CN112301082A - 一种裙带菜抗肿瘤小分子肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法。步骤如下：挑选裙带菜清水浸泡，漂洗干净后进行低温干燥，经粉碎后颗粒粒度为4μm以下；向裙带菜粉末中加入其质量25～100倍的超纯水，搅拌均匀后调节pH值至1～2，加入胃蛋白酶进行酶解，调节pH值至7～9，加入胰蛋白酶进行酶解解，再调节pH值，加入复合蛋白酶进行酶解；后加入乙醇至体系乙醇体积分数为40～60％，静置、离心取上清液；上清液经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，后采用纳滤进行脱盐处理，再进行冷冻干燥，即可获得裙带菜抗肿瘤小分子肽。本发明不仅能提高裙带菜的资源利用率，而且能为抗肿瘤的保健食品、功能食品、特医食品的开发提供优质的食品原料。
Description
技术领域
本发明公开了一种裙带菜抗肿瘤小分子肽及其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
21世纪以来，恶性肿瘤是影响人类生命和健康的一大杀手，抗肿瘤物质的研究成为一大热点。地球上海洋资源最为丰富，已经发现海洋来源的抗肿瘤活性物质有数千种，其中海洋多肽以其分子量小、靶向性高、吸收快、效应高、副作用小吸引了广大科研工作者的关注。
裙带菜(Undaria pinnatifida)属褐藻门、褐子纲、海带目、翅藻科、裙带菜属，是经济价值和药用价值很高的大型褐藻，含有多种营养物质，除多糖和粗纤维外，其蛋白质含量约占藻体的14％～17％，辽宁、山东有丰富的裙带菜资源。目前，我国对裙带菜的加工利用还处于初级阶段，人们主要是将裙带菜晒干或盐渍后食用。工业上对裙带菜的综合利用主要以提取海藻酸钠和碘为主，工业利用率低，仍有50％以上的海藻成分成为废弃物，其中蛋白质占60％，未得到有效利用。
裙带菜蛋白质的含量不仅较高，而且氨基酸种类齐全，包括人体不能合成的8种必需氨基酸，其氨基酸模式符合理想蛋白质氨基酸模式，这为开发裙带菜生物活性肽提供了较好的物质基础。目前，有关裙带菜的蛋白质功能研究，集中在其酶解多肽的降血压和抗氧化(食品科学,2017,38(6):96-103)方面。
发明内容
为拓展裙带菜在食品和生物学领域的应用，本发明的目的是提供一种裙带菜抗肿瘤小分子肽及其制备方法和应用。小分子肽应用于治疗和预防胃癌、胰腺癌、结肠癌等有关肿瘤疾病的保健食品、功能食品、特医食品及其食品组合物中。
为实现本发明的目的，采用如下技术方案：
本发明提供一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法，步骤如下：
(1)挑选裙带菜清水浸泡，漂洗干净后切成适当的长度，在20～40℃下进行低温干燥，经粗粉碎后采用超声波粉碎机粉碎至颗粒粒度为4μm以下；
(2)向步骤(1)获得的裙带菜粉末中加入其质量25～100倍的超纯水，搅拌均匀后使用0.01～0.2mol/L的HCl和NaOH来调节反应体系的pH值至1～2，加入胃蛋白酶，在控制条件下进行酶解，酶解完成后再采用相同方法调节pH值至7～9，加入胰蛋白酶在控制条件下进行酶解；
(3)酶解结束后，向步骤(2)的酶解液中加入乙醇至体系乙醇体积分数为40～60％，静置12～24h，离心取上清液。
(4)将步骤(3)得到的上清液，经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，然后采用纳滤进行脱盐处理。
(5)将步骤(4)得到的溶液进行冷冻干燥，即可获得分子量大小为3KD以下的裙带菜抗肿瘤小分子肽。
上述的方法中，步骤(1)中的裙带菜可为裙带菜的叶、梗、孢子叶及其提糖后的副产物。进一步的，若为提糖后的副产物不需经过干燥和粉碎，可直接进行酶解。
上述的方法中，所述步骤步骤(2)周加入胰蛋白酶进行酶解之后，采用相同方法调节pH值至6～8，加入复合蛋白酶在控制条件下进行酶解。
上述的方法中，步骤(2)胃蛋白酶(1:15000U/mg)的酶解条件为：体系pH值调至1～2，胃蛋白酶的添加量为3～8％(w/w)，酶解温度为37℃，酶解时间为1～4h；胰蛋白酶(1:250U/mg)的酶解条件为：体系pH值调至7～9，胰蛋白酶的添加量为1～6％(w/w)，酶解温度为37℃，酶解时间为1～4h。
上述的方法中，复合蛋白酶(1.5AU/g)的酶解条件为：体系pH值调至6～8，复合蛋白酶的添加量为0.005～0.4％(w/w)，酶解温度为40～60℃，酶解时间为1～8h。
