JP2013533362A - ヒアルロン酸の疎水性有機化合物とのエステル化用のプロセス - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩またはヒアルロン酸誘導体の、疎水性有機化合物とのエステルを提供するためのプロセスに関する。本プロセスは、所望のエステルを得るために、（ｉ）ヒアルロン酸、その塩または誘導体を低下させた温度で微細化し、（ｉｉ）適切な溶媒中で、疎水性化合物をステップ（ｉ）で得られた微細化されたヒアルロン酸と反応させ、そして（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られた反応混合物を濾過または透析するステップを含む。また、本発明による目的は、その方法により得られたエステルおよびそれらを含む組成物、軟骨の損傷および炎症に対する治療および／または予防用への使用である。

Description

本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）、その塩および誘導体の疎水性有機化合物とのエステル調製用のプロセスに関する。

ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンの交互のユニットが直鎖状に形成され１３×１０^６ダルトンまでの分子量を有する天然ムコ多糖類である。ヒアルロン酸は、生物のすべての軟組織中、および、例えば、滑液、関節の軟骨、皮膚等の多くの生体組織中に存在している。

ヒアルロン酸およびその塩、特に、ナトリウム塩は、長年に亘り、関節の特定の疾患（diseases）や障害（disorders）の結果として劣化または減少する滑液中に通常存在するヒアルロン酸を置換することを目的として関節内投与に使用されている。眼科手術において、ヒアルロン酸は、眼の前房の一時的な充填剤（filler）や手術器具の潤滑剤として使用されている。

特に、ヒアルロン酸ナトリウムは、関節の炎症の治療に使用され優れた効果をもたらしており、それは関節内注射により投与され、デュアル機構：少なくとも部分的にフリーラジカル捕捉能に起因する抗炎症効果、および、ヒアルロン酸塩により生じる滑液の粘性増加に起因する潤滑効果を介して作用する。さらに、ヒアルロン酸塩は、軟骨修復（repair）に有益な効果を有しており、このため、軟骨損傷部位での軟骨組織の回復（restoring)を目的とする補足的療法が可能である。

また、ヒアルロン酸塩は、眼科学や皮膚病学に有益であり、その保護作用、潤滑作用、抗炎症作用のために使用され、創傷や組織の修復のために使用される。

しかしながら、ヒアルロン酸およびその塩の１つの重大な欠点は、多糖鎖のグリコシド結合の加水分解による劣化に対する感受性である。加水分解速度（rate）は、温度、ｐＨ値およびイオン濃度により大きく影響される。

ヒアルロン酸のヒドロキシ基のエステル化は、解重合に対する感受性を少なくとも部分的に減少させることができることが見出されている。しかしながら、ヒアルロン酸の、アントラセンカルボン酸およびその誘導体のような疎水性有機化合物とのエステル化は、ヒアルロン酸およびその塩の親水性に起因する問題が残されている。

化学名が４，５−ジヒドロキシ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸であるレイン（rhein）は、センナ、大黄（ルバーブ）およびアロエベラ等の植物由来のアルカロイド誘導体であり、抗炎症作用および組織保護作用を有しており、関節の炎症の治療に使用されている。その抗炎症効果は、軟骨性変性の原因となる薬剤（agents）中に存在するインターロイキン−１（ＩＬ−１）および窒素酸化物（ＮＯ）のＩＬ−１調整生成物（IL-1
controlled production）の合成の阻害によりもたらされる。

通常、レインは、レインと比較して向上した生物学的利用能（bioavailability）を有しヨーロッパ諸国において骨関節炎の治療用に経口使用が認可されているプロドラッグ（前駆薬、prodrug）、ジアセチルレインまたはジアセレイン（diacerhein）として経口ルートで投与される。しかしながら、レインおよびジアセチルレインは、いずれも、相当な緩下剤作用をもたらす欠点があり、下痢を誘発し、このため、その使用を高齢者や衰弱した患者に勧めることができない。さらに、レインおよびジアセチルレインの水に対する不溶性のために、この副作用は、これらの化合物を非経口または関節内ルートを介して投与することにより取り除くことができない。これに加えて、活性化合物であるレインは、非常に短い半減期を有しており、急速に排出される。そして、ジアセレインは、胃で早期にレインに加水分解されやすい。

これらの特性−低吸収、緩下剤効果、急速な排出、胃でのジアセレインの加水分解−は、経口ジアセレイン療法の低許容性の理由付けとなる。このため、標的（target）領域での局所投与を使用することが好ましい。

しかしながら、ジアセレインの関節内投与は、滑液と適合可能なキャリアにおける薬剤の溶解性がないことに起因して、また、ＩＬ−１合成の効果的なブロックには短すぎることが示されている、関節における短い半減期のために、実現することが難しい。

国際特許出願のＷＯ２００５／０８５２９３号は、ヒアルロン酸のレインとのエステルを開示しており、ヒアルロン酸をレイン塩化物と反応させ、続いて限外濾過または透析による精製によりエステルが調製される。しかしながら、この公報に開示された方法では、ヒアルロン酸のレインとの所望のエステルを極めて低収率でのみ得られるものである。

