ES2293538T3 - Esteres de acido hialuronico con reina, procedimiento para su preparacion y composiciones que comprenden los mismos. - Google Patents
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Abstract
Compuesto a base de ácido hialurónico, en el que los grupos alcohol del ácido hialurónico están esterificados con reína, como tal o en forma derivada o una sal del mismo.
Description
Ésteres del ácido hialurónico con reína,
procedimiento para su preparación y composiciones que comprenden los
mismos.
La presente invención se refiere a ésteres del
ácido hialurónico (HA) con reína, más particularmente a un
compuesto a base de ácido hialurónico, en el que los grupos alcohol
del ácido hialurónico están esterificados con reína, a un
procedimiento destinado a la preparación de dicho compuesto y a una
composición farmacéutica que comprende dicho compuesto.
La reína es un alcaloide derivado de la senna
que posee propiedades antiinflamatorias y protectoras de los
tejidos.
La reína, cuyo nombre químico es ácido
4,5-dihidroxi-9,10-dihidro-9,10-dioxo-2-antracen
carboxílico, presenta la fórmula general siguiente (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es
H.
Esta sustancia se administra vía oral,
generalmente como diacetilreína, un derivado de la formula general
(I) anterior en la que cada uno de los grupos R es un grupo acetilo,
posee una mayor biodisponibilidad y se utiliza principalmente en el
tratamiento de la inflamación de las articulaciones.
Sin embargo, tanto la reína como la
diacetilreína tienen el problema de poseer una considerable acción
laxante, que puede incluso producir diarrea y por consiguiente su
utilización es desaconsejable para los pacientes mayores y
débiles.
Además, debido a la insolubilidad de la reína y
de la diacetilreína en agua, estos efectos secundarios no se pueden
evitar mediante la administración de estos principios activos por
vía parenteral o por vía intraarticular.
El ácido hialurónico es un mucopolisacárido
natural constituido por unidades de ácido
D-glucurónico y N-acetilglucosamina
alternantes, tal como se representa de manera general a
continuación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
formando una cadena lineal con un
peso molecular de hasta 13 x 10^{6}
Daltons.
El ácido hialurónico se encuentra en todos los
tejidos blandos del organismo y en muchos fluidos fisiológicos
tales como, por ejemplo, el líquido sinovial de las articulaciones y
el humor vítreo de los ojos.
El ácido hialurónico se utiliza en muchas
aplicaciones clínicas en forma de ácido o sal.
En particular, se utiliza con gran éxito en la
inflamación de las articulaciones, administrándose mediante
infiltración directa en la articulación en la que actúa mediante un
doble mecanismo: por una parte reduciendo la inflamación de las
articulaciones y por otra mediante el incremento de la viscosidad
del líquido sinovial, beneficiando de este modo al cartílago, que
en consecuencia está más lubricado.
También se aplica en oftalmología, en la que se
utiliza por sus propiedades protectoras y antiinflamatorias y en la
reparación de tejidos, en virtud de su actividad
anabólica-reconstructora sobre el cartílago y la
piel.
Sin embargo, es conocido que el ácido
hialurónico sufre degradación.
Se ha informado sobre la degradación del ácido
hialurónico, que produce la hidrólisis dependiendo de las
condiciones de pH y la concentración de cationes [Uchiyama H.,
et al., J. Biol. Chem., 265:7753-7759
(1990); Yokita Y. y Okamoto A., Polimer Degr. And Stab.
48:269-273 (1995); Hawkins C.L. y Davies M.J.
Free Rad. Biol. Med., 24:1396-1410 (1998);
Schiller J. et al., Current Med. Chem.,
10:2123-2145 (2003).
Después de exhaustivos estudios, los presentes
inventores descubrieron que el ácido hialurónico con grupos alcohol
esterificados con reína posee, sorprendentemente, una estabilidad
superior a la del ácido hialurónico y tiene además una mejor
actividad farmacológica en comparación con la que se observa con el
ácido hialurónico y la reína utilizados por separado.
Además, los presentes inventores han descubierto
que el ácido hialurónico con grupos alcohol esterificados con reína
se puede utilizar ventajosamente mediante administración local,
evitando así los problemas asociados a la administración oral de
reína.
La presente invención se ha basado en estos
resultados.
Según un primer aspecto, la presente invención
se refiere a un compuesto a base de ácido hialurónico, en el que
los grupos alcohol del ácido hialurónico están esterificados con
reína, como tales o en forma de derivado, o como una sal del mismo,
que no solamente tiene una estabilidad superior a la del ácido
hialurónico sino también una actividad farmacológica mejorada en
comparación a lo observada con respecto al ácido hialurónico y
reína utilizados por separado, y que además se puede utilizar
mediante administración local, evitando de este modo los
inconvenientes asociados con la administración oral de reína.
Según un segundo aspecto, la presente invención
se refiere a un procedimiento destinado a la preparación del
compuesto o una sal del mismo según el primer aspecto, que comprende
hacer reaccionar el cloruro ácido de reína, como tal o en forma de
un derivado, con ácido hialurónico.
Según un tercer aspecto, la presente invención
se refiere a una composición farmacéutica que comprende el
compuesto o la sal del mismo según el primer aspecto en combinación
con un excipiente adecuado y/o diluyente.
