CN1499929A - 含有包裹的活性成分的配方及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明披露了含有包裹的活性成分如氨基糖的配方及其用途。在一个实施方案中，提供了可以关节内注射的配方。

Description

含有包裹的活性成分的配方及其用途

发明领域

本发明一般性涉及含有包裹的活性成分如氨基糖的配方及其用途。更特别涉及可以关节内注射的含有N-乙酰葡糖胺的配方。

背景技术

骨性关节炎是常见的关节疾病，具有明显的社会反应(Lawrence等人，(1998)Arthritis Rheum.41：778；Gabriel等人，(1997)J.Rheumatol.24：719；March等人，(1997)Baillieres Clin.Rheumatol.11：817)。用于治疗OA的药物类包括，非甾类抗炎药物(NSAIDS)，可注射的关节内皮质甾类和透明质酸。这些药物主要缓解疼痛，但仍然没有证明能通过减缓或停止疾病的进程真正的缓解疾病。(Altman等人，(1998)Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl.A：22；Hochberg等人，(1995)ArthritisRheum.38：1535；Hochberg等人，(1995)Arthritis Rheum.38：1541)。

多种形式的关节炎最初用NSAIDS治疗，有时与其他止痛药一起使用。当用这些药物不能合适的控制疾病时，疾病改变(缓解诱发)的抗风湿药物，可以使用如金盐、D-青霉胺、抗疟药和细胞毒性剂。最后，可以通过全身或关节内使用糖皮质激素。但是，在大多数病人中，这些药物中没有能够显著有效的获得疾病的真正缓解。

Bohne描述了使用葡糖胺(GA)治疗OA(Bohne(1969)Med.Welt30：1668)。从那时起，GA得到普及，并且现在通常用于治疗OA病人。GA盐(硫酸盐和氯化物)被认为具有软骨保护或疾病改变特性(Altman等人，(1998)Osteoarthritis Cartilage 6 Suppl.A：22；L.ozada等人，(1997)Bull.Rheum.Dis.46：5；Mevorach等人，(1994)Isr.J.Med.Sci.30：928)，并且最初建议促进受损软骨的修复。许多研究证明用OA治疗的病人的软骨的特征是软骨基质成分的加速更新，并且是不合适的修复(Inerot等人，(1978)Biochem.J.169：143；Dieppe等人，(1995)Acta.Orthop.Scand.(Suppl.266)66：1)。已经证明GA通过多种不同的机制提供抗炎活性。例如，GA显示能通过诱导氨基葡糖胺的合成提供抗炎活性。

GA-诱导的氨基葡糖胺合成的上调代表了复杂的代谢过程，该过程通过多种机制潜在调节，例如通过GA介导的进入己糖胺通路并防止尿苷-二磷酸盐-N-乙酰-13-D-葡糖胺的负反馈控制(Kornfeld等人，(1964)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 52：371)并上调TGFα1的产生(Kolm-Litty等人，(1998)J.Clin.Invest.101：160)。最近描述了GA调节的软骨保护的新机制，涉及抑制通过抑制葡萄糖磷脂酰肌醇-连接蛋白(Sandy等人，(1999)Arch.Biochem.Biophys.367：258)牛软骨移植和大鼠软骨肉瘤细胞的凝集酶活性(Sandy等人，(1998)Biochem.J.335(Pt 1)：59)。

GA可以抑制白介素-1β(IL-1β)信号级链中的磷酸化作用，提供抗炎活性。己糖胺通路终产物的一个，UDP-N-乙酰-β-D-葡糖胺，显示参与了蛋白O-糖基化的动力过程，它利用丝氨酸或苏氨酸残基作为锚着位点(Haltiwanger等人，(1997)Biochem.Biophys.Res.Commun.231：237)。潜在地，丝氨酸残基的O-糖基化可以与相同残基的磷酸化竞争，导致细胞内信号传导级链损伤(Chou等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4417)。

已知IL-1β能诱导培养的人关节软骨细胞的一氧化氮(NO)的产生(Geng等人，(1995)J.Cell.Physiol.163：545)。IL-1β-调节的某些炎症调节因子包括NO、环氧酶-2-酶(COX-2)和白介素-6(IL-6)，与转录因子-κB(NF-κB)二聚体从胞浆向核的转位有关，在核内它们与靶基因结合，调节其转录(Chu等人，(1998)Biochem.Biophys.Res.Commun.248：871；Newton等人，(1997)FEBS Lett.418：135；Parikh等人，(1997)J：Sur.Res.69：139)。NF-κB激活的方法依赖于κBα抑制蛋白(IκBα)的N-末端调节区的κBα抑制蛋白(IκBα)的两个丝氨酸(Ser-32和Ser-36)的磷酸化。(Karin(1999)J.Biol.Chem.274：27339).

除了GA-诱导的氨基葡糖胺合成的上调，抗炎症活性也归因于GA的抗关节炎活性。GA显示抗炎活性，并保护由缓激肽、5-羟色胺和组胺诱导的大鼠爪水肿。(Setnikar等人，(1991)Arzneim-Forsch./DrugRes.41：157)。GA还保护动物对抗由角叉菜诱导的浆膜炎、和由乙酸诱导的小鼠腹膜炎。(Setnikar等人，(1991)Arzneim-Forsch./DrugRes.41：157)。GA不抑制烧伤大鼠爪中的环氧酶或蛋白水解酶，但可以抑制大鼠肝脏中超氧化物的产生和溶酶体酶的活性(Setnikar等人，(1991)Arzneim-Forsch./Drug Res.41：157)。

口服GA还表现高岭土-或佐剂-诱导的大鼠关节炎的抗炎活性(Setnikar等人，(199 I)Arzneim-Forsch./Drug Res.41：542)。然而，与口服服用乙酰水杨酸盐或消炎痛的相应活性相比，口服应用GA的抗渗出和抗炎活性较低。

许多病人涉及使用GA和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)治疗特异性关节炎状态。美国专利3,683,076(Rovati)揭示使用GA盐治疗OA和类风湿性关节炎；美国专利4,870,061(Speck)揭示通过面颊使用GlcNAc治疗退行性关节病；美国专利5,840,715和美国专利6,136,795(都是Florio)揭示使用GlcNAc硫酸盐作为饮食治疗中的营养成分缓解关节炎。

发明概述

本发明的一个实施方案涉及葡糖胺(GA)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗炎和软骨保护特性。根据该实施方案，GA和GlcNAc通过干预软骨细胞中细胞因子诱导的基因表达显示其抗炎和软骨保护特性。

在本发明的一个特别的方面，GlcNAc配方另人惊奇的显示了预想不到的哺乳动物的止痛效果。本发明的配方的止痛效果使它们可以用于在需要该治疗的病人中治疗如骨性关节炎(OA)或类风湿性关节炎(RA)。