ヒアルロン酸のジアセレインとのエステル形成用の他の方法は、欧州特許出願第０７０２１６２１．３に開示されている。開示された方法は、アミノ酸をエステル化するために用いられる従来の方法に従い、カルボン酸基がＮ−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）との反応により保護されたジアセレインの使用を含んでいる。イミダゾリルジアセレイン（ＣＤＩＤＩＡＣ）の合成は、無水有機溶媒、例えばＤＭＦ中、３０〜４０℃の温度での化学量論的な反応によりなされる。エステル化反応のために、ヒアルロン酸が有機溶媒に可溶化される必要があり、それゆえ、有機溶媒に可溶性のヒアルロン酸テトラブチルアンモニウム塩を得るために、まず、テトラブチルアンモニウム水酸化物等の強力な第四級塩基で塩化される。エステル化反応は、窒素下、４０℃より低い温度、約４８時間の反応時間で行われる。

この方法は、エステル化反応が生じることを許容するために、ヒアルロン酸分子をその反応パートナーであるＣＤＩＤＩＡＣと接触させることが必要となるような、ヒアルロン酸の労力を要する（labor-intensive）塩化および可溶化を要求する、という欠点を有している。さらに、水溶液の添加は、反応を停止し、所望のエステル生成物を沈殿させるために必要であるが、同様に、未反応の保護されたジアセレイン（ＣＤＩＤＩＡＣ）も加水分解してしまい、他の反応サイクルに使用するために新たに合成する必要がある、という不利な点を有している。

このため、ヒアルロン酸の、レインやジアセレインのようなアントラセンカルボン酸誘導体等の疎水性有機化合物とのエステル化のための改善された方法を提供することが望ましい。

第１の態様では、本発明は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩およびヒアルロン酸誘導体で構成する群から選択されたヒドロキシ基含有化合物を疎水性有機化合物でエステル化するためのプロセスに関し、
（ｉ）前記ヒドロキシ基含有化合物を低下させた温度で微細化（micronizing）し、
（ｉｉ）前記エステルを生成するために、適切な溶媒中で前記疎水性有機化合物を前記（ｉ）で得られた微細化されたヒドロキシ基含有化合物と反応させ、
（ｉｉｉ）所望のエステルを得るために、前記（ｉｉ）で得られた反応混合物を濾過または透析する、
ステップを含む。

他の態様では、本発明は、疎水性化合物の、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩およびヒアルロン酸誘導体で構成する群から選択されたヒドロキシ基含有化合物とのエステルであって、本発明のプロセスに従い得られるエステルに関する。

また他の態様では、本発明は、発明されたプロセスに従い得られたエステルおよび薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤（excipient）を含む薬学的組成物に関する。

更なる態様では、本発明は、軟骨の損傷および／または炎症を治療する（treating）、および／または、予防する（preventing）ために、本発明のプロセスに従い得られたエステルを提供する。

また更なる態様では、本発明は、本発明のプロセスに従い得られたエステルの治療的に有効な量をそれを必要とする患者（subject）に投与することにより、軟骨の損傷および／または炎症を治療および／または予防し、創傷修復を促進し、または、皮膚や目の炎症および／または乾燥の症状を緩和する方法も開示する。

初期ヒアルロン酸、微細化したヒアルロン酸および生成物であるＨＡ−エステルのＧＰＣクロマトグラムを示す。

ここで用いられる用語「典型的（exemplary）」は、「実施例、例示または図示として」を意味する。ここで「典型的」として記載された実施形態や設計（design）は、いずれも、他の実施形態や設計に対して好適である、または、有利であるとして解釈されるべきものではない。

種々の実施形態の文脈において、次の用語は、別に明確に示されていない限り、以下に示す意味を有している。

ここで用いられる「疎水性」は、基本的に非極性である、および／または、基本的に水や他の極性プロトン性溶媒に不溶性ないし非常に僅かな溶解性であるか、または、水や他の極性プロトン性溶媒と非混和性である化合物に関する。このため、そのような化合物の親水性物質とのエステル化は、特別な反応条件を要する。本発明の意図する疎水性化合物は、１０^−８モル／水１リットル以下、１０^−９モル／水１リットル以下、１０^−１０モル／水１リットル以下のように、水に対する非常に低い溶解度定数を有していてもよい。

ここで互換性があるように用いられる「ヒアルロン酸」、「ヒアルロナン（hyaluronan）」および「ヒアルロン酸塩」は、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンで構成される二糖類のポリマであり、β−１，４グリコシド結合およびβ−１，３グリコシド結合により交互に結合したポリマに関する。ヒアルロナンは、生体内において（in
vivo）、２５，０００の二糖類の繰り返しの長さ、５，０００から２０，０００，０００ダルトン（Ｄａ）までの範囲の大きさである。ヒト滑液における平均分子量は、３百万−４百万ダルトンである。

