CN1903191A - 青蒿琥酯在制备抗肝纤维化制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及青蒿琥酯在制备抗肝纤维化制剂中的应用，属于有机有效成分是内酯类的医药配制品的用途。本发明提供的青蒿琥酯对不同原因的肝纤维化有防治作用，并减轻过氧化损伤，无肝毒性；青蒿琥酯能抑制肝星状细胞增殖、阻止其由G0/G1向S期进展，诱导活化的肝星状细胞凋亡，降低胶原分泌和脂质过氧化作用，且无细胞毒活性，可用于防治肝纤维化，抑制肝纤维化—肝硬化—肝癌的病理过程。本发明为发现新的原理和药物作用靶点提供重要依据，为青蒿素类药物的新用途开发提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及有机有效成分是内酯类的医药配制品的用途，具体是一种青蒿琥酯在制备抗肝纤维化制剂中的应用。
背景技术
肝纤维化存在于一切慢性肝病的发病过程中，是慢性肝病的特征性变化，其结局是肝硬化和肝癌，严重影响民众健康。据统计，慢性乙型、丙型病毒性肝炎患者中1/3可转化为肝硬化，后者的1/3可转化为肝癌；酒精性肝病、血吸虫病以及其它原因的慢性肝病使肝纤维化的发生率增高。一般认为肝纤维化是可以逆转的，而肝硬化则否。因而阻断了肝纤维化向肝硬化及肝癌的发病过程，但迄今为止未见确有疗效的抗肝纤维，化药物。
肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝脏细胞外基质的主要来源，肝脏的炎症、损伤等各种因素均可使HSC活化，HSC的活化是肝纤维化的核心。抑制HSC的活化即可使细胞外基质生成减少，诱导活化的HSC凋亡等于消除了细胞外基质的来源，这就从不同环节阻断了肝纤维化的发生。
1970年代我国科学家首次从黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离鉴定出抗疟有效成分青蒿素，为一种新型的倍半萜内酯。其后人工合成了蒿甲醚、二氢青蒿素、青蒿琥酯等衍生物。青蒿琥酯(artesunate)是青蒿素的水溶性衍生物，蒿甲醚是青蒿素的脂溶性衍生物，双氢青蒿素是青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚的活性代谢产物，已作为我国开发的抗疟新药。
青蒿琥酯对红细胞内期滋养体有杀灭作用，作用机制与青蒿素相同，即可能是血红素或Fe2+催化青蒿琥酯(青蒿素)形成自由基破坏疟原虫表膜和线粒体结构，导致疟原虫死亡，作为起效快、疗效确切、副作用小的新型抗疟药，青蒿素用于治疗间日疟和恶性疟。青蒿琥酯抗疟效果强于青蒿素，近期复发率比青蒿素低，主要用于脑型疟和各种危重疟疾的抢救，并可用于预防血吸虫病。
中国专利85 1 00781 A公开了“抗疟药物青蒿酯及其制备方法”，其是由二氢青蒿素与琥珀酸酐在氯仿溶液中，在弱碱性物质的催化下，经酯化反应生成。其抗疟活性是青蒿素的5倍，可制成水溶性制剂。
《中国药理学报》1987；8(1)：72-76以“青蒿素丁二酸酯钠对小鼠脾细胞[3H]尿核苷掺入及细胞膜的作用”为题，报道了青蒿琥酯能抑制小鼠纤维母细胞的[3H]UR渗入。
《医学研究通讯》1998；27(2)：417-8报道了“青蒿素对实验性矽肺预防、病后治疗观察”，介绍了蒿甲醚50mg腹腔注射或灌胃对实验性矽肺有预防及病后早期治疗作用，能使肺重、肺胶原、肺组织矽含量显著降低。
《重庆医科大学学报》1998；23(3)260-262“青蒿素局部治疗增殖性瘢痕临床观测”，介绍了青蒿素局部用于烧伤后增生性瘢痕，治疗后瘢痕厚度及硬度显著降低。
《Int J Oncol》(国际肿瘤学杂志)2001，18(4)：767-73介绍了青蒿素及其衍生物对白血病、结肠癌等多种肿瘤细胞株有抑制作用。
《Blood Cells Mol Dis》(血液细胞分子疾病)2002，28(2)：160-168报告了青蒿琥酯诱导肝癌细胞HepG2株凋亡。
