CN109833292A

CN109833292A - 一种双醋瑞因滴眼液及其用途

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Publication number: CN109833292A
Application number: CN201910134682.8A
Authority: CN
Inventors: 张红敏; 岳娟; 陈家旭; 刘素素; 简守珺; 谢艳亭; 张俊杰; 周天洋; 董军璐; 吕奇学
Original assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Henan Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2019-02-23
Filing date: 2019-02-23
Publication date: 2019-06-04

Abstract

本发明提供了一种双醋瑞因滴眼液及其用途。双醋瑞因是一种蒽醌类化合物，在我国是一种治疗骨关节炎的上市药物，是胶囊剂型。局部应用抗菌药物治疗角膜感染有许多优点，包括避免全身不良反应，增加感染靶部位的药物浓度，降低耐药性。目前为止，无双醋瑞因以及双醋瑞因滴眼液治疗细菌性角膜炎的文献报道。本发明专利采用生理盐水为溶剂，采用特定的方式对双醋瑞因进行溶解制成滴眼液，并将此药用于细菌性角膜炎的治疗。

Description

一种双醋瑞因滴眼液及其用途

技术领域

本发明涉及到一种治疗细菌性角膜炎的滴眼液，具体来说是一种双醋瑞因滴眼液及其用途。

背景技术

细菌性角膜炎是一种侵袭性的感染性角膜疾病，发病快，进展迅速，如不及时有效地治疗，可导致角膜穿孔甚至失明。即使感染完全根除，往往也会影响视力。目前，细菌性角膜炎仍然是世界范围内引起微生物角膜炎的最常见原因，且其发病率有所增加。

细菌性角膜炎目前用抗生素治疗。然而，由于抗生素的耐药性，细菌性角膜炎的治疗变得越来越困难。当一种新的耐药机制出现时，开发有效的新抗生素及抗微生物药物显得尤为重要。

文献表明，许多抗炎药物无论是在体外还是在体内，除具有很强的抗炎作用外，还具有中强度的抗菌作用或提高某些抗生素的活性。因此，针对原有抗炎药物的抗菌新用途研究可能为治疗与炎症有关的难以治疗的细菌感染方面提供新的方向。

双醋瑞因是一种在世界许多国家都能获得的药物。它是一种蒽醌类化合物，在我国是一种治疗骨关节炎的上市药物，是胶囊剂型。文献显示，双醋瑞因与苯唑西林和四环素联合应用对金黄色葡萄球菌均有协同或相加作用。目前为止，尚无双醋瑞因以及双醋瑞因滴眼液治疗细菌性角膜炎的文献报道。

发明内容

本发明提供了一种双醋瑞因滴眼液及其用途，它采用特定的方式对双醋瑞因进行溶解，将难溶于水的双醋瑞因制成双醋瑞因滴眼液，并将其应用于治疗细菌性角膜炎。

一种双醋瑞因滴眼液，它的制备步骤如下：

1)将透明质酸钠、羟苯乙酯加入到生理盐水中，然后放置于微波炉内进行反复加热，并搅拌直至完全溶解。

2)将双醋瑞因加入到步骤1)制得的溶液中，然后加吐温-80，继续搅拌至看不到黄色颗粒。

3)在步骤2)所得的溶液中加入生理盐水进行定容，然后超声5min即可。

一种双醋瑞因滴眼液，它在治疗细菌性角膜炎中的应用。

一种双醋瑞因滴眼液，它的浓度为2％。

一种双醋瑞因滴眼液，它的具体制备步骤如下：称取透明质酸钠：0.030g，羟苯乙酯：0.009g，加生理盐水约12ml，放置微波炉反复加热，搅拌直至完全溶解，称取双醋瑞因：0.300g，加入溶解的溶液中，然后加吐温-80 0.15ml，搅拌至看不到黄色颗粒，继续加生理盐水定容至15ml。超声5min，即得2％双醋瑞因滴眼液，混匀后分装。

本发明的双醋瑞因滴眼液，将难溶于水的双醋瑞因采用特定的方式进行溶解，制成液体，并将其应用于治疗敏感菌引起的细菌性角膜炎，特别适合于有角膜及眼表炎症基础疾病的细菌性角膜炎。

