, 또 다시 37℃ 에서 1시간 인큐베이트하였다. 반응 혼합액을 3회로 나눠 하기 조건으로 GPC 에 적용시켜 콘쥬게이트 분획을 분취하였다. 분취한 분획을 원심식 한외 여과 (Vivaspin20, MWCO: 50000, 후나코시 주식회사 제조) 에 의해 약 4.85mL 까지 농축하여, 표제의 HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트 용액을 얻었다. GLP-1 변이체를 사용하지 않고서 본 실시예와 동일한 조작을 실시하여 얻어진 시료를 대조로서 보정에 사용하고, 얻어진 HA-GLP-1 변이체 용액의 280㎚ 에서의 흡광도와 카르바졸황산법으로, GLP-1 변이체 농도, HA-AM-MI/SUC 농도 및 GLP-1 변이체 도입률을 산출하였다. GLP-1 변이체가 42.6n㏖/mL, HA-AM-MI/SUC 가 3.54㎎/mL, GLP-1 변이체가 3.7/HA (㏖/㏖) 였다.

GPC 조건

System: FPLC (아마샴 바이오사이언스 주식회사 제조)

Mobile phase: PBS (pH 7.4)

Flow rate: 1.0mL/min

Detection: UV (280㎚)

카르바졸 황산법에 의한 HA 수식물 정량 방법

[시약]

황산 용액: Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O 의 황산 용액 (25mM)

카르바졸 용액: 카르바졸의 에탄올 용액 (1.25㎎/mL: 0.125%)

[표준 물질]

N-[κ-말레이미드운데카노일옥시]-술포숙신이미드 에스테르의 DMSO 용액을 첨가하지 않은 것 외에는 실시예 15-1 과 동일한 방법으로 HA-AM 에 무수 숙신산만이 도입된 히알루론산 수식물 (HA-AM-SUC) 을 조제하고, PBS 에 용해하여 0.5㎎/mL 로 하였다. 이 0.5㎎/mL 의 HA-AM-SUC 용액으로부터 2배 희석열을 조제하였다 (농도 5점: 0.03125∼0.5㎎/mL).

[정량]

빙랭한 황산 용액 (1mL) 에, PBS (대조) 및 표준 물질 (각 0.2mL), 그리고 실시예 15-2 에서 얻어진 HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트 용액을 PBS 에 의해 19.8배 희석하여 얻은 용액 (0.2mL) 을 첨가하고, 혼합하였다. 열수욕 중에서 25분간 가열한 후, 흐르는 물로 실온까지 냉각하였다. 각각에 카르바졸 용액 (40μL) 을 첨가하여 혼합하였다. 다시 열수욕 중에서 약 30분간 가열한 후, 흐르는 물 로 실온까지 냉각하였다. 530㎚ 에서의 흡광도를 측정하여, 대조 및 표준 물질의 흡광도로부터 검량선을 작성하고, 시료 용액에 함유되는 HA 수식물의 농도를 정량하였다.

[시험예 5] HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트의 혈중 체류 시간 평가

HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트 투여 래트 혈장 샘플

실시예 15-2 에서 얻어진 HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트 용액을 Tween 80 을 0.05% 함유하는 PBS (pH 7.4; 이하, 「용매 Z」라고도 한다) 로 희석하고, 50㎍/㎏ 의 용량으로 래트 정맥내에 단회 투여하여, 투여후 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 및 168시간에 채혈 (헤파린 처리) 하고, 원심분리에 의해 혈장을 얻었다. 이 혈장 샘플은 측정때까지 -20℃ 이하에서 동결 저장하였다.

측정 방법

GLP-1 (Active) ELISA KIT (Linco Research, Inc. America; 이하, 「키트 W」라고도 한다) 의 96 웰 플레이트에 검량선용 표준 시료 및 측정용 시료를 분주하고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 분석을 실시하였다. 이하에 조건을 나타낸다.

Detection: Fluorescence (EX: 355㎚, EM: 460㎚)

측정 시료의 조제

ㆍ검량선용 시료;

실시예 15-2 에서 얻어진 HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트 용액을 용매 Z 및 키 트 W 에 동봉된 Assay Buffer 를 사용하여 희석하여, 12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1㎍/mL 및 0㎍/mL 의 표준액을 조제하였다. 이 표준액에 5μL 의 정상 래트 혈장을 첨가하여, 검량선용 시료를 조제하였다.

ㆍ측정용 시료의 조제;

HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트 투여 래트 혈장 샘플에, 키트 W 에 동봉된 Assay Buffer 를 첨가하여 측정용 시료를 조제하였다.

ㆍ혈장 중의 HA 수식물 농도의 산출;

해석 소프트 SOFTmax PRO (Molecular Devices 사 제조) 를 사용하여 각 표준 시료의 형광 강도로부터 얻어진 검량선으로부터 혈장 중의 HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트 농도를 산출하였다.