青蒿琥酯，化学名为二氢青蒿素-12-α-琥珀酸单酯，分子式为C19O8H28，分子量是384.4 3，结构式见图1，是一种新型的具有倍半萜内酯结构的抗疟药青蒿素的衍生物，分子内存在过氧基团。
青蒿琥酯为无色结晶或白色结晶性粉末，无臭，几乎无味。略溶于水，易溶于乙醇、丙酮、氯仿。熔点131℃～136℃，比旋度+10～+14，酸碱度pH 3.5～5.5。
青蒿琥酯的结构式：
发明内容
本发明就是为了解决当今临床上治疗肝纤维化药物贫乏和治疗效果不理想的问题，而提供一种用于防治或逆转肝纤维化的青蒿琥酯在制备抗肝纤维化制剂中的应用。
本发明的医药新用途是：
1.青蒿琥酯在制备抗肝纤维化制剂中的应用。
2.青蒿琥酯在制备对四氯化碳复合因素所致肝纤维化防治作用制剂中的应用。
3.青蒿琥酯在制备对牛血清白蛋白免疫性肝纤维化的防治作用制剂中的应。
4.青蒿琥酯在制备抑制大鼠肝星状细胞增殖、调节肝星状细胞周期和诱导肝星状细胞凋亡制剂中的应用。
本发明证实了青蒿琥酯有抗肝纤维化的作用并初步探讨了其作用机制。研究结果对肝纤维化的防治有重要价值。
青蒿琥酯的制备：青蒿琥酯是以二氢青蒿素和琥珀酸酐为原料，在氯仿溶剂中，在弱碱性介质三乙胺或碳酸氢钠存在下，酯化反应而成。反应路线参见图10。
使用方法：
青蒿琥酯用于防治或逆转实验性肝纤维化，采用口服给药。
对四氯化碳复合因素所致肝纤维化，使用28.8mg青蒿琥酯/kg体重，每日一次，用药44天；
对牛血清白蛋白免疫性肝纤维化，使用18.75mg青蒿琥酯/kg体重，每日一次，用药6周；
毒副作用：青蒿琥酯及其制剂对肝功能无不良影响；并对肝星状细胞无细胞毒作用。
药理作用：青蒿琥酯能有效的降低模型大鼠的脂质过氧化物水平，在明显抑制肝星状细胞增殖、阻止肝星状细胞由G0/G1期进入S期、诱导活化的肝星状细胞凋亡的同时，显著降低肝星状细胞分泌羟脯氨酸水平及脂质过氧化物含量。
一.青蒿琥酯对四氯化碳复合因素所致肝纤维化的防治作用的体内实验：
采用Wistar大鼠，清洁级，雌雄各半，饲养于清洁级动物室。青蒿琥酯原料药由桂林南药股份有限公司提供。秋水仙碱为Sigma公司产品。羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)(AR，上海康达氨基酸厂，批号920506)。其它试剂为市售分析纯试剂。
参照韩德五的方法(“葫芦素B对实验型肝炎与肝硬变的防治作用”《中华医学杂志》，1979；59(4)：206-9)，以四氯化碳复合因素造模。分别对雄性和雌性大鼠按体重随机区组法分组。设大、中、小剂量的青蒿琥酯用药组(5.75mmol·L-1，1.92mmol·L-1，0.64mmol·L-1)，同时设正常对照，模型对照(灌胃等体积的蒸馏水)，秋水仙碱对照组。预防性用药。肝组织Hyp检测按Jamall等的方法(Jamall IS，Finelli VN，QueHee SS.A simple method to determine nanogram levels of 4-hydroxyprolinein biological tissues.Analytical Biochemistry，1981；112(1)：70～5)。常规制备肝组织石蜡切片，HE染色、胶原纤维染色(Masson结缔组织三合染色)。纤维化程度判别，根据Scheuer分期(Scheuer PJ.Classification of chronicviral hepatitis：a need for reassessment.J Hepatol，1991；13(3)：372～4)。脂质过氧化物(lipid peroxide，LPO)的测定方法：(Yagi K.A simplefluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma.Biochem Med，1976，15，212～6)。
