CN113278670B - 一种螺旋藻多肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物提取领域，特别涉及一种螺旋藻多肽及其制备方法，其中，一种螺旋藻多肽的制备方法，将螺旋藻粉与纯化水混匀得到的螺旋藻混悬液依次经破壁提取、离心静置除杂，向得到的螺旋藻水提液，依次加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行双水解，将经灭酶活的木瓜蛋白酶水解液，离心、过滤取上清液截留分子量200‑3000Da的螺旋藻蛋白酶解液，再经浓缩、干燥得到螺旋藻多肽。该方法依次通过碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行双水解得到的螺旋藻多肽对酪氨酸酶抑制活性高，具有抑制黑色素形成的作用。

Description

一种螺旋藻多肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物提取领域，特别涉及一种螺旋藻多肽及其制备方法。

背景技术

目前酪氨酸酶抑制剂通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成，可用来预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等，典型的酪氨酸酶抑制剂有曲酸、多酚类化合物、苯甲醛和苯甲酸脂类衍生物等，已被广泛应用于研究果蔬保鲜剂，化妆品美白剂和生物杀虫剂。

螺旋藻是一种古老的丝状蓝藻，富含藻蓝蛋白、螺旋藻多酚、小分子多

糖等活性成分。螺旋藻提取物在护肤品中有较为广泛的应用，其功效在改善皮肤暗沉、晒黑、色素紊乱等方面受到较多关注。

如期刊《中国食品学报》2019年10月第19卷10期发表的名称为《螺旋藻多糖对酪氨酸的抑制作用及其抗氧化性能》公开了螺旋藻多糖的提取工艺以及螺旋藻多糖对酪氨酸酶具有较好的抑制效果。

又如公告号为CN105853342B，公告日为2019年5月3日，名称为《一种螺旋藻中的多酚提取物在制备酪氨酸酶抑制剂中的用途》，公开了以螺旋藻多酚提取物作为活性成分之一或唯一的活性成分用于制备酪氨酸酶抑制剂；所述螺旋藻多酚提取物的制备方法：采用体积浓度为80％的乙醇提取螺旋藻，得到螺旋藻多酚粗提液，再将螺旋藻多酚粗提液于40℃减压浓缩，冷冻干燥后得到固态的螺旋藻多酚提取物。

但目前关于在螺旋藻中提取的用于抑制酪氨酸酶活性的多肽物质的报道较少，因此有待进一步研究。

发明内容

为解决背景技术中的提到的问题，本发明提供一种螺旋藻多肽的制备方法，将螺旋藻粉与纯化水混匀得到的螺旋藻混悬液依次经破壁提取、离心静置除杂、酶解及分离纯化得到所述螺旋藻多肽；

所述酶解为向离心静置除杂得到的螺旋藻水提液，依次加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行双水解，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解程序之间通过灭酶操作终止水解反应；

所述分离纯化为将木瓜蛋白酶水解液经离心分离得到的液体，截取分子量为200-3000Da的滤液，再经浓缩、干燥得到所述螺旋藻多肽。

在上述方案的基础上，进一步地，所述螺旋藻粉与水的料液质量比为1：8-12。

在上述方案的基础上，进一步地，所述碱性蛋白酶的酶解条件：酶与底物的比例为4％-6％，pH为8.0-8.7，在55-57℃下酶解4-6h；

所述木瓜蛋白酶的酶解条件为酶与底物的比例为3％-5％，调pH为6.0-6.7，在55-57℃下酶解2-4h；

上述酶在各自的酶解条件下，稳定性高，不易变性，底物转变成产物的速度快，酶解效率高，产物主要以低分子的短肽和游离氨基酸为主，使螺旋藻资源得到了充分利用。

较佳地，所述木瓜蛋白酶的酶活力为60万-200万U/g，所述碱性蛋白酶的酶活力不低于20万U/g。

在上述方案的基础上，进一步地，所述碱性蛋白酶水解液及木瓜蛋白酶水解液的灭酶活条件均为在85-90℃水浴15-20min灭酶活。

在上述方案的基础上，进一步地，所述破壁处理为将螺旋藻混悬液经均质和超声处理得到粗提液；采用均质和超声对螺旋藻进行破壁处理，再以水为溶剂提取螺旋藻蛋白，蛋白提取效率高，保留了螺旋藻的全蛋白，为后续的酶解过程提供了丰富的蛋白质，提高了酶解液中多肽的种类，且水提蛋白的复溶性好，使用方便。