Según otro aspecto, la presente invención se
refiere a un medicamento o a un dispositivo médico de uso humano o
animal, que comprende una composición según el tercer aspecto y a la
utilización de un compuesto o una sal del mismo según el primer
aspecto con el fin de preparar un medicamento destinado al
tratamiento de las enfermedades inflamatorias, o la reparación
tisular, o la preparación de biomateriales.
En la siguiente descripción detallada se pondrán
de manifiesto otras ventajas de la presente invención.
La Figura 1 muestra el espectro
^{1}H-RMN de la reína obtenido mediante
saponificación del compuesto HA-Re de la presente
invención,
la Figura 2 muestra el espectro IR de reína
obtenido mediante la saponificación del compuesto
HA-Re de la presente invención,
la Figura 3 muestra el análisis
HPLC-MS de reína obtenido mediante la saponificación
del compuesto de HA-Re de la presente
invención,
la Figura 4 describe los resultados obtenidos en
experimentos de RT-PCR que comparan el efecto del
ácido hialurónico a la concentración farmacológica con los efectos
del compuesto de HA-Re de la presente invención a la
misma concentración,
la Figura 5 describe los resultados de
experimentos de RT-PCR en los que el efecto reína a
una dosis farmacológica se compara al efecto de una dosis similar
del compuesto HA-Re de la presente invención,
la Figura 6 describe el espectro
^{13}C-RMN de un compuesto de
HA-Re según la presente invención, y
la Figura 7 muestra el espectro
^{1}H-RMN de un compuesto de HA-Re
según la presente invención.
La presente invención se describirá a
continuación con mayor detalle.
La presente invención proporciona un compuesto a
base de ácido hialurónico, en el que los grupos alcohol del ácido
hialurónico se encuentran esterificados con reína, como tal o en
forma de derivado o con una sal de la
misma.
misma.
En la presente descripción, el compuesto de la
presente invención se designará también como el "compuesto
HA-Re".
Se debe apreciar que en las presentes
descripción y reivindicaciones, el término "reína" se refiere a
reína como tal o en forma de derivado.
Las sales del compuesto HA-Re
según la presente invención comprenden preferentemente las sales
farmacéuticamente aceptables, por ejemplo una sal de sodio, una sal
de potasio, una sal de magnesio, una sal de calcio u otras sales
convencionales farmacéuticamente aceptables, más preferentemente la
sal de sodio.
Según la presente invención, el termino "forma
derivada" de reína comprende cualquier derivado de reína que es
farmacológicamente activo in vivo y en el que el grupo ácido
de reína está disponible para formar un enlace éster con los grupos
hidroxilo del ácido hialurónico.
Resultan preferidos a los derivados de reína en
los que dicha antraquinona esta disponible in vivo.
Los ejemplos de reína en forma derivada según la
presente invención comprenden reína tal como se representa en la
fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la que R es independientemente cualquier
grupo adecuado protector del hidroxi, preferentemente un grupo
acilo, por ejemplo un grupo acetilo, propionilo, butilo o pivaloilo,
sin quedar limitado a estos.
En una forma de realización preferida de la
presente invención reína se encuentra en forma de derivado, y más
preferentemente como diacetilreína.
Según la presente invención, reína esterifica
preferentemente por lo menos el 5% de los grupos de alcohol
esterificables del ácido hialurónico, más preferentemente entre el 5
y el 50% y todavía más preferentemente entre el 5 y el 20%.
Resulta particularmente preferido un compuesto
en el que reína esterifica el 10% de los grupos de alcohol
esterificables del ácido hialurónico.
Dicho compuesto de HA-Re se
puede preparar mediante un procedimiento según la presente
invención, que comprende hacer reaccionar cloruro ácido de reína
con ácido hialurónico, preferentemente en una cantidad tal que la
proporción de entre los milimoles de cloruro de reína y los
miliequivalentes de unidades de alcohol esterificado del ácido
hialurónico sea superior al 5%, más preferentemente entre el 5% y el
50%, todavía más preferentemente entre el 5% y el 20%, y según una
forma de realización particularmente preferida el 10%.
El procedimiento seleccionado tuvo en
consideración la elección de disolventes dependiendo de la
aceptabilidad de sus residuos (ICH-International
Conference of Harmonization of Technical Requirements for
Registration of
Pharmaceuticals for Human Use).
Pharmaceuticals for Human Use).
Preferentemente, los procedimientos
anteriormente mencionados según la presente invención comprenden las
siguientes etapas:
- a)
- preparar una suspensión de ácido hialurónico y un disolvente no polar aprótico;
- b)
- añadir cloruro ácido de reína disuelto en la cantidad mínima de un disolvente no polar aprótico y un aceptor de iones de hidrógeno;
- c)
- agitar la mezcla a reflujo durante un tiempo suficiente para que ocurra la reacción de esterificación y
- d)
- evaporar el disolvente.
Los ejemplos de disolventes no polares apróticos
que se pueden utilizar en la etapa a) comprenden ciclohexano,
tetrahidrofurano, toluenos, diclorometano, n-hexano,
más preferentemente ciclohexano.
