CN103880910A - 一种环黄芪醇的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环黄芪醇的制备方法及其用途。环黄芪醇的制备方法是以黄芪甲苷或黄芪皂苷为原料，通过氧化、还原、水解、萃取、纯化制得高纯度的环黄芪醇。该方法操作简便、条件温和、产品质量好、收率高。环黄芪醇的用途是，在制备抗癌辅助治疗药物中的应用。以其为药物活性成分制得的抗癌辅助治疗药物，能增强抗癌药物疗效、降低抗癌药物毒性、预防和治疗抗癌药物治疗引起的白细胞降低的抗癌辅助治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种环黄芪醇的制备方法及其用途，属于医药化工领域
背景技术
癌症是危害人类健康的三大疾病之一，其发病率及死亡率在某些国家已上升到第1位，在我国每年大约有350万人患癌，250万人死于癌症，而且还在不断的增长，并逐渐呈年轻化趋势。癌症每年给我国造成的直接经济损失逾千亿元。因此，研制抗癌药物是改善人类生活质量的一个重要方式，也是是广大医药工作者面临的重大课题之一。目前开发成功的很多抗癌药物，虽然有较明显治疗效果，但其毒副反应也显而易见，它在杀伤癌细胞的同时，也杀害了人体正常细胞，伴随着药物治疗而来的，是患者胃肠道功能紊乱、肝肾功能的损伤、白细胞数目减少和免疫力降低等毒副作用；使抗癌药物的临床应用受到限制。因此，目前抗癌药物研究，一方面继续寻找杀死癌细胞的治疗药物外，开发增强抗癌药物的疗效，降低其毒副作用为主要功效的抗癌辅助药物也越来越受到重视。
黄芪皂苷，是黄芪属(Astragalus)植物中的一类活性成分，是黄芪药效物质基础重要药组成之一，是一类对人类健康有显著保健作用的天然活性成分，具有调节机体免疫、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、保护心脑血管、保护肝肾、促进骨髓造血等作用。当其与抗肿瘤化疗药物配合使用时，能较好的改善人体对化疗药物的耐受性，提高癌症患者的生存质量；但由于黄芪皂苷的相对分子质量较大、具有溶解惰性等原因使其在体内的相对生物利用度不足，限制了其作为药物的开发和推广。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种环黄芪醇的制备方法，该种方法反应温和、操作简便、收率高、产品质量好、便于大规模工业化生产。
本发明的第二目的是提供环黄芪醇的用途，即在制备抗癌辅助治疗药物中的应用。以其为药物活性成分制得的抗癌辅助治疗药物，能增强抗癌药物疗效、降低抗癌药物毒性、预防和治疗抗癌药物治疗引起的白细胞降低的抗癌辅助治疗作用。
本发明实现其第一目的，所采用的第一种技术方案是，一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤：
A、氧化
将黄芪甲苷加入溶剂配制成黄芪甲苷含量为0.001-0.05mol/L的悬浊液；加酸调节悬浊液的pH至3-6，向悬浊液中加入氧化剂，在5-35℃下避光反应12-96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:2-1:15；随后加碱调pH至7-10，减压浓缩至无醇味，再经过滤或萃取得到氧化产物；
B、还原
将A步得到的氧化产物加入溶剂分散成溶液或悬浊液；加入的溶剂与A步的黄芪甲苷的质量比为1:0.7-1:40；然后加入硼氢化钠或硼氢化钾作为还原剂，还原反应12-48h后，再加入乙酸或乙酸水溶液调节反应液的pH至4-6酸性以终止还原反应；其中还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:2-1:8；
C、水解
向步骤B的反应液加入强酸，在10-60℃下静置或搅拌反应6-96h；加入的强酸与反应液的质量比为0.5-3:100；
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加碱、调pH至中性，再采用与反应液等体积的乙酸乙酯萃取3-5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、重结晶中的一种或多种方法进行纯化，即得环黄芪醇。
本发明实现其第一目的，所采用的第二种技术方案是，一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤：
A、氧化
将黄芪皂苷加入溶剂配制成黄芪皂苷含量为0.6-50g/L的悬浊液；加酸调节悬浊液的pH至3-6，再向悬浊液中加入氧化剂，在5-35℃下避光反应12-96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为3:1-1:5；随后加碱调pH至7-10，减压浓缩至无醇味，再经过滤或萃取得到氧化产物；
B、还原
将A步得到的氧化产物加入溶剂分散成溶液或悬浊液，加入的溶剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:0.6-1:50；然后加入硼氢化钠或硼氢化钾作为还原剂，还原反应12-48h后，再加入乙酸或乙酸水溶液调节反应液的pH至4-6酸性以终止还原反应；其中还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:1.5-1:20；
C、水解
向步骤B的反应液加入强酸，在10-60℃下静置或搅拌反应6-96h；加入的强酸与反应液的质量比为0.5-3:100；
D、萃取
向步骤C得到的反应液中加入碱，调pH至中性，采用与反应液等体积的乙酸乙酯萃取3-5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、重结晶中的一种或多种方法进行纯化，即得环黄芪醇。
