CN104223115B - 鱼鳞胶原蛋白多肽的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鱼鳞胶原蛋白多肽在制备抗肿瘤的特殊膳食食品、药品或者保健品中的新用途。本发明鱼鳞胶原蛋白多肽的抑瘤效果非常优良，副作用小，有非常良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及鱼鳞胶原蛋白多肽的新用途。
背景技术
动物胶原类物质是动物的基本组成成分，是动物及人体组织结构的基础，包括空腔器官、血管、骨骼、脏器等，其分子结构是进化中最保守的，因而在人类应用中是最不易引起过敏反应的一类物质，在我国中医药中被广泛应用，均广泛用于我国中医药散结化瘀、创伤修复、补血养颜等方面。
鱼胶原蛋白含19种氨基酸，包括人体必需的7种氨基酸和2种儿童必需氨基酸，比人乳蛋白所含的氨基酸还多两种，其蛋白含量比牛乳粉、羊乳粉高4倍。鱼皮、鱼鳞胶原蛋白多肽是鱼胶原的酶解产物，现代生物学实验证明，鱼皮、鱼鳞胶原蛋白多肽具有优良的吸收性、低抗原性，具有促进脂质代谢、降低胆固醇、促进矿物质吸收、降血压、抗氧化等生理功能。
发明内容
本发明的目的是提供鱼鳞胶原蛋白多肽在制备治疗抗肿瘤药物中的新用途。
本发明提供了鱼鳞胶原蛋白多肽在制备抗肿瘤的特殊膳食食品、药品或者保健品中的用途。
本发明还提供了鱼鳞胶原蛋白多肽在制备用于肿瘤辅助治疗的特殊膳食食品、药品或者保健品中的用途。
特殊膳食营养品，是指在肿瘤治疗过程中的具有营养支持作用的营养食品。
其中，所述肿瘤是肉瘤、肺癌、乳腺癌或胸腺癌。
其中，所述鱼鳞胶原白多肽以罗非鱼鱼鳞为原料制备而成，其中，羟赖氨酸重量百分含量大于1.3％；重均分子量为800～2400。优选地，所述多肽中羟脯氨酸的重量百分含量大于7.3%，羟脯氨酸的重量百分含量优选大于9.2%，再进一步优选为9.2~9.4%。
所述鱼鳞胶原白多肽由如下方法制备：
a、将100重量份的罗非鱼鱼鳞为原料，加入800～1200重量份水，升温至80～90℃，恒温20～60分钟；
b、然后降温至30～65℃，调节pH值至8～9，加入1～8份碱性蛋白酶，恒温降解0.5～12小时；
c、再在45-50℃恒温条件下，加入1～8份中性蛋白酶，搅拌反应0.5～12小时；
d、然后再升温到75～90℃，保温15～30分钟，使酶失活；
e、加入絮凝剂，经絮凝沉淀杂质、过滤，将滤液喷雾干燥，即得。
步骤b所述的碱性蛋白酶是alcalase或胰酶中的至少一种。
步骤c所述的中性蛋白酶是A1398、或Neutrase酶，或Flavourzyme中的至少一种。
步骤e所述的絮凝剂是硅藻土或活性炭的至少一种。
本发明还提供了一种抗肿瘤或者用于肿瘤辅助治疗的药品、特殊膳食食品或者保健品，它是以鱼鳞胶原蛋白多肽为活性成分，加上药品、食品保或健食品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
其中，所述制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂。
本发明鱼鳞胶原蛋白多肽可以有效抑制肿瘤的生长，对肉瘤、肺癌、乳腺癌和胸腺癌的疗效确切，副作用小，为临床抗肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物、特殊膳食食品或保健食品提供了一种新的选择，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1鱼鳞胶原蛋白多肽组与对照组的肿瘤（肉瘤）大小比对图；
