CN101732340B - 一种花蕊石提取物的用途及制备方法 - Google Patents
一种花蕊石提取物的用途及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种花蕊石提取物的用途及制备方法，本发明公开了花蕊石(主成分为蛇纹石)提取液的制备方法及其抗癌用途。该提取物可从花蕊石包括蛇纹石单矿、含蛇纹石的大理岩及含有蛇纹石矿族特征的岩石中提取。该提取物来源于花蕊石药材、药材超微粉及其矿质悬浮颗粒、蛇纹石天然纳米纤维(以上来源包括生/锻制品)。通过体内外药理活性研究表明花蕊石提取物具有较强的抗癌活性，可望开发为以花蕊石提取物为原料的具有广泛临床使用价值和商业开发价值的抗癌新药。
Description
技术领域
本发明涉及中药花蕊石(蛇纹石)提取物制备方法及其抗癌的应用，属于化学及医药技术领域。
背景技术
中药矿物药花蕊石为2005版《中国药典》收载的中药矿物药品种，本品为变质岩类蛇纹大理岩，从祖国医学上看，花蕊石又名蛇纹石，异名花乳石《嘉祐本草》、白云石《全国中草药汇编》。始载于宋代《嘉佑本草》，《本草衍义》曰：“黄石中间有淡白点，以此得花之名。”《纲目》引《玉册》云：“花乳石，阴石也。生代州山谷中(在山西省)，有五色，可代丹砂匮药。蜀中汶山、彭县亦有之(四川省)。”从古代各家本草对其形状、产地、用途等方面进行考证与目前习用的花蕊石，即主要为含蛇纹石多少不等的大理岩相符。其中晶莹的白点是由方解石组成的大理岩，黄色的花斑或花纹既是为变质岩类岩石蛇纹石大理岩块具有化瘀止血的功效。始载于宋·《嘉佑本草》，《本草纲目·石部》谓其功专止血，酸以收之。临床上花蕊石多见于抗癌复方尤其见于抗肝癌复方中，临床治疗肝癌效果显著，而有关其水煎液、提取物及其化学组分、化学结构抗癌活性研究迄今为止尚未见报道。
花蕊石主要成分蛇纹石，是一种天然生成的镁的硅酸盐(Mg6[SiO4O10](OH)8)，蛇纹石为层状构造的Fe、Mg硅酸盐，含Ni、Co、Ca、An等元素，是矿物主要脉石矿物，有叶蛇纹石、胶蛇纹石、水蛇纹石和纤维蛇纹石共4个亚科(曹树明等蛇纹石理化性质及生物活性研究进展，中国民族民间医药)。其中以纤蛇纹石含量较大，纤蛇纹石纤维在垂直于纤维轴的二维方向上的尺寸小于100nm，一般在20-50nm之间，因此，它是一种天然产出的纳米级矿物，具有一维纳米纤维特性，即小尺寸效应、高比表面积和晶格弯曲(彭同江等，纤蛇纹石石棉的纳米效应与生物活性岩石矿物学杂志2000，19(3))，具有高生物活性。花蕊石在传统用药过程中，经加工处理粉碎煎煮后，水溶液中纤蛇纹石纤维外柱表面的氢氧镁石八面体层溶解出OH-和Mg2+形成碱性环境，使得纤蛇纹石极易与酸性体液发生反应。纤蛇纹石纳米颗粒具有大量活性基团，李学军等通过对蛇纹石化学成分、晶体结构及键性的分析，将蛇纹石的活性基团划分为5类，即不饱和Si-O-Si、O-Si-O、含镁键类、羟基和氢键活性基团的大量存在使蛇纹石具有很高的化学活性(李学军天然蛇纹石活性机理初探岩石矿物学杂志2003，22(4))。水煎液中富含大量无机离子与纳米颗粒，小尺寸效应使纤蛇纹石纤维有非常好的柔韧性和抗拉强度，使得纤蛇纹石很容易进入肿瘤细胞，让各种活性基团在细胞中发挥作用。水溶液中，纤蛇纹石纤维外柱表面的氢氧镁石八面体层溶解出OH-和Mg2+形成碱性环境，细胞蛋白质的在复性时可能造成二硫键的错配，得不到天然构象，丧失功能活性，pH值的改变会影响酶分子的构象，使大量的酶(适合于pH在1.5～7之间)变形而失去活性，同时会影响底物、ES活性复合物的离解状态；溶液的pH和Mg2+离子强度的改变会使DNA变性，从而影响DNA的复制。Mg2+含量的增加抑制了酶的活性，活性下降(孙志贤，1995.现代生物化学理论与研究技术[M].北京：军事医学科学出版社.1995)；Mg2+含量的陡然增加也会影响氨基酸链的折叠由于Ca2+比Mg2+更易在氧化硅上吸附和沉淀，当硅氧四面体层裸露(即形成非晶质硅氧物外壳)时，细胞质Ca2+浓度会发生变化，从而影响Ca2+对细胞功能的调节功能；在碱性氧化环境下，Fe、Mg2+和Ca2+在非晶质硅氧物外壳上能形成络合物MO2Si(OH)2 +3或螯合物MO2Si(OH)0 2、M(OSi(OH)3)0 2并被吸附，使细胞功能必需的元素浓度发生变化(王华东，郝春曦，王建.1992.环境中的砷[M].北京：中国环境科学出版社)，造成细胞的损伤。而有关花蕊石(蛇纹石)生制品水煎液对癌细胞的细胞毒性研究目前尚未见报道。