与现有技术相比，本发明的有益成果是：
一、黄芪甲苷或黄芪皂苷通过液相中的氧化、还原、水解、萃取和纯化反应，使黄芪甲苷或黄芪皂苷降解得到较小分子量的环黄芪醇，并有效去除其它成分，获得的环黄芪醇的品质高。测试表明本发明方法制备的环黄芪醇的纯度在95%以上。
二、整个制备过程均在液相中进行、最高温度不超过80度，其工艺条件温和、收率高、操作简便、对操作人员技术要求低，适合工业化推广。
上述步骤A的黄芪皂苷为环黄芪醇类皂苷的含量不低于50%的黄芪皂苷。
当环黄芪醇类皂苷的含量低于50%时，混杂有较多的黄酮苷等成分，在反应时会发生较多的副反应，从而影响制备物的纯度。
上述步骤A中的溶剂选用水、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的混合液。
这三种溶剂能较好的溶解黄芪皂苷，且其价廉易得。
上述步骤A中的氧化剂为高碘酸、高碘酸钠或高碘酸钾。
这三种氧化剂既能对黄芪皂苷中的糖部分进行氧化使其开链，以便于后续的水解去除，又不影响苷元（环黄芪醇）部分，从而能很好地提取出环黄芪醇。
上述步骤A中的萃取的具体操作是：加入与减压浓缩后的反应液等体积的正丁醇萃取2-4次；合并正丁醇萃取液，水洗2次，再蒸干正丁醇。
使用正丁醇萃取，能够有效的去除步骤A中产生的小分子杂质，另外可去除未完全反应的氧化剂。
上述步骤B中的溶剂为体积分数为0-50%的甲醇水溶液或乙醇水溶液。
使用体积分数为0-50%的甲醇水溶液或乙醇水溶液，能够较好的溶解和分散A步的氧化产物，且对D步的萃取无影响。
上述步骤C中加入的强酸为硫酸、盐酸或硝酸。
这三种强酸价廉易得，并能很好的进攻糖苷键使其断裂，从而水解得到环黄芪醇。下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本发明实现其第二发明目的所采用的技术方案是，上述制备方法得到的环黄芪醇的用途是，环黄芪醇在制备抗癌辅助治疗药物中的应用。
上述用途的具体应用方法是：将环黄芪醇作为活性成分，添加制药辅剂采用药物制剂技术，制成抗癌辅助治疗用的固体口服制剂或液体口服制剂。
所述的固体口服制剂优选为普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒、胶囊、滴丸、散剂或缓控释制剂。所述的缓控释制剂优选为缓控释片剂、颗粒或胶囊。
所述的液体口服制剂优选为口服液或乳剂。
采用本发明方法制得的环黄芪醇，其品质高，纯度在95%以上，将其作为药效成分制成抗癌辅助治疗药物，药效实验表明其抗癌辅助治疗效果显著：
与单独使用抗癌药物相比，在对小鼠H22肝癌和S180肉瘤的抑制率增加20%以上；同时明显改善由于单独使用抗癌药物引起的胸腺指数、脾指数、白细胞数下降，与单独使用抗癌药物相比，这些参数改善50%以上。在相同效果下，作为抗癌辅助药物，其用药量仅为黄芪皂苷的30%及以下。
高纯度环黄芪醇用于抗癌辅助药物效果好的可能机理是：与黄芪皂苷相比，环黄芪醇具有相对较小的分子质量和较强的亲脂性，其在生物膜渗透和胃肠道吸收方面具有优势，有更好的生物利用度，从而有更好的抗癌辅助治疗效果。
具体实施方式
实施例1
A、氧化
取780mg(约1mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入水配置成黄芪甲苷含量为0.01mol/L的悬浊液，加盐酸调节悬浊液的pH至3-4，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钠在20℃下避光反应48小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:10；随后加Na2CO3调pH至7-8，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入30%的甲醇水溶液分散成悬浊液，加入的30%甲醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:0.7；然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入50%乙酸至反应液pH到4-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:2。
C、水解
向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为0.5:100，在50℃下静置反应48h；
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加入K2CO3，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化：用适量的CH2Cl2-丙酮溶解后，然后置于10℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为99%。
实施例2
A、氧化
取1.5g(约2mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入水配置成黄芪甲苷含量为0.001mol/L的悬浊液，加硫酸调节悬浊液的pH至4-5，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸在5℃下避光反应96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:2；随后加NaOH调pH至8-9，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼多次后，得到氧化产物
B、还原