上述的方法中，步骤(3)所述的离心条件为5000～12000r/min，离心15～40min。
上述的方法中，步骤(4)所述的纳滤膜可为0.15KD、0.2KD和0.25KD。
本发明还提供一种裙带菜抗肿瘤小分子肽，采用上述制备方法制备得到。
本发明还提供一种裙带菜抗肿瘤小分子肽在制备抗肿瘤食品或食品组合物中的应用，具体地，是在制备食疗及预防胃癌、胰腺癌、结肠癌等有关疾病的食品或食品组合物中的应用。上述的制备方法，步骤(1)-(5)得到的裙带菜抗肿瘤小分子肽具有抗肿瘤活性，例如，对人胃癌细胞(SGC7901)、胰腺癌细胞(SW1990)和结肠癌细胞(LS180)体外生长具有较好的抑制作用。
与现有的技术相比，工艺简便、可行、提取效率高，超声波粉碎机的使用既可使裙带菜粒度分布更均匀，也可促进细胞内有效成分的释放速度和释放量，蛋白质在不经提取的前提下可直接加酶酶解；在胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解的基础上，添加复合蛋白酶进一步酶解，作用于更多的酶切位点，促进抗肿瘤小分子肽的溶出，抗肿瘤活性显著提高；后添加乙醇既可中止酶解反应，同时利用多糖和未降解的大分子蛋白质不溶于醇溶液的特性，有效除杂，且使后期的过滤更加方便，不易堵塞，可节省操作时间和能耗。本发明不仅能提高裙带菜的资源利用率，而且能为抗肿瘤的保健食品、功能食品、特医食品的开发提供优质的食品原料。
附图说明
图1为本发明实施例中采用胃蛋白酶和胰蛋白酶所制备的裙带菜抗肿瘤小分子肽对人胃癌细胞(SGC7901)、胰腺癌细胞(SW1990)和结肠癌细胞(LS180)的抑制效果。
图2为本发明实施例中采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和复合蛋白酶所制备的裙带菜抗肿瘤小分子肽对人胃癌细胞(SGC7901)、胰腺癌细胞(SW1990)和结肠癌细胞(LS180)的抑制效果。
具体实施方式
以下结合实例和附图对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。
实施例1
一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法，步骤如下：
(1)挑选裙带菜的叶子清水浸泡，漂洗干净后切成长度为15cm的段，在30℃下进行低温干燥，经粗粉碎后采用超声波粉碎机粉碎至颗粒粒度为4μm以下。
(2)取步骤(1)获得的裙带菜粉末25g，加入625mL超纯水溶解后，将pH值调至2，按照6％(w/w)的酶底比加入胃蛋白酶，调节温度至37℃，酶解2h。然后调节体系pH至8，按照5％(w/w)的酶底比加入胰蛋白酶，调节温度至37℃，酶解2.5h。酶解该过程中使用0.05mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值。
(3)酶解结束后，向步骤(2)的酶解液中加入乙醇至体系乙醇体积分数为40％，静置12h，8000r/min离心30min后取上清液。
(4)将步骤(3)得到的上清液，经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，然后采用0.15KD的纳滤进行脱盐处理。
(5)将步骤(4)得到的溶液进行冷冻干燥，即可获得分子量大小为0.15～3KD的裙带菜抗肿瘤小分子肽。
实施例2
一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法及对人胃癌细胞(SGC7901)的体外抑制作用，步骤如下：
(1)挑选裙带菜的梗清水浸泡，漂洗干净后切成长度为10cm的段，在40℃下进行低温干燥，经粗粉碎后采用超声波粉碎机粉碎至颗粒粒度为4μm以下。
(2)取步骤(1)获得的裙带菜粉末50g，加入1.25L超纯水溶解后，将pH值调至1.5，按照5％(w/w)的酶底比加入胃蛋白酶，调节温度至37℃，酶解2.5h。然后调节体系pH至8.5，按照4％(w/w)的酶底比加入胰蛋白酶，调节温度至37℃，酶解3h。酶解该过程中使用0.1mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值。
(3)酶解结束后，向步骤(2)的酶解液中加入乙醇至体系乙醇体积分数为50％，静置18h，8000r/min离心25min后取上清液。