统计分析：计量资料用单因素方差分析，方差齐性时用Tukey检验，方差不齐时用Tamhane’s检验；等级资料用Ridit分析。
病理形态学观察：模型对照组鼠肝汇管区纤维结缔组织增生，并向肝小叶内延伸。把肝小叶分隔成许多大小不等的肝细胞岛，部分形成假小叶，增生的纤维组织内见炎症细胞浸润，肝细胞胞浆疏松、气球样变及脂肪样变；青蒿琥酯用药组肝汇管区纤维组织较少，小叶内纤维隔薄，且向小叶内伸展浅，纤维组织内炎症细胞较少，肝细胞变性减轻，随用药剂量增大，肝纤维变性减轻更明显。模型对照组肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量显著高于正常对照组(P＜0.01)，青蒿琥酯高剂量组明显低于模型对照组(P＜0.05)；青蒿琥酯高、中剂量组的肝纤维化程度明显低于模型对照组(P＜0.05)。青蒿琥酯高剂量组和秋水仙碱组大鼠血清脂质过氧化物(LPO)明显低于模型对照组(P＜0.01)。
表1.青蒿琥酯对四氯化碳所致肝纤维化肝组织Hyp含量、纤维化程度、血清LPO的影响
| n | Hyp | 肝胶原纤维半定量结果 | LPO(μmol/L) | ||||||
| ( x±s.μg/g(liver)) | - | + | ++ | +++ | ++++ | u值 | |||
| 正常对照组模型对照组青蒿琥酯高剂量组(28.8mg/kg)青蒿琥酯中剂量组(9.6mg/kg)青蒿琥酯低剂量组(3.2mg/kg)秋水仙碱组(0.1mg/kg) | 575777 | 79.97±27.08190.57±45.86**113.20±45.11##155.88±18.59172.22±25.84152.56±34.79 | 53111 | 11322 | 21233 | 3111 | 1 | 2.96**2.54#2.18# | 7.70±0.679.72±1.796.76±1.47##8.06±1.258.34±0.506.19±1.33## |
与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。胶原纤维增生程度，多组比较的Ridit分析，χ2＝18.73，P＜0.05。
按本领域技术人员公知的方法将本发明药物制备成片剂，采用预防性经口给药44天，28.8mg青蒿琥酯/kg有明显的抗肝纤维化作用，疗效在一定程度上优于0.1mg秋水仙碱/kg(用LSD检验时，P＜0.05)；9.6mg青蒿琥酯/kg亦有一定效果。
青蒿琥酯有抗四氯化碳复合因素所致肝纤维化大鼠的脂质过氧化损伤的作用。
二.青蒿琥酯对牛血清白蛋白免疫性肝纤维化防治作用的体内实验
采用Wistar大鼠，清洁级，雌性，饲养于清洁级动物室。青蒿琥酯原料药由桂林南药股份有限公司提供。牛血清白蛋白(BSA)：电泳纯，北京双螺旋微生物培养基制品厂，批号20030310。弗氏不完全佐剂：羊毛脂(化学纯)50g，液体石蜡(分析纯)100ml(均购自天津化学试剂二厂)，加热至70度混匀，高压灭菌，室温存放。丙氨酸氨基转移酶和天门冬酸氨基转移酶试剂盒，北京北化康泰临床试剂有限公司，批号040408。总蛋白和白蛋白试剂盒，北京北化康泰临床试剂有限公司，批号031215。其它试剂为市售分析纯试剂。
参照方步武的方法(“益气活血合剂抗牛血清白蛋白免疫性肝纤维化作用的实验研究”，《(中国中西医结合杂志》，1992，12(12)：738-740)造模：以牛血清白蛋白福氏不完全佐剂的乳化液皮下多点注射免疫大鼠(共5次)，对血清抗牛血清白蛋白抗体阳性的大鼠于尾静脉攻击注射牛血清白蛋白(剂量递增，共10次)。攻击注射2次后，将大鼠按体重随机区组法分为模型对照组(对照组)和青蒿琥酯治疗组(治疗组)。治疗组灌胃青蒿琥酯(采用人的等效剂量，即3.75mg/200g)至停止攻击注射后2周，同时设正常对照，模型对照组(灌胃等体积的蒸馏水)。按试剂盒说明书的方法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬酸氨基转移酶(AST)、总蛋白、白蛋白。其它方法与实施例1相同。
