CN1116879C - 注射用复方胰核糖核酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种注射用复方胰核糖核酸的制备方法，它是以牛胰脏为原料，先后经过前处理，匀浆，提取，除蛋白，沉淀，纯化，除菌，过滤和冻干等程序制成，含有胰核糖核酸，硒和脾细胞内转移因子，具有抗癌，抗衰老和增强免疫功能，配合手术，本药物和中药，疗效显著，减轻放，化疗的毒副反应，能使癌细胞引起空泡样变性，癌细胞溶解，液化性坏死，在其周围大量增生纤维芽细胞，巨噬细胞和淋巴细胞，以结缔组织代替癌组织。

Description

注射用复方胰核糖核酸的制备方法

本发明涉及一种抗癌，抗衰老新生化药物的制备方法，尤其是涉及一种利用牛胰脏组织制备抗癌、抗衰老药物的制备方法。

目前有一种利用猪肝和牛肝制做的抗癌药物—肝核糖核酸，包括如下制做步骤：

选择健康的猪肝和牛肝，用生理盐水洗净，切成块状，并加入氯化钠—柠檬酸三钠，聚乙烯硫酸酯缓冲液，用组织捣碎机捣成匀浆，再用离心机进行分离。

取离心清液，加入三乙醇胺，十二烷基磺酸钠，乙二胺四乙酸二钠，搅拌均匀后，加入0.2％8羟基喹啉—苯酚和氯仿，于常温下振荡30分钟，再用离心机进行分离提取。

在离心清液中加入等量氯仿，振摇，2至3次，反复除蛋白，至中间无明显蛋白层为止，再用离心机进行分离。

向上清液中加入乙酸钾和无水乙醇，在温度为0℃的情况下静置1小时，再用离心机进行分离，得白色沉殿物。

弃去离心上清液，将白色沉淀物溶解于乙二胺四乙酸二钠—乙酸钠溶液中，加入等体积的磷酸氢二钾，在不断地搅拌情况下，再加入等体积的乙二醇甲醚，放置0.5小时，放置温度为0℃，再用离心机进行分离，以除去糖元。

离心上清液在温度为0℃的条件下，边搅拌边加入等体积0.2摩尔/升的乙酸钠溶液和十六烷基三甲基溴化铵，随之放置0.5小时，其温度为0℃，再用离心机进行络合。

用乙酸钠溶液和乙醇对上述沉淀物反复洗涤五次，以无泡沫为止。

将上述沉淀物溶解于乙二胺四乙酸二钠之中，最后对其进行除菌，过滤，测定含量，无菌分装和冻干即可。

上述药物主要用于各种肝脏疾病，提高免疫能力，其存在如下缺点：其制做步骤，工艺条件和流程复杂，如需要经过除糖元，络合过程，必需加入核糖核酸酶抑制剂，如若不加入酶抑制剂，则无抗肿瘤作用，疗效低，疗效率为39-50％，所选用的化学试剂配方，其离子强度超过0.05-0.2摩尔/升浓度范围，影响了对核糖核酸酶(RNase)的抵抗力，特别是影响了核糖核酸的结构与功能，提取核糖核酸的温度为常温，收率较低，仅以等量的氯仿做为除蛋白剂，据体外试验表明，均未见有抗肿瘤作用，上述除蛋白剂除能够除掉蛋白外，还影响核糖核酸抗癌有效组份的结构与功能。其二级结构被破坏，该药物只能用于治疗脏器仅具备专一性，用途单一，使用范围窄小。