作为传统中药的矿物药花蕊石生/制品水煎提取液已在体内外抗肿瘤实验中证明其具有明显的抑制肿瘤作用，花蕊石已见于中药抗癌复方，用于临床肿瘤治疗中。
本发明一方面证明花蕊石提取物的抗肿瘤用途，一方面将传统医药理论与现代科学理论结合，进一步诠释了中医理论。
发明内容
本发明目的在于提供中药花蕊石提取物的制备方法及作为其抗癌物质的应用。
本发明给出了一个具有抗癌作用的提取物制备技术及应用新方案，主要是利用花蕊石，本发明中所指花蕊石包括蛇纹石单矿、含蛇纹石的大理岩及含有蛇纹石矿族特征的所有岩石。
本发明给出了一个具有抗癌作用的药物制备技术及应用新方案是含有花蕊石药材(生/锻制品)、药材超微粉及其矿质悬浮颗粒、蛇纹石天然纳米纤维的提取液、完全提取物为主要活性成分的。
本发明所用提取溶剂为水。
花蕊石提取液及其完全提取物作为一种有效的抗癌药物，在应用于临床中的有效剂量可以根据日常常用处方剂量及患者病情酌量增减。
本发明的发明人根据临床的需要将花蕊石抗癌提取物制备为各个剂型而可添加药学上可接受的辅剂及载体供临床选择应用。
具体实施方案：
本发明提供一下技术措施，实施例仅用于说明本发明，并不是限制发明的权利范围。
一、药物制备实施例
实施例1：具有抗癌活性花蕊石水提取液及提取物的制备步骤：
取样：按《岩石矿物分析》中要求，采用交互法、四分法对花蕊石进行缩分，以保证试样均匀。以四分法取出花蕊石，将花蕊石洗净，风干。
粉碎：净制的花蕊石经高速万能粉碎机粉碎后，粉末过100-200目筛转移于烘箱中，于105℃恒温干燥2h，置干燥箱中放冷，备用。
提取：精密称定恒温干燥的花蕊石粉末100g，置于2000mL圆底烧瓶中，1∶10加入去离子水1000ml，回流提取2-4次，每次1-2h，趁热过滤，将过滤液浓缩，定容于100ml容量瓶中，加水至刻度，得到花蕊石水提取液。
取花蕊石水提浓缩液，冻干浓缩，得到花蕊石完全提取物冻干结晶粉；取花蕊石水提浓缩液，水浴蒸干，得到花蕊石完全提取物蒸干结晶粉。
二、花蕊石抗肿瘤实验研究
实施例2花蕊石(产地河南)、蛇纹石纤维(产地四川)生制品水煎提取液对人肝癌细胞HepG2，人肝癌细胞SMMC-7721、宫颈癌细胞Hela、结肠癌细胞SW-480的体外细胞抑制作用研究。
体外抑制癌细胞实验：
A：制备癌细胞悬液，取对数生长期的各肿瘤细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，用培养基配制成5×104个细胞/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μL。
B：37℃，5％CO2及饱和湿度下培养细胞24h。
C：将待测药液，经0.45μm滤膜过滤，分别按含不同生药量的浓度加药，每孔100μL，设5个复孔，将正常癌细胞组作为阴性对照组，对照组加等量新鲜培养液。37℃，5％CO2及饱和湿度下培养细胞。
D：培养72h后，加入新配制的MTT，每孔20μL，置37℃CO2培养箱内培养作用4h，小心吸去上清液，加入二甲亚砜(DMSO)150μL，在振荡器上轻轻振荡5min后，用酶标仪于492nm处测吸光度值(A值).取5孔平均值，计算抑制率.根据公式：
细胞抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％
实验重复三次，实验结果见表1，表2，表3。
表1 花蕊石生制品水煎液对不同人肿瘤细胞的抑制作用
表2 蛇纹石生品水煎液对不同人肿瘤细胞的抑制率
表3 蛇纹石制品水煎液对不同人肿瘤细胞抑制率
表4 花蕊石抗肿瘤体外抑制肿瘤细胞结果
