CN102851345A

CN102851345A - 小球藻抗肿瘤多肽的制备方法

Info

Publication number: CN102851345A
Application number: CN2012103180914A
Authority: CN
Inventors: 张学武; 王晓琴
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2032-08-31
Also published as: CN102851345B

Abstract

本发明提供小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，首先采用低温超高压连续流细胞破碎机提取小球藻蛋白，再用胰蛋白酶水解小球藻蛋白,超滤离心管过滤,获得分子量大小范围为0-3KD、3-5KD、5-10KD以及大于10KD的小球藻多肽。本发明制备的小球藻多肽具有抗肿瘤活性,例如,对人肝癌细胞HepG2体外生长具有一定的抑制作用，当浓度为1mg/mL时，0-3KD、3-5KD和5-10KD多肽对肝癌细胞（HepG-2）体外生长抑制率分别达到7%、14%和10%，有利于抗肿瘤保健食品和医药产品的开发利用。

Description

小球藻抗肿瘤多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及小球藻深加工及生物技术领域，具体涉及小球藻抗肿瘤多肽的制备方法。

背景技术

小球藻(Chlorella pyenoidosa) 是一类普生性单细胞绿藻，属于绿藻门、小球藻属，生长速度快，易于培养，应用价值高. 小球藻含有丰富的生物活性物质和药用成分，作为一种新型保健食品和药物蕴藏着巨大潜力。小球藻具有抗肿瘤活性、增加免疫力、解毒保肝、降压作用等，其粗蛋白含量高 (50%左右),品质好，已经成为小球藻应用领域十分活跃、备受重视的一个方面.

生物活性肽是指那些具有特殊生理活性或功能特性的肽类。绝大多数蛋白质都是具有一定功能作用的生物活性肽的前体物质，其肽链结构中存在着具有一定生物活性的氨基酸序列片段(功能区)，在正常状态下，其功能区肽段隐藏在肽链中，但一旦单独从蛋白质肽链中释放出来，在适当的环境下，就能显示出独特的生物活性，这个功能肽段就是生物活性肽。现代生物代谢研究发现：人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后，更多的是以低肽的形式直接吸收，具有更高的营养价值和生物效价。酶水解法获得生物活性肽已经成为工业化生产生物活性肽的主要手段。

恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病之一，目前已有的抗肿瘤药物虽对大多数肿瘤有一定疗效，但仍存在着治疗效率低、选择性差、毒副反应大、易产生瘤细胞耐药等问题。因此，从不同途径寻找高效、低毒、特异强的抗肿瘤药物仍是药物治疗肿瘤的当务之急。近年来，人们越来越重视生物活性肽的研究和开发，各种生物活性肽不断被发现和制备，多肽类药物因其分子量小、无免疫原性、结构简单、副作用小，其抗肿瘤活性的研究正在引起国内外学者的广泛关注。

发明内容

为拓展小球藻在食品和生物医学领域的应用，本发明的目的是提供小球藻抗肿瘤多肽的制备方法。

为实现本发明目的，采用如下技术方案：

小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）将小球藻粉和纯水混合后搅拌得混合溶液，在所述混合溶液中提取小球藻蛋白质，得到的粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，将获得的溶液离心，去除沉淀获得蛋白上清液, 再真空冷冻干燥，获得小球藻蛋白质粉；

（2）以步骤（1）得到的小球藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为1~4% (w/v，g/mL)的小球藻蛋白水溶液，加胰蛋白酶进行水解，水解后，灭酶，冷却至室温后将水解液离心，取上清液，然后,在经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤，滤液再经过3 KD、5 KD的超滤离心管过滤，即可获得分子量大小范围为＜3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。

上述的小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（1）所述小球藻粉和纯水的质量比为1:10～1:40,所述搅拌时间为30～120分钟。

上述的小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（1）所述提取小球藻蛋白质为在温度4℃～10℃、压力50MPa～250MPa的条件下提取。

上述的小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（1）所述再提取所提取的次数为1次～8次，每次提取的时间为10min～60min。

上述的一种小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（1）所述离心为在温度4~8 ℃,转速为5000~10000 r/min下离心10~60 min。

上述的一种小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（2）所述水解的条件是温度30~70 ℃，pH= 5~10，水解时间为4~12h；所述胰蛋白酶与小球藻蛋白质水溶液的比为1%~5%（w/v, g/mL）。

上述的一种小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（2）所述灭酶为在100 ℃水中灭酶10 min。

上述的一种小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（2）所述离心为在 8000 r/min 下离心 25 min。

上述的一种小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤（2）所述过滤为在8000 g、4 ℃条件下经超滤离心管过滤。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明得到的小球藻多肽具有下述抗肿瘤活性：对人肝癌细胞HepG2体外生长具有一定的抑制作用，当浓度为1 mg/mL时，0-3 KD、3 -5 KD和5-10 KD多肽对肝癌细胞（HepG-2）体外生长抑制率分别达到7%、14%和10%。因而本发明得到的小球藻抗肿瘤多肽有利于抗肿瘤保健食品和医药产品的开发利用。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

实施例1

小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下：

（1）采用低温超高压连续流细胞破碎机对小球藻蛋白质进行提取: 将小球藻粉和纯水以1:20的质量比混合后搅拌50分钟得混合溶液。将上述混合溶液在温度为6℃、压力为100MPa的条件下提取小球藻蛋白质，得到粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，提取的次数为3次，每次提取的时间为20min。最后，将获得的溶液于温度4 ℃,转速为6000 r/min下离心30 min，去除沉淀获得蛋白上清液, 再真空冷冻干燥，获得小球藻蛋白质粉.