El disolvente aprótico no polar que se puede
utilizar para disolver el cloruro ácido de reína no está limitado,
pero se debe seleccionar preferentemente para que sea el mismo que
el utilizado en la etapa a).
Los ejemplos de aceptor de iones de hidrógeno
que se puede añadir en la etapa b) comprenden piridina,
trietilamina, más preferentemente Et_{3}N;
El tiempo durante el que se deja la reacción a
reflujo no está limitado, pero preferentemente debería ser de por
lo menos 20 horas.
El ácido hialurónico que se puede utilizar con
el fin de preparar el compuesto HA-Re según la
presente invención preferentemente tiene un peso molecular
comprendido entre 500.000 y 3.000.000 Da, más preferentemente de
aproximadamente 600.000 Da.
El peso molecular del ácido hialurónico se puede
determinar mediante procedimientos convencionales, por ejemplo
mediante cromatografía de permeabilización de gel (GPC).
El ácido hialurónico que se utiliza en la
preparación del compuesto HA-Re según la presente
invención puede encontrarse comercialmente disponible (por ejemplo
de Fidia Farmaceutici SpA- Abano T.PD) o se puede preparar, por
ejemplo, mediante la extracción de crestas de gallo, mediante la
fermentación de bacterias con una capa de mucina o mediante otros
procedimientos convencionales (Proteoglycan Protocols, Humana Press,
R.V. Iozzo Ed. Totowa, 2001).
El cloruro ácido de reína que se puede utilizar
en el procedimiento de preparación del compuesto
HA-Re según la presente invención se puede obtener
mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:
- a')
- preparar una suspensión de reína en un disolvente no polar aprótico;
- b')
- añadir una cantidad de SOCl_{2} suficiente para obtener una proporción molar entre SOCl_{2} y reína superior a 10;
- c')
- agitar la reacción a reflujo en una atmósfera inerte durante el tiempo suficiente para que se forme el cloruro ácido de reína; y
- d')
- eliminar el disolvente y el exceso de SOCl_{2} no reaccionado mediante destilación.
Los ejemplos de disolventes no polares apróticos
que se pueden utilizar en la etapa a') comprenden ciclohexano,
tetrahidofurano, toluenos, diclormetano, n-hexano,
preferentemente un disolvente de cloruro y más preferentemente
CH_{2}Cl_{2}.
El tiempo durante el que la reacción se deja a
reflujo en la etapa c') no está limitado, preferentemente debe ser
de por lo menos 3 horas.
La reína, como tal o en forma de derivado, que
se puede utilizar en la etapa a') con el fin de preparar el cloruro
ácido de reína puede ser de origen comercial (por ejemplo Aldrich) o
se puede sintetizar según procedimientos convencionales [Nawa H
et al., J. Org. Chem. 26:979-981
(1961) y referencias publicadas en la presente memoria; Smith C.W.
et al., Tetrahedron Lett. 34:7447-7450
(1993); Gallagher P.T. et al., Tetrahedron Lett.
35:289-292 (1994)].
Según una aplicación particularmente preferida,
se purifica el compuesto de HA-Re de la presente
invención obtenido utilizando el procedimiento según la presente
invención.
La purificación preferentemente se realiza
utilizando una membrana de diálisis.
\newpage
En este caso, tal como se describirá en los
ejemplos siguientes, se da preferencia a la utilización de una
membrana de diálisis comercialmente disponible bajo la marca
comercial "Slide-A-Lyzer 3.5K"
(Pierce, Rockford, IL USA), según las instrucciones del
fabricante.
Tal como se ha expuesto anteriormente, el
compuesto HA-Re de la presente invención tiene una
ventajosa elevada estabilidad, siendo estable por lo menos durante
36 mese a una temperatura de 4ºC\pm3,5ºC en disolución acuosa,
preferentemente tamponada a pH 7,4 mediante, por ejemplo, una
disolución salina de tampón fosfato preparada según la Farmacopea
Oficial Italiana XI edición.
El compuesto HA-Re según la
presente invención tiene propiedades antiinflamatorias,
cicatrizantes, reconstructivas y anabólicas para la piel y el
cartílago.
La presente invención, por consiguiente, también
se refiere a una composición farmacéutica que comprende un
compuesto HA-Re según la presente invención en
combinación con un excipiente adecuado y/o diluyentes.
En particular, la composición farmacéutica según
la presente invención puede ser un mecanismo médico y/o un
medicamento para utilización humana o veterinaria.
La composición farmacéutica según la presente
invención tiene preferentemente una formulación adecuada para la
administración loco-regional.
Una composición farmacéutica particularmente
preferida según la presente invención es una composición adecuada
para su utilización vía infiltración intraarticular, vía
administración oftálmica, por ejemplo, gotas para los ojos y
ungüentos oftálmicos y vía administración tópica.
Preferentemente, la composición de la presente
invención se encuentra en forma de dispersión acuosa.
Dicha dispersión preferentemente se encuentra en
una disolución tamponante de pH fisiológico, más preferentemente a
un pH de 7,4, para una disolución salina tamponada con fosfato
preparada según la Farmacopea Oficial Italiana, edición XI.
