CN1914228A - 透明质酸与大黄酸的酯,它们的制备方法及含有它们的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及透明质酸与大黄酸的酯，更具体而言，涉及基于透明质酸的化合物，其中透明质酸的醇基团被大黄酸酯化，还涉及用于制备所述酯的方法及含有所述酯的药物组合物。

Description

透明质酸与大黄酸的酯，它们的制备 方法及含有它们的组合物

发明背景

本发明涉及透明质酸(HA)与大黄酸的酯，更具体而言涉及一种基于透明质酸的化合物，其中透明质酸的醇基团被大黄酸酯化，还涉及用于制备所述化合物的方法及含有所述化合物的药物组合物。

现有技术

大黄酸是来源于番泻叶的生物碱，其具有抗炎和组织-保护性质。

大黄酸，其化学名称为4，5-二羟基-9，10-二氢-9，10-二氧代-2-蒽羧酸，具有下列通式(I)

其中R是H。

该物质经由口服途径给药，通常为二乙酰大黄酸，上述通式(I)的衍生物，其中各R基团为乙酰基，其具有较高的生物可利用度且主要用于治疗关节炎症。

然而，大黄酸和二乙酰大黄酸呈现出具有显著泻下作用的缺点，其甚至可导致腹泻且由此使其不适用于年老或衰弱的患者。

此外，由于大黄酸和二乙酰大黄酸不溶于水，该副作用不能通过经由非肠道或关节内途径给予这些活性成分而避免。

透明质酸是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺的交替单位形成的天然粘多糖，如下面以一般方式所提供的

葡糖醛酸                N-乙酰基-葡糖胺

形成具有高达13×10⁶道尔顿分子量的直链。

透明质酸存在于肌体的所有软组织中和许多生理液体中，例如关节滑膜液和眼睛的玻璃体液中。

透明质酸以其酸或盐形式用于许多临床应用中。

具体而言，它已经非常成功用于关节炎症，其中它是通过直接渗透到关节中给药并通过双重机理发挥作用的：一方面通过减轻关节炎症，另一方面通过增加滑膜液粘度，由此有益于软骨，其因此更加润滑。

它还可用于眼科学中，其中利用其保护和抗-炎性质并用于组织修复，这是由于其对软骨和皮肤的组成代谢再造作用。

然而，已知透明质酸易降解。

已经报道过透明质酸的降解是由水解引起的，这取决于pH条件和阳离子浓度[参见，例如，Uchiyama H.等人，J.Biol.Chem.1990；265：7753-7759；Tokita Y.和Okamoto A.，Polymer Degr.和Stab.1995；48：269-273；Hawkins C.L.和Davies M.J.Free Rad.Biol.Med.1998；24：1396-1410；Schiller J.等人，Current Med.Chem.2003；10：2123-2145]。

广泛研究之后，本发明人发现具有被大黄酸酯化的醇基团的透明质酸具有令人吃惊的、较之透明质酸更高的稳定性且与在单独使用透明质酸和大黄酸中观察到的相比，药理学活性进一步提高。

此外，本发明人发现具有被大黄酸酯化的醇基团的透明质酸可通过局部给药而被有利地使用，由此避免与大黄酸口服给药有关的缺点。

本发明已经基于这些结果而实现。

发明概述

第一方面，本发明涉及基于透明质酸的化合物本身或其衍生形式或盐，其中透明质酸的醇基团被大黄酸酯化，其不仅具有较之透明质酸更高的稳定性，还具有与单独使用透明质酸和大黄酸观察到的相比更高的药理学活性，此外其可通过局部给药使用，由此避免与大黄酸口服给药有关的缺点。

第二方面，本发明涉及一种用于制备第一方面的化合物或其盐的方法，其包括使大黄酸本身或衍生形式的酰基氯与透明质酸反应。

第三方面，本发明涉及包含第一方面的化合物或其盐以及适宜赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。

另一方面，本发明涉及由第三方面的组合物形成的、用于人或兽医使用的药用产品或药用装置，以及第一方面的化合物或其盐制备用于治疗炎性疾病、或组织修复、或制备生物材料的用途。