ここで数値または範囲とともに用いられる「約（about）」は、対象となる数値の±２０％の偏差（variation）、好ましくは±１０％の偏差に関する。

ここで用いられる「親水性」は、極性を有する、または、電荷を帯びており（charged）、このため、水や他の極性プロトン性溶媒に容易に混和ないし溶解し、通常非極性溶媒に不溶性の化合物に関する。

ここで用いられる「低下させた温度」は、周囲の（ambient）温度以下の温度、つまり、２０℃以下の温度、好ましくは１５℃以下、１０℃以下、５℃以下または０℃以下の温度に関する。

第１の態様では、本発明は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩およびヒアルロン酸誘導体で構成する群から選択されたヒドロキシ基含有化合物の疎水性有機化合物とのエステル調製用プロセスを開示するものであり、
（ｉ）前記ヒドロキシ基含有化合物を低下させた温度で微細化し、
（ｉｉ）前記エステルを生成するために、適切な溶媒中でアントラセンカルボン酸誘導体を前記（ｉ）で得られた微細化されたヒドロキシ基含有化合物と反応させ、
（ｉｉｉ）所望のエステルを得るために、前記（ｉｉ）で得られた反応混合物を濾過または透析する、
ステップを含む。

通常高親水性であるヒドロキシ基含有化合物の微細化は、微細粒子を生成することが必要である。そして、これらは、適切な溶媒中に分散させることができ、このため、ヒドロキシ基含有化合物を非極性溶媒に可溶化することを要せずに、疎水性化合物と反応させることができる。低下させた温度は、微細化するプロセスにより生じた熱に起因する劣化を回避する目的に役立つ。固体粒子形状の１つの反応相手（partner）の使用は、未反応の反応物および溶媒からの反応生成物の単純で速やかな分離を許容し、手間がかかり時間を要する沈殿手順（protocols）を回避することができる。

本プロセスの種々の実施形態において、疎水性有機化合物は、アントラセンカルボン酸またはその誘導体である。典型的なアントラセンカルボン酸誘導体は、レイン（４，５−ジヒドロキシ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸）、ジアセレイン（４，５−ジアセトキシ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸）およびそれらの誘導体で構成する群から選択することができる。誘導体は、１またはそれ以上のヒドロキシ基が保護基で保護されたレイン誘導体を含んでいてもよい。典型的な保護基は、制限されるものではないが、ｔ−ブチル、アリル、ベンジル、メトキシメチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、テトラヒドロピラニル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、ピバロイルおよびベンゾイルを含む。

本プロセスのさらに種々の実施形態において、疎水性有機化合物は、非ステロイド系抗炎症性薬剤（ＮＳＡＩＤ）やその誘導体等の抗炎症性薬剤である。典型的なＮＳＡＩＤは、制限されるものではないが、イブプロフェン（Ibuprofen）、ナプロキセン（Naproxen）、フェノプロフェン（Fenoprofen）、ケトプロフェン（Ketoprofen）、フルルビプロフェン（Flurbiprofen）、オキサプロジン（Oxaprozin）、インドメタシン（Indomethacin）、スリンダク（Sulindac）、エトドラク（Etodolac）、ジクロフェナク（Diclofenac）、ナブメトン（Nabumetone）、ピロキシカム（Piroxicam）、メロキシカム（Meloxicam）、テノキシカム（Tenoxicam）、ドロキシカム（Droxicam）、ロルノキシカム（Lornoxicam）、イソキシカム（Isoxicam）、メフェナム酸（Mefenamic
acid）、メクロフェナム酸（Meclofenamic acid）、フルフェナム酸（Flufenamic acid）、トルフェナム酸（Tolfenamic
acid）、セレコキシブ（Celecoxib）、ロフェコキシブ（Rofecoxib）、ヴァルデコキシブ（Valdecoxib）、パレコキシブ（Parecoxib）、ルミラコキシブ（Lumiracoxib）、エトリコキシブ（Etoricoxib）、ニメスリド（Nimesulide）およびリコフェロン（Licofelone）を含む。ステロイド系抗炎症性薬剤は、制限されるものではないが、ヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）、プレドニゾン（Prednisone）、プレドニゾロン（Prednisolone）、メチルプレドニゾロン（Methylprednisolone）、デキサメタゾン（Dexamethasone）、ベタメタゾン（Betamethasone）、トリアムシノロン（Triamcinolone）およびベクロメタゾン（Beclomethasone）を含む。

クレームされたプロセスの種々の実施形態において、ヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸エステルである。典型的なエステルは、ヒアルロン酸の、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ドデシルおよびベンジルのエステルを含む。そのようなエステルでは、ヒアルロン酸分子が疎水性化合物の結合を許容するように、ほんの部分的にエステル化されている。

さらなる実施形態において、ヒアルロン酸は、例えば、架橋等の修飾がなされていてもよい。種々の実施形態において、架橋されたヒアルロン酸は、先に挙げた疎水性化合物、例えば、アントラセンカルボン酸およびその誘導体と結合していてもよい。