所述超声条件为将螺旋藻混悬液置于2-6℃的条件下，以570-580W的超声功率处理20-25min；将螺旋藻混悬液置于2-6℃中进行超声处理是为了防止超声过程中产生的热量使蛋白质变性。

在上述方案的基础上，进一步地，所述均质方法为采用球磨机均质20-40min。

在上述方案的基础上，进一步地，所述离心静置除杂为将粗提液管式离心分离,转速为10000-14000r/min，之后在2-6℃下静置沉淀10-15min，取上清液经浓缩得到螺旋藻水提液；该环节主要是去除粗提液中色素等脂溶性等成分。

在上述方案的基础上，进一步地，所述螺旋藻水提液的蛋白含量为2％-4％。

在上述方案的基础上，进一步地，所述分离纯化中的木瓜蛋白酶水解液经离心分离得到的液体，采用硅藻土过滤得到清液，再经50nm陶瓷膜和3000Da超滤膜过滤，封闭超滤杯后，用氮气进行加压，超滤压强为0.25MPa；接着经200Da纳滤膜除杂得到分子量200-3000Da的滤液。

本发明还提供一种采用如上任意所述的螺旋藻多肽的制备方法所制得的螺旋藻多肽。

本发明提供的一种螺旋藻多肽的制备方法，与现有技术相比，具有以下技术效果：

1、依次通过碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行双水解得到的螺旋藻多肽对酪氨酸酶抑制活性高，具有抑制黑色素形成的作用；

2、采用超滤法进行过滤能耗低，具有化学试剂耗用少、工艺流程短等优点，适合工业化生产；

3、该方法制得的螺旋藻多肽凝胶性低，黏度小，在生产过程中损失较小；稳定性好，不易变性，便于生产及保存。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的螺旋藻分离纯化分析图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供如下实施例1：

S100、破壁提取：准确称取5份螺旋藻粉按料液质量比1：10，加入适量纯化水混合，常温下磁力搅拌均匀后送入球磨机均质30min，然后将螺旋藻粉溶液至于带冷却功能的超声波提取器中，温度设置2-6℃，以580W的超声功率下超声20min，得到螺旋藻粗提液；

S200、离心静置除杂：将螺旋藻粗提液于4℃,转速为10000r/min条件下离心30min并过滤，之后在4℃下静置沉淀10min，取上清液检测其蛋白质浓度，并通过纳滤膜浓缩至蛋白质含量2％，得到螺旋藻水提液；

S300、酶解：向S200得到的螺旋藻水提液，先加入2709碱性蛋白酶，酶与底物的比例为5％，调pH为8.0，在55℃下酶解5h，在85℃下15min灭酶活；

随后降温至55℃，加入木瓜蛋白酶，酶与底物的比例为4％，调pH为6.0，在55℃下酶解3h，在85℃下15min灭酶活；

水解结束后在室温下冷却，随后将水解液在10000r/min下离心30min，粗滤后用硅藻土过滤取上清液，然后减压浓缩得到酶解产物，减压浓缩参数为真空度为0.08-0.1Mpa，浓缩温度在40-60℃，浓缩时间在2h；

S400、分离纯化：将上述酶解产物经凝胶色谱进行纯化，用Toyopearl尺寸排阻填料HW-40F进行层析分离，层析柱体积为130mL，酶解产物上样量为0.5g(2mL)，初始流动相为纯化水，等度洗脱90min；随后以乙醇-水体系为流动相，梯度洗脱30min；最后用100％乙醇为流动相，等度洗脱60min。期间流速为1mL/min，每6min收集一管，共收集35管，检测波长为214nm、260nm、280nm、405nm。

由于产物在280nm检测波长的吸光值最为灵敏，如图1所示，按280nm检测结果收集分离产物为4部分,分别命名为A1-A4，减压浓缩后，检测各纯化产物抑制酪氨酸酶的活性，结果如表1所示：

表1

注：酪氨酸酶抑制活性检测方法参考文献：范羽仪,胡征宇,梅洪.不同念珠藻的提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用[J].武汉植物学研究,2008(02):179-182.