本发明的目的在于克服上述现有技术中的缺点，提供一种具有抗癌，抗衰老，增强机体免疫功能的注射用复方胰核糖核酸的制备方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：首先剥去新鲜健康的牛胰脏组织被膜和脂肪组织，称取1公斤牛胰脏组织，放入0.3％十二烷基硫酸钠缓冲液中进行清洗，以洗净为止，其用量为每1公斤牛胰脏放入2倍体积的0.3％十二烷基硫酸钠缓冲液2000毫升，所述0.3％十二烷基硫酸钠缓冲液，其配制方法为：称取十二烷基硫酸钠24克，放入配制试剂容器内，同时加入氯化钠72克和亚硒酸钠3克，随之加入去离子水5000毫升，其水温为60℃，待其完全溶解后，再加入浓度为2.5摩尔/升，PH值为5.1的乙酸钠溶液32毫升，最后，再加入去离子水至8000毫升，PH值为6.5-7.0，备用，将清洗干净的牛胰脏组织放入研磨机内，经过粗、细2次研磨，使牛胰脏组织细胞破裂为止，制得牛胰脏组织匀浆液，将牛胰脏组织匀浆液置入水浴中，并加入6倍体积0.3％十二烷基硫酸钠缓冲剂6000毫升，其PH值6.5-7.0，经混摇使其充分混合，其温度为58℃，边混摇边放入5倍体积的0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液5000毫升和氯仿1500毫升，经振荡机上的恒温流水管，其恒温温度为58℃，在恒温流水中振荡20分钟，振荡次数120次/分，随之经冷却流水进行冷却，当冷却温度达到18℃时为止，冷却时间为20分钟，再经过大容量离心机进行分离，其转数为3000转/分，时间为20分钟，利用真空泵吸取上清液，弃去沉淀物，所述0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液，配制方法为：称取再蒸馏的苯酚9000克放入容器内，水浴温度为58℃，随之加入去离子水1000毫升，水浴温度为60℃，已经过再蒸馏的苯酚溶解后，再加入8羟基喹啉10克，便制得0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液备用，向被提取的牛胰脏组织，游离核蛋白体上清液中加入2/4体积的0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液2000毫升，同时加入1/4体积的氯仿加入量小于750毫升，再依次经过振荡机进行振荡和大容量离心机进行分离，其振荡次数为120次/分，振荡时间为20分钟，离心机转数为3000转/分，离心时间为20分钟，最后取其上清液，弃去沉淀物，如此反复按上述方法操作3次，吸取上清液，达到中间无蛋白层为止，汇集上述上清液，测量其上清液的总体积，并向其中加入将浓度2.5摩尔/升的乙酸钠溶液换算为浓度0.15摩尔/升的乙酸钠溶液，其PH值为5.1，经混摇后，加入2倍体积的98％乙醇，乙醇存放温度为-20℃，经混摇后，在夜间放置2-12小时，其温度为4℃，使粗胰核糖核酸进行沉殿，所述浓度2.5摩尔/升的乙酸钠溶液，其配制方法为：将无水乙酸钠205克(分子量为82.03)，放入配制试剂溶器内，随之加入去离子水500毫升，待无水乙酸钠完全溶解后，加入浓盐酸62.5毫升，再放入去离子水至1000毫升，经调制使其PH值达到5.1，便制得2.5摩尔/升乙酸钠溶液1000毫升，再经过分装，密封和高压灭菌，备用。所述98％乙醇的用量为10000毫升，保存温度为-20℃，备用，所述90％乙醇的用量为10000毫升，保存温度为-20℃，备用，将粗胰核糖核酸沉淀物移入大容量离心机内，离心机转数3000转/分，离心时间20分钟，弃去上清液，取其沉淀物加2倍体积的浓度为0.15摩尔/升乙酸钠溶液和2.5倍体积的90％乙醇溶液，经过混摇后，放置1小时，温度保持4℃，离心机转数3000转/分，离心时间20分钟，弃去上清液，取其沉淀物，如此反复按上述方法纯化三次，汇集沉淀物并存放于冰室内，冰室温度为-20℃，存放时间为48小时，存放的沉淀物数量达到批量生产时，移入冷冻机内，冷冻离心机转数为3500转/分，离心时间30分钟，弃去上清液，取其沉淀物硒化胰核糖核酸，再以牛脾透析24小时外液，即牛脾转移因子按60毫升/公斤牛胰脏组织比例进行溶解，随之对被提取的胰核糖核酸(RNA)含量，硒含量，脱氧核糖核酸(DNA)含量，紫外分光光度计波长A260/A280比值和热原试验进行测定，使硒化胰核糖核酸最终浓度被稀释为25毫克/毫升，最后经过除菌，过滤，分装和冻干程序，即被制成冻干粉针剂，50毫克复方胰核糖核酸/支。所述浓度0.15摩尔/升乙酸钠溶液，其配制方法为：取浓度为2.5摩尔/升，PH值5.1的乙酸钠溶液60毫升，再加入去离子水至1000毫升，便制得浓度为0.15摩尔/升乙酸钠溶液1000毫升，备用。

本发明经过对抑制动物体内实体瘤试验，对离体瘤细胞的杀伤作用试验和临床观察试验结果说明，本发明药物是由硒、核糖核酸和牛脾透析外液即转移因子三种成份组成，均在体内以生理性存在，是生命活动的极其重要的生物活性物质，是生命核心物质。从牛胰脏组织提取的硒化胰核糖核酸具有识别自己或非自己的能力，如同正常胰脏组织制造和分泌各种蛋白消化酶，脂肪消化酶，各种多糖消化酶至十二指肠内，对自己消化道组织的蛋白质、脂肪、糖类不进行消化，而只能对来自外部的饮食物中的蛋白质、脂肪、多糖类能够进行消化，还能将胰岛上皮细胞内分泌的胰岛素，直接进入血管内，调节血糖水平，进行醣代谢的功能，本发明药物肌肉注射后，经药代动力试验证明，进入一小时内，形成血液内高峰，并分布到各脏器组织细胞内。

