CN104232714A - 龟甲胶多肽的制备方法和制药新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种龟甲胶多肽的制备方法，包括如下步骤：（1）取龟甲胶，加水煮沸溶解，得龟胶液；（2）调节龟胶液pH至6.9～9.0，在48～52℃的条件下，加入广西酶至浓度为0.3～3.0g/L，恒温反应0.5～4h；（3）调节溶液pH至8.0～9.0，在53～57℃的条件下，加入碱性蛋白酶至浓度为0.3～3.0g/L，恒温反应0.5～4h；（4）调节溶液pH至6.0～9.0，在48℃～52℃的条件下，加入风味酶，恒温反应0.5～4h；（5）升温使酶失活；（6）抽滤，得滤液，浓缩，干燥，即得。本发明还公开了龟甲胶多肽在制备抗肿瘤药品中的用途。本发明龟甲胶多肽可以治疗肿瘤，实际应用价值强。

Description

龟甲胶多肽的制备方法和制药新用途

技术领域

本发明涉及制备龟甲胶多肽的方法，以及龟甲胶多肽的新用途。

背景技术

动物胶原类物质是动物的基本组成成分，是动物及人体组织结构的基础，如，空腔器官、血管、骨骼、脏器等，其分子结构是进化中最保守的，因而在人类应用中是最不易引起过敏反应的一类物质，在我国中医药中被广泛应用，如取自驴皮的阿胶、龟甲动物的龟甲胶等，均广泛用于我国中医药散结化瘀、创伤修复、补血养颜等方面。

龟甲胶的主要成分是蛋白质、骨胶原、脂肪、钙、磷、肽类和多种酶以及多种人体必需微量元素。龟甲胶水溶液中含有多肽、氨基酸、微量元素等成分，有抗凝血、增加冠脉含量、提高耐缺氧功能、促进免疫等作用，可以广泛用于营养食品和药品。

发明内容

本发明目的在于提供一种龟甲胶的酶解方法，以及该方法制备得到的龟甲胶多肽及其制备抗肿瘤药物的用途。

本发明酶解龟甲胶的方法，包括如下步骤：

（1）取龟甲胶，加水煮沸溶解，得龟胶液；

（2）调节龟胶液pH至6.9～9.0，在48～52℃的条件下，加入广西酶至浓度为0.3～3.0g/L，恒温反应0.5～4h；

（3）再调节溶液pH至8.0～9.0，在53～57℃的条件下，加入碱性蛋白酶至浓度为0.3～3.0g/L，恒温反应0.5～4h；

（4）然后再调节溶液pH至6.0～9.0，在48℃～52℃的条件下，加入风味酶至浓度为0.3～3.0g/L，恒温反应0.5～4h；

（5）升温至75～90℃，保温3～15分钟，使酶失活；

（6）抽滤，得滤液，浓缩，干燥，即得龟甲胶多肽。

步骤（1）中，龟胶液的浓度为50～120g/L。优选地，所述龟胶液的浓度为80g/L。

步骤（2）中，所述pH优选为7.3～7.7，进一步优选为7.5；所述温度优选为49～51℃，进一步优选为50℃；所述广西酶的浓度优选为0.55～0.75g/L，进一步优选为0.64g/L；所述反应的时间优选为1.5～2.5h，进一步优选为2h。

步骤（3）中，所述pH优选为8.0～8.2，进一步优选为8.0；所述温度优选为54～56℃，进一步优选为55℃；所述碱性蛋白酶的浓度优选为1.5～1.7g/L，进一步优选为1.6g/L；所述反应的时间优选为1.5～2.5h，进一步优选为2h。

步骤（3）中，所述碱性蛋白酶为alcalase。

步骤（4）中，所述pH优选为6.8～7.2，进一步优选为7.0；所述温度优选为49～51℃，进一步优选为50℃；所述风味酶的浓度优选为0.3～0.5g/L，进一步优选为0.4g/L；所述反应的时间优选为1.5～2.5h，进一步优选为2h。

