CN108175771A - 平菇多糖的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了平菇多糖的用途，平菇多糖可用于制备预防糖尿病肾病制剂，该制剂为颗粒剂或口服液或膏剂或胶囊剂。上述平菇多糖经超微粉碎、平菇粗多糖提取、除蛋白、纯化进行提取获得。本发明平菇多糖在高糖环境下可降低与肾系膜细胞增殖有关的细胞因子和细胞外基质成分的表达，逆转肾系膜细胞的增殖和细胞外基质的积聚，维持肾系膜细胞的正常功能，防止肾小球硬化，发挥肾保护作用，进而预防糖尿病肾病，该平菇多糖的提取方法简单可行，提取率高、纯度高，能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，保持多糖的活性不被破坏。

Description

平菇多糖的用途

技术领域

本发明涉及天然活性成分领域，特别涉及平菇多糖的用途。

背景技术

平菇(Pleurotusostreatus)又称侧耳、糙皮侧耳、蚝薛、黑牡丹菇，台湾又称为秀珍菇，是担子菌门下伞菌目侧耳科的种类，是一种相当常见的食用菇。平菇的主要成分是多糖和蛋白质，其中平菇多糖的研究越来越受到关注。从平菇中分离出的多糖，化学成分是葡聚糖和蛋白聚糖类，结构各异，具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抗肿瘤和镇痛等作用，具有一定的医药价值。天然多糖类物质作为一类重要的生物大分子，近些年来，人们对其生物学功能有了许多新的认识和发现，已成为生命科学的研究热点，多糖在食品和医药领域的应用也展示出诱人的前景。且随着食用菌多糖的研究进展，对平菇多糖的研究也逐渐成为热点。平菇多糖是指从平菇子实体、菌丝体、菌丝体发酵液中提取的多糖。目前，对平菇多糖的研究主要集中于分离纯化、结构分析、功能检测等方面。据报道显示，从平菇子实体或菌丝体中提取的多糖化学组成是相似的，葡萄糖是组成这些平菇多糖的主要单糖组份。平菇多糖的提取采用了真菌多糖适用的方法，即水提醇沉法，传统的有热水浸提法，在研究过程中，引入了超声波辅助法、微波辅助法、酶解法以及方法之间的协同联合使用。

随着社会的进歩和科技的发展，人们的生活水平不断提高，但是由于饮食习惯和生活环境等多种因素的影响，糖尿病人群的发病率呈上升趋势。糖尿病肾病（DN）是糖尿病的并发症之一，是导致肾小球硬化、肾衰竭等终末期肾脏疾病的主要原因。肾系膜细胞是维持正常的肾小球结构和功能的三种肾小球细胞之一，不仅是多种细胞因子的分泌源，而且是多种细胞因子受体的主要靶细胞，在肾小球疾病的发生过程中起着非常重要的作用。糖尿病患者中，高血糖和糖基化的终末产物可以直接刺激肾小球细胞合成细胞因子TGF-β1，再通过自分泌和旁分泌途径作用于肾系膜细胞，促进系膜细胞增生和细胞外基质蛋白的合成。另外研究证实，高糖也能促进肾系膜细胞的氧化应激反应，可诱导肾系膜细胞内活性氧的产生增多，继而激活多条下游信号转导途径，导致系膜细胞增生和积聚为特征的早期糖尿病肾病的发生发展。平菇多糖结构各异，具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抗肿瘤和镇痛等作用，医药价值高，而对平菇多糖用于降血糖的饮品具有重要的研究价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种平菇多糖纯度高、活性高，在高糖环境下降低与肾系膜细胞增殖有关的细胞因子和细胞外基质的表达，逆转肾系膜细胞的增殖和细胞外基质的积聚，维持肾系膜细胞的正常功能，防止肾小球硬化，发挥肾保护作用的预防糖尿病肾病制剂的平菇多糖的用途。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：平菇多糖的用途，平菇多糖可用于制备预防糖尿病肾病制剂，该制剂为颗粒剂或口服液或膏剂或胶囊剂。细胞因子对肾系膜细胞外基质的代谢起着重要的调节作用，不仅能够促进肾系膜细胞的增殖，使细胞分泌大量的IV型、V型、VI型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白等细胞外基质成分，同时能够促进这些细胞分泌基质蛋白降解酶的抑制物，抑制细胞外基质成分降解，导致肾系膜细胞外基质过度积聚，最终可导致慢性肾纤维化和肾小球硬化。高糖可激活细胞因子而引起肾小球硬化，并且在高糖刺激中，细胞因子的生成早于细胞外基质，同时细胞因子可诱导细胞外基质的产生，所以，阻断细胞因子的作用可治疗肾小球纤维化和肾小球硬化，为糖尿病肾病的治疗带来广阔的前景。总之，平菇多糖在高糖环境下可降低与肾系膜细胞增殖有关的细胞因子和细胞外基质成分的表达，逆转肾系膜细胞的增殖和细胞外基质的积聚，维持肾系膜细胞的正常功能，防止肾小球硬化，发挥肾保护作用，进而预防糖尿病肾病。

