CN105087713A

CN105087713A - 鲍鱼脏器多糖的制备方法

Info

Publication number: CN105087713A
Application number: CN201510550648.0A
Authority: CN
Inventors: 翁武银
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2015-09-01
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明公开了一种鲍鱼脏器多糖的制备方法，技术工艺包括鲍鱼内脏利用含有金属螯合剂的冷水萃取、酒精沉淀、蛋白酶解、酒精分级沉淀、活性炭脱色去杂、干燥等步骤，就可以获得主要成分为半乳糖、总糖含量大于80%的酸性多糖，而且制备的多糖具有明显抑制乳腺癌细胞和肝癌细胞生长繁殖的生物活性。本发明提取工艺简便，成本低，为鲍鱼内脏高值化利用开辟新途径；制备的多糖具有良好的抗肿瘤活性，进一步分离、纯化将有可能应用于生物医药等行业。

Description

鲍鱼脏器多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及多糖提取，尤其涉及一种鲍鱼脏器多糖的制备方法。

背景技术

鲍鱼主要以海藻为饵料，浓缩了海藻的营养素，味道鲜美，是中国传统的名贵食材，被誉为四大海味之首。2014年福建省的鲍鱼年产量已经突破9万吨，然而，由于鲍鱼的收获季节较短，并且鲜活鲍鱼等不易保存和长途运输，造成福建鲍鱼滞销，而其他地区却供不应求。为了适应市场需求，煮干鲍、冷冻鲍、罐头鲍等鲍鱼加工产品不断增加，在加工生产过程中会产生约占鲍鱼重量25%的内脏下脚料。

鲍鱼多糖已经被证明具有抗肿瘤、增强机体免疫能力、抗氧化等生理活性，利用鲍鱼内脏提取多糖已经引起广泛的关注。中国专利2014108841144.X公开一种制备鲍鱼硫酸多糖的方法，主要利用鲍鱼内脏或性腺通过碱法或酶法进行提取、再利用离子交换树脂分离纯化、超滤除盐和浓缩，获得蛋白含量低于10%的鲍鱼硫酸多糖；中国专利201210439232.8公开了鲍鱼内脏酸性多糖、含有其的保健品和应用，主要是鲍鱼内脏通过氯仿-甲醇混合溶液进行前处理，利用木瓜蛋白酶进行酶解后，再利用氯化十六烷基吡啶沉淀去除蛋白，最后采用DEAE-52阴离子交换柱和S-200凝胶过滤柱对多糖进行分离纯化，最后获得的多糖主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖组成。然而，这些提取制备步骤都比较繁琐，成本高，成果不容易转化成工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简便的鲍鱼脏器多糖的制备方法，它是以鲍鱼内脏为原料，通过利用含有金属螯合剂的冷水萃取、蛋白酶解、酒精分级沉淀、活性炭脱色去杂、干燥等步骤，可以获得纯度较高的酸性多糖。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

它包括以下步骤：(1)冷水萃取：以鲍鱼内脏为原料，利用2-4倍原料质量的含有金属螯合剂的冷水搅碎后，在10～20°C下通过搅拌萃取30-120min，通过离心除去不溶物；(2)酒精沉淀：将获得的冷水萃取溶液缓慢加到酒精中，使溶液中的酒精浓度达到70-80%，放在4°C下静置8-16h，获得沉淀物；(3)蛋白酶解：获得的沉淀物用蒸馏水溶解，先用碱性蛋白酶和胶原蛋白酶酶解3-5h后，再用木瓜蛋白酶酶解1-3h；(4)酒精分级沉淀：往酶解液中缓慢添加酒精，使酶解液中的酒精浓度达到30-40%后，于常温下静置30-60min，过滤除去沉淀后，继续往滤液中缓慢添加酒精，使滤液中的酒精最终浓度达到70-80%，放在4°C下静置8-16h，获得沉淀物；(5)活性炭脱色、除杂：将步骤(4)获得的最终沉淀物用蒸馏水溶解后，加入沉淀物质量的1.0-2.0%的活性炭，在30-40°C下进行脱色1-3h，通过离心、过滤除去活性炭，获得鲍鱼脏器多糖溶液；(6)干燥：鲍鱼脏器多糖溶液通过冷冻干燥或喷雾干燥制备成鲍鱼脏器多糖。

在步骤(1)中，所述的含有金属螯合剂的冷水的pH为5-7。

在步骤(1)中，所述的金属螯合剂浓度为1-5%。

在步骤(1)中，所述的金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠、葡萄糖酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠中的一种或组合。