本发明根据在体外培养的癌细胞内示踪试验证明，本发明药物可以进入癌细胞胞浆和核内(放射自显影法)，发挥其生物活性，抑制癌细胞脱氧核糖核酸(DNA)复制，导致癌细胞溶解，液化性坏死。根据³H-胸甙(³H-TDR)渗入率(放射自显影法)试验和³H胸甙(³H Thymidine utake)闪烁液试验(CPM计数)证明，体外96孔培养盘中培养癌细胞加入本发明药物培养8小时，每孔加入³H-胸甙0.5微居里/50微升，继续培养24小时，癌细胞脱氧胰核糖核酸(DNA)不能复制癌细胞，其死亡率为95-98％以上。本发明可抑制刀豆素A(ConA，蛋白)细胞分裂增生作用，根据体外试验证明，体外培养正常脾细胞5×10⁵毫升，加入刀豆素A 5微克，加入本发明药物50微克/毫升，培养8小时，加入10微居里/毫升³H-胸甙(³H thymidineuptake)培养24小时，本发明药物可以控制刀豆素A(ConA)对正常脾脏细胞迅速分裂增生作用，这说明本发明药物可以防止癌瘤的迅速扩散，本发明药物在使用剂量范围内，可以提高免疫功能和防御功能，根据动物NIH小鼠实体瘤的抑瘤试验与本发明药物注射第1周对照组T/B淋巴细胞比值倒置，第3周本药物治疗组末稍血像内T淋巴细胞/B淋巴细胞比值恢复正常(α-醋酸萘酯酯酶染色法)。本发明药物注射NIH带瘤小鼠的抑瘤实验证明，第一周，对照组和本发明药物治疗组的瘤块同样增大，从第二周开始用本发明药物治疗的治疗组的小鼠能吃、运动活泼，从第三周开始(对照组带瘤小鼠全部死亡)本发明药物治疗组实体瘤先软化，其体积逐渐缩小，有的癌瘤甚至用肉眼也看不到了，至18天时全摘出瘤块做病理组织标本，根据光镜观察效果显示，癌细胞引起空泡样变性，癌细胞溶解，液化性坏死，其周围大量增生纤维芽细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，毛细血管内皮细胞等，以结缔组织代替癌组织，说明本发明药物(硒化复方胰核糖核酸)在使用剂量范围内，具有能够识别癌细胞和正常细胞的能力，由于机体产生和纠正细胞基因表达紊乱，人体对癌瘤产生排斥、杀伤、溶解和吞噬作用，排除癌细胞的基因(DNA)不能再复制，瘤块体积遂渐缩小以致消失，具有相当大的抗癌功能，另一种试验所示，本发明药物注射第1周的带瘤NIH小鼠末销血像经α-醋酸萘酯酯酶染色法T、B淋巴细胞计数结果，其T/B淋巴细胞比值完全倒置，第三周经本发明药物治疗未稍血像T/B淋巴细胞比值恢复正常水平，说明本发明药物确有提高细胞免疫功能。本发明主要成份为硒化复方胰核糖核酸，其中硒在体内的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)为重要成份，起到抗氧化作用，硒也具有自己单独(非酶系列)的抗氧化作用，它能够分解和清除有害的自由基(体内代谢过程中产生的过氧化物或一些致癌物)，并分解为无毒的物质，保护细胞膜，线粒体膜、核膜，免受有毒的自由基如超氧化阴离子O₂ ^-，·OH，H₂O₂，脂质磷酸过氧化氢物等，这些过氧化物损伤细胞膜系统，对癌细胞选择性抑制癌细胞基因(DNA)的复制，抑制癌细胞的复制，刺激肿瘤坏死因子的产生，它们三者(硒，胰核糖核酸，牛脾透析外液)相互协同，相补相成识别癌细胞，杀伤癌细胞，溶解癌细胞，通过提高免疫和防御功能，分解和清除体内产生的有毒性的一些治癌物和溶解癌细胞坏死物，纠正基因表达紊乱，在体内外一定条件下，可以防止癌瘤的迅速扩散。

本发明药物具有抗衰老作用，硒对谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的调节是基因(DNA)水平上的调节，用分子杂交法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的信息核糖核酸(mRNA)，证明硒对谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的调节是细胞核外转录后调节，人体衰老的原因是随着年龄的增长而在体内物质代谢过程中产生的自由基和脂质过氧化物对生物膜的损伤作用，经过本发明药物治疗分解和清除过量产生的超氧化物阴离子自由基(O₂ ^-)自由基(·OH)，过氧化氢(H₂O₂)形成过氧化脂质，将沉积于细胞内和细胞间隙内脂褐素分解成最终产物丙二醛(MDA)，水(H₂O)过氧化氢(H₂O₂)还原为无毒的水(H₂O)和氧(O₂)而被清除，通过还原脂质过氧化物，以防止脂质过氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)的产生，从而保护和修补脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和免受各生物膜的损害，由此，防止和延缓细胞功能退化和衰老，而且可以控制由于一些致癌物因素引起的癌瘤发生和发展，可以在一定范围内调控基因表达紊乱，因此有的单用本药物的癌瘤病人也可以得到完全恢复，有的虽未完全恢复但可以延长生存时间，有的继续恶化以致于死亡，其原因是由患者的体内外各种因素决定，本药物经临床观察表明，具有抗癌，杀伤癌细胞，抑制DAN复制，增强免疫能力，用于各种消化道癌，胰腺体尾部癌，肺癌，乳腺癌，软组织肉瘤等，它是抗癌综合疗法之一，如配合手术，本药物，中药等疗效显著，减轻放，化疗的毒副作用。同时也具有抗衰老作用，经本药物治疗后，逐渐增加食欲，体重以及活动量，皮肤弹性增加，皮肤有光泽，脂褐素斑色素变淡或消失等，起到延缓衰老作用。