附图说明

图1为2％双醋瑞因滴眼液成品照片。

图2为BALB/c小鼠金黄色葡萄球菌角膜炎分别给予生理盐水(NS)、左氧氟沙星(LF)和双醋瑞因(DA)滴眼液间隔2h、1h和0.5h(DA 2h、DA 1h、 DA 0.5h)治疗12h的临床评分结果。

图3为BALB/c小鼠金黄色葡萄球菌角膜炎分别给予生理盐水(NS)、左氧氟沙星(LF)和双醋瑞因(DA)滴眼液间隔2h、1h和0.5h(DA 2h、DA 1h、 DA 0.5h)治疗12h，每个角膜的载菌量的定量结果(以每角膜CFU(Log10) 表示)。

图4为BALB/c小鼠金黄色葡萄球菌角膜炎分别给予生理盐水(NS)、左氧氟沙星(LF)和双醋瑞因(DA)滴眼液间隔2h、1h和0.5h(DA 2h、DA 1h、 DA 0.5h)治疗12h的角膜组织病理学图像。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

一、2％双醋瑞因滴眼液的制备

称取透明质酸钠：0.030g，羟苯乙酯：0.009g，加生理盐水约12ml，放置微波炉反复加热，搅拌直至完全溶解，称取双醋瑞因：0.300g，加入溶解的溶液中，然后加吐温-800.15ml，搅拌至看不到黄色颗粒，继续加生理盐水定容至15ml。超声5min，即得2％双醋瑞因滴眼液，混匀后分装。

二、双醋瑞因滴眼液的性状、稳定性及刺激性评价

(一)性状

本滴眼液是黄色的混悬液体，如图1。测得滴眼液的PH值为6.44，符合人眼对滴眼液酸碱度的要求。

(二)稳定性测试

双醋瑞因滴眼液样品分别置于(4±1)℃及常温条件下保存，观察样品放置 1月、3月、5月的外观，观察有无颜色变化。

实验结果发现，本方法制得的双醋瑞因滴眼液在(4±1)℃条件下存放五个月，外观不发生变化。

(三)刺激性评价

采用Draize试验评价双醋瑞因滴眼液刺激性是否符合行业标准。

(1)选用健康日本大耳白兔(角膜无浑浊，结膜情况良好，瞳孔圆形，两侧等大，对光反射良好；裂隙灯检查显示角膜透明，无云翳、斑翳，虹膜纹理清晰，无充血水肿)4只，每只动物右眼结膜囊内均滴双醋瑞因滴眼液，左眼结膜囊内滴生理盐水为对照，连续给药10d，每天早上7:00双醋瑞因滴眼液和生理盐水冲击滴眼，即1次/2min，共点3次，后改为2h一次，点到晚上6:30，最后一次也是冲击给药。每次给药量50ul，给药时压迫鼻泪管，并使眼被动闭合5-10s。给药前和结束给药后1h、2h、4h、24h、48h、72h进行裂隙灯拍照，并记录眼的局部刺激反应情况，按照表1眼刺激反应评分表进行评分，具体为各时间点受试动物的积分总和/受试动物数。

(2)Draize评分标准

0-3分：无刺激；4-7分：轻度刺激；8-12分：中度刺激；13-16分：重度刺激。具体评分标准见表1。

(3)刺激性实验结果

双醋瑞因滴眼液组与生理盐水对照组各时间点的Draize评分结果见表2。双醋瑞因滴眼液组与生理盐水对照组各时间点的Draize评分均小于3分，表明双醋瑞因滴眼液对兔眼无刺激性。各组在给药期间主要表现与给药前基本相同。

表1眼刺激反应评分标准

表2双醋瑞因滴眼液组与生理盐水组刺激性Draize评分平均值(n＝4)

三、双醋瑞因体外抑制多种革兰氏阳性菌的实验研究

(1)菌株来源

实验菌株来自于2017年3月至2018年2月期间在河南省立眼科医院(河南眼科研究所，郑州，中国)细菌性角膜炎患者中分离出的60株革兰氏阳性球菌。对每个分离株中分离出的代表性菌落进行革兰氏染色，并利用市售试剂盒的体外细菌诊断试剂板进行菌株鉴定(珠海迪尔生物科技有限公司，珠海，中国)。金黄色葡萄球菌标准株(ATCC29213，由郑州颐和医院检验科赠予)作为倍比稀释药敏试验的质量控制菌株。