本发明的其它优点呈现在下列详细描述中。

附图简述

图1表示通过本发明HA-Re化合物的皂化获得的大黄酸的¹H-NMR谱，

图2表示通过本发明HA-Re化合物的皂化获得的大黄酸的I.R.谱，

图3表示通过本发明HA-Re化合物的皂化获得的大黄酸的HPLC-MS分析，

图4报道了在RT-PCR实验中获得的结果，该实验将药理学浓度的透明质酸的效力与相同浓度的本发明HA-Re化合物的效力进行比较。

图5报道RT-PCR实验的结果，其中将药理学剂量的大黄酸的效力与相同剂量的本发明HA-Re化合物的效力进行比较。

图6表示本发明HA-Re化合物的¹³C-NMR谱。

图7表示本发明HA-Re化合物的¹H-NMR谱。

发明详述

下面将以更详细的方式描述本发明。

本发明提供一种基于透明质酸的化合物本身或衍生形式或其盐，其中透明质酸的醇基团被大黄酸酯化。

在本文中，本发明的化合物还表示为“HA-Re化合物”。

应注意在本文和权利要求中，术语“大黄酸”是指大黄酸本身或衍生形式。

本发明HA-Re化合物的盐，优选包括药学可接受的盐，例如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、或其它常规药学可接受的盐，更优选钠盐。

根据本发明，术语大黄酸的“衍生形式”包括大黄酸的任意衍生物，其在体内是药理学活性的且其中大黄酸的酸基团可与透明质酸的羟基形成酯键。

优选可使所述蒽醌体内可用的大黄酸衍生物。

本发明衍生形式的大黄酸的例子包括下式给出的大黄酸

其中R独立地是任意适宜的羟基-保护基团，优选酰基，例如乙酰基、丙酰基、丁酰基或新戊酰基，对此没有限制。

在本发明优选实施方案中，大黄酸为衍生形式，且更优选二乙酰大黄酸。

根据本发明，大黄酸优选使至少5％，更优选5％-50％，且甚至更优选5-20％的透明质酸可酯化醇基团酯化。

特别优选其中大黄酸使10％的透明质酸可酯化醇基团酯化的化合物。

所述HA-Re化合物可通过本发明方法制备，其包括使大黄酸的酰基氯与透明质酸反应，优选用量为大黄酸酰基氯的mmol与透明质酸可酯化醇基团的meq.之间的百分比大于5％，更优选5％-50％，甚至更优选5％-20％，且特别优选的实施方案为10％。

所选择的方法应根据它们残渣的可接受性考虑溶剂的选择(ICH-International Conference of Harmonisation of TechnicalRequirements for Registration of Pharmaceuticals for HumanUse)。

优选，本发明上述方法包括下列步骤：

a)在质子惰性的非-极性溶剂中制备透明质酸的混悬液；

b)加入溶于最少量质子惰性的非-极性溶剂中的大黄酸酰基氯和氢离子受体；

c)使该混合物回流搅拌一段时间，这段时间足以使酯化反应发生；和

d)蒸发溶剂。

可用于步骤a)中的质子惰性的非-极性溶剂的例子包括环己烷、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、正-己烷，更优选环己烷。

对可用于溶解大黄酸酰基氯的质子惰性的非-极性溶剂没有限制，但应当优选与步骤a)中所用相同的。

可加入到步骤b)中的氢离子受体的例子包括吡啶、三乙胺，更优选Et₃N；

对反应回流的时间没有限制，但应优选至少20个小时。

可用于制备本发明HA-Re化合物的透明质酸优选具有500,000-3,000,000Da，更优选约600,000Da的分子量。

透明质酸的分子量可根据常规方法，例如，凝胶渗透色谱法(GPC)测定。

用于制备本发明HA-Re化合物的透明质酸可商业得到(例如，Fidia Farmaceutici SpA-Abano T.PD)或可通过从鸡冠提取，通过具有粘蛋白层细菌的发酵或通过其它常规方式制备[参考Proteoglycan Protocols，Humana Press，R.V.lozzo Ed.Totowa，2001]。