图2 鱼鳞胶原蛋白多肽组与对照组的实验解剖图；
图3 鱼鳞胶原蛋白组与对照组小鼠外观比对图；
图4 鱼鳞胶原蛋白组和对照组肿瘤（肺癌）组织外观图；
图5 鱼鳞胶原蛋白组与对照组肿瘤（肺癌）镜下观察比对图（400倍镜下）。
具体实施方式
实施例1 本发明鱼鳞胶原蛋白多肽的制备方法
本发明鱼鳞胶原蛋白可通过购买市售产品获得，也可按照如下方法制备：
方法一：将100克脱钙罗非鱼鳞，水洗，加无离子水1000升温至85℃30分钟，后降温至45℃，调pH值到8.0，加入3克碱性蛋白酶，降解2小时，同样条件下再加入中性蛋白酶4克，反应2小时，鳞片全部溶解，然后升温到90℃，保温15～30分钟，使酶失活，加入适量絮凝剂硅藻土和活性炭(以1∶1混合)沉降8小时，直接取上清；上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后喷雾干燥，即得固态蛋白多肽粉。
经测定，其中：羟脯氨酸含量：9.4％；羟赖氨酸，1.4％。
方法二：过程同方法一，其中，碱性蛋白酶为胰酶，用量8克，中性蛋白酶8克絮凝剂为硅藻土，上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后喷雾干燥，即得固态蛋白多肽粉。
经测定，其中：羟脯氨酸含量：9.2％；羟赖氨酸，1.42％。
方法一以罗非鱼鳞为原料制备胶原蛋白及多肽
将100克脱钙罗非鱼鳞，水洗，加无离子水1000升温至85℃30分钟，后降温至45℃，调pH值到8.0，加入3克碱性蛋白酶，降解2小时，同样条件下再加入中性蛋白酶4克，反应2小时，鳞片全部溶解，然后升温到90℃，保温15～30分钟，使酶失活，加入适量絮凝剂硅藻土和活性炭(以1∶1混合)沉降8小时，直接取上清；上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后喷雾干燥，即得固态蛋白多肽粉。
经测定，其中：羟脯氨酸含量：9.4％；羟赖氨酸，1.4％。
方法二以罗非鱼鳞为原料制备胶原蛋白及多肽
过程同实施例1，其中，碱性蛋白酶为胰酶，用量8克，中性蛋白酶8克絮凝剂为硅藻土，上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后喷雾干燥，即得固态蛋白多肽粉。
方法三以罗非鱼皮为原料制备胶原蛋白及多肽
称取100g干鱼皮于1000ml烧杯中，常温洗涤至pH值为7左右，加热至80度下恒温30分钟，冷却至50℃，调pH值至8，加入碱性蛋白酶2.5克，反应3小时；调温至45℃，加入中性蛋白酶4克，恒温搅拌反应3小时；加热至85℃恒温15分钟，灭活酶。加入适量絮凝剂硅藻土和活性炭(以1∶2混合)沉降8小时，直接取上清。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后喷雾干燥，即得固态蛋白多肽粉。
产品检测结果：羟脯氨酸含量：9.38％；羟赖氨酸，1.31％。
方法四以鳕鱼皮为原料制备胶原蛋白及多肽
称取100g干燥鳕鱼皮于1000ml烧杯中，常温洗涤至pH值为7左右，加热至80度下恒温30分钟，冷却至50℃，调pH值至8，分别加入中胰酶4克，反应6小时；调温至45℃，加入1398蛋白酶3克，恒温搅拌反应5小时；加热至85℃恒温15分钟，灭活酶。