種々の実施形態において、ヒドロキシ基含有化合物は、ヒアルロン酸またはその塩である。好ましい実施形態において、ヒアルロン酸塩は、ヒアルロン酸ナトリウムである。他のヒアルロン酸塩は、制限されるものではないが、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸鉄、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウムおよびヒアルロナン亜鉛を含む。

本発明のいくつかの（certain）実施形態において、ヒドロキシ基含有化合物は、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩および／またはヒアルロン酸誘導体の混合物でもよい。

種々の実施形態において、ヒアルロン酸またはその塩若しくは誘導体は、約１００，０００〜約２，５００，０００ダルトン、約１００，０００〜約１，５００，０００ダルトン、約５００，０００〜約１，０００，０００ダルトンまたは約１００，０００または約１，０００，０００ダルトンの平均分子量を有している。

本発明に従うプロセスの種々の実施形態において、微細化は、約−２０℃〜約−２５０℃の温度、約−４０℃〜約−２００℃の温度、約−７０℃〜約−２００℃、約１００℃〜約−２００℃または約−１５０℃〜約−２００℃で行われる。そのような低温下で微細化ステップを行うことは、微細化する手法（procedure）により生じた熱が微細化した化合物を劣化させることを回避することに役立つ。

低温は、適切な条件下、例えば、冷却媒体中で微細化を行うことにより達成することができる。安全であり、微細化した化合物の劣化を回避し、基本的に不活性である微細化ステップ用の適切な媒体は、制限されるものではないが、液体窒素を含む。

低温は、微細化ステップ（ｉ）がヒドロキシ基含有化合物の分子量を大きく変化させないこと、すなわち、ポリマの劣化に至らないことを確実にする。

微細化は、粉砕（milling）や磨砕（grinding）等の従来の技術（techniques）により行うことができる。粉砕は、例えば、クライオミル（cryomilling）でもよい。クライオミル法において、ヒドロキシ基含有化合物は、液体窒素等の冷却媒体とともに低温スラリまたは結晶性や非晶性の物質を形成し、機械的に粉砕される。適切な技術は当業者に知られており、そのようなクライオミル法用の装置は市販されている。

微細化ステップで生成された粒子は、わずか数マイクロメートルの平均直径を有しており、ナノメートル範囲のように小さいことが好ましい。好適な平均粒子サイズは、約０．１〜１００ｎｍ、例えば１〜１０ｎｍである。

種々の実施形態において、微細化された粒子は、適切な溶媒中で疎水性化合物と接触される。好適な実施形態において、疎水性化合物は、その溶媒に溶解される。

そのような実施形態において、溶媒は、非極性または極性非プロトン性溶媒でもよい。適切な非極性溶媒は、当業者に知られており、制限されるものではないが、ｎ−ペンタン、シクロペンタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテルおよびｔ−ブチルメチルエーテルを含む。適切な極性非プロトン性溶媒は、制限されるものではないが、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、エチルアセテート、アセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリルおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。

種々の実施形態において、微細化されたヒドロキシ基含有化合物を適切な溶媒中で疎水性化合物と接触させることを含む反応ステップ（ｉｉ）は、約３０分間、約１時間、約２時間、約４時間、約８時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間または約７２時間行われる。

種々の実施形態において、エステル化反応、つまり、ステップ（ｉｉ）は、約１０〜約８０℃、約２０〜７０℃または約３０〜６０℃で行われる。他の実施形態において、反応は、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０または約７５℃の温度で行われる。

発明したプロセスの種々の実施形態において、反応物、つまり、ヒドロキシ基含有化合物および／または疎水性化合物は、反応ステップ（ｉｉ）で活性化されてもよい。

そのような活性化は、例えば、それぞれの化合物を活性化剤と反応させることにより行うことができる。

典型的な活性化剤は、制限されるものではないが、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を含む。

好適な実施形態において、例えば、アントラセンカルボン酸またはその誘導体である疎水性化合物は、ステップ（ｉｉ）の前にＣＤＩで活性化される。

活性化は適切な溶媒、例えば、ＴＨＦのような極性非プロトン性溶媒中で行うことができる。アントラセンカルボン酸誘導体のＣＤＩでの活性化は、例えば、周囲の温度で約３０分間〜約４時間で行うことができる。

ヒドロキシ基含有化合物、つまり、ヒアルロナンまたはその塩若しくは誘導体の活性化は、ヒドロキシ基含有化合物の１またはそれ以上のヒドロキシ基に適切な脱離基を結合させることにより行われてもよい。活性化剤は、エステル化系が知られており、制限されるものではないが、ＤＣＣ／ＤＭＡＰ、ＤＩＡＤ／ＰＰｈ３、スルホニル基、トシル基、トリフルオロメタンスルホネート基、イミダゾールおよびイミダゾール誘導体を含む。

反応物、適切な活性化剤および反応条件の活性化用プロセスは、当業者に知られている。

本発明のプロセスの種々の実施形態において、ステップ（ｉｉ）は、触媒存在下で行われる。一実施形態において、触媒は、金属性または非金属性触媒で構成する群から選択される。