步骤（5）中，所述温度为80℃，所述保温时间为10min。

本发明还提供了前述任意一项方法制备得到的龟甲胶多肽。

本发明还提供了前述龟甲胶多肽在制备抗肿瘤的特殊膳食食品、药品或者保健品中的用途。其中，所述肿瘤未肉瘤或者肺癌。

特殊膳食营养品，是指在肿瘤治疗过程中的具有营养支持作用的营养食品。

本发明还提供了龟甲胶多肽在制备用于肿瘤辅助治疗的特殊膳食食品、药品或者保健品中的用途。其中，所述肿瘤未肉瘤或者肺癌。

本发明还提供了一种抗肿瘤或者用于肿瘤辅助治疗的药品、特殊膳食食品或者保健品，它是以前述龟甲胶多肽为活性成分，加上药品、食品或保健食品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

本发明方法制备得到的龟甲胶多肽，可以有效抑制肿瘤的生长，对肉瘤和肺癌的疗效确切，副作用小，为临床抗肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物、特殊膳食食品或保健食品提供了一种新的选择，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1龟甲胶多肽组与对照组的肿瘤（肉瘤）大小比对图；

图2龟甲胶多肽组与对照组的实验解剖图；

图3龟甲胶多肽组与对照组小鼠外观比对图；

图4龟甲胶多肽组和对照组肿瘤（肺癌）组织外观图；

图5龟甲胶多肽组与对照组肿瘤（肺癌）镜下观察比对图（400倍镜下）。

具体实施方式

实施例1本发明龟甲胶多肽的制备方法

一、实验试剂：

精密pH试纸、NaOH溶液（2mol/L）、HCL溶液（2mol/L）、明矾、硅藻土，均为市售品。

广西酶，购自南宁庞博生物工程有限公司

碱性蛋白酶（后文称A酶），alcalase，购自诺维信(中国)生物技术有限公司。

复合风味酶，简称风味酶（后文称F酶），购自诺维信(中国)生物技术有限公司。

龟甲胶，由湖北老中醫制药有限公司提供，也可按照《中华人民共和国药典(2010年版)》第169页龟甲胶的制法制备。

二、制备方法

1、天平称取50g龟甲胶，置于不锈钢锅内，加少量清水煮沸熔解。

2、将溶解后的龟胶液倒入1000mL烧杯中，加入适量清水，配成625mL龟胶液。

3、将水浴恒温至50℃，将龟胶液转移进1000mL三口烧瓶中，待龟胶液温度恒定50℃，调pH至7.5。

4、称取0.4g广西酶，加入龟胶液，恒温搅拌反应2h。

5、控制水浴，升温龟胶液至55℃，调节pH至8.0，加入1g A酶，反应2h。

6、龟胶液降温至50℃，调节pH至7.0，加入0.25g F酶，反应2h。

7、升温龟胶液至80℃，保持15min灭酶活，转移龟胶液至1000mL烧杯。

8、抽滤，真空浓缩至40%左右的浓度，真空干燥得成品。

9平行作十组实验，收集合并产物。

三、本发明龟甲胶多肽的检测

将原料龟甲胶与本发明方法水解得到的龟甲胶多肽的氨基酸种类和含量以及氨含量分析如下表：

表1龟甲胶及龟甲胶水解物氨基酸对比表

氨基酸	龟甲胶	龟甲胶水解物
			.天门冬氨酸	3.57	3.63
苏氨酸	1.50	1.40
			丝氨酸	2.59	2.28
谷氨酸	7.20	7.50
			甘氨酸	14.58	13.89
丙氨酸	6.05	6.17

胱氨酸	0.13	0.32
			缬氨酸	1.40	1.46
蛋氨酸	0.49	0.47
			异亮氨酸	0.97	1.01
亮氨酸	1.93	1.99
			酪氨酸	0.78	0.75
苯丙氨酸	1.56	1.49
			赖氨酸	1.51	1.47
羟赖氨酸	0.96	0.95
			组氨酸	0.40	0.32
精氨酸	4.68	4.55
			脯氨酸	6.54	6.80
羟脯氨酸	7.72	7.98
			氨基酸总量	64.56	64.43
氨	0.68	0.69