在本方法的一个实施方案中，本发明提供了一种方法，包括给病人使用一种组合物，该组合物含有治疗有效量的GlcNAc，可以单独使用，也可以与抗炎药物或己糖胺酶抑制剂结合使用。使用本发明配方的合适的方法包括，但不限于，关节内注射、局部应用和肌肉注射的方法。一方面，当配方是关节内注射时，GlcNAc的包裹或包裹物(如脂质体)有利地改变了关节内注射的GlcNAc的利用度和药物动力全貌。

附图简述

图1显示根据本发明一个实施方案的包裹在不同脂质体配方中的[³H]GlcNAc的时间依赖性释放。

图2阐明来自三个类风湿关节炎(RA)病人滑液的包裹在不同脂质体配方中的[³H]的时间依赖性释放。

图3阐明来自三个骨性关节炎(OA)病人滑液的包裹在不同脂质体配方中的[³H]GlcNAc的时间依赖性释放。

图4阐明单独关节内使用生理盐水中的GlcNAc与单独关节内给予和包裹在含有DSPC/Chol脂质体配方中的GlcNAc相比，GlcNAc在大鼠膝关节的时间依赖性保持。

图5阐明单独关节内使用包裹在含有DSPC/Chol/DPSE脂质体配方中的GlcNAc后GlcNAc在大鼠膝关节的时间依赖性保持。

图6阐明大鼠的疼痛反应(基于此处定义的疼痛分数)与关节内使用缓激肽的函数。

图7阐明当关节内(IA)使用含有DPSE的脂质体配方与在生理盐水和生理盐水中的GlcNAc相比，GlcNAc的止痛效果。

发明的详细描述

缩写和术语

根据本发明和此处所用，以下术语和缩写定义为具有以下意义，除非其它的清楚的说明。这些解释仅仅作为范例。它们无意限制这些术语如它们在整个说明书描述或所指的原义。而是，这些解释是指包括如在此所描述和要求的术语的任何其它方面和/或范例。

此处所用的以下缩写为：

Chol＝胆固醇；

DMEM＝Dulbecco’s修饰的Eagle培养基

DSPC＝二硬脂酰L-α-磷脂酰胆碱；

DSPE＝二硬脂酰L-α-磷脂酰乙醇胺；

DSPE-Con＝与聚乙二醇共扼的二硬脂酰L-α-磷脂酰乙醇胺；

DSPG＝二硬脂酰L-α-磷脂酰-DL-乙二醇；

DPPS＝二棕榈酰L-α-磷脂酰-L-丝氨酸

ERK＝细胞外信号调节激酶；

GA＝葡糖胺；

GAGs＝氨基葡糖胺；

GlcNAc＝N-乙酰基葡糖胺；

HA＝透明质酸；

IL-1β＝白介素-1β；

IL-6＝白介素-6；

iNOS＝可诱导的一氧化氮合成酶；

MAP＝有丝分裂原活化蛋白；

MHA＝Mueller-Hinton琼脂；

MLV＝多层载体；

NSAID＝无类固醇的抗炎药物；

OA＝骨性关节炎；

PBS＝磷酸盐缓冲盐；

PEG＝聚乙二醇；

PMSF＝苯甲基磺酰氟化物；

RA＝类风湿性关节炎；

SUV＝小单层载体；

TFA＝三氟乙酸；

TNF-α＝肿瘤坏死因子；

术语“活性成分”指治疗有效量的药物或其配方。优选的本发明的活性成分是氨基糖，如GlcNAc和GA。

术语“藻酸盐凝胶”指含有不同比例的1，4-连接的β-D-甘露糖醛酸和α-L-guluronic酸残基的天然多糖聚合物。藻酸盐能形成稳定的凝胶，特别是在某些二价阳离子的存在之下，如钙、钡和锶。

术语“氨基糖”指任何合成或天然产生的糖，其中一种或多种碳原子的羟基(-OH)被氨基(-NH₂)取代。这种取代的发生不考虑任何糖上存在的不对称碳的方向或构型。除非其它地方有描述，术语“氨基糖”指环氨基糖的任一异头物(α或β)。氨基糖可以是乙酰化的，其中侧基氨基上的一个氢原子被酰基(-COR，其中R＝低级烷基)取代。根据本发明的一个优选的实施方案，R＝甲基(-CH₃)。

术语“关节炎”指特征为关节炎症的任何特定疾病，虽然在不同的条件下炎症的病因学可以不同。相对常见的关节疾病包括类风湿性关节炎、青少年性关节炎、关节强硬性脊椎炎、牛皮癣性关节炎和骨性关节炎。这些疾病也称“退化性关节疾病”。

术语“关节软骨”或“软骨”指覆盖骨末端并形成关节表面的物质。软骨可以承受压力，使关节滑动时产生低摩擦表面。关节软骨含有称为软骨细胞的细胞和含有蛋白和氨基糖的基质。

术语“关节退化”指含有软骨的组织退化。这样的退化的特征为关节炎。

术语“壳多糖”指以β-1，4模式连接的(多)GlcNAc。壳多糖是在自然界中发现的，例如在昆虫和甲壳纲动物的外骨架中。

术语“脱乙酰壳多糖”指去乙酰的壳多糖或以β-1，4模式连接的(聚)N-葡糖胺。

术语“软骨细胞”指关节软骨内发现的细胞。软骨细胞产生一种壳多糖蛋白-胶原，它是连接至蛋白的氨基葡糖胺(也叫粘多糖)。

术语“共扼”指两个或多个化学键相连的不同分子的结合。本发明中共扼的一个例子是“DPSE-Con”，其中DPSE对应于与聚乙二醇共扼的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，在这种情况下通过酯键共扼。根据本发明的共扼的其他键特征包括，但不限于，酰胺、乙缩醛、硫乙缩醛(thioacetal)、酯和硫酯、或任何主要通过用亲核物质处理反应性羰基成分形成的这类键。

术语“COX-1”和“COX-2”指两个结构相关、但功能不同的环氧酶。COX-1具有体内平衡功能，其抑制是不期望的。COX-2是可以诱导的酶，其存在能增加对炎症的反应。

术语“包裹效果”指包绕、掺入、负载、相连、结合或其它形式包裹在脂质体、微球体、纳米颗粒等中的化合物或活性成分的数量。一般说来，“产量”指活性成分的包裹百分比。

术语“包裹”或“包绕”指配制活性成分的任何方法，其能限制、隔离或用其它方法抑制活性成分在溶液或固相中的自由溶解。优选的包裹或包绕活性成分的例子包括，但不限于，在脂质体、微球体、纳米颗粒如固-脂纳米颗粒中的配方。

术语“氨基葡糖胺”指含有重复二糖单元的长杂多糖分子。二糖单元含有两个修饰的氨基糖：N-乙酰半乳糖胺或GlcNAc和糖醛酸如葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸。除了其他功能，GAGs作为关节的润滑液。生理意义的特定GAGs是透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素、硫酸肝素和硫酸角质素。

