CN103610699B - 一种蛞蝓的提取方法及其抗肺癌应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛞蝓的提取方法及其抗肺癌应用。包括（1）、将蛞蝓真空冻干，加入纯化水然后进行水浴搅拌，向其中加入高浓度乙醇溶液，搅拌均匀至乙醇浓度为60-70%，静置，然后固液分离；（2）、采用无机陶瓷膜系统对步骤（1）所得的液体进行澄清截留，得到蛞蝓总清液；（3）、对步骤（2）所得的蛞蝓总清液再经反渗透膜浓缩；（4）、对步骤（3）所得的超滤液进行浓缩干燥，得到的水溶性蛞蝓粉。本发明所得的蛞蝓粉的分子量集中在20000到3000之间，具有显著的抑癌作用，肿瘤抑制率高于华蟾素，接近于环磷酰胺。本发明的水溶性蛞蝓粉用于治疗肺癌，高效且低毒。

Description

一种蛞蝓的提取方法及其抗肺癌应用

技术领域

本发明涉及蛞蝓技术领域，具体地说，涉及一种蛞蝓的提取方法及其抗肺癌应用。

背景技术

近半个世纪以来，肺癌的发病率及死亡率均在逐年增加，到20世纪末肺癌已占恶性肿瘤死亡的首位。根据世界卫生组织(WHO)定期公布的资料显示，肺癌的发病率和死亡率在世界各国均呈明显上升的趋势，尤其在工业发达的国家。各种污染，如车辆尾气、抽烟也是引发肺癌的诱因。在许多发达国家里肺癌已是最常见的恶性肿瘤了，在男性常见恶性肿瘤里，肺癌位列第一，在女性常见恶性肿瘤里，肺癌位列第二。28个发达国家公布的调查统计资料显示肺癌已成为恶性肿瘤中最常见的死亡原因。在肺癌中非小细胞肺癌(Non-SmallCell Lung Cancer，NSCLC)约占85％-90％，而非小细胞肺癌中以肺腺癌为主(约占40％)。内科治疗、外科治疗，以及放射治疗是目前在临床上应用较多、疗效较确切的肺癌治疗方法。此外还有免疫治疗、介入治疗等。药物方面，不管是化学药——广谱抗癌药，如环磷酰胺(CTX)、顺铂等，还是中药，如长春碱类，它们的选择性低、毒性大。就确诊肺癌患者的实际情况而言，患者或需同时接受多种药物、治疗方法，又或不能接受任何一种毒性大的药物、损伤性治疗方法，这都会影响患者的生存成本和生活质量。

故采用高效的制药方法，制备高效、毒性低的抗癌药物成为医药研究者热衷的课题。

蛞蝓，一种对肺癌的抑制有特异性、毒性低的中药，对小细胞肺癌和肺腺癌，及中晚期不能放疗和化疗的肺癌患者均有针对性。但因目前对蛞蝓物质基础研究仍缺乏，故采用切割分子量段的手段来分离富集当中的有效物质。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种蛞蝓的提取方法及其抗肺癌应用。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明根据蛞蝓特点，利用无机陶瓷膜和反渗透膜的特点，利用组合膜分离系统，选择性富集目标分子量段的蛞蝓成分，具体提取方法如下：

一种蛞蝓的提取方法，包括如下步骤：

(1)、将蛞蝓真空冻干，加入纯化水然后进行水浴搅拌，向其中加入高浓度乙醇溶液，搅拌均匀至乙醇浓度为60-70％，静置，然后固液分离；

(2)、采用无机陶瓷膜系统对步骤(1)所得的液体进行澄清截留，得到蛞蝓总清液，所述的无机陶瓷膜的孔径为50nm-800nm，所述的无机陶瓷膜系统分离的频率33.35-38.05Hz，进膜压力1.5-1.9bar，出膜压力1-1.25bar；

(3)、对步骤(2)所得的蛞蝓总清液再经反渗透膜浓缩，所述的反渗透膜滤过的频率50Hz，进膜压力22-28bar，出膜压力22-26bar；

(4)、对步骤(3)所得的超滤液进行浓缩干燥，得到的水溶性蛞蝓粉。

在上述提取方法中，所述的蛞蝓是高突足襞蛞蝓全虫(Vaginulusalte Ferussac，1821)，隶属软体动物门、腹足纲、肺螺亚纲、柄眼目、足襞蛞蝓科、足襞蛞蝓属。