经絮凝沉淀过滤，滤液于50℃左右进行减压蒸馏，最后经喷雾干燥，即得鱼皮胶原蛋白多肽粉。
产品检测结果：羟脯氨酸含量：7.3％；羟赖氨酸，1.3％
经测定，其中：羟脯氨酸含量：9.2％；羟赖氨酸，1.42％
方法五以草鱼鳞为原料制备胶原蛋白及多肽
将100克脱钙草鱼鳞，水洗，加无离子水1000升温至85度30分钟，后降温至45℃，调pH值到8.0，加入5克alcalase酶，降解2小时，同样条件下再加入1398酶3克，反应2小时，鳞片全部溶解，然后升温到90℃，保温15～30分钟，使酶失活，加入适量絮凝剂硅藻土和活性炭的混合物(按照1∶2混合好)沉降8小时，直接取上清。上清液于真空度0.06～0.10Mpa，温度40～65℃减压蒸馏，最后喷雾干燥，即得固态蛋白多肽粉。
经测定，其中：羟脯氨酸含量：9.8％；羟赖氨酸，1.43％。
以下通过药效试验证明本发明的有益效果：
实施例1本发明鱼鳞胶原蛋白多肽的抗肉瘤实验
1、实验材料动物：昆明种小鼠，体重20克左右，无特定病原体(SPF)条件下饲养；
瘤种：S180 肉瘤；
罗非鱼鳞酶解胶原蛋白多肽粉，按照实施例1方法一制备。
2、实验方法
（1）实体肿瘤单剂量抑瘤实验
取上述昆明种小鼠20只，称重，随机分成两组，一组为对照组，生理盐水灌胃；一组为鱼鳞胶原蛋白多肽组。将鱼鳞胶原蛋白多肽溶解在生理盐水溶液中，形成10%浓度的鱼鳞胶原蛋白多肽溶液。
对照组接种生理盐水，鱼鳞胶原蛋白多肽组口服10%浓度的鱼鳞胶原蛋白多肽溶液，每天按照0.2ml（鱼鳞胶原蛋白多肽组相当于口服20mg鱼鳞胶原蛋白多肽/天.只鼠）剂量分别灌胃，前肢腋下接种S180肿瘤；同时灌胃十天后处死动物，解剖，观察实体肿瘤生长状况，称重瘤体。
（2）实体肿瘤量效关系实验
取昆明种小鼠40只，称重，完全随机分成4组，分为对照组和3个鱼鳞胶原蛋白多肽组。将鱼鳞胶原蛋白多肽物质分别溶解成10%、5%、2.5%浓度的鱼鳞胶原蛋白多肽溶液。
对照组口服生理盐水，3个鱼鳞胶原蛋白多肽组分别口服10%、5%、2.5%浓度的鱼鳞胶原蛋白多肽溶液，每天按照0.2ml（3个鱼鳞胶原蛋白多肽组相当于分别口服20mg、10mg和5mg鱼鳞胶原蛋白多肽/天.只鼠）三个剂量要求分别灌胃，前肢腋下接种S180肿瘤；同时灌胃十天后处死动物，解剖，观察肿瘤生长状况，称重瘤体。
统计学处理数据以±s或％表示，用SAS软件包中的方差分析(ANOVA)和直线回归分析处理数据，均为双侧检验，α取0.05。
3、实验结果
（1）实体肿瘤单剂量抑瘤实验
抑瘤作用如图1~2和表1所示：
表1抑瘤作用(±s)动物数(n)体重(g)
如图1~2可以看出，对照组肿块生长旺盛，肿块组织周边血管丰富，呈充血状；本发明鱼鳞胶原蛋白多肽组，肿块组织生长状况一般，外观大部分呈淡淡白色，周边血管不丰富，有的肿块在植入处呈分散状或者扁平状，外部包膜整齐无血管分布。
由表1可以看出，鱼鳞胶原蛋白多肽组小鼠的体重与对照组无明显差别，而瘤重则非常显著低于对照组，对肉瘤的抑瘤率高达87.37%，说明本发明鱼鳞胶原蛋白多肽可以有效抑制肉瘤的生长。
（2）实体肿瘤量效关系实验
表2抑瘤作用(±s)动物数(n)体重(g)
如表2所示，各组的体重无明显差别，而不同剂量的鱼鳞胶原蛋白多肽组的瘤重则非常显著低于对照组，对肉瘤的抑瘤率分别为76.69%，62.78%，54.26%，说明本发明鱼鳞胶原蛋白多肽在各个剂量下均可以有效抑制肉瘤生长，并且，随着给药剂量增加，抗肿瘤效果增强，呈明显的剂量效应关系。