青蒿琥酯对肝组织形态学的影响：正常对照组，鼠肝汇管区纤维组织少，肝板以中央静脉为中心呈条索状向四周放射样排列整齐，肝细胞结构正常；模型对照组肝小叶结构破坏，纤维结缔组织增生，形成假小叶，可见残存的肝细胞团，增生的纤维组织中有炎症细胞浸润，肝细胞不同程度增生，增生的纤维组织附近，可见界板肝细胞核固缩、破裂、溶解。青蒿琥酯治疗组多数大鼠肝汇管区有少量胶原纤维，小叶间少见胶原纤维，增生的纤维组织内炎症细胞少，肝细胞无明显增生。各组肝纤维化程度见表2，青蒿琥酯治疗组的肝纤维化程度明显低于模型对照组(P＜0.01)，青蒿琥酯治疗组明显低于模型对照组(P＜0.01)。青蒿琥酯治疗组大鼠血清LPO明显低于模型对照组(P＜0.05)，见表2。模型对照组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)明显高于正常对照组(P＜0.01)，青蒿琥酯治疗组大鼠血清ALT明显低于模型对照组(P＜0.01)，肝功能的其他指标(天门冬酸氨基转移酶、总蛋白、白蛋白)在三组间差异无统计学意义。
表2.青蒿琥酯对免疫性肝纤维化鼠肝组织Hyp含量、纤维化程度、血清LPO的影响
| n | Hyp | 肝胶原纤维半定量结果 | LPO(μmol/L) | ||||||
| ( x±s，mg/g(liver)) | - | + | ++ | +++ | ++++ | u值 | |||
| 正常对照组模型对照组青蒿琥酯治疗组(18.75mg/kg) | 678 | 0.498±0.1801.742±0.895**0.602±0.325## | 61 | 14 | 13 | 2 | 3 | 3.11**2.57# | 6.228±0.8988.198±0.729*5.458±1.645# |
与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。胶原纤维增生程度，多组比较的Ridit分析，x2＝15.02，P＜0.01。
表3.青蒿琥酯对免疫性肝纤维化大鼠肝功能的影响
| n | ALT | AST | 总蛋白(g/L) | 白蛋白(g/L) | 白/球蛋白比值 | |
| 正常对照组模型对照组青蒿琥酯治疗组 | 666 | 21.8389±3.86030.6404±3.591*22.3211±5.540# | 173.6323±4.062184.5164±15.073177.3489±15.903 | 84.7179±3.54585.1487±9.46680.7243±9.639 | 40.3527±0.93738.5259±3.12338.4213±6.996 | 0.9160±0.0920.8388±0.1830.9242±0.183 |
与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.01
按本领域技术人员公知的方法将本发明药物制备成片剂，防治性经口给药6周，18.75mg青蒿琥酯/kg有明显的抗大鼠免疫性肝纤维化的作用，同时能降低该模型大鼠的脂质过氧化损伤，可降低肝纤维化大鼠血清丙氨酸氨基转移酶，对其它肝功能指标无不良影响。
三.青蒿琥酯抑制大鼠肝星状细胞增殖、调节肝星状细胞周期和诱导肝星状细胞凋亡的体外实验
