CN102851344B

CN102851344B - 一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法

Info

Publication number: CN102851344B
Application number: CN201210318087.8A
Authority: CN
Inventors: 张学武; 许平平; 张博超
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangdong geometric Cell Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2032-08-31
Also published as: CN102851344A

Abstract

本发明提供一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，主要采用反复冻融与超声破碎相结合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白,超滤离心管过滤,获得分子量大小范围为0-3KD、3-5KD、5-10KD以及大于10KD的螺旋藻多肽,并且,这样制备的螺旋藻多肽具有抗肿瘤活性,有利于抗肿瘤保健食品和医药产品的开发利用。

Description

一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及螺旋藻深加工及生物技术领域，具体涉及一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法。

背景技术

螺旋藻(Spirulina platensis)是一种蓝藻,具有护肝,抗氧化,防病毒,抗癌和增强免疫力等生理功能. 螺旋藻蛋白质占其干重的50-70%,是迄今发现的蛋白质含量最高的物种之一. 螺旋藻蛋白质组成最接近于世界粮农组织(FAO) 规定的标准,包含18种氨基酸,并具有人体必须的全部8种氨基酸,是一种优质蛋白源. 目前，螺旋藻主要以干粉和片剂形式使用。由于其溶解性有限，不利于人体直接吸收等问题，使其应用受到一定的限制。因此，从螺旋藻中分离纯化活性肽具有巨大的社会经济效益和广泛的应用前景。

生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生物活性的氨基酸聚合物，又称为功能肽。其结构松散，小至由两个氨基酸大到由数百个氨基酸通过肽键连接而成。现代营养学表明，蛋白质经消化道酶作用后并不一定以完全游离氨基酸的形式吸收，且主要是低肽的形式吸收，具有更高的营养价值和生物效价。酶水解法获得生物活性肽已经成为工业化生产生物活性肽的主要手段。

恶性肿瘤已经成为我国居民死亡的首要原因之一。目前对肿瘤患者的治疗方法主要是化疗和放疗手段，对人体损伤严重。几十年来，人们一直在探索对人体损伤小治疗肿瘤方法，大多从天然动植物中寻找活性高、毒副作用小的广谱抗肿瘤新药。迄今为止，发现多种生物活性肽具有抗肿瘤活性，抗肿瘤肽因其分子量小、肿瘤细胞穿透能力强、提高免疫应答、抑制肿瘤血管形成等特点，已经成为肿瘤治疗研究的热点。

发明内容

为拓展螺旋藻在食品和生物医学领域的应用，本发明的目的是提供一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法。

为实现本发明目的，采用如下技术方案：

一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，首先采用反复冻融与超声破碎相结合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白,然后经超滤离心管过滤, 获得螺旋藻抗肿瘤多肽。

一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）螺旋藻粉5~50 g溶于100~1000 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌10~60 min，待其全部溶解后置于-20 ℃冰箱中冷冻80 min中，再置于4 ℃冰箱中解冻，依此反复冻融一次以上；然后，采用超声破碎方法将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来，将样品置于冰浴中；最后，将获得的溶液于温度4 ℃,转速为5000~10000 r/min下离心10~60 min，去除沉淀获得蛋白上清液, 再真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉。

（2）以步骤（1）得到的螺旋藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为1~5%（w/v,g/mL）的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解；水解后再灭酶，室温冷却后将水解液在 5000 r/min 下离心 25 min，取上清；然后, 在6000 g、4 ℃条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤，滤液再经过3 KD、5 KD、10 KD的超滤离心管过滤，即获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的螺旋藻多肽水解液。

上述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（1）所述反复冻融次数为三次。

上述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（1）所述超声破碎方法为在10~300 W的超声功率下每超声5~20 s间隔3~10 s,共超声10~300次将螺旋藻壁破碎。

上述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（2）所述水解条件是温度30~60 ℃，pH= 4~9，酶与底物的比2%~7%（w/v,g/mL），水解5~12 h。

上述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（2）所述灭酶为在100 ℃水中灭酶10 min。

上述的制备方法，步骤（1）~(2)得到的螺旋藻多肽具有抗肿瘤活性, 例如, 对人乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2体外生长具有一定的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但具体实施方式不应理解为是对本发明保护范围的限定。

实施例1

螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下：

（1）螺旋藻粉25 g溶于250 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌30 min。待其全部溶解后置于-20 ℃冰箱中冷冻80 min中，再置于4 ℃冰箱中解冻，如此反复冻融三次。然后，采用超声破碎方法，在130W的超声功率下每超声10 s间隔5 s,共超声200次将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来。为了防止超声过程中产生的热量使蛋白质变性，将样品置于冰浴中。最后，将获得的溶液于温度4 ℃,转速为7000 r/min下离心30 min，去除沉淀获得蛋白上清液, 再迅速真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉。

（2）以步骤（1）得到的螺旋藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解. 实验条件是温度45 ℃，pH= 6.5，酶与底物的比1.5%. 水解9 h后，在100 ℃水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在 6000 r/min 下离心 25 min，取上清液。然后, 在6000 g、4 ℃条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD、5 KD、10 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的螺旋藻多肽水解液。