术语“己糖胺”指含有醛基或酮基的六个碳的多羟基醇的任何氨基糖。术语己糖胺包括醛糖、脱氧醛糖和酮糖，不考虑不对称碳键的方向或构型。优选的氨基糖是2-、3-、5-或6-脱氧酮糖，优选的脱氧氨基糖如，例如，GA、甘露糖胺和半乳糖胺。更优选地，氨基糖是N-乙酰化的并选自脱氧酰基胺糖如，例如，GlcNAc、N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰半乳糖胺。

术语“己糖胺酶”指部分或全部水解壳多糖或脱乙酰壳多糖成为其分别的单糖结构单元如GlcNAc和GA的任何糖苷酶。示例性的酶包括外-型β-D-葡糖胺酶、β-N-乙酰基己糖胺酶、脱乙酰壳多糖酶、溶酶体等。

术语“透明质酸”指天然存在的、含有葡萄糖醛酸和葡糖胺改变的亚单位的粘多糖。透明质酸是通过重复二糖单位形成的线性多糖(长链生物聚合物)，二糖单位由通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键连接的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺组成。多个分子量范围的透明质酸可以商业购买，其分子量范围从大约50,000至大约8×10⁶道尔顿。透明质酸也可以以钠盐的形式购买，它是干燥的、高纯化的物质。透明质酸钠可以与本领域己知多种保存剂保存，包括，但不限于，烷基取代的苯甲酸酯、醇、结合物、混合物及其混合。

术语“透明质酸(hyaluronan)”指N-乙酰基葡糖胺和葡萄糖醛酸重复分子聚合物。

术语“IL-1β”指白介素1β，它是调节较宽范围的免疫和炎症反应包括B-和T-细胞活化的免疫调节因子。

术语“IL-6”指白介素-6，一种多功能细胞因子，是由多种细胞产生的。IL-6的功能是免疫反应、急性期反应和血细胞生成的调节子。

术语“imonocyclitol”指糖的亚胺类似物，是己糖胺酶的抑制剂。

术语“炎症关节病”指衰弱和疼痛疾病的总和，有时也简单指风湿性疾病。在多种形式的炎症性关节病中，骨性关节炎(也称为骨关节炎)和风湿性关节炎是最常见的。其他认知形式的炎症关节病包括强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、假痛风、赖特综合征或关节炎继发的结缔组织疾病。

术语“可注射的配方”指制备成溶液或悬液的无菌、可注射组合物。也可以制备适用于注射之前液体载体的溶液或悬液的固体形式。制剂也可以是乳化的或使活性成分包裹。可注射的制剂还可以包含多种本领域已知多种保存剂，包括，但不限于，烷基取代的苯甲酸酯、醇、结合物、共混物或其混合物。

术语“关节内”指直接向关节释放药物的方法。传统的药物给予方法如，依赖于滑膜的血管灌注例如口服、静脉内或肌肉内使用，以将药物携带至关节。这是无效的，因为小分子从滑膜毛细血管经滑膜转运至关节腔通常是被动弥散发生的，而靶分子的大小增加时将变得没有效果。因此，介导分子如GA进入关节腔实质上是受限制的。药物的关节内注射防止了这些局限的发生。

术语“脂质体”指，例如，当磷脂分散在水中或液体介质中时，自发性形成的载体，并且从脂质端基部分的亲水反应获得，产生单和多层系统(载体)类似生物膜。在一个单层脂质体中，双层结构形或中空的球形，极性侧基面对内部水单元和外部大量的水。形成脂质体的多个可以接受的方法是本领域已知的方法。一般说来，多层中心的双层载体的形成具有分离脂质双层的液体层。该类洋葱结构指多层载体(MLV)。小单层载体(SUN)可以通过声纳或在合适的条件下MLV的挤出产生。脂质体可以与Chol配方以增加稳定性，并且可以包含其它材料，如中性脂质，和表面改性剂，如正电或负电化合物。优选的脂质体是小单层-双层球形壳。脂质体既可以包裹亲脂药物，也可以包裹亲水药物。当通过合适的方法制备时，它们可以释放延长周期的药物。另外，磷脂没有毒性。多种天然和合成磷脂可以商业购买用于制备脂质体。本领域已知、并且通过首字母描述的例子包括，但不限于，DSPC、DSPE、DSPE-Con、DSPG和DPPS。

术语“微球体”指用于包裹或包绕本发明活性成分的聚合物载体。通过选择和配置多种活性成分/聚合物结合，微球体基配方使得可以控制药物剂量和时间。药物的总剂量和释放的动力学是可变的，可以被调整。例如，通过改变共聚物的比率和共聚物的分子量，可以最优化药物释放参数。微球体-基系统也可以增加活性成分的周期。使用配方中含有丙交酯-乙交酯共聚物的微球体提供了某些优点如生物相容性和生物降解性。可以根据本领域已知的方法制备微球体，即加工、机压、研磨、压碎或挤出。

术语“药物的包裹百分率”指(1)在脂质体的最终配方中要被包裹的活性成分的数量与(2)在包裹前制备配方方法中使用的被包裹的活性成分的总数量的比率，该比率再乘以100。

术语“药学可接受的”或“药物学可接受的”指当适合给哺乳动物使用时不产生相反、过敏或其它非预期反应的配方(即通过医生或兽医)。

术语“聚合物载体”指透明质酸、聚乙二醇、聚乙二醇和聚(乳酸/羟基乙酸)的共聚物、聚(乙二醇-γ(DL-乳酸-共-羟基乙酸)的共聚物、藻酸盐凝胶、脱乙酰壳多糖，或其药学可接受的盐。

术语“聚乙二醇”或“PEG”指含有HO-(CH₂CH₂O)_nH亚单位的水溶性聚合物。PEG可以具有烷基的末端加帽。

术语“固体-脂质纳米颗粒”指用于药物释放的载体。固体-脂质纳米颗粒药物的固体溶液在脂质基质中。颗粒的直径通常低于1μm，颗粒通常是单分散的。制备固体-脂质纳米颗粒的方法可以避免使用有机溶剂，而使用常规或高压匀浆物，特别是合适的赋形剂。由于脂质基质，固体-脂质纳米颗粒也可以稳定化学敏感药物。使用固体-脂质纳米颗粒作为对照释放系统特别适用于活性成分的局部应用。

术语“运动损伤”指与当参与运动发生的应激或损伤相关或由其引起的任何疼痛或衰弱条件。当损伤的结果发展为关节炎时，例如运动损伤，它通常指为“继发”性骨关节炎。作为运动损伤结果的软骨退化可以由创伤引起。另外，此处也包括软骨损伤的其它指征，如其它损伤的结果或退化性疾病。

术语“持续释放”指时间间期，在该间期中，药物的释放是可利用的，或以其它方式有利于生理的摄入。持续释放间期可以早于诱导间期，在该间期中，很少或没有药物释放，或可以是双相的，包括初始时间间期和继发时间间期，在初始时间间期中某些药物释放，在继发间期中另外的药物释放。作为对照，术语“持续释放”仅仅用于描述似乎是单相的释放全貌，具有释放的平滑-曲线时间全貌。本领域普通技术人员将理解释放全貌实际上对应于指数或对数时间释放全貌。