采用肝星状细胞系HSC-T6(由上海中医药大学徐列明教授提供)，为猴病毒40(SV40)转染的SD大鼠肝星状细胞(HSC)，其表现型为活化的HSC，可表达高水平的I型胶原。青蒿琥酯粉针剂由桂林南药股份有限公司提供。主要试剂：DMEM全培养基，L-谷氨酰胺，HEPES，胰蛋白酶，碘化丙啶(PI)，均为GIBCO产品，秋水仙碱为Sigma产品，均由联星天津生物技术有限公司进口分装；国产优质胎牛血清由联星天津生物技术有限公司提供。羟脯氨酸测定试剂盒(批号20050307)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号20041026)均为南京建成生物工程研究所产品。主要仪器：CO2孵箱，美国NAPCO(series 5400)；全自动酶标仪，奥地利TECAN公司；倒置显微镜，日本OLYMPUS；离心机，1380型低速自动平衡离心机；细胞计数板，上海求精生化仪器厂；流式细胞仪，美国Beckman CoulterEPICS-XL；凝胶成像分析仪，美国Rodak 440CF型产品。
1.基本方法
(1)培养液的配制：DMEM低糖全培养液含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1％L-谷氨酰胺。(2)0.25％胰酶消化液：NaCl8g KCl 3.2g Na2HPO4 0.2g KH2PO4 0.2g加水溶解，再加胰酶2.5g定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤除菌。(3)青蒿琥酯的配制：称取10mg青蒿琥酯加入500μl 5％NaHCO3完全溶解后，加DMEM培养液定容至5ml，即终浓度为2mg/ml。用时用全培养液稀释至所需的浓度。(4)培养条件：所有细胞均在37℃，5％CO2的培养箱中培养。(5)细胞传代：镜下观察细胞密度约80％时，弃去旧的培养液，加入2ml 0.25％胰蛋白酶，镜下观察细胞回缩，胞体趋于变圆，细胞间隙扩大后，立即翻转培养瓶，弃去消化液，加入1ml全培养液终止消化，倒掉，加入2～3ml全培养液，用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁细胞成细胞悬液，完全培养液调整细胞浓度，以1×105/ml传代。(6)细胞收集：按传代方法，常规消化细胞，将细胞悬液移入无菌离心管中，室温下1900r/min离心5分钟，弃上清即得。(7)细胞冻存：常规消化细胞，1900r/min离心5分钟弃上清，依所需体积量配制细胞冻存液(70％DMEM培养液、20％胎牛血清、10％二甲基亚砜)重悬细胞沉淀，分装至冻存管，放入-80℃冰箱短期保存。(8)在倒置显微镜下进行细胞观察。
2.主要方法：
(1)HSC-T6生长曲线的绘制：细胞以1×105/ml密度接种于24孔细胞培养板。实验第二天起，每隔12小时检测每孔细胞数，每次数3个孔，并计算平均值，直至结束，根据记录绘制细胞生长曲线。
(2)MTT比色法测定细胞抑制率：用5％无酚红1640全培养液将细胞密度调整为1×105/ml后接种于3块9 6孔培养板中100μl/孔，24小时后换不同浓度药物(青蒿琥酯终浓度为1.5，3.125，6.25，12.5，25，50，100μg/ml)的5％无酚红1640全培养液200μl/孔，每组设6复孔，培养至24、48、72小时，终止培养前4小时加MTT(5mg/ml，以PBS(0.01mol/L，pH 7.4)溶解)20μl/孔，弃上清液加入DMSO100μl/孔，震荡混匀，于酶标仪570nm处测定各孔吸光度值(A值)。抑制率＝(1-药物组A值/对照组A值)×100％
(3)流式细胞仪测细胞周期的方法