作为优选，平菇多糖经超微粉碎、平菇粗多糖提取、除蛋白、纯化进行提取获得。

作为优选，超微粉碎步骤为：将平菇洗净，烘干，粗粉碎，按重量比1000:0.011-0.013向平菇粗粉加入助磨剂，超微粉碎，即得平菇粉，备用，助磨剂为重量比为1:0.33-0.38的甲苯磺丁脲和伏格列波糖混合物，超微粉碎可使平菇加工成微微纳米级的微粉，使得部分平菇细胞破壁，进而使多糖被大量的释放出来，从而使得多糖溶出率增大，而助磨剂的加入可防止大分子的多糖结构在超微粉碎时发生断裂而产生寡糖，减少了多糖在超微粉碎中的损失，避免超微粉碎对多糖平均分子量的影响，保持多糖的活性不被破坏，且助磨剂可在后续多糖提取及纯化步骤中彻底除去，无残留。

作为优选，平菇粗多糖提取为：按料液比为1:17-22向平菇粉加水，在温度为70-80℃、功率为100-150W下超声提取80-100min，然后在4000-6000rpm下离心14-18rnin，将上清液浓缩至原体积的1/4至1/2，加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇进行沉淀多糖，静置过夜，离心，沉淀冷冻干燥得平菇粗多糖，利用超声波作用产生空化效应，在组织细胞内形成高压，高压的释放在溶液中形成强大的冲击波，能够有效地减小、消除水与平菇之间的阻力，从而加大了传质效率，同时细胞组织受到冲击波产生的物理剪切力而变形破裂，释放出胞内物质，大大加速了提取过程。

作为优选，除蛋白步骤为：按料液比为1:17-22将平菇粗多糖溶于水中，加入酶溶液，在40-50℃下酶解2-4h，在90-100℃下灭酶5-10min，冷却至室温，然后在4000-6000rpm下离心8-12min，再将上清液中以体积比1:3-5加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇20-30min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2-3次，得到脱蛋白多糖液，乙醇沉淀多糖时，蛋白质、肽类、核酸及其他一些小分子物质等也会跟随多糖沉淀下来，影响多糖的纯度，酶解法能够将糖液中游离的蛋白质和部分糖蛋白水解，从而大大的降低多糖中的蛋白质含量，但是加酶量不适宜易引入外来的蛋白质，因此在酶解之后，再用试剂处理，能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，并保证多糖的存在，有效的降低了多糖的损失率，上述酶溶液为浓度0.9-1.2mg/mL的中性蛋白酶溶液，平菇粗多糖水溶液与酶溶液的体积比为1:0.18-0.22，酶溶液的制备方法为：将中性蛋白酶溶于pH为6.8-7.2的磷酸盐缓冲液中，该酶溶液在酶解过程中能维持酶解反应的pH，不用反复调节pH，为实现多糖提取的工业化提供条件。

作为优选，纯化步骤为：采用DEAE-52阴离子交换层析柱，上样后依次用去离子水洗脱、0.1M、0.3M、0.5M、1.0M NaCl溶液洗脱，控制流速为0.6-0.7mL/min，洗脱部分放入截留分子量为6000-8000的透析袋中流水透析24小时，浓缩即得不同级分的平菇多糖，然后，乙醇沉淀过夜、冷冻干燥，即得平菇多糖，离子交换纤维素的基质主体纤维素是亲水链状结构，链间经过适当的交联处理，接有功能基团，能够分离纯化各种相对分子质量不同的多糖，不同的溶剂洗脱得到种不同组分，同时洗脱过程，纤维素吸附了色素等物质，使多糖得到纯化。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明将平菇多糖用于制备预防糖尿病肾病制剂，在高糖环境下可降低与肾系膜细胞增殖有关的细胞因子和细胞外基质成分的表达，逆转肾系膜细胞的增殖和细胞外基质的积聚，维持肾系膜细胞的正常功能，防止肾小球硬化，发挥肾保护作用，进而预防糖尿病肾病；2）本发明平菇多糖的制备方法简单可行，机械化操作成度高，耗时短，能够提高原材料的利用率，平菇多糖的提取率高、纯度高，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力；3）本发明采用超微粉碎和助磨剂相结合，使得部分平菇细胞破壁，进而使多糖被大量的释放出来，从而使得多糖溶出率增大，同时可防止大分子的多糖结构在超微粉碎时发生断裂而产生寡糖，保持多糖的活性不被破坏；4）本发明能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，并保证多糖的存在，有效的降低了多糖的损失率，且反应条件温和，试剂使用量少，符合国家倡导的绿色生产。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