適切な金属性触媒は、制限されるものではないが、金属炭酸塩、金属ホウ酸塩、有機金属カルボン酸塩、有機金属スルホン酸塩、金属アルカン複合体、金属アシレート（metal acylates）および金属酸化物を含む。このため、典型的な触媒は、これらに制限されるものではないが、炭酸マグネシウム、炭酸亜鉛、ホウ酸亜鉛、酢酸錫（ＩＩ）、オクタン酸錫（ＩＩ）、乳酸錫（ＩＩ）、酢酸亜鉛、酢酸アルミニウム、トリフルオロメタンスルホン酸錫（ＩＩ）、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛、トリフルオロメタンスルホン酸マグネシウム、メタンスルホン酸錫（ＩＩ）、ｐ−トルエンスルホン酸錫（ＩＩ）、ジラウリン酸ジブチル錫（ＤＢＴＬ）、アンチモン酸化物（Ｓｂ_２Ｏ_３）、チタン酸ブチル（Ｔｉ（ＩＶ）ｂｕｔ）、およびチタン酸イソプロピル（Ｔｉ（ＩＶ）ｉｓｏ）を含む。

適切な非金属性触媒は、酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１−プロパンスルホン酸、１−ブタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−キシレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１−スルホン酸、ナフタレン２−スルホン酸、塩酸、硫酸、リン酸、トリエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、ルチジン、イミダゾール類（imidazoles）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１、５−ジアザビシクロ（４．３．０）ノナ−５−エン（ＤＢＮ）で構成する群から選択されてもよい。

本プロセスの種々の実施形態において、本プロセスは、ステップ（ｉｉｉ）で得られたエステルを適切な溶媒で洗浄するステップをさらに含む。そのような洗浄ステップは、固体エステル粒子を適切な溶媒でリンスすることを含んでもよい。他の精製手順は、エステルを適切な溶媒に可溶化し再結晶化することを含んでもよい。

濾過ステップ（ｉｉｉ）および選択的な洗浄および／または精製ステップの後、ステップ（ｉｉｉ）で得られたエステルは、例えば、低下させた圧力で乾燥させてもよい。

種々の実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）の後に濾液や透析外液に存在する未反応の反応物を回収し反応に再利用してもよい。このことは、反応物が、例えば、ＣＤＩ活性化したレインやジアセレインのような活性化されたアントラセンカルボン酸誘導体等の活性化した反応物であれば、特に好都合である。

本発明に従うプロセスにおいて、ヒドロキシ基含有化合物中での約０．１および約１０％の間の置換率が得られる。好適な実施形態において、ヒドロキシ基含有化合物のヒドロキシ基の少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３、少なくとも約４または少なくとも約５％が疎水性化合物でエステル化される。

本発明の発明者らは、驚くべきことに、ヒアルロナンまたはその塩若しくは誘導体の、適切な疎水性化合物であって、それ自身、例えば、抗生作用、抗菌性（antifungal）、抗炎症性、免疫調節性、鎮痛剤等の有益な治療上の特性を有する疎水性化合物とのエステル化が、ヒアルロナンの安定性を向上させることを見出した。さらに、ヒアルロナンに対する治療剤の共有結合は、疎水性化合物の投与に関連する問題を解消するのに役立ち、その化合物のコントロールされた放出、つまり、持続的な放出につながる。

このため、上述した本プロセスの更なる実施形態において、本プロセスは、ヒアルロン酸またはその塩若しくは誘導体のエステルであって、未反応のヒアルロン酸またはその塩若しくは誘導体と比べて向上した安定性を有するエステルを生成するために使用される。

他の態様では、本発明は、ヒドロキシ基含有化合物のエステルであって、発明したプロセスに従い得ることが可能な、または、得られた疎水性化合物とのエステルも包含する。

他の態様では、本発明は、軟骨の損傷や炎症の治療および／または予防するためのような、医学的応用のためのこれらのエステルの使用もカバーする。更なる実施形態において、これらのエステルは、眼や皮膚の疾患や障害の治療および創傷および／または組織の修復のために使用されてもよい。投与は、例えば、注射により、関節内に、または、局所になされる。

また他の態様では、本発明は、発明したプロセスに従い得ることが可能なエステルおよび薬学的に受け入れられるキャリアや賦形剤を含む薬学的組成物にも特徴がある。

さらに他の態様では、本発明は、発明したプロセスに従い得ることが可能なエステルを治療的に有効な量でそれを必要とする患者に投与することにより、軟骨の損傷および炎症を治療し、および／または、予防する方法にも関連している。

更なる実施形態は、特許請求の範囲および実施例の範囲内にある。以下の実施例は例示にすぎないものであり、本発明が例示された実施形態に制限されるものと解釈されるべきものではない。