为表明本发明药物对癌瘤的治疗效果，进行了动物体内实体瘤试验，试验结果表明：

1.抑瘤率：注射本药物18天的给药组平均实体瘤瘤重(0.963±0.429g)，与只注射生理盐水的对照组实体瘤瘤组重(2.41±0.397g)相比减少非常显著(P＜0.01)，其抑瘤率为68.3％。

2.生命延长率：对照组小鼠一般在12-24天内全部死亡，在给药组，注射复方胰核糖核酸一周内与对照组一样其实体瘤仍然生长，注射本药物第二周后实体瘤体积开始缩小，到第三周时实体瘤逐渐消失，NIH小鼠的皮毛有光泽而紧贴在身上，运动活泼，90天生存者达76.7％，连续观察90天的给药组平均存活日数为72.8±3.1天，对照组的平均存活日数为15.4±4.1天，两组的差异非常显著(P＜0.01)，其生命延长率为372％。

3.带瘤小鼠的T、B淋巴细胞百分率变化，见表1。

用本药物注射带瘤小鼠，第一周内，带瘤小鼠的末稍血像内T、B淋巴细胞百分率的比值变为倒值[T/B淋巴细胞为13.8/86.2(％)]，但注射复方胰核糖核酸18天后的带瘤NIH小鼠T/B淋巴细胞百分率为72.6/27.4(％)，即注射复方胰核糖核酸三周以上生存者的细胞免疫功能基本恢复正常。

4.把抑瘤试验后的两组瘤组织块做成病理切片，观察比较其病理组织学上的变化，见图1-4，从图中可以看到，给药组瘤组织细胞呈空泡样变性和液化性坏死，周围有大量的成纤维细胞，巨噬细胞和淋巴细胞增生，甚至以结缔组织代替瘤组织。

备注：

(1)复方胰核糖核酸注射液

系为延边肿瘤医院肿癌研究室研制，用牛胰脏为原料，用SDS-热酚法提取的一种低分子复方胰核糖核酸。

(2)癌细胞株S 180 P388 HepG2

艾氏复水癌细胞(EC)等瘤细胞株由北京中国医学科学院药物研究所提供，将各瘤细胞培养7天接种于NIH小鼠右侧腋窝下，形成实体瘤。

(3)实验动物  NIH小鼠

由北京中国医学科学院，长春生物制品所试验动物研究室供应，实验动物中心提供。

(4)分组

选用18-22g体重的NIH雄小鼠，分为对照与给药组，对照组分为两组，每组各10只，对照组用于观察抑瘤率，生命延长率以及病理组织，给药组用于观察T、B淋巴细胞百分率变化。

在复方胰核糖核酸对离体瘤细胞杀伤作用的结果表明，胰RNA提取物不仅对艾氏腹水癌细胞具有直接杀伤作用，而且对其他瘤细胞(S180、P383、HepG2)，也具有同样的杀伤作用。为了解胰RNA提取物的作用和性质又作了接触试验，透析处理，除糖操作，凝胶过滤层析以及破坏二级结构的因素等实验。结果表明，复方胰RNA提取物与瘤细胞直接接触的时间越长，其杀伤瘤细胞的效果越大。表现活性的物质不是外源性凝集素样多糖类物质或能透过半透膜的低分子化合物，而是具有一定二级结构的低分子的RNA。