结果表明，花蕊石、蛇纹石纤维生制品水煎提取液对人肿瘤细胞有明显的抑制作用。
实施例3花蕊石纤维纳米粒子对小鼠肝肿瘤H22的体内抗癌活性研究。
A：H22肿瘤细胞的培养与传代
H22细胞接种前与DMEM+10％小牛血清培养液中37℃、5％CO2传代培养至状态良好，制成2×107个/ml的细胞悬液，接种于健康昆明种小鼠腹腔，腹水传代。
B：建立H22肝癌小鼠实体瘤模型
无菌条件下用注射器抽取接种7-9天的H22小鼠腹水，以灭菌生理盐水稀释调整细胞量为1×107个/ml，接种到50只小鼠腋下，每只0.2ml，观察小鼠生长情况，制作实体瘤模型。
C：动物分组与给药
接种24h后随机分成5组，每组10只，每天上午定时灌胃给药：①阴性对照组，生理盐水0.2ml灌胃。②花蕊石制品组，花蕊石制品水煎液(10g·kg-1·d-1)灌胃0.2mL；③蛇纹石生品组，蛇纹石生品水煎液(10g·kg-1·d-1)灌胃0.2mL；④蛇纹石制品组，蛇纹石制品水煎液(10g·kg-1·d-1)灌胃0.2mL；⑤阳性对照组，环磷酰胺(20mg·kg-1·d-1)灌胃0.2mL。各组连续灌胃10d，每天观察实体瘤的生长情况。
D：抑瘤率检测
小鼠经实验处理后，于第11d脱颈椎处死，镊子镊住小鼠右腋肿瘤生长部位皮肤后，用手术剪子剪开皮肤，暴露肿瘤，手术剪钝性剥离肿瘤，用天平称瘤重，计算抑制率。以抑瘤率来判断抑瘤作用。
肿瘤抑制率(％)＝[1-(平均实验组瘤重/平均对照组瘤重)]×100％。
E：统计学处理
实验数据用X±S表示。P＜0.05或P＜0.01为差异有显著或高度显著性水平。
采用SPSS11.5统计软件进行处理，组间比较用单因素方差分析和LSD检验，结果见表5。
表5 花蕊石、对H22肝癌小鼠实体瘤抑瘤率(x±s n＝10)
注：*与阴性组比较，P＜0.01
实验结果经统计学处理，各受试给药组与H22阴性对照组瘤重差异具有统计学意义(P＜0.01)，各给药组对H22肝癌小鼠肿瘤抑制率均高于30％(中药的瘤重抑制率＞30％，评定药物具有抑瘤作用)，表明花蕊石制品水煎液，蛇纹石生品水煎液，蛇纹石制品水煎液对H22肝癌实体瘤具有明显的抑制作用。
Claims (7)
1.一种花蕊石提取物的制备方法，其特征在于：
取样：按岩石矿物分析中要求，采用交互法、四分法对花蕊石进行缩分，以保证试样均匀，以四分法取出花蕊石，将花蕊石洗净，风干；
粉碎：净制的花蕊石经高速万能粉碎机粉碎后，粉末过100-200目筛转移于烘箱中，于105℃恒温干燥2h，置干燥箱中放冷，备用；
提取：精密称定恒温干燥的花蕊石粉末100g，置于2000mL圆底烧瓶中，1∶10加入去离子水1000ml，回流提取2-4次，每次1-2h，趁热过滤，将过滤液浓缩，定容于100ml容量瓶中，加水至刻度，得到花蕊石水提取液；
取花蕊石水提浓缩液，冻干浓缩，得到花蕊石完全提取物冻干结晶粉；取花蕊石水提浓缩液，水浴蒸干，得到花蕊石完全提取物蒸干结晶粉。
2.根据权利要求1所述的一种花蕊石提取物的制备方法，其特征在于所述的花蕊石选自蛇纹石单矿、含蛇纹石的大理石的生品或者制品。
3.根据权利要求1所述的花蕊石提取物的制备方法制得的花蕊石提取物，其特征在于用花蕊石提取物制备成抗癌药物。
4.根据权利要求3所述的用花蕊石提取物制备成的抗癌药物，其特征在于所述用花蕊石制备成的抗癌药物中含有花蕊石药材、生/锻制品及其矿质悬浮颗粒、蛇纹石天然纳米纤维的提取液、完全提取物为主要活性成分的。
5.根据权利要求1所述的花蕊石提取物制备方法制备成的花蕊石提取液、提取物，其特征在于制备的各种剂型添加药学上能接受的辅剂供临床治疗癌症选择应用。
6.根据权利要求3所述的用花蕊石提取物制成的抗癌药物，其特征在于在体内外均抑制癌细胞增长，能应用于肝癌、乳腺癌、肠癌、宫颈癌的治疗。
7.根据权利要求3所述的用花蕊石提取物制成的抗癌药物，其特征是所述抗癌药物给药方式为口服给药，局部注射给药或静脉注射给药。
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