(3) 步骤（1）~（2）所得的螺旋藻多肽-壳聚糖纳米粒进行抗肿瘤活性检测(使用MTT检测方法). 当浓度为1 mg/mL时，0-3 KD、3 -5 KD、5-10 KD和>10 KD多肽对人乳腺癌细胞MCF-7体外生长抑制率分别达到2%、12%、14%和11%。当浓度为1 mg/mL时，0-3 KD、3 -5 KD、5-10 KD和>10 KD多肽对肝癌细胞（HepG-2）体外生长抑制率分别达到19%、12%、13%和12%。

实施例2

螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下：

（1）螺旋藻粉30 g溶于200 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌20 min。待其全部溶解后置于-20 ℃冰箱中冷冻80 min中，再置于4 ℃冰箱中解冻，如此反复冻融三次。然后，采用超声破碎方法，在50 W的超声功率下每超声5 s间隔6 s,共超声200次将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来。为了防止超声过程中产生的热量使蛋白质变性，将样品置于冰浴中。最后，将获得的溶液于温度4 ℃,转速为6000 r/min下离心30 min，去除沉淀获得蛋白上清液, 再迅速真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉。

（2）以步骤（1）得到的螺旋藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解. 实验条件是温度55 ℃，pH= 6，酶与底物的比5%. 水解8 h后，在100 ℃水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在 5000 r/min 下离心 25 min，取上清液。然后, 在6000 g、4 ℃条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD、5 KD、10 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的螺旋藻多肽水解液。检测方法与结果基本同实施例1。

实施例3

螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下：

（1）螺旋藻粉30 g溶于400 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌50 min。待其全部溶解后置于-20 ℃冰箱中冷冻80 min中，再置于4 ℃冰箱中解冻，如此反复冻融三次。然后，采用超声破碎方法，在150 W的超声功率下每超声10 s间隔6 s,共超声120次将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来。为了防止超声过程中产生的热量使蛋白质变性，将样品置于冰浴中。最后，将获得的溶液于温度4 ℃,转速为5000 r/min下离心40 min，去除沉淀获得蛋白上清液, 再迅速真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉。

（2）以步骤（1）得到的螺旋藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解. 实验条件是温度50 ℃，pH= 9，酶与底物的比6%. 水解12 h后，在100 ℃水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在 5000 r/min 下离心 25 min，取上清液。然后, 在6000 g、4 ℃条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD、5 KD、10 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的螺旋藻多肽水解液。检测方法与结果基本同实施例1。

实施例4

螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下：

（1）螺旋藻粉40 g溶于700 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌50 min。待其全部溶解后置于-20 ℃冰箱中冷冻80 min中，再置于4 ℃冰箱中解冻，如此反复冻融三次。然后，采用超声破碎方法，在200 W的超声功率下每超声15 s间隔8 s,共超声150次将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来。为了防止超声过程中产生的热量使蛋白质变性，将样品置于冰浴中。最后，将获得的溶液于温度4 ℃,转速为6000 r/min下离心50 min，去除沉淀获得蛋白上清液, 再迅速真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉。

（2）以步骤（1）得到的螺旋藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解. 实验条件是温度40 ℃，pH=6，酶与底物的比6%. 水解8 h后，在100 ℃水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在 5000 r/min 下离心 25 min，取上清液。然后, 在6000 g、4 ℃条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD、5 KD、10 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的螺旋藻多肽水解液。检测方法与结果基本同实施例1。

Claims

1.一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，首先采用反复冻融与超声破碎相结合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白,然后经超滤离心管过滤, 获得螺旋藻抗肿瘤多肽；所述制备方法具体包括如下步骤：

（1）螺旋藻粉5~50 g溶于100~1000 mL Milli-Q水中，常温下磁力搅拌10~60 min，待其全部溶解后置于-20 ℃冰箱中冷冻80 min中，再置于4 ℃冰箱中解冻，依此反复冻融一次以上；然后，采用超声破碎方法将螺旋藻壁破碎，使得蛋白质游离出来，将样品置于冰浴中；最后，将获得的溶液于温度4 ℃,转速为5000~10000 r/min下离心10~60 min，去除沉淀获得蛋白上清液, 再真空冷冻干燥，获得螺旋藻蛋白质粉；所述超声破碎方法为在10~300 W的超声功率下每超声5~20 s间隔3~10 s,共超声10~300次将螺旋藻壁破碎；

（2）以步骤（1）得到的螺旋藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为1~5%（w/v）的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解，所述水解条件是温度30~60 ℃，pH= 4~9，酶与螺旋藻蛋白溶液的比2%~7%.（w/v），水解5~12 h；水解后再灭酶，室温冷却后将水解液在 5000 r/min 下离心 25 min，取上清；然后, 在6000 g、4 ℃条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤，滤液再经过3 KD、5 KD、10 KD的超滤离心管过滤，即获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的螺旋藻多肽水解液。

2.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述反复冻融次数为三次；步骤（2）所述灭酶为在100 ℃水中灭酶10 min。