将A步得到的氧化产物用水分散成悬浊液，加入的水与A步的黄芪甲苷的质量比为1:20；然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应12h后，加入50%乙酸至反应液pH到4-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:4。
C、水解
向步骤B的反应液加入盐酸，使加入的盐酸与反应液的质量比为2：100，在30℃下搅拌反应72h；
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加入NaHCO3，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化：用适量的石油醚-丙酮溶解后，然后置于4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为98%。
实施例3
A、氧化
取800mg(1mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入20%甲醇水溶液配置成黄芪甲苷含量为0.05mol/L的悬浊液，加磷酸调节悬浊液的pH至5-6，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸在25℃下避光反应48小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:15；随后加KHCO3调pH至7-8，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入50%的甲醇水溶液分散成溶液，加入的50%甲醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:40；然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入50%乙酸至反应液pH到4-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:8。
C、水解
向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为0.5：100，在60℃下搅拌反应12h；
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加氨水，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化：用适量的丙酮溶解后，然后置于-4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为98%。
实施例4：
A、氧化
取78.5mg(0.1mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入50%甲醇水溶液配置成黄芪甲苷含量为0.05mol/L的悬浊液，加甲酸调节悬浊液的pH至3-4，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钾在20℃条件下避光反应12小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:5；随后加Na2CO3调pH至7-8，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼多次后，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入20%的乙醇水溶液分散成悬浊液，加入的20%乙醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:10；然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应12h后，加入50%乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:8。
C、水解
向步骤B的反应液加入盐酸，使加入的盐酸与反应液的重量比为1：100，在40℃下搅拌反应12h。
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加入KHCO3，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化：用适量的甲醇溶解后，滴加水使水的比例为10%(v/v)，然后置于0℃冰水浴条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为97%
实施例5：
A、氧化
取1.5g(约2mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入乙醇配置成黄芪甲苷含量为0.05mol/L的悬浊液，加磷酸调节悬浊液的pH至5-6，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钾在5℃下避光反应96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:13；随后加NaHCO3调pH至8-9，减压浓缩至无醇味，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼几次后，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入水溶解分散成悬浊液，加入的水与A步的黄芪甲苷的质量比为1:10；然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:2。
C、水解
向步骤B的反应液加入硝酸，使加入的硝酸与反应液的质量比为1：100，在15℃下静置反应96h；