可用于制备本发明HA-Re化合物的方法中的大黄酸酰基氯可通过包括下列步骤的方法获得：

a′)制备大黄酸溶于质子惰性的非-极性溶剂中的混悬液；

b′)加入获得SOCl₂与大黄酸之间的摩尔比大于10的用量的SOCl₂；

c′)在惰性气体中，该反应回流搅拌一段时间，该时间足以形成大黄酸酰基氯；和

d′)蒸馏除去溶剂和过量未反应的SOCl₂。

可用于步骤a’)中的质子惰性的非-极性溶剂的例子包括环己烷、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、正-己烷，优选氯化物溶剂且更优选CH₂Cl₂。

对步骤c’)中反应回流的时间没有限制，应优选至少3个小时。

可用于步骤a’)中制备大黄酸酰基氯的大黄酸本身或衍生形式可商业得到(例如，Aldrich)或可根据常规方法合成[参考，Nawa H等人，J.Org.Chem.1961；26：979-981和其中报道的参考文献；Smith C.W.等人，Tetrahedron Lett.1993；34：7447-7450；Gallagher P.T.等人，Tetrahedron Lett.1994；35：289-292]。

根据一种特别优选的应用，纯化使用本发明方法获得的本发明HA-Re化合物。

这种纯化优选使用透析膜进行。

在这种情况下，如下面实施例所述，优选按照制造商的说明，使用可商业得到的、商品名为“Slide-A-Lyzer 3.5K”的透析膜(Pierce，Rockford，IL USA)。

正如上面已经讨论的，本发明的HA-Re化合物具有有利的高稳定性，在4℃±0.5℃的水溶液，优选pH 7.4的缓冲液，如根据OfficialItalian Pharmacopoeia，XI版制备的磷酸盐缓冲的盐溶液中稳定至少36个小时。

本发明的HA-Re化合物对皮肤和软骨具有抗炎、愈合、再造及组成代谢的性质。

因此，本发明涉及包含本发明HA-Re化合物以及适宜赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。

具体而言，本发明的药物组合物可以是用于人和兽医使用的药用装置和/或药用产品。

本发明的药物组合物优选具有适于loco-部位给药的制剂。

本发明特别优选的药物组合物是适于经由关节内渗透、经由眼睛给药，例如滴眼剂和眼用软膏剂，以及经由局部给药的组合物。

优选，本发明的组合物为含水分散液的形式。

所述分散液优选具有生理pH，更优选pH7.4的缓冲溶液，例如根据Official Italian Pharmacopoeia，XI版制备的磷酸盐-缓冲的盐溶液。

根据一个特别优选的应用，在本发明的药物组合物中，本发明的HA-Re化合物或其盐以0.5％-2％w/v，优选1％w/v的浓度存在。

本发明另一方面是本发明的HA-Re化合物或其盐制备用于治疗炎性疾病，优选包括关节炎性疾病，特别是骨关节炎和类风湿性关节炎的药剂的用途。

本发明另一目的还在于本发明的HA-Re化合物或其盐制备用于组织修复的药剂的用途，其中所述组织为软骨或皮肤。

此外，本发明的HA-Re化合物或其盐可用于制备生物材料，例如用于治疗创伤或烧伤的纱布和用于治疗烧伤和植入的细胞生长的基质。

通过下列实验实施例以及附图可更好地举例说明本发明。

                       实施例

实施例1

大黄酸酰基氯的制备

将大黄酸(由Aldrich提供)(21.5mg；0.075mmol)放在50ml圆底烧瓶中并向其中加入CH₂Cl₂(15ml)。混悬液变为橙色。然后，将SOCl₂(0.5ml；6.9mmol)加入到该混悬液中。在惰性气体(N₂)中回流(50℃)搅拌以进行反应。使反应混合物回流3个小时，溶液变为澄明的橙黄色。为了除去CH₂Cl₂和过量未反应的SOCl₂，加入(约5ml)甲苯，在相当于6.6×10⁴Pa的500mmHg下蒸馏该混合物至少4次，获得23mg粗的大黄酸酰基氯(产率：定量)。通过TLC，乙酸乙酯鉴定该产物。