由表1可以看出，与原料龟甲胶相比，本发明龟甲胶多肽的氨基酸的含量无明显下降，说明本发明方法可以有效保留龟甲胶的蛋白类有效成分。

实施例2本发明龟甲胶多肽的制备方法

一、实验试剂：

同实施例1。

二、制备方法

1、天平称取50g龟甲胶，置于不锈钢锅内，加少量清水煮沸熔解。

2、将溶解后的龟胶液倒入1000mL烧杯中，加入适量清水，配成1000mL龟胶液。

3、将水浴恒温至48℃，将龟胶液转移进1000mL三口烧瓶中，待龟胶液温度恒定48℃，调pH至6.9。

4、称取0.3g广西酶，加入龟胶液，恒温搅拌反应0.5h。

5、控制水浴，升温龟胶液至53℃，调节pH至8.0，加入0.3g A酶，反应0.5h。

6、龟胶液降温至48℃，调节pH至6.0，加入0.3g F酶，反应0.5h。

7、升温龟胶液至75℃，保持15min灭酶活，转移龟胶液至1000mL烧杯。

8、抽滤，真空浓缩至40%左右的浓度，真空干燥得成品。

9平行作十组实验，收集合并产物。

实施例3本发明龟甲胶多肽的制备方法

一、实验试剂：

同实施例1。

二、制备方法

1、天平称取75g龟甲胶，置于不锈钢锅内，加少量清水煮沸熔解。

2、将溶解后的龟胶液倒入1000mL烧杯中，加入适量清水，配成625mL龟胶液。

3、将水浴恒温至52℃，将龟胶液转移进1000mL三口烧瓶中，待龟胶液温度恒定52℃，调pH至9.0。

4、称取1.875g广西酶，加入龟胶液，恒温搅拌反应4h。

5、控制水浴，升温龟胶液至57℃，调节pH至9.0，加入1.875g A酶，反应4h。

6、龟胶液降温至52℃，调节pH至9.0，加入1.875g F酶，反应4h。

7、升温龟胶液至90℃，保持3min灭酶活，转移龟胶液至1000mL烧杯。

8、抽滤，真空浓缩至40%左右的浓度，真空干燥得成品。

9平行作十组实验，收集合并产物。

实施例4本发明龟甲胶多肽的制备方法

一、实验试剂：

同实施例1。

二、制备方法

1、天平称取50g龟甲胶，置于不锈钢锅内，加少量清水煮沸熔解。

2、将溶解后的龟胶液倒入1000mL烧杯中，加入适量清水，配成1000mL龟胶液。

3、将水浴恒温至49℃，将龟胶液转移进1000mL三口烧瓶中，待龟胶液温度恒定49℃，调pH至7.3。

4、称取0.55g广西酶，加入龟胶液，恒温搅拌反应1.5h。

5、控制水浴，升温龟胶液至54℃，调节pH至8.0，加入1.5g A酶，反应1.5h。

6、龟胶液降温至49℃，调节pH至6.8，加入0.3g F酶，反应1.5h。

7、升温龟胶液至75℃，保持15min灭酶活，转移龟胶液至1000mL烧杯。

8、抽滤，真空浓缩至40%左右的浓度，真空干燥得成品。

9平行作十组实验，收集合并产物。

实施例5本发明龟甲胶多肽的制备方法

一、实验试剂：

同实施例1。

二、制备方法

1、天平称取75g龟甲胶，置于不锈钢锅内，加少量清水煮沸熔解。

2、将溶解后的龟胶液倒入1000mL烧杯中，加入适量清水，配成625mL龟胶液。

3、将水浴恒温至52℃，将龟胶液转移进1000mL三口烧瓶中，待龟胶液温度恒定52℃，调pH至7.7。

4、称取0.469g广西酶，加入龟胶液，恒温搅拌反应2.5h。

5、控制水浴，升温龟胶液至56℃，调节pH至8.2，加入1.063g A酶，反应2.5h。

6、龟胶液降温至51℃，调节pH至7.2，加入0.313g F酶，反应2.5h。