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加氨水，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析纯化：洗脱剂选用石油醚：乙酸乙酯=5:1～1:5，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为96%。
实施例6：
A、氧化
取400mg(约0.5mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入40%乙醇水溶液配置成黄芪甲苷含量为0.005mol/L的悬浊液，加盐酸调节悬浊液的pH至3-4，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钾在5℃下避光反应96小时，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:4；然后加入乙二醇终止氧化；随后加NaOH调pH至9-10，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取2次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入50%乙醇水溶液分散成溶液，加入的乙醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:15；然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:5。
C、水解
向步骤B的反应液加入盐酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为3:100，在15℃下搅拌反应96h；
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加KOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析结合重结晶纯化：洗脱剂选用石油醚：丙酮=5:1～1:3，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，用适量氯仿-甲醇溶解，置于4℃下静置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为98%。
实施例7：
A、氧化
取6g(约4mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入水配置成黄芪甲苷含量为0.001mol/L的悬浊液，加盐酸调节悬浊液的pH至3-4，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钾在15℃下避光反应72小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:10；随后加NaHCO3调pH至8-9，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入10%甲醇水溶液分散成悬浊液，加入的10%甲醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:30；然后加入硼氢化钾作为还原剂，还原反应48h后，加入乙酸至反应液pH到5-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:2。
C、水解
向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为3：100，在10℃下搅拌反应6h；
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加KOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析纯化：洗脱剂选用乙酸乙酯：甲醇=100:0.1～10:1，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为95%。
实施例8：
A、氧化
取1.5g(约2mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入体积比为1:1的甲醇乙醇溶液配置成黄芪甲苷含量为0.01mol/L的悬浊液，加乙酸调节悬浊液的pH至3-4，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸在25℃下避光反应48小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:7；随后加KOH调pH至9-10，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入5%乙醇水溶液分散成悬浊液，加入的5%乙醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:40。然后加入硼氢化钾作为还原剂，还原反应24h后，加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:8。
C、水解
向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为1:100，在60℃下静置反应36h；
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加NaOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用反相硅胶柱层析纯化：洗脱剂选用甲醇：水=50:50～100:0，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为96%。