在上述提取方法中，所述的蛞蝓是新鲜采集的或真空冻干的或冷冻的或超微粉碎的。

在上述提取方法中，所述的纯化水重量不低于蛞蝓重量的20倍。

在上述提取方法中，步骤(1)所述高浓度乙醇溶液的乙醇浓度为体积百分数75％以上。

在上述提取方法中，步骤(1)所述固液分离方式为抽滤、离心分离或其它物理分离方式。

在上述提取方法中，步骤(1)所述水浴搅拌的温度是50℃，静置温度是30℃。

在上述提取方法中，步骤(4)所述浓缩的方式为真空旋转浓缩或其它可控温度的浓缩方式；所述干燥方式为真空冷冻干燥、喷雾干燥或其它物理干燥方式。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明根据膜分离原理和技术，得到水溶性蛞蝓粉。所得的水溶性蛞蝓粉的分子量集中在20000到3000之间。经采用理化鉴别、薄层鉴别、紫外-可见分光光度法、分子量检测等方法研究，认为当中存在物质可能是蛋白质、多肽、多糖、氨基酸、生物碱成分。凸显该分子量段蛞蝓粉混合物的作用效果，拓宽了蛞蝓药材的应用范围；

2、本发明采用人源肺腺癌细胞株A549裸小鼠移植瘤模型，对蛞蝓进行了抗肺癌试验。结果发现，分子量集中在20000到3000之间的蛞蝓粉混合物具有显著的抑癌作用，肿瘤抑制率高于华蟾素，接近于环磷酰胺。本发明的水溶性蛞蝓粉用于治疗肺癌，高效且低毒。

3、本发明所采用的膜分离技术适用范围广，无相变过程，节能，无污染，不引入杂质，操作简单，集浓缩、分离、除杂于一体，所得产品纯度高，稳定性好，尤其适合热敏性物质。所得的水溶性蛞蝓粉混合物与适当的辅料混合，可制成喷雾剂、胶囊剂，片剂，丸剂，冻干粉针剂和水针剂等，扩大临床候选抗肺癌药物种类和蛞蝓粉的应用范围。

附图说明

图1为蛞蝓粉样品HKY对人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤的抑制作用。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐述本发明。需说明，本发明要求保护的包括但不限于以下实施例。

实施例1：

蛞蝓真空冻干，加入纯化水于50℃水浴搅拌4小时，向其中加入85％乙醇，搅拌均匀至乙醇浓度为60-70％。于30℃下静置24小时后，离心分离固体物。离心液经50nm无机陶瓷膜分离截留得到蛞蝓总清液(无机陶瓷膜系统分离的频率33.35Hz，进膜压力1.5bar，出膜压力1bar)。蛞蝓总清液再经反渗透膜浓缩(反渗透膜滤过的频率50Hz，进膜压力28bar，出膜压力26bar)，收集超滤浓缩液，真空旋转浓缩后，真空冷冻干燥，即得到水溶性蛞蝓粉混合物，以鲜蛞蝓重量计算，得率0.3％。

把已干燥的蛞蝓粉末按0.3g量直接装进胶囊壳里即得成品蛞蝓粉样品HKY。

实施例2：

蛞蝓真空冻干，加入纯化水于50℃水浴搅拌4小时，向其中加入95％乙醇，搅拌均匀至乙醇浓度为60-70％。于30℃下静置24小时后，离心分离固体物。离心液经500nm无机陶瓷膜分离截留得到蛞蝓总清液(无机陶瓷膜系统分离的频率38.05Hz，进膜压力1.9bar，出膜压力1.25bar)。蛞蝓总清液再经反渗透膜浓缩(反渗透膜滤过的频率50Hz，进膜压力22bar，出膜压力22bar)，收集超滤浓缩液，真空旋转浓缩后，真空冷冻干燥，即得到水溶性蛞蝓粉混合物，以鲜蛞蝓重量计算，得率0.1％。

把已干燥的蛞蝓粉末按0.3g量直接装进胶囊壳里即得成品。

实施例3  实施例1的活性实验

下面通过药效学试验阐述蛞蝓粉样品HKY(实施例1)在治疗肺癌方面的效果。

(一)、实验材料及分组

实验动物：来源、种系、品系：SPF级BALB/c裸小鼠。

日    龄：28-35日。

性    别：雌雄各半。

人癌细胞株：肺腺癌A549，由中山大学实验动物中心细胞库提供。

移植瘤：人源肺腺癌A549细胞株接种于腋皮下而建立。细胞接种量6管，每管数量约为1×10⁷。接种形成移植瘤后再在裸小鼠体内传3代后使用。

实验药物：HKY，每天灌胃一次，广州白云山汉方现代药业有限公司提供；阳性对照药为环磷酰胺，每两天灌胃一次，华蟾素，每天灌胃一次；阴性对照为生理盐水，每天灌胃一次。