从表1可知，纯化组分A4的抑制率最高，为39.04％(4mg/mL)，其IC50值为5.7601±0.0567mg/mL。

本发明还分别采用木瓜蛋白酶、2709碱性蛋白酶、1398中性蛋白酶、537酸性蛋白酶、胰酶、风味蛋白酶、夏盛氨基肽酶代替实施例1中的酶解过程，作为对比例；每种酶的水解条件如下表所示：

表2

	酶	温度/℃	pH	酶底比/％	时间/h
						对比例1	2709碱性蛋白酶	55	6.5	4	8
对比例2	1398中性蛋白酶	50	8.5	5	8
						对比例3	537酸性蛋白酶	55	7	4	5
对比例4	胰蛋白酶	37	2	6	8
						对比例5	风味蛋白酶	42	8	3	8
对比例6	木瓜蛋白酶	50	7	4	5
						对比例7	夏盛氨基肽酶	57	8.5	5	5

同时还将实施例1中的酶解过程改为先加入木瓜蛋白酶，酶与底物的比例为4％，调pH为6.0，在55-57℃下酶解3h，在85℃下15min灭酶活后加入2709碱性蛋白酶，酶与底物的比例为5％，调pH为8.0，在55-57℃下酶解5h后，在85℃下15min灭酶活，作为对比例8；

以及将实施例1中的酶解过程改为先加入胃蛋白酶，酶与底物的比例为6％，调pH为2.0，在37℃下酶解2h，在85℃下15min灭酶活后加入胰蛋白酶，酶与底物的比例为3％，调pH为8.0，在37℃下继续酶解2h，随后在85℃下15min灭酶活，作为对比例9；

将对比例1-9得到的酶解产物以及实施例1的酶解产物配制成4mg/mL分别进行酪氨酸酶抑制活性筛选，并与阳性药曲酸进行对比，各酶解产物对酪氨酸酶活性的抑制率如表3所示：

表3

从表3的结果可以看出，单一水解中木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的酶解产物具有微弱的酪氨酸酶抑制活性，其余酶解产物则无酪氨酸酶抑制活性，且通过以上实验证明先加入碱性蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶进行双水解得到的酶解产物能够显著提高酪氨酸酶抑制活性，而相反的酶解顺序却不具备此效果。

本发明还提供如下实施例2：

S100、破壁提取：准确称取螺旋藻粉1Kg按料液质量比1：12加入纯化水，常温下搅拌均匀后送入球磨机均质30min，然后将螺旋藻混悬液置于带冷却功能的超声波提取器中，在2-6℃，580W的条件下超声20min得到螺旋藻粗提液；

S200、离心静置除杂：将粗提液管式离心分离,转速为12000r/min，之后在4℃下静置沉淀10min，取上清液检测其蛋白质浓度，并通过纳滤膜浓缩至蛋白质含量4％，得到螺旋藻水提液；

S300、酶解：向S200得到的螺旋藻水提液中，先加入2709碱性蛋白酶，酶底比为5％，调pH为8.5，57℃酶解5h,在85℃下15min灭酶活后，温度降至57℃，加入木瓜蛋白酶，酶底比为4％，调pH为6.5，酶解4h后，在85℃下15min灭酶活；

S400、分离纯化：将木瓜蛋白酶水解液在12000r/min下管式离心，分离得到的液体用硅藻土过滤得到清液，再用50nm陶瓷膜过滤，3000Da超滤膜过滤，封闭超滤杯后，用氮气进行加压，超滤压强为0.25Mpa，接着经200Da纳滤膜除杂，最后进行减压浓缩，喷干得到所述螺旋藻多肽。