为表明本发明药物对癌瘤的治疗效果，做了如下临床观察试验，根据病史，病情，年龄及治疗方法，选择配合手术，化疗，放疗，内服中药的癌瘤患者320例为对照组，选择配合手术，本发明药物，内服中药的癌瘤患者408例为治疗组，年龄范围为40岁以上各种癌瘤病人。经临床观察结果表明：根据病情癌瘤大小(经B超或CT扫描提示)，手术前开始利用本发明药物注射，将本发明药物加入复方氯化钠溶液内进行溶解，每日静脉注射100-200毫克，无论手术摘出癌瘤患者或不能摘出晚期癌瘤患者，均需静脉注射，一个月为一个疗程，根据病情休息一周观察后，接着继续进行2-3个疗程的治疗，每月定期复查，对照，记录和观察，根据临床观察试验表明：本发明药物可减轻疼痛，能够安静入睡，增加食欲和体重。有的患者，探查开腹腹膜后肉瘤7×6×5厘米大的肿块，手术不能摘出的恶性肿瘤，经用本发明药物一个疗程的治疗，其肿块先软化，肿块体积逐渐缩小，消失，有的患者经过三个疗程的治疗至今为止，已有十一余年，每年复查一次，尚未复发，工作和生活正常，本药物具有广谱性，克服了单一治疗某一脏器癌瘤的缺点，如对各种消化道癌，软组织肉瘤，胰腺体部，尾部癌瘤，肺癌，乳腺癌都有相应的疗效，同时对于特亲和力的软组织肉癌也有显著疗效，其应用范围广，可配合手术，本药物和中药使用，疗效显著，减轻放，化疗的毒副反应，末稍血像内的T/B淋巴细胞比值恢复正常，本发明药物可提高机体的细胞免疫功能，同时可使皮肤增强弹性，滋润皮肤，使皮肤有光泽，可使皮肤上所沉积的脂褐素色变淡，甚至消失，本发明药物具有延缓衰老的作用。在临床观察试验中也发现有与动物NIH小鼠实体瘤的抑瘤试验相似的反应，用本发明药物治疗18天，摘出瘤块做病理组织标本，在光镜下所示癌细胞溶解(本药物能识别正常细胞与癌细胞)，液化性坏死，抑制癌细胞基因DNA复制能力，导致癌细胞坏死，其周围出现机体正常防御功能，大量增生纤维芽细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，毛细血管内皮细胞，以结缔组织，代替瘤组织，在有效病例中，探查开腹不能摘出癌瘤(晚期胰腺癌)，用本发明药物治疗三个疗程，复查，长期带瘤维持正常生活，经B超，CT扫描，其肿块周围包膜有钙化沉着，中心部有液体所见，有的直肠癌术后血行扩散至肝脏成为散在性转移性肝癌，经本药物治疗一个疗程，经CT扫描可见(对照本药物治疗前CT片子)小肿块周围钙盐沉着，所见本药物确有对癌瘤有防御功能，说明本药物治疗动物NIH小鼠体内实体瘤的形态变化和人体内癌瘤的形态变化，相类似。在本药物使用剂量范围内，本发明药物中的硒、胰核糖核酸和牛脾透析外液三种成份，相互作用，相补相成，以发挥其疗效。本发明药物经临床观察试验结果表明，本发明药物治疗组408例各癌瘤平均总缓率(CR+PR)为71.6％，未缓解率(MR、SD、PD)为28.4％，对照组320例各癌瘤平均总缓解率(CR+PR)为42.8％，未缓解率(MR、SD、PD)为57.2％，其X²值为61.26；P＜0.001，见表2，表3，本发明药物治疗组比对照组具有非常显著的疗效，P＜0.001。

备注：

按照国家卫生部1988年1月颁布(试行)的抗癌药物临床研究指导原则的要求，做了如上临床观察试验。

1.疗效判定标准

(1)完全缓解(CR)：所有可见病变完全消失并只少维持1个月以上。

(2)部分缓解(PR)：肿瘤病灶最大直径乘积减少50％以上，并维持1个月以上。

(3)好转(MR)：肿瘤病灶两径乘积缩小25％以上。

(4)稳定(SD)：肿瘤病灶两径乘积缩小＜25％或增大＞25％，无新病灶出现。

(5)病变进展(PD)：肿瘤病灶两径乘积增大＞25％或出现新病灶。

(6)总缓解率：完全缓解病例十部份缓解病例(CR+PR)好转，稳定病例不得记入。

本发明药物经临床使用结果表明，有下述优点：

1.它属于复方胰核糖核酸冻干粉针剂，制备工艺简单，对人体无毒，无副作用，可配合手术，本药物和中药，疗效显著，可减轻放化疗的毒副反应。

2.具有抗癌作用。经体外培养的癌细胞试验证明，本发明药物可进入癌细胞胞浆和核内，发挥其生物活性，它能够识别癌细胞，抑制癌细胞脱氧核糖核酸(DNA)的复制，导致癌细胞溶解，液化性坏死。经NIH小鼠实体瘤的抑瘤实验表明，可使癌细胞引起空泡样变性，癌细胞溶解，液化性坏死，其周围有大量增生纤维芽细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，毛细血管内皮细胞等以结缔组织代替癌组织，本发明药物具有识别癌细胞和正常细胞的能力，机体能够产生和纠正细胞基因表达紊乱，在一定范围内防止癌瘤迅速扩散。