(2)双醋瑞因对革兰氏阳性球菌体外最小抑菌浓度(minimal inhibitconcentration，MIC)测定方法

采用肉汤倍比稀释法测定了双醋瑞因对60株革兰阳性球菌的MIC。将 2560mg药物溶于200μL DMSO和80Mueller-Hinton培养基中，即得双醋瑞因工作液。在96孔板上，每孔加入100μL(1×10⁶cfu/ml)细菌稀释液，再加入100μL 双醋瑞因工作液，使其浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1和0.5μg/ml。 96孔板在37℃孵育24h，以无细菌生长的最低药物浓度作为该药的MIC。每个实验至少重复三次。

(3)双醋瑞因对革兰氏阳性球菌的体外抗菌活性

表3.双醋瑞因对54株常见革兰氏阳性球菌临床株的MIC范围、几何均数(GM)、众数、MIC50和MIC90结果

双醋瑞因对60株眼表感染革兰氏阳性球菌临床株的MIC见表3。结果表明，双醋瑞因对葡萄球菌(表皮葡萄球菌、中间葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)、肠球菌的最低抑菌浓度(MIC)均低于或等于32μg/ml。双醋瑞因对6株临床少见的革兰氏阳性球菌临床株的MIC结果见表4。这些数据对了解双醋瑞因的抗菌特性有一定的参考价值。结果表明，双醋瑞因对葡萄球菌较敏感(MIC范围为 2～32μg/ml)。

表4.双醋瑞因对6株临床少见的革兰氏阳性球菌的MIC值

四、2％双醋瑞因滴眼液对小鼠金黄色葡萄球菌角膜炎的治疗作用

(一)材料和方法

(1)2％双醋瑞因滴眼液

(2)实验动物

健康无眼疾的8-10周龄的BALB/c小鼠。

(3)小鼠金黄色葡萄球菌角膜炎模型建立

所有小鼠腹腔内注射80mg/kg戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich，美国)全身麻醉，用1％盐酸丁卡因滴眼液滴眼进行角膜表面麻醉。在解剖显微镜下，将1.5μL 0.3M NaOH浸泡的直径为2mm的圆形滤纸片(Sigma-Aldrich，美国)均匀地贴于小鼠角膜中央1min，然后立即用50mL无菌生理盐水迅速冲洗眼睛。30min 后，在受损角膜上接种5μL金黄色葡萄球菌(ATCC29213)标准株培养液(15×10⁸ CFU/ml)。

(4)分组以及实验药物使用方法

细菌接种18小时，模型成功者根据临床评分随机将小鼠分为五组：生理盐水(NS)组(阴性对照组)、左氧氟沙星滴眼剂组(LF，三腾药业(中国)有限公司，苏州，中国)(阳性对照组)和三个双醋瑞因滴眼剂组(DA)，即DA 2h 组、DA 1h组和DA 0.5h组。分组后，分别给予5μL生理盐水、左氧氟沙星滴眼剂和双醋瑞因滴眼液进行冲击滴眼(连续3次，每次间隔2min)，生理盐水、左氧氟沙星再以2h的间隔滴眼，双醋瑞因组分别以2h(DA 2h)、1h(DA1h)、和0.5h(DA 2h)的间隔进行滴眼，用药时间长度共12h。

(5)裂隙灯观察与角膜临床评分

细菌接种18h和30h，在裂隙灯(SLM-8E，重庆康华瑞丽科技有限公司，重庆，中国)下观察角膜，进行角膜病变临床评分并拍照。临床评分判定标准如下:病灶面积、角膜浑浊度、前房积脓和其他变量。(1)病灶面积：1分(占角膜总面积1-25％)；2分(占角膜总面积26-50％)；3分(占角膜总面积51-75％)； 4分(占角膜总面积76-100％)。(2)角膜浑浊度：1分(角膜轻度雾状浑浊，瞳孔虹膜清晰可见)；2分(角膜浅层浑浊，透过病灶可见瞳孔及虹膜)；3分(角膜全层呈不均匀浑浊)；4分(均匀致密浑浊)。(3)前房积脓：1分(少量积脓，未及角膜旁中央)；2分(大量积脓，达角膜旁中央)。