术语“滑液”指在关节、囊和键鞘中发现的少量的粘的、通常是浅黄色物质。滑液包括透明质酸，一种分子量范围为100000-10000000道尔顿的多糖。透明质酸相对是不容易压缩的，能置换大量的水，其特性帮助滑液成为优异的润滑剂和令人惊讶的关节内吸收剂。

术语“治疗有效量”指诱导期望的药学效应必需的生物活性物质的量。根据特定活性物质的作用；个体的年龄、体重和反应以及个体综合征的性质和严重性，该数量可以有较大的变化。因此，关于活性成分的数量，没有高或低的严格限制。本发明使用的治疗有效量可以容易的被本领域普通技术人员确定。

术语“TNF-α”指肿瘤坏死因子，在人风湿性关节炎的病理形成中明显的细胞因子。

配方及方法

本发明涉及GA和GlcNAc介导的抗-炎症活性。因此，以下讨论详细描述了实验，该实验设计用于确定GlcNAc的软骨保护和抗炎特性的起因。这些实验中的某些在于2001年3月29日申请的美国临时申请系列号60/280,351中有描述，其在此全文引入以供参考。

为了研究GlcNAc是否抑制了可诱导的NO合成酶(iNOS)的酶活性或相应蛋白的表达，分析了GlcNAc对iNOS蛋白(Western免疫印迹)和iNOS mRNA(Northern印迹)表达的影响。发现GlcNAc明显抑制iNOS mRNA和蛋白的表达。而且发现GA和GlcNAc都抑制由IL-1β触发的NO产生。GA和GlcNAc都抑制由IL-1β和TNFα诱导的正常人关节软骨细胞的一氧化氮(NO)产生。

为了分析所发现现象的糖特异性，比较了葡萄糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺、GlcNAc和GA对IL-1β诱导的NO生成的作用。当使用浓度为10mM时，只有GlcNAc和N-乙酰半乳糖胺显示了抑制活性。一些其它的单糖，包括葡萄糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰甘露糖胺没有抑制IL-1β和TNFα诱导的一氧化氮(NO)的产生。而且，根据测定结果，GlcNAc聚合物，包括GlcNAc二聚体和三聚体没有表现IL-1β诱导的NO产生的抑制活性，没有影响NO的产生。

相信所观察到的IL-1β诱导的NO产生的抑制与可诱导的NO合成酶(iNOS)mRNA和蛋白表达的抑制相关。另外，GlcNAc也抑制了IL-1β诱导的COX-2和IL-6的产生。研究了GlcNAc对用IL-1β刺激的培养的人关节软骨细胞中COX-2表达的影响。实验结果表明，GlcNAc抑制了用Western免疫印迹测定的COX-2蛋白的表达和用Northern印迹测定的COX-2mRNA的表达。与COX-2表达相反，GlcNAc没有影响持续表达的COX-1蛋白的表达。除了NO和COX-2，GlcNAc抑制了用IL-1β刺激的培养的人关节软骨细胞中IL-6的产生。差异有统计学意义(p＜0.001)。因此，GlcNAc抑制了多种IL-1β诱导的炎症产物，但没有抑制持续表达的分子。

为了确定GlcNAc-介导的IL-1β-诱导的NO、COX-2和IL-6的产生是否依赖于NF-κB的活化，比较研究了NF-κB在用IL-1β单独刺激和用IL-1β刺激并用GlcNAc治疗的软骨细胞中的核转位。实验结果表明，GlcNAc并不影响IL-1β诱导的NF-κB的核转位。GlcNAc-介导的人软骨细胞的IL-1β反应的抑制与MAP激酶(JNK、ERK和p38)的活性下降并不相关，与转录因子NF-κB的活化也不相关。

IL-1β通路的细胞内信号导致多种蛋白激酶的活化，包括MAP激酶(Geng等人，(1996)J.Clin.Invest.98：2425：30)。GlcNAc残基参与了蛋白O-糖苷化的动力过程，它利用丝氨酸残基作为锚着点。因此，通过竞争相同的结合位点，O-糖基可以减少丝氨酸磷酸化的作用，因此干预了信号传导。为了阐述该现象可能的机制，分析了GlcNAc对MAP激酶(ERK、JNK和p38)在由IL-1β诱导的软骨细胞的活化中的作用。实验结果表明GlcNAc不抑制ERK、INK和p38 MAP激酶的活化。

GlcNAc不抑制由IL-1β诱导的软骨细胞的所有反应。例如，它并不抑制IL-1β-介导的己糖胺分泌的增加。而且，IL-1β在诱导TGFα1中有协同作用。总的说来，这些发现表明，GlcNAc选择性抑制细胞因子诱导的某些炎症前介质的基因表达和产生。

实验结果表明，GA和GlcNAc在较低的毫摩尔范围内可检测的抑制了NO的产生；然而，低于1mM的浓度是无效的。该浓度范围类似于以前描述的GA-诱导的TGFα1在培养的牛间质细胞中产生的上调(Kolm-Litty等人，(1998)J.Clin.Invest.101：160)。GA和GlcNAc在高浓度有较好的抗炎活性反映了这些糖和葡萄糖之间从培养基质通过转运分子进入细胞的竞争。(Rauchman等人，(1992)Biochem.Biophys.Acta.1111：231)。氨基糖的治疗浓度可以达到以1500mg每天的可接受的剂量的GA的人类口服应用，其低于本申请中使用的浓度。因此，关于GlcNAc和GA活性的抗炎机制的体外数据不能直接用于解释GA在OA病人中的治疗作用。

当使用等摩尔浓度时，GlcNAc较GA显示了强大的抑制NO产生的作用。观察到GlcNAc的最大抑制作用的浓度是20mM；低于1mM不能抑制NO的产生。GlcNAc的IC₅₀是4.1±1.3mM，GA的IC₅₀是14.9±2.1mM，(p＜0.01)。根据MTT测定，GA和GlcNAc在超过20mM时都不能影响细胞的存活(Park等人，(1987)Cancer Res.47：5875)。

虽然不欲被任何特定理论限制，GlcNAc调节的IL-1β反应抑制的可能机制是N-乙酰葡糖胺-介导的IL-1β信号级链事件中磷酸化的抑制。己糖胺通路的终产物之一，显示UDP-N-乙酰-β-D-葡糖胺参与了蛋白O-糖苷化的动力过程，它利用丝氨酸和苏氨酸残基作为锚着区(Haltiwanger等人，(1997)Biochem.Biophys.Res.Commun.231：237)。丝氨酸残基的O-糖基化可以潜在地与相同残基的磷酸化竞争，导致细胞内信号传导级链的受损(Chou等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4417)。为了阐明其可能性，分析了GlcNAc对MAP激酶(ERK、JNK和p38)活化和IL-1β刺激的软骨细胞的NF-κB的核转位的作用。这些MAP激酶和NF-κB的活化是软骨细胞对IL-1β和相关的细胞因子反应的中心事件。实验结果表明，可以测量的GlcNAc并不抑制IL-1β诱导的MAP激酶的活化(ERK、JNK和p38)，或NF-κB的核转位。