3.增强机体免疫功能。本发明药物中的硒是通过人体的谷胱肽过氧化物酶(GPX)起到抗氧化作用，硒也具有单独(非酶系列)的抗氧化作用，它能够分解和清除有害的自由基、体内产生的有毒过氧化物或一些致癌物，将它们变为无毒的物质，保护细胞膜，线粒体膜，微粒体膜，核膜，免受自由基、有毒物质，过氧化物损伤细胞膜系统，对癌细胞有选择性的抑制癌细胞基因复制，在使用剂量范围内，硒能够刺激肿瘤坏死因子的产生，硒和胰核糖核酸相互协同，相补相成，能够增强杀伤癌细胞的生物活性作用。根据机体免疫功能实验证明，在NIH小鼠腋窝下接种癌细胞，分二组：注射本药物治疗第一组：注射本药物第一周末NIH小鼠尾静脉采血做涂片，固定，用α-醋酸萘酯酯酶染色法T，B淋巴细胞计数结果表明，末稍血像内的T淋巴细胞数小于B淋巴细胞数，其比值，完全倒置，当注射本发明药物经治疗三周做为第二组：NIH小鼠末稍血像的T/B淋巴细胞比值恢复正常值，(X＝72.6T淋巴细胞/27.4B淋巴细胞比值)，说明本发明药物能够提高机体免疫能力。

4.具有抗衰老作用。人体衰老的原因是在机体的物质代谢过程中产生的自由基和脂质过氧化物，对生物膜造成的损伤所致，它随着年龄的增长而增长，经过本发明药物治疗分解和清除过量产生的超氧化物阴离子自由基(O₂ ^-)，羟自由基(·OH)，过氧化氢(H₂O₂)，形成的过氧化脂质，将沉积于细胞内和细胞间隙内的脂褐素及皮肤上沉着的老年斑等分解成最终产物丙二醛(MDA)，水(H₂O)，将过氧化氢(H₂O₂)还原为无毒的水(H₂O)，和氧(O₂)，而被清除，通过还原脂质过氧化物以防止脂质过氧化物(LPO)和丙二醛(MDA)的产生，从而保护了脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)和生物膜免受损害，防止和延缓细胞功能的退化和衰老。

5.本药物对治疗各种癌瘤缓解率高。在临床观察中，治疗组对各种癌瘤408例的平均总缓解率(完全缓解[CR]和部份缓解[PR]为)71.6％，明显地大于对照组320例的平均总缓解率42.8％，X²测验为61.26，P＜0.001。

实施例：

首先剥去新鲜健康的牛胰脏组织被膜和脂肪，称取1公斤牛胰脏组织放入0.3％十二烷基硫酸钠缓冲液中进行清洗，以洗净为止，其用量为每公斤牛胰脏放入2倍体积的0.3％十二烷基硫酸钠缓冲液2000毫升，所述0.3％十二烷基硫酸纳缓冲液的制备方法为，称取十二烷基硫酸钠24克，并放入配制试剂容器内，同时加入氯化钠72克和亚硒酸钠3克，其水温为60℃，待其完全溶解后，再加入浓度为2.5摩尔/升，PH值为5.1的乙酸钠溶液32毫升，最后再加入去离子水至8000毫升，PH值为6.5-7.0，备用，将清洗干净的牛胰脏组织放入研磨机内，经过粗、细2次研磨，使牛胰脏组织细胞破裂为止，制得牛胰脏组织匀浆液，将牛胰脏组织匀浆液置入提取容器内，并加入6倍体积0.3％十二烷基硫酸钠缓冲剂6000毫升，其PH值6.5-7.0，经搅拌使其充分混均，其温度为58℃，边混摇边放入5倍体积的0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液5000毫升和氯仿1500毫升，经振荡机上的恒温流水管，其恒温的温度为58℃，在恒温流水管内振荡20分钟，振荡次数为120次/分，随之经冷却水管进行冷却，当冷却温度达到18℃时停止冷却，冷却时间为20分钟，再经过大容量离心机进行分离，其转数为3000转/分，时间为20分钟，利用真空泵吸取上清液，弃去沉殿物，所述0.1％8羟基喹啉-90％，苯酚溶液，配制方法为：称取已经过再蒸馏的苯酚9000克放入水浴中，随之加入去离子水1000毫升，水浴温度为60℃，已经过再蒸馏的苯酚溶解后，加入8羟基喹啉10克，便制得0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液，备用，向被提取的含有牛胰核蛋白体的上清液中加入2/4体积的0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液2000毫升，同时加入1/4体积的氯仿，氯仿加入量要小于750毫升，依次经过振荡机进行振荡和大容量离心机进行分离，其振荡次数为120次/分，振荡时间为20分钟，离心机转数为3000转/分，离心时间为20分钟，最后取其上清液，弃去沉淀物，如此反复按上述方法操作3次，进行除蛋白，达到中间无蛋层为止。汇集上述上清液，测量上清液的总体积并加入将浓度2.5摩尔/升的乙酸钠溶液换算为浓度0.15摩尔/升的乙酸钠溶液，其PH值为5.1，经混均后，加入2倍体积的98％乙醇，乙醇保存温度为-20℃，经混均后，在夜间放置2-12小时，其温度为4℃，使粗胰核糖核酸进行沉淀，所述浓度2.5摩尔/升的乙酸钠溶液，其配制方法：将称取无水乙酸钠205克(分子量为82.03)，放入配制试剂容器内，随之加入去离子水500毫升，待无水乙酸钠完全溶解后，加入浓盐酸62.5毫升，再放入去离子水至1000毫升，经调制使其PH值达到5.1，便制得2.5摩尔/升乙酸钠溶液1000毫升，再经过分装密封和高压灭菌，备用，所述98％乙醇的用量为10000毫升，保存温度为-20℃，备用，所述90％乙醇的用量为10000毫升，保存温度为-20℃，备用，将粗胰核糖核酸沉淀物移入大容量离心机内，离心机转数为3000转/分，离心时间为20分钟，同时弃去上清液，取其沉淀物，加入2倍体积的浓度为0.15摩尔/升乙酸钠溶液和2.5倍体积的90％乙醇溶液，经过混摇后，放置1小时，温度保持4℃，如此反复按上述方法纯化三次，加入2倍体积的0.15摩尔/升乙酸钠，溶解后加入2.5倍体积的90％乙醇溶液，混均，汇集沉淀物并存放于冰室内，冰室温度为-20℃，存放时间为48小时，待生产达到一定批量时，再移入装有冷冻机的大容量离心机内进行分离，离心机转数为3500转/分，离心时间为30分钟，弃去上清液，取其沉淀物硒化胰核糖核酸，再以牛脾透析24小时外液，即牛脾转移因子按60毫升/公斤牛胰组织比例进行溶解，之后对被提取的晒化胰核糖核酸(RNR)的含量，硒含量，脱氧核糖核酸(DNA)的含量，波长A260/A280比值和热源试验进行测定，使硒化胰核糖核酸最终浓度被稀释为25毫克/毫升，最后经过除菌，过滤，分装和冻干程序，即被制成冻干粉针剂，复方胰核糖核酸50毫克/支，各项技术标准为：胰核糖核酸(RNA)含量50毫克/支