将实施例2得到的螺旋藻多肽配置成4mg/mL的多肽溶液，检测其酪氨酸酶抑制活性，并与阳性药曲酸进行对比，测试结果如表4所示：

表4

从表4的测试结果可以看出，实施例2所制备的螺旋藻多肽的酪氨酸酶的抑制率为37.41％(4mg/mL)，具有抑制黑色素形成的作用，该制备方法采用超滤法能耗低，用于蛋白质制品的分离纯化，具有不使用化学试剂、工艺流程短等优点；

实施例1和实施例2分离得到的组分分子量和酪氨酸酶抑制活性十分接近，说明实施例1和实施例2得到的组分基本相同，因此，本领域技术人员可根据实际需要，选择实施例1的小批量试制工艺或者实施例2的大批量工业化生产工艺。

本发明还提供如下对比例：

分别采用诺维信碱性蛋白酶NS 37071、夏盛碱性蛋白酶代替实施例2中的2709碱性蛋白酶作为对比例10和对比例11；其余与实施例2一致；

将实施例2、对比例10和对比例11各自经灭酶活的木瓜蛋白酶水解液进行减压浓缩，减压浓缩参数为真空度为0.08-0.1Mpa，浓缩温度在40-60℃，浓缩时间在2h；

将浓缩得到的酶解产物，配制成4mg/L分别进行酪氨酸酶抑制活性筛选，并与阳性药曲酸进行对比，各酶解产物对酪氨酸酶活性的抑制率如表5所示：

表5

从表5的测试结果可以看出，虽然同为碱性蛋白酶，采用诺维信碱性蛋白酶NS37071、夏盛碱性蛋白酶得到的酶解产物的酪氨酸酶抑制活性却远低于实施例1和实施例2，由此可见，采用的2709碱性蛋白酶+木瓜蛋白酶两次酶解的工艺所制得的多肽具有较高酪氨酸酶抑制率，同时工艺简单，经济合理，适于工业化生产。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种螺旋藻多肽的制备方法，其特征在于：将螺旋藻粉与纯化水混匀得到的螺旋藻混悬液依次经破壁提取、离心静置除杂、酶解及分离纯化；

所述酶解为向离心静置除杂得到的螺旋藻水提液，依次加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行双水解，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解程序之间通过灭酶操作终止水解反应；

所述分离纯化为将木瓜蛋白酶水解液经离心分离得到的液体，截取分子量为200-3000Da的滤液，再经浓缩、干燥得到所述螺旋藻多肽；

所述碱性蛋白酶的酶解条件：酶与底物的比例为4%-6%， pH为8.0-8.7，在55-57℃下酶解4-6h；

所述木瓜蛋白酶的酶解条件为酶与底物的比例为 3%-5%，调pH为6.0-6.7，在55-57℃下酶解2-4h；

所述碱性蛋白酶水解液及木瓜蛋白酶水解液的灭酶活条件均为在85-90℃水浴15-20min灭酶活；

所述碱性蛋白酶为2709碱性蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的螺旋藻多肽的制备方法，其特征在于：所述螺旋藻粉与纯化水的料液比为1：8-12。

3.根据权利要求1所述的螺旋藻多肽的制备方法，其特征在于：所述破壁处理为将螺旋藻混悬液经均质和超声处理得到粗提液；

所述超声条件为将螺旋藻混悬液置于2-6℃的条件下，以570-580W的超声功率处理20-25min。

4.根据权利要求1所述的螺旋藻多肽的制备方法，其特征在于：所述离心静置除杂为将粗提液管式离心分离,转速为10000-14000r/min，之后在2-6℃下静置沉淀10-15min，取上清液经浓缩得到螺旋藻水提液。

5.根据权利要求4所述的螺旋藻多肽的制备方法，其特征在于：所述螺旋藻水提液的蛋白质含量为2%-4%。

6.根据权利要求1所述的螺旋藻多肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化中的木瓜蛋白酶水解液经离心分离得到的液体，采用硅藻土过滤得到清液，再经50nm陶瓷膜和3000Da超滤膜过滤，封闭超滤杯后，用氮气进行加压，超滤压强为0.25MPa；接着经200Da纳滤膜除杂得到分子量200-3000Da的滤液。