实验结果说明，本发明鱼鳞胶原蛋白多肽能够有效抑制肉瘤细胞的生长，治疗肉瘤，可用于制备抗肿瘤或者肿瘤辅助治疗的药物、特殊膳食食品或保健食品。
实施例2本发明鱼鳞胶原蛋白多肽的抗人肺癌裸鼠移植瘤实验
1、材料和方法
动物：BALB／C裸鼠30只，3~4周龄，体质量15 g左右；购自武汉大学实验动物中心
瘤种：人肺癌A549细胞株，购自武汉大学保种中心。
罗非鱼鳞酶解胶原蛋白多肽粉，按照实施例方法一制备。
2、试验方法：
（1）对老鼠实体肿瘤生长的抑制作用
在每只裸鼠右前腋皮下接种(1x107／ml)X对数生长期A549细胞株0．2 m1．待移植瘤直径约5mm时，取20只荷瘤裸鼠随机分成4组开始实验。分为接种对照组、鱼鳞胶原蛋白多肽组。将鱼鳞胶原蛋白多肽溶解在生理盐水中，制成10%浓度的鱼鳞胶原蛋白多肽溶液。
对照组口服生理盐水，鱼鳞胶原蛋白多肽组口服10%浓度的鱼鳞胶原蛋白多肽溶液，每天按照0.2ml（鱼鳞胶原蛋白多肽组相当于接种20mg鱼鳞胶原蛋白多肽/天.只鼠）剂量要求分别灌胃，灌胃十天后停止给药一周后处死动物，解剖，观察肿瘤生长状况，游标卡尺测量移植瘤最长径(a)和最短径(b)，按公式(V=0.52×ab2)计算体积；称重瘤体。
抑瘤率计算：
肿瘤组织微血管密度计数：
取各组部分移植瘤组织10％甲醛固定。石蜡包埋．4µm连续切片，分别做常规HE染色和CD34免疫组化染色，移植瘤石腊标本4µm切片2张，常规脱腊。组织抗原修复采用微波抗原修复法，CD34抗工作浓度均为l：50：具体染色步骤按照试剂盒说明书操作。按Weidner微血管计数法计算微血管数目。本过程采用盲法．由两位经验丰富的病理专家同时计数3次，取均值作为MVD值。
统计学处理：数据以±s或％表示，用SAS软件包中的方差分析(ANOVA)和直线回归分析处理数据，均为双侧检验，α取0.05。
3、实验结果
实验结果如表3所示：
表3 鱼鳞胶原蛋白多肽的抑瘤作用(±s)
如表3所示，鱼鳞胶原蛋白多肽组小鼠的体重与对照组无明显差别，而瘤重则非常显著低于对照组，对肺癌的抑制率为74.35%。
如图3~4所示，对照组小鼠肿瘤明显，体积大，而本发明鱼鳞胶原蛋白多肽组小鼠的肿瘤不明显，体积较小。
如图5镜下观察结果所示，对照组小鼠肿瘤明显，体积大生长旺盛，肿块组织周边血管丰富，呈充血状；而本发明鱼鳞胶原蛋白多肽组小鼠的肿瘤不明显，体积较小，外观大部分呈淡淡白色，周边血管不丰富。
实验结果说明，本发明鱼鳞胶原蛋白多肽可以有效抑制肺癌细胞的增殖，减少肿瘤组织中血管数量，能够有效治疗肺癌，可用于制备抗肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物、特殊膳食食品或保健食品。
实验例3 本发明鱼鳞胶原蛋白多肽的抗肿瘤临床实验
1、某女，65岁，2006年被诊断患左乳腺癌并淋巴结转移，2006年手术切除左乳腺并淋巴清扫。连续化疗8个疗程，放疗两个疗程，到最后体质严重下滑，无法进行下一步治疗。因此自2007年下半年开始口服实施例一制备的鱼鳞胶原蛋白，每日10克，每天一次。至2008年，2009年，连续监测肿瘤标志物CA153，基本维持在4-8之间（大于25为阳性）。至今已生存7年，无任何复发转移迹象，生存质量良好，期间未服用任何抗癌药物和其他相关保健品。