硒含量               1-3微克/支

脱氧核糖核酸(DNA)    4％以下

波长A260/A280比值≥1.9-2.0

热源试验            合格

安全试验            合格

无菌试验            合格

异性蛋白试验        合格

热源试验，安全试验，无菌试验和异性蛋白试验各技术标准根据国家生化药物质量标准而定。

测试仪器：

自动调PH计，用于测定PH值。

紫外吸收分光光度计，用于测定硒化胰核糖核酸。

荧光分光光度计，用于测定硒的含量。

        表1  带瘤小鼠的TB淋巴细胞百分率之比(T/B)的比较表小鼠编号    对照组(本品注射第一周百分比)    给药组(本品注射第三周百分比)1                  12/88                           67/332                   7/93                            死亡3                  15/85                           76/244                  23/77                           80/205                  16/84                           79/216                  14/86                           75/257                  11/86                           63/378                  20/80                           72/289                  2/98                             死亡10                  18/82                            63/37均值                13.8/86.2                       72.6/27/4

    表2  本发明药物治疗408病例的各癌瘤缓解率统计学观察表癌瘤的             对照组疗效判定                            本药物疗效判定

                                            MR                                     MR

种类    病例数(N)  CR    PR   缓解率(％)        PD  病例数(N)  CR   PR  缓解率(％)       PD

                                            SD                                     SD胰腺癌         48      2     2      8.3         0   44     62      10    26    58.1    20    6软部组织肉瘤    21     4     4      38.1        1   12     21      12    6     85.7     1    2肝癌           45      1    14      33.3        14  16     55       3    31    61.8    13    8胃癌           60     28     6      56.7        4   22     62      42    8     80.6     2   10结肠癌         42     14    10      57.1        2   16     62      22    18    80.0     6    4乳腺癌         38     14     8      57.9        4   12     44      24    16    90.9     2    2肺癌           66     18    12      48.5        2   34     86      21    37    67.4    17   11其他癌          0                                          28      10    6     57.1     8    4合计          320     81    56                 27   156   408     144   148            69   47总缓解率      320       137         42.8         18.3     408        292       71.6       116

                    表3  对照组和本药物治疗组统计学观察表

                  缓解例数           未缓解例数       平均缓解率    X²         P

         本品组  292(240.43)  116(167.57)   408        71.6％缓解率的比较

         对照组  137(188.57)  183(131.43)   320        42.8％

          小计       429          299       728                   X²＝61.26 P＜0.001

Claims (1)

1.一种注射用复方胰核糖核酸的制备方法，其特征是：

A.将新鲜健康的牛胰脏组织被膜和脂肪组织剥去，称取1公斤牛胰脏组织，放入0.3％十二烷基硫酸钠缓冲液中进行清洗，以洗净为止，其用量为每公斤牛胰脏放入2倍体积的0.3％十二烷基硫酸钠缓冲液，