总之，本研究是第一次测定了GA和GlcNAc对人软骨细胞对IL-1β刺激反应的作用，并描述了GlcNAc-调节的抗炎活性的新机制。我们的实验结果清楚的显示，GA以及很大程度上的GlcNAc能抑制IL-1β诱导的NO在培养的人关节软骨细胞中的产生。糖对NO产生的作用是特异的，因为多种其它的单糖，包括葡萄糖、葡萄糖醛酸和N-乙酰基-甘露糖胺并没有表现出该活性。而且，已经表明，GlcNAc聚合物，包括二聚体和三聚体也不影响NO的产生。所观察到的IL-1β诱导的NO产生的抑制是iNOS蛋白和mRNA表达抑制的结果。除了NO的抑制活性，GlcNAc还抑制了IL-1β诱导的COX-2和IL-6的产生。然而，COX-1的表达并不被GlcNAc影响。

本发明的一个实施方案提供了给有需要该治疗的病人治疗OA(或炎性关节病类型)、运动性损伤或软骨退化的方法。所述的方法包括以下步骤：给病人单独服用含有治疗有效量的GlcNAc的组合物，或与至少一种其它抗炎药物或己糖胺抑制剂结合使用，而抗炎药物和抑制剂是本领域已知的。本发明另外的实施方案包括适用于关节内、局部或肌肉内使用的制剂。有利地，该制剂可以经关节内有效使用。

含有活性成分溶解或分散在其中的药物组合物不需要限定基础的剂型。这种组合物可以制备成可注射的溶液，可以是液体溶液，也可以悬浮液。然而，可以制备成适合在使用之前溶于液体的溶液或悬浮液的固体形式。该制剂也可以是乳化的。

活性成分也可以与药学可接受和可以与活性成分相容的赋形剂混合，其量适用于此处描述的治疗方法。合适的赋形剂是，例如水、盐、右旋糖、甘油、乙醇或等等或其结合。另外，如果需要，组合物可以含有少量的助剂物质，如湿化剂或乳化剂、pH缓冲剂等等，它们能增加活性成分的效能。

本发明的组合物包括其成分的药学可接受的盐。药学可接受的盐包括与无机酸如盐酸或磷酸、硫酸等或某些有机酸如乙酸、酒石酸、马来酸等形成的酸加盐(与任何自由氨基形成)。由葡糖胺中存在的自由羰基形成的盐也可以衍生自无机碱如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物，以及某些有机碱如异丙胺、三甲基胺、二氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等等。特别优选的是TFA和HCl盐。

本发明的另外一个实施方案是活性成分GlcNAc的改进的配方。当关节内注射时，GlcNAc在脂质体或其它包裹制剂中的包裹或包绕改善了其药学全貌。例如关节内使用GlcNAc的液体溶液迅速移动出大鼠的膝关节。而相反的是，配制进脂质体的GlcNAc在根据本发明关节内使用后留在大鼠的膝关节内。在本发明的另外一个实施方案中，GlcNAc的脂质体配方对缓激肽诱导的哺乳动物的疼痛没有显示预期的止痛效果。没有脂质体配方的GlcNAc本身显示很轻微但统计学上没有意义的止痛效果。

本发明将参考以下实施例进一步描述，然而，可以理解的是，本发明并不限于这些实施例。

实施例

材料

正常软骨来自圣地亚哥Orange County and San Antonio的尸检机构和组织库。关节软骨来自股骨髁和胫骨坪。所有的组织标本根据修饰的mankin评分分级(Mankin等人，(1971)J：Bone Joint SurgAm.53：23)，而且只有没有OA证据的软骨用于软骨细胞源。死亡和在实验室从这些关节收获软骨的时间间隔为至少24小时至最多96小时。用组织板在验尸后24小时收获软骨薄片，置于组织培养介质中(DMEM、10％FBS、青霉素、链霉素)，并且在4℃储藏在实验室。收获后24小时之内在实验室加工组织。

GA、GlcNAc、葡萄糖、葡萄糖醛酸和N-乙酰甘露糖胺购自Sigma(St.Louis，MO)。N-乙酰葡糖胺二聚体(N，N’-二乙酰壳二糖)和N-乙酰葡糖胺三聚体(N，N’，N″-三乙酰壳多糖)购自TRC(Toronto，Canada)。

在配方研究中使用的设备和动物购自：循环水浴(Huber)，真空泵(Gast manufacturing Inc，Model DOA-P 104-BN)，多功能闪烁扫描计数器(Beckman coulter，LCS-6500)，SpeedVac集中器(Savant，ModelDNA-230)。实验中使用的Wistar大鼠(雄性，200-250g)是从新加坡实验动物中心获得的。

方法

软骨细胞通过胶原酶消化从软骨上分离，保存在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中持续单层培养。通过胶原酶消化正常软骨分离的软骨细胞的细胞存活率大于95％。该细胞存活水平在验尸后保持至少96小时。当测定一氧化氮和IL-6释放时，对IL-1作用为分解代谢反应的研究显示在死亡和组织加工之间的时间中，随着时间的变化没有显著变化。用原代或第一代细胞进行了实验报告。

在1％FBS存在下，软骨细胞以40000细胞/孔放置在96孔培养板上。48小时后，用5ng/ml的IL-1β(Sigma)刺激细胞24h。NO的产生以NO₂在培养上清中的积聚用Griess反应测定，Griess反应见其它处的描述。(Heval等人，(1994)Methods Enzymol.233：250)。培养上清IL-6用ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)根据供应商的要求测定。

通过用冰冷的溶解缓冲液(10mM TrisHCl pH7.6，158mM NaCl，1mM EDTA，0.1％SDS，1％Triton X-100，白胃素111g/ml，抑肽酶1μg/ml，和0.5mM PMSF)溶解培养板上的细胞从用如上所述刺激的3×10⁶软骨细胞中制备全细胞提取物，溶解缓冲液在使用之前立即加入。将溶解物转移到Eppendorf管中，在20000g，4℃离心30分钟。将上清液转移至新鲜的管中，通过Bradford检测测定蛋白的浓度。通过10％SDS PAGE分离相似数量的蛋白，通过电印迹转移至硝酸纤维素滤膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)。将滤膜在5％牛奶粉/TBS-T溶液中阻断过夜，然后进一步与以下抗体中的一种孵育2小时：抗-iNOS(C-19，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，抗-COX-2(Cayman Chemicai，Ann Arbor，MI)，抗-COX-1(H-3，Santa CruzBiotechnology，Inc.)，抗-磷-INK(phosphoThr 183/Tyr 185，NewEngland Biolabs，Inc.，Beverly，MA)，抗-磷-p38MAP(磷-Thr 80/Tyr182，New England Biolabs，Inc.)或抗-磷-ERK(phosphoThr 180/Tyr182，New England Biolabs，Inc.)。将膜用TBS-T冲洗3次，然后进一步用合适的辣根过氧化酶标记的二抗在5％的牛奶粉/TBS-T中孵育，用ECL系统(Amersham，Arlington Heights，IL)显色。