Según otra forma de realización particularmente
preferida, en la composición farmacéutica de la presente invención,
el compuesto HA-Re o la sal del mismo según la
presente invención se encuentra presente a una concentración
comprendida entre 0,5% y 2% peso/vol., preferentemente a una
concentración del 1% peso/vol.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en utilizar el compuesto HA-Re o la sal del mismo
según la presente invención con el fin de preparar un medicamento
destinado al tratamiento de las enfermedades inflamatorias, que
preferentemente comprenden las enfermedades inflamatorias de las
articulaciones, en particular la osteoartritis y la artritis
reumatoide.
Otro objetivo adicional de la presente invención
también es la utilización del compuesto HA-Re o una
sal del mismo según la presente invención con el fin de preparar un
medicamento para la reparación tisular, en la que dicho tejido es
el cartílago o la piel.
Además, el compuesto HA-Re o la
sal del mismo según la presente invención se pueden utilizar con el
fin de preparar biomateriales, por ejemplo, gasas destinadas al
tratamiento de heridas o quemaduras y matrices para el crecimiento
de células que se utilizarán en el tratamiento de quemaduras y
transplantes.
La presente invención se ilustrará mediante los
Ejemplos experimentales siguientes así como también mediante las
Figuras.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Reína (proporcionada por Aldrich) (21,5 mg;
0,075 mmol) se cargó en un frasco de fondo redondo de 50 ml y a
esto se añadió CH_{2}Cl_{2} (15 ml). La suspensión adquirió un
color naranja. A continuación, se añadió a la suspensión SOCl_{2}
(0,5 ml; 6,9 mmol).
La reacción se realizó con agitación a reflujo
(50ºC) en una atmósfera inerte (N_{2}). La mezcla de reacción se
dejó a reflujo durante 3 horas y se volvió transparente de color
amarillo naranja claro. Con el fin de eliminar el CH_{2}Cl_{2}
y el exceso de SOCl_{2} no reaccionado, se añadió tolueno
(aproximadamente 5 ml) y se destiló la mezcla a
500 mmHg, correspondiente a 6,6 x 10^{4} Pa., por lo menos 4
veces con el fin de obtener 23 mg de cloruro ácido de reína crudo
(rendimiento: cuantitativo). El producto se identificó mediante
TLC, acetato de etilo.
Ejemplo
2
Se suspendió ácido hialurónico (proporcionado
por Fidia Farmaceutici SpA-Abano T. PD; peso
molecular medio aproximado 600.000 Da) (277,3 mg; 4,6 x 10^{-4}
mmol; correspondiente a 0,75 meq. de unidades de alcohol primario
esterificable) en ciclohexano (20 ml). Se añadió cloruro ácido de
reína preparado tal como se describió en el Ejemplo 1 (21,5 mg,
0,075 mmol) disuelto en una cantidad mínima de CH_{2}Cl_{2}. A
continuación, se añadieron Et_{3}N (3 ml). La suspensión adquirió
un color rojo. La reacción se realizó con agitación a reflujo
(70ºC) en una atmósfera inerte (N_{2}). Después de un período de
tiempo corto, la suspensión adquirió un color
rojo-naranja, que se oscureció después de
aproximadamente tres horas. Después de 20 horas, la reacción se
paró y se evaporó el disolvente a presión reducida (650 mm Hg,
correspondiente a 8,7 x 10^{4} Pa) a sequedad, produciendo el
compuesto HA-Re en forma de un precipitado amarillo
claro.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se añadió disolución salina tamponada con
fosfato (5 ml) pH 7,4 al compuesto HA-Re (0,1019 g)
obtenido tal como se describió en el Ejemplo 2. Se obtuvo un
sistema de dos fases y la disolución adquirió un color amarillo
naranja a la vez que el residuo constituyó una masa de color
amarillo marrón de consistencia gelatinosa. Después de esperar por
lo menos 24 horas, se obtuvo un sistema coloidal viscoso de color
marrón.
Se dejó hidratar una membrana de diálisis
"Slide-A-Lyser® 3,5K" (Pierce,
Rockford, IL USA) de modo adecuado en una disolución salina
tamponada con fosfato a pH 7,4. Siguiendo las instrucciones del
fabricante, se introdujo la cantidad adecuada del compuesto
HA-Re que se debía purificar. La diálisis se realizó
durante 2 horas contra un tampón de fosfato a pH 7,4 (después de
solamente 20 minutos la disolución de tampón pareció adquirir un
color ligeramente amarillo). La operación se repitió por lo menos
tres veces hasta que la disolución de tampón permaneció incolora,
demostrando ausencia de absorción en el espectro visible mediante
ensayos de absorción. El compuesto HA-Re purificado
se recuperó de la membrana de diálisis. La pureza del compuesto
HA-Re purificado obtenido de este modo fue del
99,8%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La concentración de reína en el compuesto
HA-Re purificado obtenido según el Ejemplo 3 se
valoró mediante la lectura en el espectrofotómetro a 430 nm con
base en una calibración "robusta" en el intervalo comprendido
entre 10^{-5} y 10^{-3} (R^{2} = 0,9999). Se seleccionó esta
longitud de onda debido a que el ácido hialurónico absorbe en el
UV, lo que dificulta la determinación cuantitativa de reína. Sobre
la base de la lectura espectrofotométrica, se encontró que el
rendimiento de la reacción de esterificación, basado en reína, fue
del 58%.