实施例9：
A、氧化
取1.5g(约2mmol)黄芪甲苷作为原料，往其中加入10%乙醇水溶液配置成黄芪甲苷含量为0.03mol/L的悬浊液，加磷酸调节悬浊液的pH至4-5，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸在25℃下避光反应48小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:3；随后加KOH调pH至9-10，减压浓缩至无醇味，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼几次后，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入40%乙醇水溶液分散成悬浊液，加入的40%乙醇水溶液与A步的黄芪甲苷的质量比为1:1。然后加入硼氢化钾作为还原剂，还原反应48h后，加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:3。
C、水解
向步骤B的反应液加入硝酸，使加入的硝酸与反应液的质量比为2:100，在20℃下搅拌反应60h；
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加氨水，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用反相硅胶柱层析纯化，洗脱剂选用乙腈：水=30:70～80:20，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为96%。
实施例10：
A、氧化
取3g黄芪皂苷作为原料，往其中加入20%乙醇水溶液配置成黄芪皂苷含量为0.6g/L的悬浊液，加乙酸调节悬浊液的pH至3-4，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸在20℃下避光反应24小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为3:1；随后加NaOH调pH至8-9，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入10%甲醇水溶液分散成悬浊液，加入的10%甲醇水溶液与A步的黄芪皂苷的质量比为1:10；然后加入硼氢化钾作为还原剂，还原反应12h后，加入30%乙酸至反应液pH到5-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:1.5。
C、水解
向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为1:100，在60℃下搅拌反应6h。
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加KOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化：用适量的乙酸乙酯-乙醇溶解后，然后置于-10℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为96%。
实施例11：
A、氧化
取3g黄芪皂苷作为原料，往其中加入水配置成黄芪皂苷含量为30g/L的悬浊液，加甲酸调节悬浊液的pH至4-5，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钠在25℃下避光反应12小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为1:1；随后加氨水调pH至8-9，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入50%甲醇水溶液分散成悬浊液，加入的50%甲醇水溶液与A步的黄芪皂苷的质量比为1:0.6。然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:10。
C、水解
向步骤B的反应液加入硫酸，使加入的硫酸与反应液的质量比为2:100，在50℃下搅拌反应12h。
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加NaOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用重结晶方法纯化：用适量的CH2Cl2-甲醇溶解后，然后置于-4℃条件下放置24h，析晶，过滤干燥后即得纯度大于90%的环黄芪醇单体化合物。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为95%。
实施例12：
A、氧化
取3g黄芪皂苷作为原料，往其中加入30%乙醇水溶液配置成黄芪皂苷含量为10g/L的悬浊液，加磷酸调节悬浊液的pH至5-6，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钠在20℃下避光反应24小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为1:5；随后加NaOH调pH至8-9，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入水分散成悬浊液，加入的水与A步的黄芪皂苷的质量比为1:50；然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入30%乙酸水溶液至反应液pH到5-6终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:20。