(4)将步骤(3)得到的上清液，经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，然后采用0.2KD的纳滤进行脱盐处理。
(5)将步骤(4)得到的溶液进行冷冻干燥，即可获得分子量大小为0.2～3KD的裙带菜抗肿瘤小分子肽。
实施例2获得的裙带菜抗肿瘤小分子肽采用MTT法进行抗肿瘤活性检测。如图1所示，结果表明，当小分子肽的浓度为4mg/mL时，其对人胃癌细胞(SGC7901)体外生长抑制率为39.2％。
实施例3
一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法及对人胰腺癌细胞(SW1990)的体外抑制作用，步骤如下：
(1)挑选裙带菜的孢子叶清水浸泡，漂洗干净后切成长度为12cm的段，在25℃下进行低温干燥，经粗粉碎后采用超声波粉碎机粉碎至颗粒粒度为4μm以下。
(2)取步骤(1)获得的裙带菜粉末75g，加入3.75L超纯水溶解后，将pH值调至1，按照4％(w/w)的酶底比加入胃蛋白酶，调节温度至37℃，酶解3h。然后调节体系pH至7.5，按照3％(w/w)的酶底比加入胰蛋白酶，调节温度至37℃，酶解3.5h。酶解该过程中使用0.02mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值。
(3)酶解结束后，向步骤(2)的酶解液中加入乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静置24h，10000r/min离心20min后取上清液。
(4)将步骤(3)得到的上清液，经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，然后采用0.25KD的纳滤进行脱盐处理。
(5)将步骤(4)得到的溶液进行冷冻干燥，即可获得分子量大小为0.25～3KD的裙带菜抗肿瘤小分子肽。
对实施例3获得的裙带菜抗肿瘤小分子肽采用MTT法进行抗肿瘤活性检测。。如图1所示，结果表明，当小分子肽的浓度为4mg/mL时，其对人胰腺癌细胞(SW1990)体外生长抑制率为42.4％，当小分子肽的浓度为5mg/mL时，其对人胰腺癌细胞(SW1990)体外生长抑制率48.5％。
实施例4
一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法及对人结肠癌细胞(LS180)的体外抑制作用，步骤如下：
(1)选取裙带菜提糖后的副产物100g，加入5L超纯水溶解后，将pH值调至1.5，按照7％(w/w)的酶底比加入胃蛋白酶，调节温度至37℃，酶解1.5h。然后调节体系pH至7，按照6％(w/w)的酶底比加入胰蛋白酶，调节温度至37℃，酶解2h。酶解该过程中使用0.02mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值。
(3)酶解结束后，向步骤(2)的酶解液中加入乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静置12h，10000r/min离心15min后取上清液。
(4)将步骤(3)得到的上清液，经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，然后采用0.2KD的纳滤进行脱盐处理。
(5)将步骤(4)得到的溶液进行冷冻干燥，即可获得分子量大小为0.2～3KD的裙带菜抗肿瘤小分子肽。
对实施例4的裙带菜抗肿瘤小分子肽采用MTT法进行抗肿瘤活性检测。如图1所示，结果表明，当小分子肽的浓度为5mg/mL时，其对人结肠癌细胞(LS180)体外生长抑制率为29.99％。
实施例5
一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法，步骤如下：
(1)挑选裙带菜的叶子清水浸泡，漂洗干净后切成长度为15cm的段，在30℃下进行低温干燥，经粗粉碎后采用超声波粉碎机粉碎至颗粒粒度为4μm以下。
(2)取步骤(1)获得的裙带菜粉末200g，加入10L超纯水溶解后，将pH值调至2，按照6％(w/w)的酶底比加入胃蛋白酶，调节温度至37℃，酶解2h。然后调节体系pH至8，按照5％(w/w)的酶底比加入胰蛋白酶，调节温度至37℃，酶解2.5h。之后，将pH值调至7，按照0.1％(w/w)的酶底比加入复合蛋白酶(复合蛋白酶为市售产品，购买自丹麦诺维信有限公司)，调节温度至50℃，酶解3h。酶解该过程中使用0.05mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值。