实施例2

HA-Re化合物的制备

将透明质酸(由Fidia Farmaceutici SpA-Abano T.PD提供；平均分子量为约600,000Da)(277.3mg；4.6×10^-4mmol；相当于0.75meq.可酯化伯醇单位)混悬于环己烷(20ml)中。加入溶于最少量CH₂Cl₂中的按照实施例1所述制备的大黄酸酰基氯(21.5mg；0.075mmol)。然后，加入Et₃N(3ml)。混悬液变为红色。在惰性气体(N₂)中回流(70℃)搅拌进行反应。短时间后，混悬液变为橙红色，其在大约3小时后变深。20小时后，反应终止并减压蒸发溶剂(650mmHg，相当于8.7×10⁴Pa)至干，得到澄明的黄色沉淀物形式的HA-Re化合物。

实施例3

HA-Re化合物的纯化

a)样品的制备

将pH7.4的磷酸盐-缓冲的盐溶液(5ml)加入到按照实施例2所述获得的HA-Re化合物(0.1019g)中。得到两相系统且溶液变为橙黄色，同时残渣为棕黄色凝胶样稠度的团块。等待至少24小时后，获得棕色的粘胶态系统。

b)纯化

以适宜方式，用pH7.4的磷酸盐缓冲的盐溶液将透析膜“Slide-A-Lyzer3.5K”(Pierce，Rockford，IL USA)水合。按照制造商的说明，引入适宜量纯化的HA-Re化合物。相对于pH7.4的磷酸盐缓冲液透析2小时(仅仅20分钟后，缓冲液呈现些微黄色)。该操作重复至少3次，直到缓冲液无色，测试可见光谱是否存在吸收。通过透析从膜中回收纯化的HA-Re化合物。由此获得的HA-Re化合物的纯度为99.8％。

实施例4

所得本发明HA-Re化合物的分析

1)使用UV-VIS分光光度计试验

按照实施例3所述获得的纯化HA-Re化合物中大黄酸的浓度是基于10^-5-10^-3范围中的“稳健”校准，采集430nm处的分光光度读数而评价的(R²＝0.9999)。选择该波长是因为透明质酸在UV范围吸收，其因此导致很难定量测定大黄酸。基于分光光度读数，基于大黄酸的酯化反应产率为58％。

考虑到实施例2，对反应中所用大黄酸的量进行选择，使最多10％的透明质酸可酯化伯醇基团酯化。因为基于大黄酸的酯化反应产率为58％，估计有5，8％的透明质酸可酯化醇基团被酯化。

2)¹H-NMR分析

实施例2获得的HA-Re化合物的¹H-NMR谱是使用Varian VRX300分光计，在氘代缓冲液中进行的。然而，当解译该光谱时遇到了问题，因为与透明质酸反应的大黄酸的百分比不能使其鉴定芳香环。考虑到大黄酸在含水环境中的溶解度较差且考虑到酯化是可逆的反应，因此进行皂化，即基础水解，从而自HA-Re化合物获得大黄酸。所得皂化化合物沉淀。由此获得的皂化化合物的¹H-NMR谱是使用Varian VRX300分光计在二甲基亚砜(DMSO)中进行的。所得光谱，其在图1中表示，与大黄酸的完全一致。

3)I.R.分析

I.R.谱是相对于本发明HA-Re化合物的皂化获得化合物，在Nujol中进行的(使用Spectrum BX FT-IR System，Perkin Elmer)。如图2所示，所得光谱与纯的大黄酸一致。

4)HPLC-MS

对本发明HA-Re化合物的皂化获得的化合物进行HPLC-MS分析(使用设备Agilent 1100，LC/MSD系列)，其中使用含2.5％甲酸的甲醇/水80∶20混合物作为流动相，流速为0.8ml/分钟。如图3所示，该化合物的质量相当于大黄酸的质量。

实施例5

本发明HA-Re化合物的技术特征的评价

1)水解稳定性的评价

按照实施例2获得且没有通过透析纯化的本发明HA-Re化合物在干燥状态的小瓶中、在黑暗和室温(22℃)条件下可储存超过6个月。然后按照实施例3所述通过透析纯化该样品并使用UV-VIS分光计评价大黄酸的浓度。发现浓度与相对于立即合成的产物所获得的相等。因此，实验结果表明，在干燥状态下，没有观察到降解发生。此外，按照实施例2所述生产并按照实施例3所述通过透析纯化的本发明HA-Re化合物在pH7.4的磷酸盐缓冲液的2％溶液中、在小瓶中、在黑暗和4℃的温度下，储存超过6个月。在样品中发现异物的存在，这是由于使用了未-灭菌的材料和没有使用防腐剂的事实。使用与实施例3所述相同的方法，使样品再次经过透析，它经过透析至少4天。通过UV-VIS试验，不能发现任何大黄酸释放到各种用于透析的缓冲液中。因此，在这种情况下，化合物显示出是化学稳定的，因为没有发现自HA-Re化合物中释放大黄酸，至少可使用现有的分析技术加以证实。因此，即使在溶液中，也没有观察到水解降解。