平菇多糖的用途，平菇多糖可用于制备预防糖尿病肾病制剂，该制剂为颗粒剂或口服液或膏剂或胶囊剂。

上述平菇多糖经超微粉碎、平菇粗多糖提取、除蛋白、纯化进行提取获得。

上述超微粉碎为：将平菇洗净，烘干，粗粉碎，按重量比1000:0.011-0.013向平菇粗粉加入助磨剂，超微粉碎，即得平菇粉，备用，助磨剂为重量比为1:0.33-0.38的甲苯磺丁脲和伏格列波糖混合物。

上述平菇粗多糖提取：按料液比为1:17-22向平菇粉加水，在温度为70-80℃、功率为100-150W下超声提取80-100min，然后在4000-6000rpm下离心14-18rnin，将上清液浓缩至原体积的1/4至1/2，加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇进行沉淀多糖，静置过夜，离心，沉淀冷冻干燥得平菇粗多糖；

上述除蛋白为：按料液比为1:17-22将平菇粗多糖溶于水中，加入酶溶液，在40-50℃下酶解2-4h，在90-100℃下灭酶5-10min，冷却至室温，然后在4000-6000rpm下离心8-12min，再将上清液中以体积比1:3-5加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇20-30min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2-3次，得到脱蛋白多糖液，上述酶溶液为浓度0.9-1.2mg/mL的中性蛋白酶溶液，平菇粗多糖水溶液与酶溶液的体积比为1:0.18-0.22，酶溶液的制备方法为：将中性蛋白酶溶于pH为6.8-7.2的磷酸盐缓冲液中。

上述纯化为：采用DEAE-52阴离子交换层析柱，上样后依次用去离子水洗脱、0.1M、0.3M、0.5M、1.0M NaCl溶液洗脱，控制流速为0.6-0.7mL/min，洗脱部分放入截留分子量为6000-8000的透析袋中流水透析24小时，浓缩即得不同级分的平菇多糖，然后，乙醇沉淀过夜、冷冻干燥，即得平菇多糖。

实施例2：

平菇多糖的用途，平菇多糖可用于制备预防糖尿病肾病制剂，该制剂为颗粒剂或口服液或膏剂或胶囊剂。

上述平菇多糖经超微粉碎、平菇粗多糖提取、除蛋白、纯化进行提取获得。

上述超微粉碎为：将平菇洗净，烘干，粗粉碎，按重量比1000:0.011向平菇粗粉加入助磨剂，超微粉碎，即得平菇粉，备用，助磨剂为重量比为1:0.38的甲苯磺丁脲和伏格列波糖混合物。

上述平菇粗多糖提取为：按料液比为1:17向平菇粉加水，在温度为80℃、功率为100W下超声提取100min，然后在4000rpm下离心18rnin，将上清液浓缩至原体积的1/4，加入5倍浓缩液体积的无水乙醇进行沉淀多糖，静置过夜，离心，沉淀冷冻干燥得平菇粗多糖。

上述除蛋白为：按料液比为1:17将平菇粗多糖溶于水中，加入酶溶液，在40℃下酶解4h，在100℃下灭酶5min，冷却至室温，然后在4000rpm下离心12min，再将上清液中以体积比1:5加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇20min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复3次，得到脱蛋白多糖液，上述酶溶液为浓度1.2mg/mL的中性蛋白酶溶液，平菇粗多糖水溶液与酶溶液的体积比为1:0.18，酶溶液的制备方法为：将中性蛋白酶溶于pH为7.2的磷酸盐缓冲液中。

上述纯化为：采用DEAE-52阴离子交换层析柱，上样后依次用去离子水洗脱、0.1M、0.3M、0.5M、1.0M NaCl溶液洗脱，控制流速为0.7mL/min，洗脱部分放入截留分子量为6000的透析袋中流水透析24小时，浓缩即得不同级分的平菇多糖，然后，乙醇沉淀过夜、冷冻干燥，即得平菇多糖。

实施例3：

平菇多糖的用途，平菇多糖可用于制备预防糖尿病肾病制剂，该制剂为颗粒剂或口服液或膏剂或胶囊剂。

上述平菇多糖经超微粉碎、平菇粗多糖提取、除蛋白、纯化进行提取获得。

上述超微粉碎为：将平菇洗净，烘干，粗粉碎，按重量比1000:0.012向平菇粗粉加入助磨剂，超微粉碎，即得平菇粉，备用，助磨剂为重量比为1:0.35的甲苯磺丁脲和伏格列波糖混合物。

上述平菇粗多糖提取为：按料液比为1:20向平菇粉加水，在温度为75℃、功率为120W下超声提取90min，然后在5000rpm下离心16nin，将上清液浓缩至原体积的1/5，加入4倍浓缩液体积的无水乙醇进行沉淀多糖，静置过夜，离心，沉淀冷冻干燥得平菇粗多糖。