（2）以步骤（1）得到的小球藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为2%的小球藻蛋白溶液，加入胰蛋白酶进行水解. 实验条件是温度40℃，pH= 6，酶与小球藻蛋白质水溶液的比3%. 水解5 h后，在100 ℃水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在 8000 r/min 下离心 25 min，取上清液。然后, 在8000 g、4 ℃条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD、5 KD的超滤离心管过滤（同样在8000 g、4 ℃条件下）。即可获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。

通过步骤（1）~（2）所得的小球藻多肽进行抗肿瘤活性检测（使用MTT检测方法），结果表明, 小球藻多肽对人肝癌细胞HepG2体外生长具有一定的抑制作用，当浓度为1 mg/mL时，0-3 KD、3 -5 KD和5-10 KD多肽对肝癌细胞（HepG-2）体外生长抑制率分别达到7%、14%和10%。

实施例2

小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下：

（1）采用低温超高压连续流细胞破碎机对小球藻蛋白质进行提取: 将小球藻粉和纯水以1:30的质量比混合后搅拌80分钟得混合溶液。将上述混合溶液在温度为8℃、压力为150MPa的条件下提取小球藻蛋白质，得到粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，提取的次数为6次，每次提取的时间为50min。最后，将获得的溶液于温度4 ℃,转速为5000 r/min下离心20 min，去除沉淀获得蛋白上清液, 再迅速真空冷冻干燥，获得小球藻蛋白质粉.

（2）以步骤（1）得到的小球藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为2%的小球藻蛋白溶液，加入胰蛋白酶进行水解. 实验条件是温度50 ℃，pH=8，酶与底物的比4%. 水解6 h后，在100 ℃水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在 8000 r/min 下离心 25 min，取上清液。然后, 在8000 g、4 ℃条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD、5 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。检测方法与结果同实施例1。

实施例3

小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下：

（1）采用低温超高压连续流细胞破碎机对小球藻蛋白质进行提取: 将小球藻粉和纯水以1:35的质量比混合后搅拌100分钟得混合溶液。将上述混合溶液在温度为9℃、压力为200MPa的条件下提取小球藻蛋白质，得到粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，提取的次数为2次，每次提取的时间为10min。最后，将获得的溶液于温度4 ℃,转速为8000 r/min下离心30 min，去除沉淀获得蛋白上清液, 再迅速真空冷冻干燥，获得小球藻蛋白质粉.

（2）以步骤（1）得到的小球藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为2%的小球藻蛋白溶液，加入胰蛋白酶进行水解. 实验条件是温度30℃，pH= 5，酶与底物的比5%. 水解8 h后，在100 ℃水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在 8000 r/min 下离心 25 min，取上清液。然后, 在8000 g、4 ℃条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD、5 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。检测方法与结果同实施例1。

实施例4

小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，步骤如下：

（1）采用低温超高压连续流细胞破碎机对小球藻蛋白质进行提取: 将小球藻粉和纯水以1:10的质量比混合后搅拌90分钟得混合溶液。将上述混合溶液在温度为9℃、压力为250MPa的条件下提取小球藻蛋白质，得到粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，提取的次数为4次，每次提取的时间为40minn。最后，将获得的溶液于温度4 ℃,转速为10000 r/min下离心60 min，去除沉淀获得蛋白上清液, 再迅速真空冷冻干燥，获得小球藻蛋白质粉.

（2）以步骤（1）得到的小球藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为2%的小球藻蛋白溶液，加入胰蛋白酶进行水解. 实验条件是温度60℃，pH= 7，酶与底物的比3%. 水解10 h后，在100 ℃水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在 8000 r/min 下离心 25 min，取上清液。然后, 在8000 g、4 ℃条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD、5 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。检测方法与结果同实施例1。

Claims

1.小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：

（2）以步骤（1）得到的小球藻蛋白质粉为基础, 配置浓度为1~4% (w/v)的小球藻蛋白水溶液，加胰蛋白酶进行水解，水解后，灭酶，冷却至室温后将水解液离心，取上清液，然后,在经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤，滤液再经过3 KD、5 KD的超滤离心管过滤，即可获得分子量大小范围为＜3 KD、3-5 KD、5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。

2.根据权利要求1所述的小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤（1）所述小球藻粉和纯水的质量比为1:10～1:40,所述搅拌时间为30～120分钟。

3.根据权利要求1所述的小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤（1）所述提取小球藻蛋白质为在温度4℃～10℃、压力50MPa～250MPa的条件下提取。

4.根据权利要求1所述的小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤（1）所述再提取所提取的次数为1次～8次，每次提取的时间为10min～60min。

5.根据权利要求1所述的一种小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤（1）所述离心为在温度4~8 ℃,转速为5000~10000 r/min下离心10~60 min。

6.根据权利要求1所述的一种小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤（2）所述水解的条件是温度30~70 ℃，pH= 5~10，水解时间为4~12h；所述胰蛋白酶与小球藻蛋白质水溶液的比为1%~5%（w/v）。

7.根据权利要求1所述的一种小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤（2）所述灭酶为在100 ℃水中灭酶10 min。

8.根据权利要求1所述的一种小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤（2）所述离心为在 8000 r/min 下离心 25 min。

9.根据权利要求1所述的一种小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤（2）所述过滤为在8000 g、4 ℃条件下经超滤离心管过滤