所得结果表明本发明的HA-Re化合物在冷藏条件下(4℃±0.5℃)，在水溶液中稳定至少24小时。该陈述来源于不存在任何显而易见的水解降解。

此外，为了排除在与大黄酸酯化反应的过程中发生的透明质酸水解降解的可能性，进行了所述反应的空白试验。具体而言，使用与大黄酸和透明质酸键合的反应中相同的条件，但没有所述大黄酸存在。具体而言，将透明质酸(100mg)加入到环己烷(10ml)、二氯甲烷(1ml)和三乙胺(1ml)的混合物中，在惰性气体(N₂)中回流(70℃)进行反应24小时；一旦该时间过去，在氮气下除去反应溶剂。与天然状态的透明质酸相比，所得化合物更不溶于水且特征在于分散24小时后不可测定的粘度。这意味着可排除解聚，因为这会导致水溶性及因此浓度的降低。

最后，在灭菌后，检查按照实施例3获得的本发明纯化的HA-Re化合物的水解稳定性。正如上面所讨论的，未-灭菌材料的使用和未使用防腐剂的事实导致本发明化合物的样品中存在异物。具体而言，制备使用透析膜纯化的本发明HA-Re化合物溶于pH7.4的磷酸盐缓冲的盐溶液中的1％溶液。已知透明质酸为热敏分子的实验证据(Biomaterials 23(2002)4503-4513)，因此所得样品是在高压釜中，在121℃下，使用加压饱和蒸汽灭菌20分钟获得的。然后，样品再次于透析膜中经过透析，从而评价透析液体中是否存在大黄酸；没有发现大黄酸的痕迹。这些结果得出的结论是热灭菌后，该样品是水解稳定的。

2)流变性和注射能力的分析

将本发明HA-Re化合物的注射能力(syringeability)与具有高和低分子量的透明质酸进行比较分析。

具体而言，制备下列样品：

a)高分子量透明质酸(平均分子量约1′200′000)于pH7.4的磷酸盐-缓冲的盐溶液中的1％w/v溶液

b)低分子量透明质酸(平均分子量约600′000)于pH7.4的磷酸盐-缓冲的盐溶液中的1％w/v溶液

c)本发明HA-Re化合物于pH7.4的磷酸盐-缓冲的盐溶液中的1％w/v溶液

然后使用VISCOMATE MODEL VM-10A测量样品的粘度(玻璃小瓶：3ml；缺少搅拌条件；温度20±2℃)，得到下列值：

a)η＝78.4mPa·s

b)η＝64.8mPa·s

c)η＝47.9mPa·s

所得结果表明本发明的HA-Re化合物较之具有高和低分子量的天然状态的透明质酸具有更好的注射能力。这是因为本发明HA-Re化合物的1％w/v溶液较之低分子量透明质酸的1％w/v溶液具有更低粘度，其依次具有较之高分子量透明质酸的1％w/v溶液更低的粘度。