使用STAT-60试剂(Tel-Test，Friendswood，TX)从刺激的2×10⁶软骨细胞中分离总RNA。每一标本的RNA用光谱定量，在1.2％琼脂糖、6％福尔马林凝胶上分离5μg。在电泳后，将凝胶照相，通过毛细血管印迹将RNA转移到HybondN尼龙膜上(BRL，Baithesburg，MD)。将膜在空气中干燥，在80℃孵育2小时。用5×SCC，1mM EDTA，0.2％SDS和5×Denhardt溶液在60℃预杂交2小时。加入放射标记的探针，在60℃杂交过夜。杂交后，将滤膜在2×SSC，0.1％SDS中冲洗两次，在60℃用2×SCC，0.1％SDS冲洗1次，在60℃用0.2×SCC，0.1％SDS冲洗一次。将膜用塑料套包裹，在-70℃用加强筛选暴露12小时。用于杂交的探针如前所述制备(Geng等人，(1993)J.Immunol.151：6692；Geller等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3491)。

核蛋白的提取按如下制备：按所指示刺激2×10⁶软骨细胞。用胰蛋白酶消化收获细胞，用冰冷的PBS冲洗一次，在10mM含2mM MgCl₂，140mM NaCl，0.5mM DTT，0.05％Triton X-100，0.5mM PMSF，白胃素1μg/ml和抑肽酶1μg/ml的Tris-HCl缓冲液pH7.5中冲洗。振荡核，重悬在20mM含25％甘油，420mM NaCl，1.5mM MgCl₂，0.2mM EDTA，0.5mM DTT，0.5mM PMSF，白胃素1μg/ml和抑肽酶1μg/ml的HEPES缓冲液pH7.9中，在4℃旋转30分钟。通过离心去除核碎片后，用Bradford检测测定溶解物中的蛋白浓度。在室温下在含有10％甘油，420mM NaCl，1.5mM MgCl₂，0.2mM EDTA，0.5mM DTT和0.5mMPMSF的20mM HEPES缓冲液pH7.9中，将等量核提取物(2μg)与poly-(dI-dC)poly-(dI-dC)(0.1mg/ml)、BSA(1mg/ml)、含有NF-κB同源序列DNA结合位点(序列：5’-GATCGAGGGGACTTTCCCTAGC-3’)的1×10s计数的双链放射标记的寡脱氧核苷酸孵育15分钟。为了竞争实验，在加入放射标记的NF-κB寡脱氧核苷酸之前10分钟，将未标记的NF-κB寡脱氧核苷酸或含有oct-1同源序列的寡脱氧核苷酸以100倍摩尔过量加入到结合反应物中。将结合反应物加样到6％TGE(50mM Tris-HCl pH7.5，380mM甘氨酸，2Mm EDTA)、天然聚丙烯酰胺凝胶，4℃电泳2小时，然后干燥凝胶，用加强扫描在-80℃暴露16-48小时。产生数据的统计分析使用Window的StatMost 32程序(DataxionSoftware Inc.，Los Angeles，CA)进行。

以下磷脂和磷脂结合物可以商业购买。商业名称后面的括号中是供应商和产品号，以及缩写：

二硬脂酰L-α-磷脂酰胆碱(Sigma P6517，DSPC)、二硬脂酰L-α-磷脂酰-乙醇胺(Sigma P3531，DSPE)、与甲氧聚乙二醇(Sigma P7840，DSPE-Con)、二硬脂酰L-α-磷脂酰-DL-甘油(Sigma P9524，DSPG)、二棕榈酰L-α-磷脂酰-L-丝氨酸(Sigma P 1185，DPPS)、胆固醇(Sigma C8667，Chol)、N-乙酰氨基葡萄糖(Sigma A8625，GlcNAc)共扼的二硬脂酰L-α-磷脂酰-乙醇胺

含氚的N-葡糖胺、N-乙酰-D-[1-³H]葡糖胺购自AmershamPharmacia Biotech，Code TRK376，特异活性18.6mCi/mg，放射化学纯度97.4％)。除非另有所指，溶剂和制剂、氯仿(Sigma，C-2432)、甲醇(Merck，HPLC级)，NCS-II组织溶解剂(Amersham Pharmacia Biotech.Code NNCS502)，闪烁层状溶液(Amersham Pharmacia Biotech.CodeBCS-NA)用于接受。

实施例1

通过脂质体包裹的GlcNAc的制备

33μmol DSPC和33μmol Chol(或其它组合物，见下表1)溶于3ml的氯仿∶甲醇(95∶5，v/v)溶液在100ml埃伦迈尔烧瓶。在真空(600mm Hg)在室温下蒸发有机溶剂。在去除最后可见的痕量溶剂后，持续真空至少30分钟。

在0.85％氯化钠溶液中的2ml的GlcNAc(含有总量为10μCi标记的和5.38mg未标记的GlcNAc，最后未标记的与标记的摩尔比为10000tol)加入到烧瓶中。将烧瓶放于60℃(其它组合物的温度见表1)水浴中5分钟，干脂质通过在2500rpm剧烈振荡1分钟悬浮。将脂质体在相同温度下退火45分钟。然后将制备的脂质体分装于4个1.5-ml的Eppendorf管中。在真空下在45℃在SpeedVac浓缩器中干燥脂质体4-5小时。

在每一Eppendorf管中的干燥的脂质体中加入50μl的蒸馏水。将Eppendorf管置于60℃(其它组合物的温度见表1)水浴中5分钟。然后将脂质体通过在2500rpm剧烈振荡1分钟悬浮。将悬浮液置于相同的温度下45分钟。

将未包裹的GlcNAc从脂质体分离，在用1ml 0.85％NaCl稀释后，通过在20000G下离心15分钟将GlcNAc包裹在脂质体中。用1ml 0.85％NaCl重复相同的步骤2次去除未包裹物质。根据该方法制备以下脂质体配方：

(1)包括以摩尔比5∶5的DSPC和Chol的双相混合物；

(2)包括以摩尔比5∶5∶1的DSPC、Chol和DSPE的三相混合物；

(3)包括以摩尔比5∶5∶1的DSPC、Chol和DSPE-Con的三相混合物；

(4)包括以摩尔比5∶5∶1的DSPC、Chol和DSPG的三相混合物；

(5)包括以摩尔比5∶5∶1的DSPC、Chol和DPPS的三相混合物；

[³H]GlcNAc在每一脂质体配方和相应的上清液中的数量通过液体闪烁计数。简言之，10μl脂质体溶液或上清溶解在0.5ml的组织溶解剂中(Amersham NCS-II)，用15μl冰醋酸混合以去除可能的背景化学发光。然后将上清液或脂质体与4.5ml的闪烁层状物(BCS-NA，Amersham)混合。脂质体小丸和上清中的放射活性用于计算每一脂质体制备的包裹效能。