Considerando el Ejemplo 2, la cantidad de reína
utilizada en la reacción se seleccionó con el fin de esterificar un
máximo del 10% de los grupos de alcohol primario esterificables del
ácido hialurónico. Debido a que el rendimiento de la reacción de
esterificación basado en reína se encontró que fue del 58%, se puede
calcular que se esterificó el 5,8% de los grupos alcohol
esterificables del ácido hialurónico.
El espectro ^{1}H-RMN del
compuesto HA-Re obtenido en el Ejemplo 2 se realizó
en una disolución tampón deuterada utilizando un espectrómetro
Varian VRX300. Sin embargo, surgieron problemas cuando se interpretó
este espectro ya que el porcentaje de reína que reacciona con el
ácido hialurónico no permitió identificar el anillo aromático.
Teniendo en consideración la pobre solubilidad de la reína en un
ambiente acuoso y considerando que la esterificación es una
reacción reversible, se realizó la saponificación, es decir
hidrólisis básica, con el fin de obtener reína a partir del
compuesto HA-Re. El compuesto de saponificación
obtenido se precipitó. Se realizó un espectro
1H-RMN del compuesto de saponificación obtenido en
dimetilsulfóxido (DMSO) utilizando el espectrómetro Varian VRX300.
El espectro obtenido, mostrado en la Fig. 1, coincide completamente
con el de
reína.
reína.
Se realizó un espectro I.R. en Nujol del
compuesto obtenido de la saponificación del compuesto
HA-Re de la presente invención (utilizando BX
FT-IR System, Perkin Elmer). Tal como se muestra en
la Figura 2, el espectro obtenido coincide con el de reína
pura.
Se realizó un análisis HPLC-MS
(utilizando el equipo Agilent 1100, serie LC/MSD) sobre el compuesto
obtenido de la saponificación del compuesto HA-Re
obtenido de la presente invención, utilizando como fase móvil una
mezcla de metanol/agua 80:20 con 2,5% ácido fórmico, a una velocidad
de flujo de 0,8 ml/min. Tal como se puede observar en la Fig. 3, la
masa del compuesto corresponde a la de reína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
El compuesto HA-Re de la
presente invención obtenido en el Ejemplo 2 no purificado mediante
diálisis se almacenó durante más de seis meses en estado seco en
viales, en la oscuridad y a temperatura ambiente (22ºC). A
continuación, la muestra se purificó mediante diálisis tal como se
describe en el Ejemplo 3 y se valoró la concentración de reína
utilizando un espectrofotómetro UV-VIS. Se encontró
que la concentración fue igual a la obtenida del producto
sintetizado inmediatamente. (Mejor: "Se encontró que la
concentración fue igual a la obtenida inmediatamente después de la
síntesis del producto") Los resultados experimentales, por
consiguiente, demuestran que en seco, no se observa degradación.
Además, el compuesto HA-Re de la presente invención
producido tal como se describe en el Ejemplo 2 y purificado
mediante diálisis tal como se describe en el Ejemplo 3 se almacenó
durante 6 meses en una disolución del 2% de tampón fosfato pH 7, 4,
en viales, en la oscuridad y a una temperatura de 4ºC. En la
muestra se encontraron cuerpos extraños, debido a la utilización de
materiales no estériles y al hecho de que no se utilizaron
preservantes. La muestra se sometió de nuevo a diálisis utilizando
el mismo procedimiento que se describe en el Ejemplo 3, durante por
lo menos cuatro días. Mediante un ensayo UV-VIS, no
se pudo encontrar nada de reína liberada en las múltiples
disoluciones tampón utilizadas en la diálisis. Por consiguiente,
también en este caso se demostró que el compuesto es químicamente
estable ya que no se encontró reína liberada del compuesto
HA-Re, por lo menos en los términos que permiten su
demostración utilizando los procedimientos analíticos actuales. Por
consiguiente, incluso en disolución, no se observó degradación
por
hidrólisis.
hidrólisis.
Los resultados obtenidos hacen posible afirmar
que el compuesto HA-Re según la presente invención
es estable en disolución acuosa durante por lo menos 24 meses en
condiciones de refrigeración (a 4ºC \pm 0,5ºC). Esta afirmación
proviene de la ausencia de detección de degradación por
hidrólisis.
Además, con el fin de descartar la posibilidad
de que se produzca degradación hidrolítica durante la reacción de
esterificación con reína, se realizó un ensayo en blanco de dicha
reacción. En particular, se utilizaron las mismas condiciones que
en la reacción de enlace de reína al ácido hialurónico, pero en
ausencia de reína. En particular, se añadió ácido hialurónico (100
mg) a una mezcla de ciclohexano (10 ml), diclorometano (1 ml) y
trietilamina (1 ml) y se realizó la reacción a reflujo (70ºC) en una
atmósfera inerte (N_{2}) durante 24 horas; una vez transcurrido
dicho tiempo, se eliminaron los disolventes de la reacción bajo una
atmósfera de nitrógeno. El compuesto obtenido fue mucho menos
soluble en agua que el ácido hialurónico en estado nativo y se
caracterizó por una viscosidad no determinable después de 24 horas
de dispersión. Esto quiere decir que la despolimerización se puede
eliminar, ya que ello habría resultado en su solubilidad en agua y
por consiguiente a una reducción de la
viscosidad.
viscosidad.