(6)感染角膜活细菌定量

治疗12h收集感染的角膜(包含对照组和治疗组)，测定其活菌数量。单个角膜加50ul生理盐水，匀浆，20倍连续稀释接种于MHA培养板上，置于37℃孵育48h，统计细菌克隆形成单位(colony forming unit，CFU)数量。结果用每个角膜CFU(log₁₀)表示。

(7)苏木精-伊红(HE)和革兰氏染色

小鼠安乐死后，分别取NS组、LF组、DA各组角膜，固定在FAS固定液 (武汉赛维尔生物科技有限公司，武汉，中国)中，然后再用一系列浓度的乙醇脱水。样本用石蜡包埋，取4μm的薄片，常规方法固定。角膜切片进行HE和革兰氏染色，并用光学显微镜观察(NikonECLIPSE 80i，Japan)。

(8)统计学方法

所有数据以均值±标准差描述。各组间两两比较采用单因素方差分析 (ANOVA)，方差齐，采用LSD检验；方差不齐，采用Tamhane’s T2检验。计数资料用卡方检验进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

(二)实验结果分析

(1)角膜临床评分

各组BALB/c小鼠金黄色葡萄球菌角膜炎模型给予不同因素干预12h后，角膜临床评分结果见图2。治疗12h后，LF组、DA 1h组和DA 0.5h组临床评分(4.94±0.25，4.94±0.25，5.19±0.40)与生理盐水组(5.69±0.48)相比显著降低(P<0.01)。

(2)角膜载菌量定量结果

各组BALB/c小鼠金黄色葡萄球菌角膜炎模型给予不同因素干预12h后，各组角膜CFU(Log₁₀)结果见图3。与NS组相比，DA 2h组、DA 1h组、DA 0.5h组和LF组能显著减少角膜金黄色葡萄球菌CFU数量(P<0.01)，结果表明双醋瑞因在体内有抗菌活性，且DA 1h组和DA0.5h组的其抗菌活性强于DA 2 h组。

(3)病理结果分析

NS组、LF组、DA 1h组的组织学特征如图4所示。NS组(图4A)整个角膜可见大量中性粒细胞浸润，角膜浅基质层出现严重水肿及大量革兰氏阳性球菌。 LF组(图4B)角膜浅基质层轻度水肿，可见少量中性粒细胞浸润及少量革兰氏阳性球菌。DA 1h组(图4C)显示角膜前、中基质层有较多中性粒细胞浸润，且基质中度水肿及中等量细菌存在，箭头表示内皮细胞。三角形表示革兰氏阳性球菌(深紫色)。这些结果与裂隙灯照片和角膜临床评分一致。

通过上述对双醋瑞因滴眼液的性状、稳定性、刺激性等各方面性质的检测以及体内、体外药效试验的验证，证明双醋瑞因滴眼液是一种对眼部没有刺激性，并且对敏感细菌的细菌性角膜炎具有较好的治疗效果。鉴于双醋瑞因已被公认的抗炎作用，双醋瑞因滴眼液尤其适合于具有角膜慢性炎症的革兰氏阳性球菌的细菌性角膜炎的治疗，是一种治疗细菌性角膜炎的备选药物。

Claims

1.一种双醋瑞因滴眼液，其特征在于：它的制备步骤如下：

1)将透明质酸钠、羟苯乙酯加入到生理盐水中，然后放置于微波炉内进行反复加热，并搅拌直至完全溶解；

2)将双醋瑞因加入到步骤1)制得的溶液中，然后加吐温-80，继续搅拌至看不到黄色颗粒；

2.一种如权利要求1所述的双醋瑞因滴眼液，其特征在于：它在治疗细菌性角膜炎中的应用。

3.根据权利要求2所述的一种双醋瑞因滴眼液，其特征在于：它的浓度为2％。

4.根据权利要求3所述的一种双醋瑞因滴眼液，其特征在于：它的具体制备步骤如下：称取透明质酸钠：0.030g，羟苯乙酯：0.009g，加生理盐水约12ml，放置微波炉反复加热，搅拌直至完全溶解，称取双醋瑞因：0.300g，加入溶解的溶液中，然后加吐温-80 0.15ml，搅拌至看不到黄色颗粒，继续加生理盐水定容至15ml。超声5min，即得2％双醋瑞因滴眼液，混匀后分装。