表1显示GlcNAc在不同脂质体配方中的包裹效能。产率表示掺入、负载、相连、结合或以其它方式连接到脂质体或其双层物中化合物的数量。总之，产率以起始数量的％表示。如表1所示，GlcNAc包裹进脂质体的效能是持续的。表1的产率值代表包裹百分率(产率)的值。其它值(高或低)可以根据所使用的脂质体的数量和类型获得，只要不背离本发明的宗旨即可。

表1

GlcNAc的脂质体配方

DSPC/Chol                退火和水合温度     产率(％)

                         60℃               20.4

                                            20.0

                                            23.3

                                            16.0

                            平均值±标准差19.9±3.0

DSPC/Chol/DSPE(5∶5∶1)  退火和水合温度     产率(％)

                          75℃              23.6

                                            18.8

                                            30.6

                                            27.6

                           平均值±标准差25.2±5.1

DSPC/Chol/DSPE-Con           退火和水合温度     产率(％)

(33μmol：33μmol：20mg)

                             75℃               19.2

                                                18.6

                                                23.9

                                                17.5

                                平均值±标准差19.8±2.8

DSPC/Chol/DSPG(5∶5∶1)      退火和水合温度     产率(％)

                             60℃               28.4

                                                25.4

                                                21.8

                                平均值±标准差25.2±3.3

DSPC/Chol/DPPS(5∶5∶1)      退火和水合温度     产率(％)

                             75℃               15.2

                                                19.4

                                                23.0

                                                33.2

                                平均值±标准差22.7±7.7

所有的制备步骤以无菌的模式进行。制备脂质体的无菌使用琼脂糖细胞培养板检查。将5μl的脂质体接种在琼脂培养板上，35℃培养3天。另外5μl的脂质体接种在MHA琼脂培养板上，在室温下培养3天。结果显示没有微生物生长。

实施例2

GlcNAc从脂质体的体外释放

如前述方法制备的100μl包裹在脂质体中的GlcNAc悬浮在3ml的0.1M PBS(pH7.4)的50ml离心管中。脂质体在振荡孵育器中以60rpm在37℃孵育。在不同的时间点后，通过在20000rpm离心分离脂质体15分钟。在上清液中释放的GlcNAc(³H活性)通过液体闪烁振荡器测定。脂质体小丸重悬在3ml的新鲜PBS中，在相同的条件下孵育。不同类型脂质体的[³H]GlcNAc释放百分比与时间的函数作图见图1。

图1显示在存在0.1M PBS，pH7.4下，不同的脂质体配方包裹的体外释放[³H]GlcNAc的动力全貌。测定在上清液中测定的从脂质体释放的[³H]GlcNAc的数量，以释放的最初包裹的化合物的百分比计算。

图1显示[³H]GlcNAc的释放率根据使用的脂质体的类型变化。在这些实验中，使用DSPE的脂质体的特征是迅速的最初释放率，然后是后续时间的缓慢释放率。掺入与聚乙二醇共扼的DSPE相似的配方显示明显不同的特征，与没有PEG共扼的配方相比，在相同的时间点药物释放明显变慢。含有DSPC的脂质体显示缓慢、接近平稳的释放率。其它配方在DSPE和DSPC之间。

在来自炎性关节炎和OA病人的人滑液也进行了体外释放研究。如此处所述制备的10μl脂质体与90μl人滑液混合。在37℃、60rpm的振荡孵育器中孵育。在不同的时间点，通过加入300μl生理盐水分离脂质体，在20000G下离心15分钟。在上清液中加入4ml液体闪烁层状物，通过液体闪烁计数测定GlcNAc(³H活性)的释放。在90μl来自相同病人的滑液中重悬脂质体小丸，在如上所述的相同条件下孵育。在滑液存在下，不同类型脂质体的[³H]GlcNAc释放百分比与时间的函数作图，见图2。

图2显示包裹在不同脂质体配方中的[³H]GlcNAc体外释放进入3个类风湿(RA)病人的滑液的动力学全貌。从脂质体释放的[³H]GlcNAc的数量在上清液中测量，计算为最初包裹的化合物释放的百分比。在图2中，每一点代表平均标准偏差(±SD)，n＝4。

图3显示包裹在不同脂质体配方中的[³H]GlcNAc体外释放进入3个OA病人的滑液的动力学全貌。从脂质体释放的[³H]GlcNAc的数量在上清液中测量，计算为最初包裹的化合物释放的百分比。在图3中，每一误差棒代表三个数据点的平均标准偏差。

在关节内应用后，多种基于PC/Chol(1∶1)或DSPC/Chol/DSPE(5∶5∶1)的脂质体配方延长了GlcNAc在大鼠关节保留的时间。

实施例3

关节内应用后GlcNAc的体内保留

50μl的GlcNAc溶液(未标记的2.69mg/ml，标记的5μCi/ml，未标记的分子∶标记的分子为10000∶1)注射入六只大鼠的膝关节。这些动物(每一时间点2只动物)在应用GlcNAc溶液后0、30分钟和2小时处死。两只另外的大鼠注射生理盐水作为阴性对照。取所有的关节标本，用5ml正常生理盐水在16000rpm匀浆大约30秒。100μl的组织匀浆加入到500μl组织溶解剂中。将溶液在50℃孵育16小时，与30μl冰醋酸和5ml液体闪烁层状物混合。通过液体闪烁计数测定[³H]GlcNAc的活性。

14只大鼠用于每一脂质体配方。50μl的脂质体(根据此处公开的制备，1.13μCi/ml，GlcNAc浓度为0.61mg/ml，未标记：标记的分子为10000∶1)注射入12只大鼠的每一膝关节中。另外两只大鼠注射50μl正常生理盐水作为阴性对照。动物(2只大鼠/时间点)在应用GlcNAc后相应的0、1、3、7、14、21和28天的时间点处死。取膝关节标本，根据此处公开的测定[³H]GlcNAc的活性，图4中描述的该结果显示关节内半衰期明显延长。

图4显示在单独关节内应用包裹在含有DSPC/Chol＝5∶5脂质体配方(点和实线)中的GlcNAc后或正常生理盐水(虚线)GlcNAc在大鼠膝关节内保留的动力学全貌。每一点代表平均值±标准差，n＝4。GlcNAc生理盐水溶液在大鼠膝关节中的半衰期非常快(4.1分钟)，线非常靠近图4)中的横坐标。脂质体配方的GlcNAc在大鼠关节中的半衰期是173小时。没有配方的GlcNAc关节内应用后，GlcNAc迅速移出大鼠关节。