Finalmente, se hizo una comprobación de la
estabilidad a la hidrólisis durante la esterilización del compuesto
HA-Re de la presente invención obtenido en el
Ejemplo 3. Tal como se expuso anteriormente, se descubrió que la
utilización de materiales no estériles y el hecho de que no se
utilizaron preservantes conducen a la presencia de cuerpos extraños
en las muestras del compuesto de la presente invención. En
particular, se preparó una disolución del 1% de compuesto
HA-Re de la invención, purificado mediante una
membrana de diálisis, en una disolución salina tamponada con
fosfato a pH 7,4. Dada la evidencia experimental que demuestra que
el ácido hialurónico es una molécula sensible al calor
[Biomaterials 23:4503-4513 (2002)], la
muestra así obtenida se esterilizó mediante la utilización de vapor
saturado a presión en un autoclave durante 20 minutos a 121ºC. A
continuación, la muestra se sometió otra vez a diálisis con una
membrana de diálisis con el fin de evaluar la presencia de reína en
el líquido de diálisis; no se encontraron trazas de reína. Estos
resultados permiten concluir que la muestra es estable a la
hidrólisis durante la esterilización en caliente.
\newpage
La inyectabilidad del compuesto
HA-Re de la presente invención se analizó en
comparación a la de un ácido hialurónico de alto y bajo peso
molecular.
En particular, se prepararon las siguientes tres
muestras:
- a)
- una disolución al 1% peso/vol. de ácido hialurónico de elevado peso molecular (peso molecular medio de aproximadamente 1.200.000) en disolución salina tamponada con fosfato pH 7,4;
- b)
- una disolución del 1% peso/vol. de ácido hialurónico de bajo peso molecular (peso molecular medio aproximado de 600.000) en disolución salina tamponada con fosfato pH 7,4;
- c)
- una disolución del 1% peso/vol. del compuesto HA-Re de la presente invención en disolución salina tamponada con fosfato pH 7,4.
La viscosidad de las muestras se midió
utilizando un VISCOMATE MODELO VM-10A (vial de
vidrio: 3 ml; en ausencia de agitación; temperatura 20ºC\pm0,2ºC)
obteniéndose los siguientes valores:
- a)
- \eta = 78,4 mPa\cdots
- b)
- \eta = 64,8 mPa\cdots
- c)
- \eta = 47,9 mPa\cdots
Los resultados obtenidos demuestran que el
compuesto HA-Re de la presente invención tiene una
mejor inyectabilidad que el ácido hialurónico en estado nativo
tanto de elevado como de bajo peso molecular. Ello es debido a que
una disolución del 1% peso/vol. del compuesto HA-Re
de la presente invención tiene una menor viscosidad que una
disolución del 1% peso/vol. de ácido hialurónico de bajo peso
molecular, que a su vez tiene menor viscosidad que una disolución
al 1% peso/vol. de ácido hialurónico de elevado peso molecular.
La reducción de viscosidad que se observó, una
vez demostrado que no se producían reacciones de despolimerización
del ácido hialurónico después de la reacción de esterificación, se
puede atribuir a la interacción covalente entre la reína y ácido
hialurónico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se obtuvieron biopsias de cartílago normal de 5
individuos (3 machos y 2 hembras, edad media: 59,3\pm5,1 años)
durante cirugías de cadera o fémur resultantes de fracturas
traumáticas. Los sujetos seleccionados para el estudio no
presentaron síntomas bioquímicos o clínicos de inflamación o
enfermedad en las articulaciones y presentaron cartílago normal
tanto a nivel macroscópico como microscópico.
El cartílago se recogió en condiciones estériles
y se trató inmediatamente con el fin de aislar los condriocitos.
Las muestras primero se limpiaron de toda adherencia de tejido
muscular, conectivo o hueso subcondrial, a continuación se
fragmentaron en pedazos de un tamaño comprendido entre 1 y 3
mm^{3} y se enjuagaron con disolución salina tamponada con
fosfato pH 7,2 (PBS). A continuación se liberaron los condriocitos
sueltos mediante repetidas digestiones enzimáticas de entre 60 y 70
minutos a 37ºC con 0,25% tripsina, 400 U/ml colagenasa I, 1000 U/ml
colagenasa II y 1 mg/ml hialuronidasa. Las células se reunieron, se
lavaron extensamente en PBS y se sembraron a una densidad elevada
en placas de 35 mm (45 x 10^{3} células/cm^{2}). El medio de
cultivo fue un medio de Ham F12 modificación por Coom suplementado
10% FCS (Mascia Brunelli, Milano, Italia). La persistencia de
fenotipo de condriocito se estimó mediante la detección de colágeno
tipo II después de digerir con pepsina el sobrenadante del cultivo.