C、水解
向步骤B的反应液加入盐酸，使加入的盐酸与反应液的质量比为3:100，在20℃下静置反应72h。
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加NaOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析结合重结晶纯化：用200～300目的正相硅胶柱层析纯化，样品与硅胶的质量比为1:7，洗脱剂选用CH2Cl2:丙酮=7:1～1:1，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，用适量石油醚-丙酮溶解，置于0℃下放置48h，析晶，过滤干燥即得纯度大于90%的环黄芪醇。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为97%。
实施例13：
A、氧化
取3g黄芪皂苷作为原料，往其中加入水配置成黄芪皂苷含量为50g/L的悬浊液，加硫酸调节悬浊液的pH至4-5，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸在25℃下避光反应12小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为1:3；随后加氨水调pH至7-8，减压浓缩至无醇味，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼几次后，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入30%乙醇水溶液分散成溶液，加入的30%乙醇水溶液与A步的黄芪皂苷的质量比为1:5。然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:6。
C、水解
向步骤B的反应液加入硝酸，使加入的硝酸与反应液的质量比为1.5:100，在60℃下静置反应36h。
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加NaHCO3，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析纯化：洗脱剂选用CH2Cl2：甲醇=100:1～10:1，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为95%。
实施例14：
A、氧化
取10g黄芪皂苷作为原料，往其中加入30%乙醇水溶液配置成黄芪皂苷含量为30g/L的悬浊液，加乙酸调节悬浊液的pH至4-5，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钾在35℃下避光反应12小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为1:5；随后加氨水调pH至7-8，减压浓缩至无醇味，过滤反应液得到滤饼，用水润洗滤饼几次后，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入50%乙醇水溶液分散成悬浊液，加入的50%乙醇水溶液与A步的黄芪皂苷的质量比为1:2，此时溶液为悬浊液；然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入70%乙酸水溶液至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:15。
C、水解
向步骤B的反应液加入硝酸，使加入的硝酸与反应液的质量比为1:100，在10℃下搅拌反应12h。
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加NaOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用反相硅胶柱层析纯化：洗脱剂选用甲醇：水==50:50～100:0，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂；再即得纯度大于90%的环黄芪醇。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为95%。
实施例15：
A、氧化
取20g黄芪皂苷作为原料，往其中加入体积比1:2的甲醇乙醇溶液配置成黄芪皂苷含量为0.6g/L的悬浊液，加磷酸调节悬浊液的pH至5-6，向悬浊液中加入氧化剂——高碘酸钾在5℃下避光反应96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为1:2；随后加Na2CO3调pH至8-9，减压浓缩至无醇味，加入等体积正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取部分，水洗2次，取正丁醇部分，蒸去正丁醇，得到氧化产物。
B、还原
将A步得到的氧化产物加入加入10%乙醇水溶液分散成悬浊液，加入的10%乙醇水溶液与A步的黄芪皂苷的质量比为1:0.6；然后加入硼氢化钠作为还原剂，还原反应24h后，加入乙酸至反应液pH到4-5终止反应；其中加入的还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:15。
C、水解
向步骤B的反应液加入盐酸，使加入的盐酸与反应液的质量比为3:100，在40℃下搅拌反应96h。