所观察到的粘度的降低证实酯化反应后，没有透明质酸的解聚反应，这归因于大黄酸与透明质酸之间的共价相互作用。

实施例6

本发明HA-Re化合物的体外药理学活性的评价

在由于创伤性骨折所致的髋部或股骨手术过程中，自5名个体(3名男性和2名女性，平均年龄：59.3±5.1岁)中获得正常软骨活组织。为研究选择的受治疗者并没有呈现炎性或关节疾病的生化或临床征兆，并呈现肉眼可见和显微镜可见水平的正常软骨。在无菌条件下收集软骨并立即处理用于软骨细胞分离。首先清除样品上任何粘连的肌肉、结缔或软骨下骨组织，然后切碎成1-3mm³小段，并在pH7.2的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中冲洗。然后通过在37℃下，用0.25％胰蛋白酶、400U/ml胶原酶I、1000U/ml胶原酶II和1mg/ml透明质酸酶反复酶消化60-75分钟而释放单一的软骨细胞。收集细胞，在PBS中广泛洗涤并以较高密度接种在35mm平板(45×10³个细胞/cm²)中。培养基是补充了10％FCS的Coon′s修饰Ham′s F12(Mascia Brunelli，Milano，Italy)。软骨细胞表型的维持是通过在培养物上清液的胃蛋白酶消化后，检测II型胶原而评价的。细胞活力是通过台盼蓝排除试验而评价的。细胞复制是通过培养物的受胰蛋白酶作用和细胞数量化，以规定时间间隔测定的。当初级培养物达到汇合，则进行刺激实验(传代0)。然后在有抗坏血酸(50μg/ml)存在的条件下，培养该细胞2天，之后在有或没有(rh)IL-1β(5ng/ml)存在的条件下培养20小时，其中加入或未加入各种浓度的透明质酸(HA)、本发明化合物(HA-Re)或大黄酸。

已经报道过透明质酸和大黄酸对骨关节炎具有有益作用，这是由于它们抑制涉及软骨分解代谢的金属蛋白酶(MMP)活性的能力。

为了研究各种化合物对MMP在人软骨细胞中表达的作用，我们进行了实时-PCR测定。按照制造商的说明，使用Trizol(Gibco BRL)从培养的人软骨细胞中提取总RNA。使用Superscript First-Strand合成试剂盒(Gibco BRL)及1μg总RNA合成cDNA链。引物如下：

MMP-1(胶原酶)正义：5′-CTGAAGGTGATGAAGCAGCC-3′

反义：5′-AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3(片段大小428 bp)；

MMP-3(溶基质素(stromelysin))正义：5′-CCTCTGATGGCCCAGAATTGA-3′

反义：5′-GAAATTGGCCACTCCCTGGGT-3′((片段大小440bp)；

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，正义：5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′；

反义：5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCA(片段大小598bp)。

在iCycler Thermal Cycler(Bio-Rad Hercules，CA)中，在60-64℃下，进行45次扩增，并使用iCycler iQ Optical System Software分析数据。各样品中的相对表达是基于实时PCR效率，使用GAPDH mRNA作为参考，通过数学方法计算的。所有样品一式三份进行分析。45次扩增后，自动计算阈循环值，并根据覆盖了4个数量级范围的标准曲线计算起始cDNA的飞克。MMPs和GAPDH标准曲线范围为1-1000飞克/25-μl反应。计算MMPs与GAPDH起始量的比。使用t试验分析各实验变量和相关对照之间结果的统计学差异。

图4和5报道RT-PCR实验获得的结果。

所有样品都是一式三份测定的。在各实验中，MMPs mRNA表达的改变以和未处理细胞相比增加的倍数表示。给出三个实验的平均值和标准偏差。成对的Student’s t检验用于测定各处理作用的显著性。还报道了处理和对照组之间的统计学差异：

*＝p＜0.01；**＝p＜0.001(t检验)。

IL-1处理导致MMP-1和MMP-3表达显著增加，这与文献数据相一致。在图4报道的实验中，我们将文献中通常报道的药理学浓度(1mg/ml)HA的作用与相同浓度(1mg/ml)HA-Re(本发明化合物)的作用进行了比较。在0.1-1.5HA浓度范围中获得了类似的结果。人软骨细胞与药理学剂量(1mg/ml)的HA接触能够显著防止IL-1所致的MMP1和MMP2诱导(图4A和B)。令人吃惊的是，类似剂量的本发明HA-Re化合物导致甚至更显著的保护作用，尽管接触了IL-1，但MMP表达仍恢复到基础水平。图5报道了将药理学剂量(10μM)大黄酸的作用与类似剂量HA-Re的作用进行比较的实验结果。还显示出本发明的HA-Re化合物较之单独的Re在获得下调IL-1诱导的MMP表达方面更有效。

实施例7

本发明HA-Re化合物的另外合成按照实施例2进行，区别在于使用20mg透明质酸和23mg大黄酸酰基氯，这与基于透明质酸伯醇基团的化学计量浓度的大黄酸和透明质酸相对应。