B.所述0.3％十二烷基硫酸钠缓冲液其配制方法为，称取十二烷基硫酸钠24克，放入配制试剂容器内，同时加入氯化钠72克和亚硒酸钠3克，随之加入去离子水5000毫升，其水温为60℃，待其完全溶解后，再加入浓度为2.5摩尔/升，PH值为5.1的乙酸钠溶液32毫升，最后再加入去离子水至8000毫升，PH值为6.5-7.0，备用，

C.将清洗干净的牛胰脏组织，经过粗、细2次研磨，使牛胰脏组织细胞破裂为止，制得牛胰脏组织匀浆液，

D.将牛胰脏组织匀浆液加入提取容器内，并加入6倍体积0.3％十二烷基硫酸钠缓冲液6000毫升，其PH值为6.5-7.0，经混摇使其充分混均，其温度为58℃，边混摇边放入5倍体积的0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液5000毫升和氯仿1500毫升，经振荡机上的恒温流水管，其恒温温度为58℃，并振荡20分钟，振荡次数为120次/分，随之经冷却流水管进行冷却，当冷却温度达到18℃时为止，冷却时间为20分钟，再经过大容量离心机进行分离，其转效为3000转/分，时间为20分钟，利用真空泵吸取上清液，弃去沉淀物，

E.所述0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液，配制方法为，称取再蒸馏的苯酚9000克放入水浴中，随之加入去离子水1000毫升，水浴温度为60℃，待已经过再蒸馏的苯酚溶解后，再加入8羟基喹啉10克，便制得0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液，备用，

F.所述氯仿用量为5000毫升，备用，

G.向被提取的含有牛胰核蛋白体的上清液中加入2/4体积的0.1％8羟基喹啉-90％苯酚溶液2000毫升，同时加入1/4体积的氯仿，氯仿加入量小于750毫升，再依次经过振荡机进行振荡和大容量离心机进行分离，其振荡次数为120次/分，振荡时间为20分钟，离心机转数为3000转/分，离心时间为20分钟，最后取其上清液，弃去沉淀物，如此反复按上述方法操作3次，吸取上清液，达到中间无蛋白层为止，进行除蛋白，

H.测量其上述上清液，根据上清液的总体积加入将浓度2.5摩尔/升的乙酸钠溶液换算为浓度0.15摩尔升的乙酸钠溶液，其PH值为5.1，经混均后，加入2倍体积的98％乙醇，乙醇保存温度为-20℃，经混均后，在夜间放置2-12小时，其温度为4℃，使粗胰核糖核酸进行沉淀，

I.所述浓度2.5摩尔/升的乙酸钠溶液，其配制方法为，将无水乙酸钠205克，其分子量为82.03放入容器内，随之加入去离子水500毫升，待无水乙酸钠完全溶解后，加入浓盐酸62.5毫升，再放入去离子水至1000毫升，经调制使其PH值达到5.1，便制得2.5摩尔/升乙酸钠溶液1000毫升，再经过分装密封和高压灭菌，备用，

J.所述98％乙醇的用量为10000毫升，保存温度为-20℃，备用，

K.所述90％乙醇的用量为10000毫升，保存温度为-20℃，备用。

L.将粗胰核糖核酸沉淀物移入大容量离心机内，离心机转数为3000转/分，离心时间为20分钟，弃去上清液，取其沉淀物，加入2倍体积0.15摩尔/升的乙酸钠溶液和2.5倍体积的90％乙醇溶液，经过混均后，放置1小时，温度保持4℃，离心机转数为3000转/分，离心时间为20分钟，弃去上清液，取其沉淀物，如此反复按上述方法纯化三次，加入2倍体积0.15摩尔/升的乙酸钠，经混匀后，再加入2.5倍体积的90％乙醇，汇集沉淀物并存放于冰室内，冰室温度为-20℃，待存放的沉淀物数量达到批量生产时，移入大容量冷冻离机内进行分离，离心机转数为3500转/分，离心时间30分钟，弃去上清液，取其沉淀物硒化胰核糖核酸，再以牛脾透析24小时外液，即牛脾转移因子，按60毫升/公斤牛胰脏的比例进行溶解，随之对被提取的复方胰核糖核酸(RNA)的含量，硒含量，脱氧核糖核酸(DNA)的含量，波长A260/A280比值和热原试验进行测定，使硒化胰核糖核酸最终浓度被稀释为25毫克/毫升，最后经过除菌，过滤，分装和冻干程序，即被制成冻干粉针剂，每支含有50毫克复方胰核糖核酸，

M.所述浓度0.15摩尔/升乙酸钠溶液，其配制方法为，称取浓度为2.5摩尔/升，PH值5.1的乙酸钠溶液60毫升，再加入去离子水至1000毫升，便制得浓度为0.15摩尔/升乙酸钠溶液1000毫升，备用。

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