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加NaOH，调pH至中性，再采用与反应液等体积乙酸乙酯萃取53次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用反相硅胶柱层析纯化：洗脱剂选用乙腈：水=30:70～80:20，通过薄层层析法观察，合并环黄芪醇纯度较高的流份，浓缩除去溶剂，即得纯度大于90%的环黄芪醇。
经检测本例制得的环黄芪醇，其纯度为96%。
药效实验一：（环黄芪醇对化疗药物的增效作用）
1、实验材料
1.1药物及试剂：环黄芪醇，由实施例13所述制备方法制得，经过检测，纯度为95%，临用前用0.5%CMC-Na溶液配成母液10mg/ml，除菌备用。5-氟尿嘧啶(5-FU)针剂，批号：20130412，,10ml/支，上海旭东海普药业有限公司。IL-2和TNF-α放免试剂盒，北京东亚放射免疫研究所。
1.2动物及瘤株
昆明种小鼠，6～8周龄，体重18～22g，购自四川大学实验动物中心，合格证号：SCXK（川）2012-0010。雌雄兼用，每批实验采用同一性别。
1.3细胞株：小鼠肝癌H22，小鼠肉瘤S180，购自四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室。
1.4仪器与器械
无菌室和超净工作台；
血象分析仪；
外科手术器械；
消毒用碘酒、酒精。
2、试验内容
荷瘤鼠模型的建立：小鼠肝癌H22、肉瘤S180瘤株，腹腔传代接种。取于昆明鼠腹腔内接种七天的上述荷瘤小鼠，消毒腹部皮肤后，抽取腹水，离心后弃上清，无菌生理盐水稀释，调整细胞浓度为2×107个细胞/ml。消毒鼠腋下皮肤，每只小鼠于腋下注射瘤细胞悬液0.2ml，各瘤株分别接种90只。
接瘤后第二天随机分为如下9组并给药：
空白对照组（模型组）：给予等量辅料的0.5%CMC-Na溶液
5-FU低剂量组：5-FU5mg/kg
5-FU低剂量+药物高剂量组：给予5-FU5+环黄芪醇30mg/kg
5-FU低剂量+药物中剂量组：给予5-FU5+环黄芪醇15mg/kg
5-FU低剂量+药物低剂量组：给予5-FU5+环黄芪醇5mg/kg
5-FU高剂量组：5-FU15mg/kg
5-FU高剂量+药物高剂量组：给予5-FU15+环黄芪醇30mg/kg
5-FU高剂量+药物中剂量组：给予5-FU15+环黄芪醇15mg/kg
5-FU高剂量+药物低剂量组：给予5-FU15+环黄芪醇5mg/kg
5-FU腹腔注射给药，其余均为灌胃给药，每日1次，连续给药10天。末次给药24h后颈椎脱臼处死小鼠，称体重，计算体重差（结束体重-开始体重），剥取瘤组织并称重，计算抑瘤率。
抑瘤率=（1-模型对照组平均瘤重/实验组平均瘤重）×100%；
胸腺（脾）指数=[胸腺（脾）重量/体重]×100%。
末次给药后脱颈椎处死小鼠，取瘤并称重，比较模型对照组、单用5-FU、5-FU与环黄芪醇不同剂量联合用药各组的抑瘤率，观察环黄芪醇对化疗药物的增效作用。
3、试验结果
3.1环黄芪醇对5-FU治疗小鼠H22肝癌的增效作用
以下的表1为试验得到的环黄芪醇对5-FU治疗小鼠H22肝癌的增效作用结果。表1表明，5-FU的5mg/kg剂量组和15mg/kg剂量组的对小鼠H22肝癌的抑瘤率分别为25.58%和46.98%，而加用环黄芪醇后，明显提高了5-FU的抑瘤效果。联合治疗组与相应剂量5-FU组比较有显著性差别（高剂量和中剂量组：P＜0.01，低剂量组：P＜0.05）。表明环黄芪醇对5-FU具有明显的增效作用。
表1：5-FU与环黄芪醇联合应用对小鼠H22肝癌生长的抑制作用
注：与空白对照组比较：*P＜0.01，**P＜0.05。
与相应剂量5-FU组比较：#P＜0.01，##P＜0.05。
3.2环黄芪醇对5-FU治疗小鼠S180肉瘤的增效作用
表2为环黄芪醇对5-FU治疗小鼠S180肉瘤的增效作用结果。表2表明：5-FU的5mg/kg剂量组和15mg/kg剂量组的对小鼠S180肉瘤的抑制率抑瘤率分别为25.61%和44.72%，而加用环黄芪醇后，明显提高了5-FU的抑瘤效果。联合治疗组与相应剂量5-FU组比较有显著性差别（高剂量和中剂量组：P＜0.01，低剂量组：P＜0.05）。表明环黄芪醇对5-FU具有明显的增效作用。
表2：5-FU与环黄芪醇联合应用对小鼠S180肉瘤生长的抑制作用
注：与空白对照组比较：*P＜0.01，**P＜0.05。
与相应剂量5-FU组比较：#P＜0.01，##P＜0.05。
药效实验二：（环黄芪醇的降低抗癌药物毒性作用）
1、试验材料：
同药效实验一
2、试验内容：用小鼠H22肝癌和S180肉瘤建立小鼠体内移植瘤模型，按如下组别分组及给药：
空白对照组（模型组）：给予等量辅料的0.5%CMC-Na溶液
5-FU组：25mg/kg
5-FU+药物高剂量组：给予5-FU25+环黄芪醇30mg/kg
5-FU+药物中剂量组：给予5-FU25+环黄芪醇15mg/kg
5-FU+药物低剂量组：给予5-FU25+环黄芪醇5mg/kg
给药方法如前所述。比较空白对照组、单用5-FU治疗和5-FU与环黄芪醇各剂量联合应用治疗各组之间动物体重、胸腺指数、脾指数，用血象分析计数外周血白细胞，比较各组间白细胞数。
3、试验结果
表3、表4分别为环黄芪醇对5-FU在治疗小鼠H22肝癌中和S180肉瘤的减毒作用试验结果。表3、表4说明：在小鼠H22肝癌和S180肉瘤模型中，5-FU25mg/kg剂量组在抑瘤的同时，也使体重、免疫器官脏器指数及白细胞指数明显下降。与环黄芪醇合用后可明显改善由5-FU所致小鼠体重减轻、白细胞下降及免疫器官萎缩，提高小鼠胸腺及脾脏脏器指数。联合治疗组与相应剂量5-FU组比较有显著性差别（各剂量组：P＜0.05）。表明环黄芪醇可明显降低由5-FU所致毒副作用。
表3：环黄芪醇对5-FU在治疗小鼠H22肝癌中的减毒作用
注：与空白对照组比较：*P＜0.01，**P＜0.05。
与相应剂量5-FU组比较：#P＜0.01，##P＜0.05。