将1×105/ml细胞接种于50ml的培养瓶中，待细胞汇合约70％时换无血清的DMEM培养液培养18小时使细胞同步化；再换含不同浓度药物(青蒿琥酯浓度6.25，25，50μg/ml，秋水仙碱浓度6.25μg/ml)的全培养液，对照组加入等量的药物溶剂，每组设3复瓶，继续培养48小时收集细胞；用PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗涤细胞一遍，用0.5ml PBS悬浮细胞，吹散使之成单细胞悬液，将其滴入4ml 95％冷乙醇中，边滴边混匀，4℃固定24小时，再用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)洗一遍；细胞计数，加入碘化丙啶(50μg/ml，含RNAase 100μg/ml)，使细胞终浓度大于1×106/ml，室温避光染色20分钟，上机检测。以PI染色荧光强度(DNA)的不同，将细胞分为G0/G1期、S期、G2/M期，并计算出各期细胞的百分比。
(4)梯状DNA检测
①提取细胞DNA：以1×105/ml细胞接种于50ml的培养瓶中，待细胞汇合约80％时，分别用含不同浓度(0μg/ml、50μg/ml、200μg/ml)青蒿琥酯刺激HSC，24小时后收集细胞按基因组DNA提取试剂盒操作说明书进行。②走胶：配胶：称1.3g琼脂糖溶于100ml 0.5×TBE溶液中，微波加热使其完全溶解，待琼脂糖冷却至60℃左右，加入溴化乙锭(EB，10mg/ml)2.5μl，使其终浓度为0.5μg/μl充分混匀。制胶：洗净凝胶槽凉干，用琼脂糖凝胶灌入下槽与橡胶框的缝隙，水平放置在工作台上，待刚倒入的琼脂糖完全凝固后，在凝胶槽中插好梳子，再将温热的凝胶倒入槽中，厚度约为梳齿高度的2/3处。室温下凝固拔去梳子，将其放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳液，使液面没过胶面1mm即可。③电泳：将DNA提取物与1/10体积的上样缓冲液混合，上样。一侧梳孔内加入7μlDNA marker，70V稳压直流电泳，2小时。结果经凝胶成像系统分析。
3.其它：羟脯氨酸和乳酸脱氢酶测定按试剂盒说明书的方法。
倒置显微镜下观察传代后的HSC，3小时(h)后可见细胞陆续贴壁，呈不规则梭形、星形，有伪足；随着培养时间的延长，细胞逐渐排列紧密。青蒿琥酯(25μg/ml)处理18h后可见部分细胞逐渐变圆，折光性增强，随着时间的延长变圆的细胞越来越多，且排列疏松，呈分离状态，漂浮细胞增加。通过绘制HSC-T6生长曲线而得出HSC-T6的对数生长期，取对数生长期的细胞进行下述实验。青蒿琥酯(1.5μg/ml～100μg/ml)作用24h～72h对HSC-T6呈剂量和时间依赖性地抑制，抑制率30％～60％，100μg/ml和50μg/ml青蒿琥酯对HSC-T6的抑制作用最强，见表4。青蒿琥酯作用于HSC-T6后，培养上清液中羟脯氨酸(Hyp)含量随青蒿琥酯(12.5μg/ml～100μg/ml)用量增大和作用时间延长(24h～48h)而明显降低(P＜0.05)，见表5。采用流式细胞技术研究发现：青蒿琥酯(12.5μg/ml～50μg/ml)使HSC-T6处于细胞G0/G1期比例随着剂量的增大而逐渐增高，与正常对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05)，处于S期的比例则逐渐降低，秋水仙碱的这些作用与青蒿琥酯相似，见表6。但是青蒿琥酯并不使HSC-T6培养上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性增高，其水平与空白对照组很接近(P＞0.05)，秋水仙碱则使培养上清液LDH的活性显著升高(P＜0.01)，见表7。青蒿琥酯对HSC-T6作用48h后的细胞基因组DNA凝胶电泳，显示50μg/ml青蒿琥酯组有明显的凋亡HSC-T6的DNA梯形条带。
表4.不同浓度的青蒿琥酯刺激不同时间后对HSC-T6的抑制作用
| 青蒿琥酯 | 药物刺激12h(A) | 抑制率(％) | 药物刺激24h(A) | 抑制率(％) | 药物刺激36h(A) | 抑制率(％) |