7、升温龟胶液至90℃，保持3min灭酶活，转移龟胶液至1000mL烧杯。

8、抽滤，真空浓缩至40%左右的浓度，真空干燥得成品。

9平行作十组实验，收集合并产物。

以下通过药效试验证明本发明的有益效果：

实验例1龟甲胶多肽的抗肉瘤实验

1、实验材料动物：昆明种小鼠，体重20克左右，无特定病原体(SPF)条件下饲养；

瘤种：S180肉瘤；

龟甲胶多肽：按照本发明实施例1的方法制备。

2、实验方法

（1）实体肿瘤单剂量抑瘤实验

取20只老鼠，称重，完全随机分成2组，每组10只，将龟甲胶多肽溶解在生理盐水中，制成10%浓度的龟甲胶多肽溶液。

对照组口服生理盐水，龟甲胶多肽组口服10%浓度的龟甲胶多肽溶液，每天按照0.2ml（龟甲胶多肽组相当于接种20mg龟甲胶多肽/天.只鼠）剂量要求分别灌胃，前肢腋下接种S180肿瘤；同时灌胃十天后处死动物，解剖，观察肿瘤生长状况，称重瘤体。

（2）实体肿瘤量效关系实验

取昆明种小鼠40只，称重，完全随机分成4组，分为对照组和3个龟甲胶多肽组。将龟甲胶多肽物质分别溶解成10%、5%、2.5%浓度的龟甲胶多肽溶液。

对照组口服生理盐水，3个龟甲胶多肽组分别口服10%、5%、2.5%浓度的龟甲胶多肽溶液，每天按照0.2ml（3个龟甲胶多肽组相当于分别接种20mg、10mg和5mg龟甲胶多肽/天.只鼠）三个剂量要求分别灌胃，前肢腋下接种S180肿瘤；同时灌胃十天后处死动物，解剖，观察肿瘤生长状况，称重瘤体。

抑瘤率计算：

统计学处理数据以或％表示，用SAS软件包中的方差分析(ANOVA)和直线回归分析处理数据，均为双侧检验，α取0.05。

3、实验结果

（1）动物实体肿瘤实验抑瘤结果

抑瘤作用如图1～2和表2所示：

表2抑瘤作用()动物数(n)体重(g)

如图1～2可以看出，对照组肿块生长旺盛，肿块组织周边血管丰富，呈充血状；本发明龟甲胶多肽组，肿块组织生长状况一般，外观大部分呈淡淡白色，周边血管不丰富，有的肿块在植入处呈分散状或者扁平状，外部包膜整齐无血管分布。

由表2可以看出，龟甲胶多肽组小鼠的体重与对照组无明显差别，而瘤重则非常显著低于对照组，抑瘤率为85.44%，说明本发明龟甲胶多肽可以有效抑制肉瘤的生长。

（2）实体肿瘤量效关系实验

表3抑瘤作用()动物数(n)体重(g)

如表3所示，各组的体重无明显差别，而不同剂量的龟甲胶组的瘤重则非常显著低于对照组，抑瘤率分别为74.10%，66.48%，54.79%，说明本发明龟甲胶多肽在各个剂量下均可以有效抑制肉瘤生长，随着给药剂量增加，抗肿瘤效果增强，呈明显的剂量效应关系。

实验结果说明，本发明龟甲胶多肽能够有效抑制肉瘤细胞的生长，治疗肉瘤，可用于制备抗肿瘤或者肿瘤辅助治疗的药物、特殊膳食食品或保健食品。

实验例2本发明龟甲胶多肽的抗人肺癌裸鼠移植瘤实验

1、材料和方法

动物：BALB／C裸鼠30只，3～4周龄，体质量15g左右；购自武汉大学实验动物中心

瘤种：人肺癌A549细胞株，购自武汉大学保种中心。

龟甲胶多肽：按照本发明实施例2的方法制备。

2、试验方法：

（1）对老鼠实体肿瘤生长的抑制作用

在每只裸鼠右前腋皮下接种(1x10⁷／ml)对数生长期A549细胞株0.2m1，待移植瘤直径约5mm时，取10只荷瘤裸鼠随机分成2组开始实验，分为对照组、龟甲胶多肽组。将龟甲胶多肽溶解在生理盐水中，制成10%浓度的龟甲胶多肽溶液。