表4环黄芪醇对5-FU在治疗小鼠S180肉瘤中的减毒作用
注：与空白对照组比较：*P＜0.01，**P＜0.05。
与相应剂量5-FU组比较：#P＜0.01，##P＜0.05。
药效实验三：（环黄芪醇对小鼠血清IL-2和TNF-α的影响）
1、试验材料：同药效实验一
2、试验内容：用小鼠H22肝癌建立小鼠体内移植瘤模型，按如下组别分组及给药：
空白对照组（模型组）：给予等量辅料的0.5%CMC-Na溶液
5-FU组：25mg/kg
5-FU+药物高剂量组：给予5-FU25+环黄芪醇30mg/kg
5-FU+药物中剂量组：给予5-FU25+环黄芪醇15mg/kg
5-FU+药物低剂量组：给予5-FU25+环黄芪醇5mg/kg
给药方法如前所述。比较空白对照组、单用5-FU治疗和5-FU与环黄芪醇各剂量联合应用治疗各组之间IL-2和TNF-α的参数。
3、试验结果
表5为环黄芪醇对H22荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α的影响试验结果。表5说明：与空白对照组相比，H22荷瘤小鼠在注射5-FU后血清IL-2含量明显升高，而TNF-α含量显著降低（P＜0.05）。而5-FU与环黄芪醇高、中剂量联合治疗组血清IL-2含量明显降低，TNF-α含量明显升高，与5-FU组有显著性差异（P＜0.05）。
表5环黄芪醇对H22荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α的影响
注：与空白对照组比较：*P＜0.01，**P＜0.05。
与相应剂量5-FU组比较：#P＜0.01，##P＜0.05。
Claims (9)
1.一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤：
A、氧化
将黄芪甲苷加入溶剂配制成黄芪甲苷含量为0.001-0.05mol/L的悬浊液；加酸调节悬浊液的pH至3-6，向悬浊液中加入氧化剂，在5-35℃下避光反应12-96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪甲苷与氧化剂的摩尔比为1:2-1:15；随后加碱调pH至7-10，减压浓缩至无醇味，再经过滤或萃取得到氧化产物；
B、还原
将A步得到的氧化产物加入溶剂分散成溶液或悬浊液；加入的溶剂与A步的黄芪甲苷的质量比为1:0.7-1:40；然后加入硼氢化钠或硼氢化钾作为还原剂，还原反应12-48h后，再加入乙酸或乙酸水溶液调节反应液的pH至4-6酸性以终止还原反应；其中还原剂与A步的黄芪甲苷的摩尔比为1:2-1:8；
C、水解
向步骤B的反应液加入强酸，在10-60℃下静置或搅拌6-96h；加入的强酸与反应液的质量比为0.5-3:100；
D、萃取；
向步骤C得到的反应液中加碱、调pH至中性，再采用与反应液等体积的乙酸乙酯萃取3-5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、重结晶中的一种或多种方法进行纯化，即得环黄芪醇。
2.一种环黄芪醇的制备方法，包括以下步骤：
A、氧化
将黄芪皂苷加入溶剂配制成黄芪皂苷含量为0.6-50g/L的悬浊液；加酸调节悬浊液的pH至3-6，再向悬浊液中加入氧化剂，在5-35℃下避光反应12-96小时，然后加入乙二醇终止氧化，其中黄芪皂苷与氧化剂的质量比为3:1-1:5；随后加碱调pH至7-10，减压浓缩至无醇味，再经过滤或萃取得到氧化产物；
B、还原
将A步得到的氧化产物加入溶剂分散成溶液或悬浊液，加入的溶剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1：0.6-1：50；然后加入硼氢化钠或硼氢化钾作为还原剂，还原反应12-48h后，再加入乙酸或乙酸水溶液调节反应液的pH至4-6酸性以终止还原反应；其中还原剂与A步的黄芪皂苷的质量比为1:1.5-1:20；
C、水解
向步骤B的反应液加入强酸，在10-60℃下静置或搅拌反应6-96h；加入的强酸与反应液的质量比为0.5-3:100；
D、萃取
向步骤C得到的反应液中加入碱，调pH至中性，采用与反应液等体积的乙酸乙酯萃取3-5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，得环黄芪醇粗品。
E、纯化
将步骤D得到的环黄芪醇粗品使用正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、重结晶中的一种或多种方法进行纯化，即得环黄芪醇。
3.根据权利2要求所述的环黄芪醇的制备方法，其特征在于，所述步骤A的黄芪皂苷为环黄芪醇类皂苷的含量不低于50%的黄芪皂苷。
4.根据权利要求1或2所述的环黄芪醇的制备方法，其特征在于，所述步骤A中的溶剂选用水、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的混合液。
5.根据权利1或2要求所述的环黄芪醇的制备方法，其特征在于，所述步骤A中的氧化剂为高碘酸、高碘酸钠或高碘酸钾。
6.根据权利要求1或2所述的环黄芪醇的制备方法，其特征在于，所述步骤A中的萃取的具体操作是：加入与减压浓缩后的反应液等体积的正丁醇萃取2-4次；合并正丁醇萃取液，水洗2次，再蒸干正丁醇。
7.根据权利要求1或2所述的环黄芪醇的制备方法，其特征在于，所述步骤B中的溶剂为体积分数是0-50%的甲醇水溶液或乙醇水溶液。
8.根据权利要求1或2所述的环黄芪醇的制备方法，其特征在于，所述步骤C中加入的强酸为硫酸、盐酸或硝酸。
9.一种权利1或2要求所述的制备方法得到的环黄芪醇的用途是，环黄芪醇在制备抗癌辅助治疗药物中的应用。
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