(3)酶解结束后，向步骤(2)的酶解液中加入乙醇至体系乙醇体积分数为45％，静置16h，8000r/min离心35min后取上清液。
(4)将步骤(3)得到的上清液，经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，然后采用0.15KD的纳滤进行脱盐处理。
(5)将步骤(4)得到的溶液进行冷冻干燥，即可获得分子量大小为0.15～3KD的裙带菜抗肿瘤小分子肽。
实施例6
一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法及对人胃癌细胞(SGC7901)的体外抑制作用，步骤如下：
(1)挑选裙带菜的梗清水浸泡，漂洗干净后切成长度为10cm的段，在40℃下进行低温干燥，经粗粉碎后采用超声波粉碎机粉碎至颗粒粒度为4μm以下。
(2)取步骤(1)获得的裙带菜粉末50g，加入1.25L超纯水溶解后，将pH值调至1.5，按照5％(w/w)的酶底比加入胃蛋白酶，调节温度至37℃，酶解2.5h。然后调节体系pH至8.5，按照4％(w/w)的酶底比加入胰蛋白酶，调节温度至37℃，酶解3h。之后，将pH值调至6，按照0.2％(w/w)的酶底比加入复合蛋白酶，调节温度至55℃，酶解4h。酶解该过程中使用0.1mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值。
(3)酶解结束后，向步骤(2)的酶解液中加入乙醇至体系乙醇体积分数为50％，静置18h，8000r/min离心25min后取上清液。
(4)将步骤(3)得到的上清液，经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，然后采用0.2KD的纳滤进行脱盐处理。
(5)将步骤(4)得到的溶液进行冷冻干燥，即可获得分子量大小为0.2～3KD的裙带菜抗肿瘤小分子肽。
对实施例6获得的裙带菜抗肿瘤小分子肽采用MTT法进行抗肿瘤活性检测。如图2所示，结果表明，当小分子肽的浓度为3mg/mL时，其对人胃癌细胞(SGC7901)体外生长抑制率已达到为71.17％，比实施例2中仅采用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解制得小分子肽的抑制率39.21％(4mg/mL)显著提高。
实施例7
一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法及对人胰腺癌细胞(SW1990)的体外抑制作用，步骤如下：
(1)挑选裙带菜的孢子叶清水浸泡，漂洗干净后切成长度为12cm的段，在25℃下进行低温干燥，经粗粉碎后采用超声波粉碎机粉碎至颗粒粒度为4μm以下。
(2)取步骤(1)获得的裙带菜粉末75g，加入3.75L超纯水溶解后，将pH值调至1，按照4％(w/w)的酶底比加入胃蛋白酶，调节温度至37℃，酶解3h。然后调节体系pH至7.5，按照3％(w/w)的酶底比加入胰蛋白酶，调节温度至37℃，酶解3.5h。之后，按照0.3％(w/w)的酶底比加入复合蛋白酶，调节温度至45℃，酶解2h。酶解该过程中使用0.02mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值。
(3)酶解结束后，向步骤(2)的酶解液中加入乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静置24h，10000r/min离心20min后取上清液。
(4)将步骤(3)得到的上清液，经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，然后采用0.25KD的纳滤进行脱盐处理。
(5)将步骤(4)得到的溶液进行冷冻干燥，即可获得分子量大小为0.25～3KD的裙带菜抗肿瘤小分子肽。
将获得的裙带菜抗肿瘤小分子肽采用MTT法进行抗肿瘤活性检测。如图2所示，结果表明，当小分子肽的浓度为6mg/mL时，其对人胰腺癌细胞(SW1990)体外生长抑制率为54.05％，当小分子肽的浓度为8mg/mL时，其对人胰腺癌细胞(SW1990)体外生长抑制率为65.48％。
实施例8
一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法及对人结肠癌细胞(LS180)的体外抑制作用，步骤如下：