| 100μg/ml50μg/ml25μg/ml12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml1.56μg/ml | 0.6770±0.0290.7035±0.0390.7245±0.0230.7265±0.0350.7428±0.0340.7665±0.0540.7810±0.021 | 15.8712.589.989.737.704.762.96 | 0.8562±0.0340.8778±0.0560.8735±0.0360.8875±0.0720.8960±0.0480.8932±0.0320.9502±0.065 | 26.1624.2924.6623.4922.7322.9618.09 | 0.7933±0.0380.8140±0.0500.9182±0.0500.9637±0.0411.0458±0.0741.1105±0.0841.1867±0.064 | 54.2553.0647.0844.4639.6835.9631.56 |
表5.不同浓度的青蒿琥酯刺激不同时间后对HSC-T6分泌胶原的影响
| 剂量 | n | Hyp( x±s，μg/ml) | |
| 培养24h | 48h | ||
| 药物空白对照组青蒿琥酯组1.5μg/ml3.125μg/ml6.25μg/ml12.5μg/ml25μg/ml50μg/ml100μg/ml | 66666666 | 10.403±0.017bcde10.372±0.012bcde10.386±0.145bcde10.372±0.124bcde10.208±0.107acde9.091±0.583abde8.443±0.482abce8.091±0.017abcd | 14.559±0.121bcde14.518±0.108bcde14.516±0.080bcde14.509±0.148bcde11.322±0.545acde10.575±0.142abde10.109±0.112abce8.550±0.089abcd |
a，b，c，d，e示分别与药物空白组，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml青蒿琥酯组比较，均为P＜0.05
表6.青蒿琥酯对HSC-T6细胞周期的影响
| 剂量 | G0/G1期 | S期 | G2/M期 | |
| 药物空白对照组青蒿琥酯组秋水仙碱组 | 12.5μg/ml25μg/ml50μg/ml6.25μg/ml | 56.2±1.364.6±2.5*67.5±1.9*72.6±2.3*69.7±2.4* | 27.1±2.618.4±3.8*16.3±3.4*13.8±4.1*19.4±1.8* | 15.7±4.217.3±2.514.9±6.115.2±5.611.3±3.7 |
与药物空白对照组比较，*P＜0.05
表7.青蒿琥酯对HSC-T6细胞代谢活性的影响
| 剂量 | n | LDH(U/L) | |
| 药物空白对照组青蒿琥酯组秋水仙碱组 | 12.5μg/ml25μg/ml50μg/ml100μg/ml3.125μg/ml6.25μg/ml12.5μg/ml | 66666666 | 561.16±41.3567.26±32.27#588.40±21.75#595.65±41.83#631.15±72.21#1344.26±39.87*1415.32±44.52*1439.88±69.35* |
与药物空白对照组比较，*P＜0.01；与秋水仙碱组比较，#P＜0.01
本发明具有以下优点：
(1)首次提出青蒿琥酯具有抗肝纤维化的作用，并将青蒿琥酯用于不同病因所致肝纤维化的药物治疗。
(2)本发明为将青蒿素类药物开发成为抗肝纤维化药物提供药效学及作用机制的研究依据，具有将青蒿素类药物开发成为抗肝纤维化甚至预防肝癌发生等类药物的价值。
(3)本发明以肝纤维化形成的原理为背景，研究并阐明中药有效单体成分作用和机制，是发展中医药理论的重要方向，为发现新的作用原理和药物作用的新靶点提供重要依据。