약물 동태 데이터

투여한 HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트의 혈중 농도 추이의 데이터에 관해서, WinNonlin Ver 4.0.1 (Pharsight 사 제조) 로 약물 동태학적 파라미터를 산출하였다. 각 개체의 혈장 중 농도 추이에 관해서 모델 비의존적 해석을 실시하여, 평균 혈중 체류 시간 (MRT) 을 산출하였다. 반감기 (t1/2) 는 각 개체의 측정 가능한 최종 3점의 데이터를 사용하여 산출하였다. HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트의 혈중 농도 추이를 도 28 에 나타낸다. 또한, 산출한 약물 동태학적 파라미터를 표 12 에 나타낸다.

[표 12]

HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트를 래트에 정맥내 투여하였을 때의 약물 동태학 적 파라미터

천연형의 GLP-1 및 천연형의 GLP-1 의 2번째 알라닌을 글리신으로 변경한 변이체를, 인간 및 돼지에 정맥내 투여하였을 때의 반감기가 1∼5분인 것이 보고되어 있다 (Current Medicinal Chemistry, 제10권, 2471-2483페이지, 2003년 및 Diabetologia, 제41권, 271-278페이지, 1998년). 도 28 및 표 12 로부터, HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트를 래트에 정맥내 투여하였을 때의 반감기는, 23.6시간, MRT 는 30.2시간이 되어, 천연형의 GLP-1 등과 비교하여 대폭 혈중 체류성의 연장이 일어났음이 시사되었다.

[시험예 5] 경구 당부하 시험

8주령의 웅성 BKS.Cg-＋ Lepr^db/＋Lepr^db/Jcl 마우스 (크레아 재팬 주식회사 제조) 를 밤새 절식시킨 후, 실시예 15-2 에서 얻어진 HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트 용액을 용매 Z 로 희석한 것 (펩티드량으로서, 1.5㎍/㎏, 15㎍/㎏ 또는 150㎍/㎏) 또는 용매 Z 를 정맥내 투여하고, 정맥내 투여 1분 후에 50% 글루코오스 용액 ((주)오오쓰카 제약 공장) 을 3g/㎏ 이 되도록 경구 투여하였다. 동일하게 GLP-1 (Human, 7-37; 주식회사 펩티드 연구소 제조) 를 용매 Z 로 희석한 것 (150㎍/㎏ 또는 1500㎍/㎏) 또는 용매 Z 를 정맥내 투여하고, 정맥내 투여 1분 후에 50% 글루코오스 용액을 3g/㎏ 이 되도록 경구 투여하였다.

글루코오스 투여전 (0시간의 값으로 한다), 글루코오스 투여 0.5, 1, 2, 및 4시간 후에 꼬리 부분으로부터 혈액을 채취하고, 혈당치를 효소법 (헥소키나아제법, 오토세라S GLU (다이이치 화학 약품 (주); 기기명: BioMajesty JCA-BM1250 (닛폰전자 (주)) 으로 측정하였다.

이하의 식에서 혈당 강하율을 산출하였다.

[화학식 14]

여기서, 혈당 상승치의 AUC 란, 횡축에 글루코오스 투여후의 시간, 종축에 각 개체의 혈당치를 플롯하고, 각 점을 직선으로 연결하여 얻어지는 그래프의 곡선하 면적으로부터, 각 개체의 글루코오스 투여전의 혈당치가 글루코오스 투여 4시간 후까지 변화없이 일정하였다는 경우의 그래프의 곡선하 면적을 감산한 것이다. 구체적으로는, A¹=글루코오스 투여전의 혈당치, B¹=글루코오스 투여 30분 후의 혈당치, C¹=글루코오스 투여 1시간 후의 혈당치, D¹=글루코오스 투여 2시간 후의 혈당치, E¹=글루코오스 투여 4시간 후의 혈당치로 하였을 때, 혈당 상승치의 AUC 는 이하의 식:

[화학식 15]

으로부터 구할 수 있다.

산출된 혈당 강하율로부터 각 군마다 평균치 및 표준편차를 산출하여, 표 13 및 표 14 에 나타내었다. HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트에서는, GLP-1 (Human, 7-37) 과 비교하여 혈당 강하 작용이 대폭 증대되어, 당뇨병 치료제로서의 유용성이 시사되었다.

[표 13]

GLP-1 (Human, 7-37) 투여시의 혈당 강하율 (%)

[표 14]

HA-GLP-1 변이체 콘쥬게이트 투여시의 혈당 강하율 (%)

Claims

비프로톤성 극성 용매 중에서, 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 BOP 계 축합제를 사용하고, 히알루론산 또는 그 유도체의 글루쿠론산 부분에 함유되는 카르복시기를, 5몰% 이상의 수식(修飾)률로 치환 아미드기로 변환하는 공정을 포함하는 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법으로서, 상기 수용성 히알루론산 수식물이 식 (Ⅰ):

[화학식 2]