图6表示由此获得的本发明HA-Re化合物的¹³C-NMR谱，其中清楚表现出特征峰在175ppm，对酯功能特异。

图7表示由此获得的本发明HA-Re化合物的¹H-NMR谱，其中清楚表现出特征峰在7-8ppm，对大黄酸的芳香环特异。

因此，从这两个NMR谱可清楚表现出在本发明的HA-Re化合物中，大黄酸使透明质酸的醇基团酯化。

Claims (36)

1.一种基于透明质酸的化合物本身或衍生形式或其盐，其中透明质酸的醇基团被大黄酸酯化。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中大黄酸使至少5％的透明质酸可酯化醇基团酯化。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中大黄酸使5％-50％的透明质酸可酯化醇基团酯化。

4.根据权利要求3所述的化合物，其中大黄酸使5％-20％的透明质酸可酯化醇基团酯化。

5.根据权利要求4所述的化合物，其中大黄酸使10％的透明质酸可酯化醇基团酯化。

6.根据权利要求1-5任何一项所述化合物的钠盐。

7.一种制备权利要求1-6任何一项所述的化合物或其盐的方法，其中包括使大黄酸本身或其衍生形式的酰基氯与透明质酸反应。

8.根据权利要求7所述的方法，其中大黄酸的酰基氯与透明质酸的量为大黄酸酰基氯的mmol与透明质酸可酯化醇单位的meq.之间的百分比为至少5％。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述百分比为5％-50％。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述百分比为5％-20％。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述百分比为10％。

12.根据权利要求7-11任何一项所述的方法，其包括下列步骤：

a)在质子惰性的非-极性溶剂中制备透明质酸的混悬液；

b)加入溶于质子惰性的非-极性溶剂中的大黄酸酰基氯和氢离子受体；

c)使该混合物回流搅拌一段时间，这段时间足以使酯化反应发生；和

d)蒸发溶剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤a)中所述的质子惰性的非-极性溶剂为环己烷。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中在步骤b)中，所述氢离子受体为NEt₃。

15.根据权利要求12-14任何一项所述的方法，其中在步骤c)中，该反应回流至少20个小时。

16.根据权利要求7-15任何一项所述的方法，其中大黄酸的酰基氯是通过包括下列步骤的方法获得的：

a′)制备大黄酸于质子惰性的非-极性溶剂中的混悬液；

b′)加入获得SOCl₂与大黄酸之间的摩尔比大于10的用量的SOCl₂；

c′)在惰性气体中，该反应回流一段时间，该时间足以形成大黄酸酰基氯；和

d′)蒸馏除去溶剂和过量未反应的SOCl₂。

17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤a’)中所述的质子惰性的非-极性溶剂为氯化物溶剂。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述氯化物溶剂为CH₂Cl₂。

19.根据权利要求16-18任何一项所述的方法，其中在步骤c’)中，该反应回流至少3个小时。

20.根据权利要求7-19任何一项所述的方法，其进一步包括最后的纯化步骤。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述纯化步骤是使用透析膜进行的。

22.一种包含权利要求1-6任何一项所述的化合物或其盐以及适宜赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其具有适于loco-部位给药的制剂。

24.根据权利要求23所述的药物组合物，其适于经由关节内渗入给药。

25.根据权利要求23所述的药物组合物，其适于眼睛给药。

26.根据权利要求23所述的药物组合物，其适于局部给药。

27.根据权利要求22-26任何一项所述的含水分散液形式的药物组合物。

28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述分散液是具有pH7.4的缓冲溶液。

29.根据权利要求27或28所述的药物组合物，其中该化合物浓度为0.1％-2％ w/v。

30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中该化合物浓度为1％w/v。

31.一种由权利要求22-30任何一项所述的药物组合物形成的用于人或兽医使用的药用产品。

32.一种由权利要求22-30任何一项所述的药物组合物形成的用于人或兽医使用的药用装置。

33.权利要求1-6任何一项所述的化合物或其盐制备用于治疗炎性疾病的药剂的用途。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述炎性疾病是关节的炎性疾病。

35.权利要求1-6任何一项所述的化合物或其盐制备用于组织修复的药剂的用途，其中所述组织为软骨或皮肤。

36.权利要求1-6任何一项所述的化合物或其盐制备生物材料的用途。

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