对照组口服生理盐水，龟甲胶多肽组口服10%浓度的龟甲胶多肽溶液，每天按照0.2ml（龟甲胶多肽组相当于接种20mg龟甲胶多肽/天.只鼠）剂量要求分别灌胃，灌胃十天后停止给药，一周后处死动物，解剖，观察肿瘤生长状况，游标卡尺测量移植瘤最长径(a)和最短径(b)，按公式(V=0.52×ab2)计算体积；称重瘤体，计算肿瘤组织微血管密度。

抑瘤率计算：

肿瘤组织微血管密度计数：

取各组部分移植瘤组织10％甲醛固定。石蜡包埋.4μm连续切片，分别做常规HE染色和CD34免疫组化染色，移植瘤石腊标本4μm厚度切片2张，常规脱腊。组织抗原修复采用微波抗原修复法，CD34抗工作浓度均为l：50：具体染色步骤按照试剂盒说明书操作。按Weidner微血管计数法计算微血管数目。本过程采用盲法.由两位经验丰富的病理专家同时计数3次，取均值作为MVD值。

统计学处理：数据以或％表示，用SAS软件包中的方差分析(ANOVA)和直线回归分析处理数据，均为双侧检验，α取0.05。

3、实验结果

实验结果如表4和图4～5所示：

表4龟甲胶的抑瘤作用()

如表4所示，龟甲胶多肽组小鼠的体重与对照组无明显差别，而瘤重则非常显著低于对照组，抑瘤率为53.15%。

如图3～4所示，对照组小鼠肿瘤明显，体积大，而本发明龟甲胶多肽组小鼠的肿瘤不明显，体积较小。

如图5镜下观察结果所示，对照组小鼠肿瘤明显，体积大生长旺盛，肿块组织周边血管丰富，呈充血状；而本发明龟甲胶多肽组小鼠的肿瘤不明显，体积较小，外观大部分呈淡淡白色，周边血管不丰富。

实验结果说明，本发明龟甲胶多肽能够有效抑制肺癌细胞的增殖，减少肿瘤组织中血管数量，治疗肺癌，可用于制备抗肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物、特殊膳食食品或保健食品。

综上，本发明龟甲胶多肽可以有效抑制肿瘤细胞的生长，对肉瘤和肺癌的疗效确切，副作用小，可制备抗肿瘤药物或者用于肿瘤辅助治疗的药物、特殊膳食食品或保健食品，应用前景良好。

Claims (10)

1.一种制备龟甲胶多肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取龟甲胶，加水煮沸溶解，得龟胶液；

（2）调节龟胶液pH至6.9～9.0，在48～52℃的条件下，加入广西酶至浓度为0.3～3.0g/L，恒温反应0.5～4h；

（3）再调节溶液pH至8.0～9.0，在53～57℃的条件下，加入碱性蛋白酶至浓度为0.3～3.0g/L，恒温反应0.5～4h；

（4）然后再调节溶液pH至6.0～9.0，在48℃～52℃的条件下，加入风味酶至浓度为0.3～3.0g/L，恒温反应0.5～4h；

（5）升温至75～90℃，保温3～15分钟，使酶失活；

（6）抽滤，得滤液，浓缩，干燥，即得龟甲胶多肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，龟胶液的浓度为50～120g/L；优选地，所述龟胶液的浓度为80g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述pH为7.5；所述温度为50℃；所述广西酶的浓度为0.64g/L；所述反应的时间为2h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述pH为8.0；所述温度为55℃；所述碱性蛋白酶的浓度为1.6g/L；所述反应的时间为2h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述碱性蛋白酶为alcalase。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述pH为7.0；所述温度为50℃；所述风味酶的浓度为0.4g/L；所述反应的时间为2h。

7.权利要求1～6任意一项方法制备得到的龟甲胶多肽。

8.权利要求7所述龟甲胶多肽在制备抗肿瘤或者用于肿瘤辅助治疗的特殊膳食食品、药品或者保健品中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述肿瘤是肉瘤或者肺癌。

10.一种抗肿瘤或者用于肿瘤辅助治疗的药品、特殊膳食食品或者保健品，其特征在于：它是以权利要求7所述龟甲胶多肽为活性成分，加上药品、食品或保健食品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。