实验分组：阴性对照组(生理盐水)；HKY低剂量组(528mg/kg)；HKY高剂量组(1056mg/kg)，HKY低剂量+华蟾素组((528mg+624mg)/kg)；阳性对照组环磷酰胺(CTX)30mg/kg，华蟾素624mg/kg。

(二)实验方法

取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-300mm³后将动物随机分组。根据预试验结果，HKY低剂量组(528mg/kg)；HKY高剂量组(1056mg/kg)，HKY低剂量+华蟾素组((528mg+624mg)/kg),每天灌胃一次，连续21天；CTX30mg/kg，每两天灌胃一次，连续10天；华蟾素624mg/kg，每天灌胃一次，连续21天。阴性对照组同时给等量生理盐水，每天灌胃一次。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每周2次，每次测量同时还需称鼠重。计算相对肿瘤增殖率。第21天称重，颈椎脱臼处死裸小鼠，连同包膜完整剥出肿瘤组积，称瘤重，计算各组平均瘤重，计算肿瘤抑制率。

抗肿瘤活性评价方法：

(1)相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：

$T/C(\%)=\frac{T_{\mathrm{RTV}}}{C_{\mathrm{RTV}}}\×100\%$

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b²

其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝V_t/V₀。其中V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积。

(2)肿瘤抑制率(％)，计算公式如下：

数据处理：实验数据均以表示，由SSPS13.0数据处理软件进行方差分析和组间t检验。

(三)实验结果

阳性对照组环磷酰胺(CTX)与阴性对照组比较，体重明显降低(P<0.05或P<0.01)；蛞蝓粉样品HKY组体重与阴性对照组比较则无明显改变(P＞0.05)，提示HKY对裸小鼠体重无明显影响。

蛞蝓粉样品HKY对人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤的抑制作用，见表1和图1。

表1.HKY对人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤的抑制作用

与阴性对照组相比，^**P<0.01，^*P<0.05。

综上所述，HKY对人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤有显著的抑制生长作用，其作用强于阳性对照中药华蟾素，接近于环磷酰胺；HKY与华蟾素联合应用时有协同增效作用。HKY对动物体重无明显影响。

实施例4  实施例2的活性实验

将实施例2所得水溶性蛞蝓粉参照实施例3进行活性实验，结果显示其对人源肺腺癌A549裸小鼠移植瘤也有显著的抑制生长作用，其作用强于阳性对照中药华蟾素，接近于环磷酰胺；与华蟾素联合应用时有协同增效作用，对动物体重无明显影响。

Claims (10)

1.一种蛞蝓的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）、将蛞蝓真空冻干，加入纯化水然后进行水浴搅拌，向其中加入高浓度乙醇溶液，搅拌均匀至乙醇浓度为60-70%，静置，然后固液分离；

 （2）、采用无机陶瓷膜系统对步骤（1）所得的液体进行澄清截留，得到蛞蝓总清液，所述的无机陶瓷膜的孔径为50nm-800nm，所述的无机陶瓷膜系统分离的频率33.35-38.05Hz，进膜压力1.5-1.9bar，出膜压力1-1.25bar；

（3）、对步骤（2）所得的蛞蝓总清液再经反渗透膜浓缩，所述的反渗透膜滤过的频率50Hz，进膜压力22-28bar，出膜压力22-26bar；

（4）、对步骤（3）所得的超滤液进行浓缩干燥，得到的水溶性蛞蝓粉。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所得的水溶性蛞蝓粉混合物分子量集中在20000到3000之间。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的蛞蝓是高突足襞蛞蝓全虫；所述的蛞蝓是新鲜采集的或真空冻干的或冷冻的或超微粉碎的。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的纯化水重量不低于蛞蝓重量的20倍。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）所述高浓度乙醇溶液的乙醇浓度为体积百分数75%以上。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）所述固液分离方式为抽滤或离心分离。

7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（4）所述浓缩的方式为真空旋转浓缩，干燥方式为真空冷冻干燥或喷雾干燥。

8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）所述水浴搅拌的温度是50℃，静置温度是30℃。

9.权利要求1所述提取方法所得水溶性蛞蝓粉在制备抗肺癌药物中的应用。

10.一种抗肺癌药物的组合物，其特征在于，由权利要求1所得水溶性蛞蝓粉及药学上可接受的辅料组成。