(1)选取裙带菜提糖后的副产物100g，加入5L超纯水溶解后，将pH值调至1.5，按照7％(w/w)的酶底比加入胃蛋白酶，调节温度至37℃，酶解1.5h。然后调节体系pH至7，按照6％(w/w)的酶底比加入胰蛋白酶，调节温度至37℃，酶解2h。之后，将pH值调至8，按照0.25％(w/w)的酶底比加入复合蛋白酶，调节温度至50℃，酶解3h。酶解该过程中使用0.02mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值。
(3)酶解结束后，向步骤(2)的酶解液中加入乙醇至体系乙醇体积分数为60％，静置12h，10000r/min离心15min后取上清液。
(4)将步骤(3)得到的上清液，经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，然后采用0.2KD的纳滤进行脱盐处理。
(5)将步骤(4)得到的溶液进行冷冻干燥，即可获得分子量大小为0.2～3KD的裙带菜抗肿瘤小分子肽。
将获得的裙带菜抗肿瘤小分子肽采用MTT法进行抗肿瘤活性检测。如图2所示，结果表明，当小分子肽的浓度为3mg/mL时，其对人结肠癌细胞(LS180)体外生长抑制率已达79.27％，比实施例4中仅采用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解制得小分子肽的抑制率10.99％(4mg/mL)显著提高。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。
Claims (9)
1.一种裙带菜抗肿瘤小分子肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)挑选裙带菜清水浸泡，漂洗干净后切成适当的长度，在20～40℃下进行低温干燥，经粗粉碎后采用超声波粉碎机粉碎至颗粒粒度为4μm以下；
(2)向步骤(1)获得的裙带菜粉末中加入其质量25～100倍的超纯水，搅拌均匀后使用0.01～0.2mol/L的HCl和NaOH来调节反应体系的pH值至1～2，加入胃蛋白酶，在控制条件下进行酶解，酶解完成后再采用相同方法调节pH值至7～9；加入胰蛋白酶在控制条件下进行酶解；
(3)酶解结束后，向步骤(2)的酶解液中加入乙醇至体系乙醇体积分数为40～60％，静置12～24h，离心取上清液。
(4)将步骤(3)得到的上清液，经减压浓缩后，采用分子量为3KD的超滤膜超滤，截留分子量大小为3KD以下的酶解液，然后采用纳滤进行脱盐处理；
(5)将步骤(4)得到的溶液进行冷冻干燥，即可获得分子量大小为3KD以下的裙带菜抗肿瘤小分子肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的裙带菜可为裙带菜的叶、梗、孢子叶及其提糖后的副产物。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤步骤(2)中加入胰蛋白酶进行酶解之后，采用相同方法调节pH值至6～8，加入复合蛋白酶在控制条件下进行酶解。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤步骤(2)胃蛋白酶的酶解条件为：体系pH值调至1～2，1:15000U/mg胃蛋白酶的添加量为3～8％(w/w)，酶解温度为37℃，酶解时间为1～4h；
胰蛋白酶的酶解条件为：体系pH值调至7～9，1:250U/mg胰蛋白酶的添加量为1～6％(w/w)，酶解温度为37℃，酶解时间为1～4h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述复合蛋白酶的酶解条件为：体系pH值调至6～8，1.5AU/g复合蛋白酶的添加量为0.005～0.4％(w/w)，酶解温度为40～60℃，酶解时间为1～8h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)所述的离心条件为5000～12000r/min，离心15～40min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)所述纳滤为0.15KD、0.2KD和0.25KD的纳滤膜。
8.一种裙带菜抗肿瘤小分子肽，其特征在于，采用如权利要求1-7所述的制备方法制备得到。
9.一种裙带菜抗肿瘤小分子肽在制备抗肿瘤食品或食品组合物中的应用。
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