実施例１：ＨＡ−ジアセレインの調製（小スケール：０．５ｇスケール）
ジアセレインの０．０４４ｇをドライ（水分除去した、dry）ＴＨＦの２０ｍＬに分散させ、２ｍＬのＴＨＦに溶解した０．０２２ｇのＣＤＩを添加した。反応混合物を透き通った溶液が得られるまで室温下で１時間攪拌した。低温微細化した（cryo-micronized）ＨＡ粉末の０．５ｇを添加し、分散液を７０℃で２４時間攪拌した。そして、反応混合物を、Ｇ４ガラスフィルタ（G4-fritte）で濾過し、ドライＴＨＦの１５０ｍＬで洗浄した。ＨＡ生成物である不溶性残渣は、僅かに黄色であった。生成物を水に再溶解させ、少量の分散したジアセレインを遠心分離により除去し、視覚的に透き通った透明な水溶液を得た。

得られた生成物を、プロトンＮＭＲ（Ｈ^１−ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、紫外分光（ＵＶ）、液クロ−マススペクトル／マススペクトル（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析により分析し、以下の結果を得た。反応は、２％のジアセレイン機能化で元の（original）分子量に近いＨＡ−ポリマが１００％の収率であった。最終生成物でのＨＡの大きな劣化のないことが判明した。得られた生成物は水に可溶で、ほんの僅かに黄色であり、水溶液がジアセレインのＵＶスペクトルを示した。さらなる定性的特徴付けのために、ＨＡ−ジアセレイン生成物を酵素的に加水分解し、ジアセレインを有するＨＡ−フラグメント（オリゴマ）およびジアセレインを有さないＨＡ−フラグメントを得て、ＨＰＬＣ分析により分析した。さらに、結合したジアセレインを有するＨＡ−フラグメントおよび結合したジアセレインを有さないＨＡ−フラグメントを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定した。

実施例２：ＨＡ−ジアセレインの調製（拡大スケール：２．５ｇスケール）
ＨＡは、クライオミル（SPEX 6700 Freezer Mill、液体窒素中で１５分間、applying
middle impact frequency）により−１９６℃で微細化した。粉末は、０．００１バール（bar）（１ｈＰａに相当）で２４時間乾燥させた。ジアセレインおよびＣＤＩは、０．００１バール（１ｈＰａに相当）で２４時間乾燥させた。ＴＨＦは、使用前に、ナトリウムで水分を除去し蒸留した。

ジアセレイン（０．２２ｇ、０．５９７ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（０．１０７ｇ、０．６５７ｍｍｏｌ）をドライＴＨＦの２０ｍＬに溶解させ、透き通った溶液が得られるまで１時間攪拌し、微細化した乾燥ヒアルロン酸の２．５ｇを添加し、さらに７０℃で２４時間攪拌した。

反応混合物を室温まで冷却した後、分散液をＧ４ガラスフィルタ（G4-frit）で濾過し、ドライＴＨＦの２５０ｍＬで４回洗浄し、得られた粉末を０．００１バール（１ｈＰａに相当）で１２時間乾燥させた。未反応のＣＤＩ活性化ジアセレインを溶媒のエバポレート（evaporating）により回収した。

ＨＡ−ジアセレイン生成物の２．５ｇを２．５Ｌの蒸留水に溶解させ、２５℃で３０分間、３０，０００ｒｐｍで遠心分離し（Optima KL 100K Ultacentrifugre、Beckman Coulter社）、最終的に純粋な生成物の凍結乾燥の前に、残存するジアセレインを除去した。全ての透き通った上澄み液をあわせて混合し、凍結乾燥させた（Telstar
LyoBeta 15）。

溶液外観
凍結乾燥した化合物のおよそ１０ｍｇを１ｍｌの純水（pure MilliQ
water）に溶解させることにより、１％（質量／質量）溶液を得た。透き通った粘性のある黄色の溶液が得られ、保管または１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離でも沈殿が生じなかった。

ｐＨ決定
上述した１％溶液のｐＨは５．５であった（Biotrodeガラス電極で作動するMetrohm
691 pH-Meter；TRBにより提供された初期ヒアルロン酸について受領した仕様書では、０．５％溶液のｐＨは５．０〜８．５の範囲である）。

残留水分含有量決定
凍結乾燥後、得られた黄色の化合物のおよそ５５ｍｇの３つの標本を、Ｋａｒｌ−Ｆｉｓｈｅｒシステム（polytron PT 1300Dで作動する890 Titrando）で分析し、粉末の残留水分含有量を決定した。平均値は、９．３＋／−０．２５％の残留水分であった。