图5显示在单独关节内应用包裹在含有DSPC/Chol DSPE＝5∶5∶1的脂质体配方中的GlcNAc后的GlcNAc在大鼠膝关节内保留的动力学全貌。每一点代表平均值±标准差，n＝4。对应于两组不同的释放相，观察到该脂质体配方的双相释放曲线。大鼠关节中从该脂质体配方释放的GlcNAc半衰期分别计算为4.8小时和128小时。

实施例4

在关节内应用GlcNAc后的止痛效果

该研究的目的是为了研究Wistar大鼠的关节经关节内注射有和没有脂质体配方的GlcNAc的止痛作用。通过关节内应用缓激肽诱导疼痛。体重范围在220g至250g的成年雄性Wistar大鼠从新加坡国立大学实验动物中心获得。缓激肽和GlcNAc从Sigma获得。如上所述制备脂质体。

将50μl的GlcNAc溶液或脂质体悬液配方的GlcNAc注射进入大鼠关节腔。等量的盐水关节内注入作为阴性对照。50μl的缓激肽(60μg/ml或以指定的浓度)在使用GlcNAc后不同的时间点经关节内注入。

使用关节内注射缓激肽后引起的行走行为的变化来定义大鼠的诱导疼痛标准。该方法用来观察疼痛反应，如表2的限定。根据表3中的标准进行疼痛程度的评分。

表2

疼痛标准

行走行为         分级            指征

正常	正常	没有行走的改变
			跛行	Lam-I	单独跛行20秒或更少时间
	Lam-II	单独跛行大于20秒
			拖行	Pul-I	注射肢体只有短暂的拖行(5秒或更少时间)
	Pul-II	注射肢体拖行，然后是跛行
			三条肢体	Thr-I	短暂(5秒或更少时间)的三条肢体走路，然后是跛行
	Thr-II	三条肢体走路超过5秒，然后是跛行

表3

评价疼痛反应的行为分级标准

疼痛分级          行走行为                             评分

没有	正常行走	0
			轻微	Lam-I	1
适度	Lam-II或Pau-I	2
			中等	Pul-II或Thr-I	3
严重	Thr-II	4

图6显示如此处所述关节内应用后大鼠缓激肽的剂量反应。高评分对应于注射的缓激肽的数量。

图7显示在生理盐水或包裹在脂质体配方中的GlcNAc的止痛作用。GlcNAc的脂质体配方显示较低的疼痛评分，说明了其对缓激肽诱导的Wistar大鼠疼痛的止痛作用。没有配方的GlcNAc本身显示小、但统计学上没有意义的止痛作用。

只要不背离本发明的精神和范围，对本领域的普通技术人员来说，多种修饰和变化都是显而易见的，而本发明是由所属的权利要求来限定。例如，应该注意的是在以下权利要求的任何方法中引证的步骤并不需要以它们被引证的步骤进行。本领域普通技术人员可以理解从它们引证的步骤中可以有多种变化。例如，在某些实施方案中，可以同时进行步骤。所附的权利要求应该在头脑中遵循这些原则。

Claims (24)

1.一种可注射的配方，包括包裹的含有氨基糖的活性成分，该配方用于关节内治疗动物或人的疾病或状态。

2.根据权利要求1所述的配方，其中所述的疾病或状态选自关节炎、软骨相关的运动损伤或软骨退行性病变。

3.根据权利要求1所述的配方，其中所述的活性成分是选自N-乙酰葡糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺或iminocyclitol和其药学上可以接受的盐的氨基糖。

4.根据权利要求1所述的配方，其中所述的活性成分是被脂质体包裹的。

5.根据权利要求1所述的配方，其中所述的活性成分是被微球体包裹的。

6.根据权利要求1所述的配方，其中所述的活性成分是被固体-脂质纳米颗粒包裹的。

7.根据权利要求1所述的配方，进一步包括一种或多种选自透明质酸、聚乙二醇、聚乙二醇和聚(乳酸/羟基乙酸)的共聚物、聚(乙二醇-γ-(DL-乳酸-共-羟基乙酸)的共聚物、藻酸盐凝胶、壳多糖和脱乙酰壳多糖的聚合物载体。

8.根据权利要求1所述的配方，其中所述的配方是止痛的。

9.根据权利要求2所述的配方，其中所述的关节炎是骨性关节炎或类风湿关节炎。

10.一种可注射的配方，含有由脂质体包裹的氨基糖，其中所述的脂质体含有一种或多种选自二硬脂酰L-α-磷脂酰胆碱、二硬脂酰L-α-磷脂酰-乙醇胺、与甲氧基聚乙二醇、二硬脂酰L-α-磷脂酰-DL-甘油和二棕榈酰L-α-磷脂酰-L-丝氨酸共扼的二硬脂酰L-α-磷脂酰乙醇胺的脂质。

11.根据权利要求10所述的配方，其中所述的氨基糖选自N-乙酰葡糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺或iminocyclitol和其药学上可以接受的盐。

12.根据权利要求10所述的配方，其中所述的脂质体是单层或多层结构，平均直径为100nm或更大。

13.根据权利要求7所述的配方，其中所述的透明质酸的平均分子量为大约400至大约10000000道尔顿。

14.一种可关节内注射治疗关节炎的配方，含有由微球体包裹的氨基糖，其中所述的微球体含有聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物和其药学上可以接受的盐。

15.一种治疗哺乳动物疾病或状态的方法，所述的方法包括应用治疗有效量的氨基糖作为控制释放配方。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的疾病或状态选自关节炎、软骨相关的运动损伤或软骨退形变。

17.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括缓解疼痛。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述的配方以药学可接受的凝胶、霜剂、洗液或贴片的形式局部应用。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述的关节炎是骨性关节炎或类风湿关节炎。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述的控制释放配方包括至少一种脂质体、微球体或固体-脂质纳米颗粒。

21.一种治疗哺乳动物关节炎的方法，包括使用治疗有效量的氨基糖作为脂质体配方。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述的脂质体配方包括一种或多种选自二硬脂酰L-α-磷脂酰胆碱、二硬脂酰L-α-磷脂酰-乙醇胺、与甲氧基聚乙二醇、二硬脂酰L-α-磷脂酰-DL-甘油和二棕榈酰L-α-磷脂酰-L-丝氨酸共扼的二硬脂酰L-α-磷脂酰乙醇胺的脂质。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述的脂质体配方缓解疼痛。

24.一种治疗哺乳动物关节炎的方法，包括关节内注射治疗有效量的N-乙酰葡糖胺作为脂质体配方，其中所述的脂质体含有二硬脂酰L-α-磷脂酰胆碱、二硬脂酰L-α-磷脂酰-乙醇胺、与甲氧基聚乙二醇、二硬脂酰L-α-磷脂酰-DL-甘油或二棕榈酰L-α-磷脂酰-L-丝氨酸或其任何结合共扼的二硬脂酰L-α-磷脂酰乙醇胺。

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