[식 중, R¹, R², R³ 및 R⁴는, 각각 독립적으로, 수소 원자, C_1-6 알킬기 또는 C_1-6 알킬카르보닐기에서 선택되고,

Ra 는, 수소 원자 또는 C_1-6 알킬기이고,

Rb 는, 수소 원자, C_1-6 알킬기 또는 기 -CO-C(R²⁰)=CH₂ 이고,

A 는, -CH₂-(CHR⁵)_m-2-CH₂-NH-, -CH₂-(CHR⁶)_p-2-CH₂-O-, -(CH₂)_j-S-, -CH₂-CH₂-(Y³-CH₂-CH₂)_z-S-, -CH₂-CH₂-(Y⁴-CH₂-CH₂)_t-NH- 또는 - CH₂-CH₂-(Y⁵-CH₂-CH₂)_y-O- 이고,

여기서, m, p, 및 j 는, 각각 독립적으로 2∼10 에서 선택되는 정수이고, z, t 및 y 는, 각각 독립적으로 1∼200 에서 선택되는 정수이고, R⁵ 및 R⁶은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 수산기이고, R²⁰은, 수소 원자 또는 메틸기이고, Y³, Y⁴ 및 Y⁵ 는, 각각 독립적으로, 산소 원자 또는 -NH- 이다]

로 표시되는 반복 단위를 분자 내에 적어도 1 이상 함유하는 것이고,

비프로톤성 극성 용매가 디메틸술폭사이드인 상기 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

카르복시기의 변환에 의해 생기는 치환 아미드기의 치환기가, 적어도 1 이상의 관능기를 함유하고, 당해 관능기가, 치환되어 있어도 되는 아미노기, 수산기, 메르캅토기, 카르복시기, 알데히드기, 메타크릴로일기, 및 아크릴로일기에서 선택되는 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

카르복시기의 변환에 의해 생기는 치환 아미드기의 치환기가, 치환되어 있어도 되는 아미노기, 수산기, 메르캅토기, 카르복시기, 알데히드기, 메타크릴로일기, 및 아크릴로일기에서 선택되는 1개의 관능기를 함유하는 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

카르복시기의 변환에 의해 생기는 치환 아미드기의 치환기가, 치환되어 있어도 되는 아미노기, 수산기, 메르캅토기, 메타크릴로일기 또는 아크릴로일기에서 선택되는 1 또는 2 종류의 관능기를 각 치환기 중에 1∼9개 함유하는 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법.
제 4 항에 있어서,

각 치환 아미드기 중의 관능기수가 1∼4개인 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법.
제 4 항에 있어서,

카르복시기의 변환에 의해 생기는 치환 아미드기의 치환기가, 아미노알킬기 (이 아미노알킬기의 알킬렌 사슬은 1 이상의 수산기로 치환되어 있어도 된다), 아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기, 아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기, 히드록시알킬기 (이 히드록시알킬기의 알킬렌 사슬은 1 이상의 수산기로 치환되어 있어도 된다), 히드록시(폴리알킬렌옥시)알킬기, 히드록시(폴리알킬렌아미노)알킬기, 메르캅토알킬기, 메르캅토(폴리알킬렌옥시)알킬기, 메르캅토(폴리알킬렌아미노)알킬기, 메타크릴로일옥시알킬기, 메타크릴로일아미노알킬기, 메타크릴로일아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기, 메타크릴로일아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기, 메타크릴로일옥시(폴리알킬렌옥시)알킬기, 메타크릴로일옥시(폴리알킬렌아미노)알킬기, 아크릴로일옥시알킬기, 아크릴로일아미노알킬기, 아크릴로일아미노(폴리알킬렌옥시)알킬기, 아크릴로일아미노(폴리알킬렌아미노)알킬기, 아크릴로일옥시(폴리알킬렌옥시)알킬기 또는 아크릴로일옥시(폴리알킬렌아미노)알킬기인 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

히알루론산 또는 그 유도체와, 이하의 식:

[식 중, m, l, p, j 및 q 는, 각각 독립적으로 2∼10 에서 선택되는 정수이고, n, r, z, t 및 y 는, 각각 독립적으로 1∼200 에서 선택되는 정수이고, R⁵ 및 R⁶은 각각 독립적으로 수소 원자 또는 수산기이고, R⁷ 은, 수소 원자, 보호기 또는 -S-(CH₂)_j-NH₂ 이고, R⁸ 은, 수소 원자, 보호기 또는 -S-(CH₂-CH₂-Y³)_z-CH₂-CH₂-NH₂이고, R¹⁶, R¹⁷, R¹⁸, 및 R¹⁹는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 메틸기이고, Y¹, Y², Y³, Y⁴ 및 Y⁵ 는, 각각 독립적으로, 산소 원자 또는 -NH- 이다]

에서 선택되는 1 이상의 화합물과 반응시킴으로써 치환 아미드기를 형성하는 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

수용성 히알루론산 수식물이 2 이상의 종류의 치환 아미드기를 함유하는 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법.
삭제
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 수용성 히알루론산 수식물이 약물 담체로서 사용되는 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

수식률이 30몰% 이상인 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

수식률이 70몰% 이하인 수용성 히알루론산 수식물의 제조 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제