分子量決定
得られた化合物のＧＰＣ分析を、初期ヒアルロン酸および微細化したヒアルロン酸（クライオミル）の溶液に対して、示差屈折率（differential RI）およびトリプルアングル（triple-angle）光散乱検出と組み合わせて行い（Waters
Alliance HPLC system; Schambeck RI detector; Wyatt MiniDawn; Waters
Ultrahydrogel 2000, 1000, 250 and 120; カラム温度 ３５℃±２℃；移動相：５０ｍＭリン酸２水素ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．０；流速０．７ｍｌ／ｍｉｎ；分析時間７５分間）、合成および精製のプロセスが、薬学的処方用に最終的に想定した分子量に対してのＨＡの劣化に大きく影響していなかったことを確認した。試料調製では、ＨＡまたは分析試料の１ｍｇを１ｍＬの移動相に溶解させ、１ｍｇ／ｍＬの濃度とした。試料を１分間超音波処理し（sonicate）、完全に溶解するまで２時間攪拌した（Vortex）。５０μＬで２回注入した。図１に、初期ＨＡ:赤、微細化したＨＡ:青、最終生成物:緑の０．１％溶液で得られたクロマトグラフのプロファイルを示す。僅かなピークの広がりが生じたものの、リテンションタイムの大きなシフトは認められなかった。

計算した平均分子量は、最終化合物で１，０６５，５００ダルトンであった（初期ＨＡで１，３１０，０００ダルトン、微細化したＨＡで１，６９６，５００に対して）。

全手法（つまり、合成−精製−凍結乾燥ステップ）の間に大きな分子量低下が生じておらず、最終的な分子量として１，０００，０００ダルトン以上が残された。

ジアセレイン／レイン含有量決定
凍結乾燥後、得られた黄色の化合物の１２の標本（それぞれ２ｍｇ）を、純水（pure MilliQ water）の１ｍＬに溶解し、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿は認められなかった。

純粋なジアセレインの標準溶液の吸光度を４３０ｎｍで作動するＵＶスペクトロメータ（CINTRA 404 UV-Vis spectrometer equipped with Thermocell system）のスキャンモードにおいて、メタノール中の標準レインの校正曲線（calibration
curve）に対して測定し、同様に、純粋なレイン溶液および水（MilliQ water）に溶解した試料も測定した。その試料のスキャンプロファイルは、最終生成物にジアセレインの存在を示した。

選択的に、波長４３０ｎｍを定量的な測定用に選択し、透き通った上澄みのＵＶ吸収をメタノール中の標準レインの校正曲線に対して測定した。

拡大スケールの反応に由来するこの粉末試料で測定したジアセレインの量は、ほぼ均一であり、平均値（ｎ＝２４の測定）が０．３１％（乾燥質量／質量）であった。

同じ反応および調製条件で初期ＨＡを低減した反応では、最終生成物でのジアセレイン含有量が大きく増加する結果となった。

本発明を特徴的な実施形態を参照して示し記載したが、特許請求の範囲に記載された本発明の思想および観点から逸脱することなく、形態や細部における種々の変更がなされてもよいことは、当業者に理解されるべきである。このため、本発明の範囲は、特許請求の範囲に示されており、それゆえ、特許請求の範囲と同等の意味、範囲内でなされる全ての変更が包含されるべきものである。

Claims (39)

1. ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩およびヒアルロン酸誘導体で構成する群から選択されたヒドロキシ基含有化合物の疎水性有機化合物とのエステル調製用プロセスであって、
   （ｉ）前記ヒドロキシ基含有化合物を低下させた温度で微細化し、
   （ｉｉ）前記エステルを生成するために、適切な溶媒中で前記アントラセンカルボン酸誘導体を前記（ｉ）で得られた微細化されたヒドロキシ基含有化合物と反応させ、
   （ｉｉｉ）所望のエステルを得るために、前記（ｉｉ）で得られた反応混合物を濾過または透析する、
   ステップを含むことを特徴とするプロセス。
2. 前記疎水性有機化合物は、アントラセンカルボン酸またはその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載のプロセス。
3. 前記ヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸エステルであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のプロセス。
4. 前記ヒアルロン酸は、架橋されたヒアルロン酸であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のプロセス。
5. 前記微細化は、約−２０〜約−２５０℃の温度で行われることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のプロセス。
6. 前記微細化は、約−１００〜約−２００℃の温度で行われることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のプロセス。
7. 前記微細化は、液体窒素中で行われることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のプロセス。
8. 前記微細化するステップ（ｉ）は、前記ヒドロキシ基含有化合物の分子量を大きく変化させないことを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のプロセス。
9. 前記アントラセンカルボン酸誘導体は、レイン（４，５−ジヒドロキシ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸）、ジアセレイン（４，５−ジアセトキシ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸）およびそれらの誘導体で構成する群から選択されることを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のプロセス。
10. 前記誘導体は、前記ヒドロキシ基が保護基で保護されたレイン誘導体を含むことを特徴とする請求項９に記載のプロセス。
11. 前記ヒドロキシ基含有化合物は、ヒアルロン酸またはその塩であることを特徴とする請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載のプロセス。
12. 前記ヒアルロン酸またはその塩は、約１００，０００〜約２，５００，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有することを特徴とする請求項１１に記載のプロセス。
13. ステップ（ｉｉ）は、約３０分間〜約７２時間で行われることを特徴とする請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載のプロセス。
14. ステップ（ｉｉ）は、約１０〜約８０℃で行われることを特徴とする請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載のプロセス。
15. ステップ（ｉｉ）における溶媒は、非プロトン性溶媒であることを特徴とする請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載のプロセス。
16. 前記非プロトン性溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）であることを特徴とする請求項１５に記載のプロセス。
17. 前記疎水性化合物は、ステップ（ｉｉ）の前に活性化されることを特徴とする請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載のプロセス。
18. 前記活性化は、活性化化合物との反応によることを特徴とする請求項１７に記載のプロセス。
19. 前記活性化化合物は、１，１’−カルボニルジイミダゾ−ル（ＣＤＩ）であることを特徴とする請求項１８に記載のプロセス。
20. 前記活性化は、適切な溶媒中でなされることを特徴とする請求項１８または請求項１９に記載のプロセス。
21. 前記溶媒は、非プロトン性溶媒であることを特徴とする請求項２０に記載のプロセス。
22. 前記非プロトン性溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）であることを特徴とする請求項２１に記載のプロセス。
23. 前記アントラセンカルボン酸誘導体の活性化は、周囲の温度で、約３０分間〜約４時間行われることを特徴とする請求項１８〜請求項２２のいずれか１項に記載のプロセス。
24. ステップ（ｉｉ）は、触媒存在下でなされることを特徴とする請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載のプロセス。
25. 前記触媒は、金属性または非金属性の触媒で構成する群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載のプロセス。
26. 前記金属性触媒は、金属炭酸塩、金属ホウ酸塩、有機金属カルボン酸塩、有機金属スルホン酸塩、金属アルカン複合体、金属アシレートおよび金属酸化物で構成する群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載のプロセス。
27. 前記金属性触媒は、炭酸マグネシウム、炭酸亜鉛、ホウ酸亜鉛、酢酸錫（ＩＩ）、オクタン酸錫（ＩＩ）、乳酸錫（ＩＩ）、酢酸亜鉛、酢酸アルミニウム、トリフルオロメタンスルホン酸錫（ＩＩ）、トリフルオロメタンスルホン酸亜鉛、トリフルオロメタンスルホン酸マグネシウム、メタンスルホン酸錫（ＩＩ）、ｐ−トルエンスルホン酸錫（ＩＩ）、ジラウリン酸ジブチル錫（ＤＢＴＬ）、アンチモン酸化物（Ｓｂ_２Ｏ_３）、チタン酸ブチル（Ｔｉ（ＩＶ）ｂｕｔ）、およびチタン酸イソプロピル（Ｔｉ（ＩＶ）ｉｓｏ）で構成する群から選択されることを特徴とする請求項２６に記載のプロセス。
28. 前記非金属性触媒は、酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１−プロパンスルホン酸、１−ブタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−キシレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１−スルホン酸、ナフタレン２−スルホン酸、塩酸、硫酸、リン酸、トリエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、ルチジン、イミダゾール類、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１、５−ジアザビシクロ（４．３．０）ノナ−５−エン（ＤＢＮ）で構成する群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載のプロセス。
29. 前記ヒドロキシ基含有化合物は、ステップ（ｉｉ）の前に活性化されることを特徴とする請求項１〜請求項１６のいずれか１項に記載のプロセス。
30. 前記活性化は、前記ヒドロキシ基含有化合物のヒドロキシ基に良脱離基を結合させることによりなされることを特徴とする請求項２９に記載のプロセス。
31. 前記プロセスは、前記ステップ（ｉｉｉ）で得られたエステルを適切な溶媒で洗浄するステップを更に含むことを特徴とする請求項１〜請求項３０のいずれか１項に記載のプロセス。
32. 前記プロセスは、前記ステップ（ｉｉｉ）で得られたエステルを低下させた圧力で乾燥させるステップを更に含むことを特徴とする請求項１〜請求項３１のいずれか１項に記載のプロセス。
33. 未反応の活性化されたアントラセンカルボン酸誘導体は、前記濾液または透析外液から回収されることを特徴とする請求項１〜請求項３２のいずれか１項に記載のプロセス。
34. 前記ヒドロキシ基含有化合物におけるヒドロキシ基のエステル化率は、０．１〜１０％の範囲であることを特徴とする請求項１〜請求項３３のいずれか１項に記載のプロセス。
35. 前記プロセスは、ヒアルロン酸またはその塩若しくは誘導体のエステルであって、未反応のヒアルロン酸またはその塩若しくは誘導体と比べて向上した安定性を有するエステルを生成するために用いられることを特徴とする請求項１〜請求項３４のいずれか１項に記載のプロセス。
36. 請求項１〜請求項３４のいずれか１項に記載のプロセスに従い得ることができるエステルであって、アントラセンカルボン酸またはその誘導体の、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩およびヒアルロン酸誘導体で構成する群から選択されたヒドロキシ基含有化合物とのエステル。
37. 請求項３５に記載のエステルおよび薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物。
38. 軟骨の損傷および／または炎症の治療および／または予防用である請求項３５に記載のエステル。
39. 請求項３６に記載のエステルの治療的に有効な量を、治療を要する患者に投与することにより、軟骨の損傷および／または炎症を治療および／または予防する方法。

Images