La viabilidad celular se valoró mediante el ensayo de exclusión de
Trypan-Blue. La duplicación celular se determinó a
intervalos regulares mediante tripsinización del cultivo y la
cuantificación del número de células. Los experimentos de
estimulación se realizaron cuando los cultivos primarios alcanzaron
la confluencia (pase 0). A continuación, las células se cultivaron
durante 2 días en presencia de ácido ascórbico (50 \mug/ml) y se
incubaron a partir de entonces durante 20 horas en ausencia o
presencia de (rh)IL-1\beta (5 ng/ml), con
o sin la adición de múltiples concentraciones de ácido hialurónico
(HA), el compuesto de la presente invención (HA-Re)
o reína. Se ha informado sobre los efectos beneficiosos que tanto el
ácido hialurónico como la reína presentan con respecto a la
osteoartritis debido a su capacidad para inhibir la actividad de
las metaloproteinasas (MMP) implicadas en el catabolismo del
cartílago.
cartílago.
Con el fin de estudiar el efecto de múltiples
compuestos sobre la expresión de MMP en condriocitos humanos se
realizaron ensayos de Real Time PCR. Se extrajo ARN total de
condriocitos humanos cultivados utilizando Trizol (Gibco BRL) según
las instrucciones del fabricante. Las cadenas de ADNc se
sintetizaron utilizando un equipo de síntesis Superscript
First-Strand (Gibco BRL) con 1 \mug de ARN total.
Los cebadores fueron como sigue:
MMP-1 (colagenasa) Sentido: 5'-
CTGAAGGTGATGAAGCAGCC-3'
Antisentido:
5'-AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3' (tamaño
de fragmento 428 bp);
MMP-3 (Stromelisina) Sentido:
5'-CCTCTGATGGCCCAGAATTGA-3',
Antisentido:
5'-GAAATTGGCCACTCCCTGGGT-3' (tamaño
de fragmento 440 bp);
Gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH),
Sentido:
5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3';
Antisentido:
5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCA-3' (tamaño
de fragmento 598 bp)
La amplificación se realizó a entre 60 y 64ºC
mediante 45 ciclos en un iCycler Thermal Cycler
(Bio-Rad Hercules, CA) y los datos se analizaron
utilizando el iCycler iQ Optical System Software. La expresión
relativa en cada muestra se calculó mediante un procedimiento
matemático a base de la eficacia de la PCR de
real-time utilizando como referencia GAPDH ARNm.
Todas las muestras se ensayaron por triplicado. Después de 45 ciclos
de amplificación, se calcularon automáticamente los valores de los
umbrales de los ciclos y se calcularon los fentogramos de ADNc a
partir de curvas estándar comprendiendo un intervalo de cuatro
órdenes de magnitud. Las curvas estándar tanto de MMP como de GAPDH
comprendieron entre 1 y 1.000 fentogramos por 25 \mul de reacción.
Se calcularon las proporciones de cantidades iniciales de MMP a
GAPDH. Las diferencias estadísticas de los resultados entre las
múltiples variables experimentales y los controles relevantes se
analizaron utilizando el ensayo t de Student.
Las Figuras 4 y 5 reportan los resultados
obtenidos en los experimentos de RT-PCR.
Se ensayaron todas las muestras por triplicado.
En cada experimento, el cambio en la expresión de ARNm de MMP se
expresó como el número de veces de incremento en comparación con
células no tratadas. Se muestra la media y la desviación estándar
de tres experimentos. Se utilizó el ensayo t pareado de
Student con el fin de determinar la significancia de los efectos de
los múltiples tratamientos. También se reportan las diferencias
estadísticas entre los grupos de tratamiento y control:
* = p<0,01;
** = p<0,001 (ensayo t de
Student).
El tratamiento con IL-1 produjo
un incremento dramático de tanto MMP1 como de MMP3 que concuerda con
los datos en la literatura. En los experimentos descritos en la
Figura 4 se comparó el efecto de HA a la concentración
farmacológica generalmente descrita en la literatura (1 mg/ml) con
el efecto compuesto HA-Re de la presente invención
a la misma concentración (1 mg/ml). Se obtuvieron resultados
similares a las concentraciones de HA comprendidas entre 0,1 y 1,5.
La exposición de condriocitos humanos a dosis farmacológicas de HA
(1 mg/ml) evitó efectivamente la inducción de MMP1 y MMP2 por
IL-1 (Figuras 4A y B). Sorprendentemente, dosis
similares del compuesto HA-Re de la presente
invención produjeron un efecto protector todavía más dramático
bajando la expresión de MMP a nivel basal a pesar de la exposición
a IL-1. La Figura 5 describe los resultados de
experimentos en los que el efecto de reína a dosis farmacológica (10
\muM) se compara a una dosis similar de HA-Re.
También parece que el compuesto HA-Re de la presente
invención es más potente que la Re sola en lograr la regulación
negativa de la expresión de MMP inducida por
IL-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se realizó una síntesis adicional de
HA-Re según la presente invención tal como en el
Ejemplo 2, con la excepción de que se utilizaron 20 mg de ácido
hialurónico y 23 mg de cloruro ácido de reína, correspondiendo a
concentraciones estoiquiométrica de reína y ácido hialurónico
basadas en los grupos de alcohol primario del ácido hialurónico.
La Figura 6 muestra el espectro
^{13}C-RMN del compuesto HA-Re de
la presente invención así obtenido, en el que aparece claramente el
pico característico a 175 ppm, específico de la función éster.