2、某男，63岁，2012年8月被诊断为胸腺癌并纵膈和肺转移，与9月行内镜切除手术，因经济原因未做任何其他治疗，回家。2012年10月开始服用实施例1制备的鱼鳞胶原蛋白，每日10克，每天一次。至目前，身体恢复良好，生存质量良好，精神状态佳。每隔半年的医院复查，证明身体状况未见变化。淋巴转移灶保持原来状态，未见明显增大。
3、某男，56岁，2012年7月，因胸闷住院检查发现，肺癌晚期，肺部弥漫型且已有胸水，医院拒绝入院，劝其回家。无奈自2012年9月开始服用本发明中实施例1制备的鱼鳞胶原蛋白，每日10克，每天一次。期间未服用任何其他药物和保健品，连续服用20天后，去医院复查发现，胸水消失，再继续服用一个月后，身体状况良好，恢复正常的生活节奏，近期检查未发现癌细胞扩散。
临床实验说明，本发明鱼鳞胶原蛋白多肽能够有效治疗乳腺癌、胸腺癌和肺癌，可用于制备抗肿瘤药物。
综上，本发明鱼鳞胶原蛋白多肽可以有效抑制肿瘤的生长，对肉瘤、肺癌、乳腺癌和胸腺癌的疗效确切，副作用小，可用于制备抗肿瘤药物和肿瘤辅助治疗药物，应用前景良好。
Claims (6)
1.鱼鳞胶原蛋白多肽在制备抗肿瘤的药品中的用途，
所述鱼鳞胶原蛋白多肽以罗非鱼鱼鳞为原料制备而成，其中，羟赖氨酸重量百分含量大于1.3％；重均分子量为800～2400；羟脯氨酸的重量百分含量大于7.3%；
所述肿瘤是肉瘤、肺癌；
所述鱼鳞胶原白多肽由如下方法制备：
a、以100重量份的罗非鱼鱼鳞为原料，加入800～1200重量份水，升温至80～90℃，恒温20～60分钟；
b、然后降温至30～65℃，调节pH值至8～9，加入1～8份碱性蛋白酶，恒温降解0.5～12小时；
c、再在45-50℃恒温条件下，加入1～8份中性蛋白酶，搅拌反应0.5～12小时；
d、然后再升温到75～90℃，保温15～30分钟，使酶失活；
e、加入絮凝剂，经絮凝沉淀杂质、过滤，将滤液喷雾干燥，即得。
2.鱼鳞胶原蛋白多肽在制备用于肿瘤辅助治疗的药品中的用途，
所述鱼鳞胶原蛋白多肽以罗非鱼鱼鳞为原料制备而成，其中，羟赖氨酸重量百分含量大于1.3％；重均分子量为800～2400；羟脯氨酸的重量百分含量大于7.3%；
所述肿瘤是肉瘤、肺癌；
所述鱼鳞胶原白多肽由如下方法制备：
a、以100重量份的罗非鱼鱼鳞为原料，加入800～1200重量份水，升温至80～90℃，恒温20～60分钟；
b、然后降温至30～65℃，调节pH值至8～9，加入1～8份碱性蛋白酶，恒温降解0.5～12小时；
c、再在45-50℃恒温条件下，加入1～8份中性蛋白酶，搅拌反应0.5～12小时；
d、然后再升温到75～90℃，保温15～30分钟，使酶失活；
e、加入絮凝剂，经絮凝沉淀杂质、过滤，将滤液喷雾干燥，即得。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：步骤b所述的碱性蛋白酶是alcalase或胰酶中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：步骤c所述的中性蛋白酶是Neutrase酶或Flavourzyme。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：步骤c所述的中性蛋白酶是A1398。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：步骤e所述的絮凝剂是硅藻土或活性炭的至少一种。
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