上述除蛋白为：按料液比为1:20将平菇粗多糖溶于水中，加入酶溶液，在45℃下酶解3h，在95℃下灭酶8min，冷却至室温，然后在5000rpm下离心10min，再将上清液中以体积比1:4加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇25min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2次，得到脱蛋白多糖液，上述酶溶液为浓度1mg/mL的中性蛋白酶溶液，平菇粗多糖水溶液与酶溶液的体积比为1:0.2，酶溶液的制备方法为：将中性蛋白酶溶于pH为7的磷酸盐缓冲液中。

上述纯化：采用DEAE-52阴离子交换层析柱，上样后依次用去离子水洗脱、0.1M、0.3M、0.5M、1.0M NaCl溶液洗脱，控制流速为0.66mL/min，洗脱部分放入截留分子量为7000的透析袋中流水透析24小时，浓缩即得不同级分的平菇多糖，然后，乙醇沉淀过夜、冷冻干燥，即得平菇多糖。

实施例4：

平菇多糖对高糖环境下小鼠肾系膜细胞株的影响：

试验组用培养基为含40μg/mL实施例3得平菇多糖的高糖培养基配制；对照组1用培养基为高糖培养基；对照组3用含40μg/mL实施例3得平菇多糖的低糖培养基配制；对照组4用低糖培养基配制。

培养方法：将小鼠肾系膜细胞接96孔培养板贴壁4小时后用培养基培养12h，重新更换培养基，设6个重复，在37℃、0.05%CO₂培养箱中培养48h。

肾系膜细胞增殖：向培养基中加入5mg/mL的MTT 20μL，培养箱中继续培养4h后，吸掉上清，用PBS清洗两遍避免培养基干扰显色，每孔加150μL二甲基亚砜，置微量振荡器上避光振荡10min，使结晶物完全溶解，将96孔板置于酶标仪上在570nm波长处测定各孔的吸光度。试验组的吸光度为0.426，对照组1的吸光度为0.867，对照组2的吸光度为0.468，对照组3的吸光度为0.464，说明试验组肾系膜细胞增殖速度最慢，其次是对照组3、对照组2、对照组1，表明平菇多糖对高糖下肾系膜细胞增殖的抑制作用明显，而对于低糖下肾系膜细胞增殖的抑制作用不明显，对其无毒副作用也不刺激细胞生长。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.平菇多糖的用途，其特征在于：所述平菇多糖可用于制备预防糖尿病肾病制剂。

2.根据权利要求1所述的平菇多糖的用途，其特征在于：所述制剂为颗粒剂或口服液或膏剂或胶囊剂。

3.根据权利要求1所述的平菇多糖的用途，其特征在于：所述平菇多糖经超微粉碎、平菇粗多糖提取、除蛋白、纯化进行提取获得。

4.根据权利要求3所述的平菇多糖的提取方法，其特征在于：所述超微粉碎为：将平菇洗净，烘干，粗粉碎，按重量比1000:0.011-0.013向平菇粗粉加入助磨剂，超微粉碎，即得平菇粉。

5.根据权利要求3所述的平菇多糖的提取方法，其特征在于：所述助磨剂为重量比为1:0.33-0.38的甲苯磺丁脲和伏格列波糖混合物。

6.根据权利要求2所述的平菇多糖的提取方法，其特征在于：所述平菇粗多糖提取为：按料液比为1:17-22向平菇粉加水，在温度为70-80℃、功率为100-150W下超声提取80-100min，然后在4000-6000rpm下离心14-18rnin，将上清液浓缩至原体积的1/4至1/2，加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇进行沉淀多糖，静置过夜，离心，沉淀冷冻干燥得平菇粗多糖。

7.根据权利要求6所述的平菇多糖的提取方法，其特征在于：所述酶溶液为浓度0.9-1.2mg/mL的中性蛋白酶溶液，平菇粗多糖水溶液与酶溶液的体积比为1:0.18-0.22。

8.根据权利要求7所述的平菇多糖的提取方法，其特征在于：所述酶溶液的制备方法为：将中性蛋白酶溶于pH为6.8-7.2的磷酸盐缓冲液中。

9.根据权利要求2所述的平菇多糖的提取方法，其特征在于：所述纯化步骤为：采用DEAE-52阴离子交换层析柱，上样后依次用去离子水洗脱、0.1M、0.3M、0.5M、1.0M NaCl溶液洗脱，控制流速为0.6-0.7mL/min，洗脱部分放入截留分子量为6000-8000的透析袋中流水透析24小时，浓缩即得不同级分的平菇多糖，然后，乙醇沉淀过夜、冷冻干燥，即得平菇多糖。