附图说明
图1正常大鼠对照组肝组织Masson染色10×10
图2CCl4致大鼠肝纤维化模型对照组肝组织Masson染色10×10
图3AS高剂量(28.8mg/kg)对CCl4致肝纤维化的作用肝组织Masson染色10×10
图4AS中剂量(9.6mg/kg)对CCl4致肝纤维化的作用肝组织Masson染色10×10
图5A正常大鼠肝组织HE染色10×7.5
图5B正常大鼠肝组织Masson染色10×7.5
图6A免疫性肝纤维化大鼠肝组织HE染色10×7.5
图6B免疫性肝纤维化大鼠肝组织Masson染色10×7.5
图7A青蒿琥酯治疗6周的免疫性肝纤维化大鼠肝组织HE染色10×7.5
图7B青蒿琥酯治疗6周的免疫性肝纤维化大鼠肝组织Masson染色10×7.5
图8A培养液对照的HSC-T6传代24小时10×20
图8B传代24小时后，以25μg/ml青蒿琥酯作用HSC-T6后18小时10×20
图8C培养液对照的HSC-T6传代42小时10×20
图8D传代24小时后，以25μg/ml青蒿琥酯作用HSC-T6后24小时10×20
图9HSC-T6的DNA凝胶电泳
图10是由二氢青蒿素(I)和琥珀酸酐为原料制备青蒿琥酯(II)的反应路线。
具体实施方式
实施例1：
按本领域技术人员公知的方法将本发明药物制备成片剂，能呈剂量依赖性地和时间依赖性地抑制HSC增殖，而且对HSC无细胞毒性，阳性对照药秋水仙碱虽能抑制HSC增殖但对HSC有明显的细胞毒性；同时青蒿琥酯能明显降低HSC培养上清液中的羟脯氨酸的含量；青蒿琥酯能阻止HSC由G0/G1期进入S期，而对G2/M期无影响；青蒿琥酯能诱导活化的肝星状细胞凋亡。
青蒿琥酯片剂：每片含青蒿琥酯50.00mg，微晶纤维素92.75mg，淀粉13.25mg，无水乳糖105.69mg，硬脂酸镁2.65mg，二氧化硅0.66mg。
采用直接压片法制成片剂。用法：每次1片，每日2-3次。每周用药5-6天，每3-4周为一疗程。孕妇禁用。用药期间定期检查网织红细胞。
实施例2：
按本领域技术人员公知的方法将本发明药物制备成青蒿琥酯注射剂：在无菌条件下，以二氢青蒿素和琥珀酸酐为原料，在氯仿溶剂中，在弱碱性介质三乙胺或碳酸氢钠存在下，经酯化反应，制成青蒿琥酯，用乙醇重结晶，粉碎，得无菌粉末，在无菌室内按无菌操作法分装，每支60mg。用时以5％碳酸氢钠0.6ml溶解，然后加5.4ml生理盐水稀释，缓慢静脉注射或肌肉注射。孕妇禁用。用药期间定期检查网织红细胞。
实施例3：
按本领域技术人员公知的方法将本发明药物制备成青蒿琥酯栓剂:
青蒿琥酯5g，5％NaHCO3 50ml(溶解青蒿琥酯)，甘油35g，普流罗尼(F68)10g，硬脂酸适量，可制成50粒。
用法：每次1粒，每日1-2次，塞入肛内。每周用药5-6天，每3-4周为一疗程。孕妇禁用。用药期间定期检查网织红细胞。
栓剂使用安全方便，减少或避免了肠肝循环。
实施例4：
按本领域技术人员公知的方法将本发明药物制备成青蒿琥酯皮肤擦剂：将青蒿琥酯溶于苯二甲酸二甲酯，加渗透促进剂氮酮5.63ml及丙二醇4.83ml(此二者终浓度均为5％)，以苯二甲酸二甲酯补充其体积至100ml，青蒿琥酯浓度为10mg/ml-15mg/ml。
用法：于背部或腹部皮肤10cm×10cm面积涂抹青蒿琥酯皮肤擦剂，每公斤体重用药1ml，每日用药1次，每周用药5-6天，每3-4周为一疗程。孕妇禁用。用药期间定期检查网织红细胞。
Claims (4)
1.青蒿琥酯在制备抗肝纤维化制剂中的应用。
2.青蒿琥酯在制备对四氯化碳复合因素所致肝纤维化防治作用制剂中的应用。
3.青蒿琥酯在制备对牛血清白蛋白免疫性肝纤维化的防治作用制剂中的应用。
4.青蒿琥酯在制备抑制大鼠肝星状细胞增殖、调节肝星状细胞周期和诱导肝星状细胞凋亡制剂中的应用。
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