La Figura 7 muestra el espectro
^{1}H-RMN del compuesto HA-Re de
la presente invención así obtenido, en el que aparecen claramente
los picos característicos entre 7 y 8 ppm, específicos de los
anillos aromáticos de reína.
Por consiguiente, resulta evidente a partir de
estos dos espectros RMN que en el compuesto HA-Re
según la presente invención, reína esterifica los grupos alcohol
del ácido hialurónico.
Claims (36)
1. Compuesto a base de ácido hialurónico, en el
que los grupos alcohol del ácido hialurónico están esterificados
con reína, como tal o en forma derivada o una sal del mismo.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que la reína esterifica por lo menos el 5% de los grupos alcohol
esterificables del ácido hialurónico.
3. Compuesto según la reivindicación 2, en el
que la reína esterifica del 5% al 50% de los grupos alcohol
esterificables del ácido hialurónico.
4. Compuesto según la reivindicación 3, en el
que la reína esterifica del 5% al 20% de los grupos alcohol
esterificables del ácido hialurónico.
5. Compuesto según la reivindicación 4, en el
que reína esterifica el 10% de los grupos alcohol esterificables
del ácido hialurónico.
6. Sal sódica del compuesto según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5.
7. Procedimiento para la preparación de un
compuesto o una sal del mismo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende hacer reaccionar cloruro
ácido de reína, como tal o en forma derivada, con ácido
hialurónico.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el cloruro ácido de reína y el ácido hialurónico se
encuentran en una cantidad tal que una proporción en porcentaje
entre los milimoles de cloruro ácido de reína y los
miliequivalentes de las unidades de alcohol esterificable del ácido
hialurónico es de por lo menos el 5%.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dicha proporción en porcentaje está en el intervalo
comprendido entre 5% y 50%.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que dicha proporción en porcentaje está en el intervalo
comprendido entre 5% y 20%.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicha proporción en porcentaje es del 10%.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 11, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- preparar una suspensión de ácido hialurónico en un disolvente aprótico no polar;
- b)
- añadir cloruro ácido de reína disuelto en un disolvente aprótico no polar y un aceptor de iones de hidrógeno;
- c)
- dejar la mezcla agitar a reflujo durante un tiempo suficiente para que tenga lugar la reacción de esterificación; y
- d)
- evaporar el disolvente.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que dicho disolvente aprótico polar de la etapa a) es el
ciclohexano.
14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó
13, en el que en la etapa b), dicho aceptor de iones de hidrógeno
es NEt_{3}.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en el que en la etapa c), la reacción se
deja a reflujo durante por lo menos 20 horas.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 15, en el que el cloruro ácido de reína se
obtiene mediante un procedimiento que comprende las etapas
siguientes:
- a')
- preparar una suspensión de reína en un disolvente no polar aprótico;
- b')
- añadir una cantidad de SOCl_{2} con el fin de obtener una proporción molar entre SOCl_{2} y reína superior a 10;
- c')
- dejar la reacción agitar a reflujo en una atmósfera inerte durante un tiempo suficiente para que se forme el cloruro ácido de reína; y
- d')
- eliminar el disolvente y el exceso de SOCl_{2} no reaccionado mediante destilación.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que dicho disolvente no polar aprótico de la etapa a') es un
disolvente de cloruro.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que dicho disolvente de cloruro es CH_{2}Cl_{2}.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, en el que en la etapa c'), la reacción se
deja a reflujo durante por lo menos 3 horas.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 19, que comprende además una etapa final de
purificación.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicha etapa de purificación se realiza utilizando una
membrana de diálisis.
22. Composición farmacéutica que comprende el
compuesto o una sal del mismo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en combinación con excipientes y/o
diluyentes adecuados.
23. Composición farmacéutica según la
reivindicación 22, que presenta una formulación adecuada para la
administración loco-regional.
24. Composición farmacéutica según la
reivindicación 23, que es adecuada para la administración vía
infiltración intraarticular.
25. Composición farmacéutica según la
reivindicación 23, que es adecuada para la administración
oftálmica.
26. Composición farmacéutica según la
reivindicación 23, que es adecuada para la administración
tópica.
27. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 22 a 26, en forma de dispersión acuosa.
28. Composición farmacéutica según la
reivindicación 27, en la que dicha dispersión está en una disolución
tampón que presenta un pH de 7,4.
29. Composición farmacéutica según la
reivindicación 27 ó 28, en la que el compuesto se encuentra a una
concentración comprendida entre el 0,1% y el 2% peso/volumen.
30. Composición farmacéutica según la
reivindicación 29, en la que el compuesto se encuentra en una
concentración del 1% peso/volumen.
31. Medicamento destinado a la utilización
veterinaria o en humanos, que está constituido por una composición
farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30.
32. Dispositivo médico para su utilización
veterinaria o en humanos, constituido por una composición
farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30.
33. Utilización de un compuesto o una sal del
mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las
enfermedades inflamatorias.
34. Utilización según la reivindicación 33, en
la que dichas enfermedades inflamatorias son enfermedades
inflamatorias de las articulaciones.
35. Utilización de un compuesto o una sal del
mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la
preparación de un medicamento destinado a la reparación tisular, en
la que dicho tejido es cartílago o piel.
36. Utilización de un compuesto o una sal del
mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la
preparación de biomateriales.
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