在步骤(3)中，所述的蒸馏水的用量按质量比为酒精沉淀物的5-10倍。

在步骤(3)中，所述的蛋白酶的用量按质量比为：碱性蛋白酶和胶原蛋白酶为酒精沉淀物的0.5-1.0%，木瓜蛋白酶为酒精沉淀物的0.1-0.5%。

在步骤(3)中，利用碱性蛋白酶和胶原蛋白酶进行酶解时，溶液的pH为7.5-8.5，温度为45～55°C；利用木瓜蛋白酶进行酶解时，溶液的pH为5.5-6.5，温度为45～55°C。

在步骤(5)中，所述的蒸馏水的用量按质量比为酒精沉淀物的5-10倍。

由于鲍鱼内脏除了含有多糖以外，还含有胶原蛋白和肌原纤维蛋白，以及未消化的海藻纤维等，本发明采用含有金属螯合剂的冷水对鲍鱼内脏在pH5-7条件下进行萃取时，胶原蛋白、肌原纤维蛋白和海藻纤维都不容易溶解，而金属螯合剂由于螯合了内脏中的金属离子，使多糖容易在冷水中溶解出来；利用蛋白酶解的方式切断蛋白主链，使糖蛋白酶解，多糖容易从糖蛋白中分离出来；由于在低浓度的酒精（30-40%）中可以沉淀大部分的蛋白，在高浓度的酒精中大部分氨基酸也可以溶解，因此通过酒精分级沉淀的方式就可以使鲍鱼脏器多糖得到很好的分离纯化。由于本发明提取制备工艺都是在常温以下的温度进行，提取条件温和，不容易破坏多糖的生物活性。因此本发明具有以下突出优点：

1、本发明利用金属螯合剂吸附鲍鱼内脏中的金属，破坏鲍鱼内脏结构，有利于鲍鱼多糖在冷水中溶解。

2、本发明采用弱酸性的冷水对鲍鱼内脏萃取多糖，使鲍鱼内脏蛋白不容易溶解，可以减少除蛋白的繁杂工序。

3、本发明采用酒精分级沉淀方法去除蛋白和氨基酸，可以减少其他有机溶剂的使用，降低污染和成本。

4、本发明提取温度低，提取的多糖将具有良好的生物活性。

5、本发明提取多糖后的残渣还可以用于鲍鱼多肽的提取，将起到多元化综合利用。

下面结合附表和具体实施例对本发明作进一步的说明。

附图说明

图1A、图1B、图1C分别为本发明第一个实施例、第二个实施例、第三个实施例的鲍鱼脏器多糖的紫外扫描图；

图2为本发明制备的鲍鱼脏器多糖对人体肝癌细胞生长抑制的影响；

图3为本发明制备的鲍鱼脏器多糖对人体乳腺癌细胞生长抑制的影响。

具体实施方式

实施例1

1kg的鲍鱼内脏利用4L含有0.5%乙二胺四乙酸二钠-0.5%葡萄糖酸钠的冷水（pH6）搅碎后，在10°C下搅拌萃取120min，通过5000rpm离心除去不溶物后，获得4.5L的上清液缓慢加入18L的无水酒精中，放在4°C下静置16h获得约100g左右的沉淀物，该沉淀物用1L的蒸馏水溶解后，加入0.2g碱性蛋白酶和0.3g胶原蛋白酶，调整溶液的pH至8.5，于45°C下酶解5h，再调整溶液pH至6.5，加入0.5g木瓜蛋白酶，于45°C下酶解1h，酶解结束后，往酶解液中加入0.67L的无水酒精，于常温下静置30min后，过滤除去沉淀，继续往滤液中缓慢添加3.33L的无水酒精，放在4°C下静置8h可以获得75g左右的沉淀物，该沉淀物用0.75L的蒸馏水溶解后，加入1.5g的活性炭，在30°C下脱色3h后，通过5000rpm离心、过滤除去活性炭，最后通过冷冻干燥获得30g左右水分含量约为5%的鲍鱼脏器多糖，并对鲍鱼脏器多糖的理化性质和抗肿瘤活性进行测定。

实施例2

1kg的鲍鱼内脏利用2L含有0.25%乙二胺四乙酸二钠-2.5%酒石酸钠的冷水（pH4）搅碎后，在20°C下搅拌萃取30min，通过5000rpm离心除去不溶物后，获得4.5L的上清液缓慢加入13.5L的无水酒精中，放在4°C下静置8h获得约90g左右的沉淀物，该沉淀物用0.45L的蒸馏水溶解后，加入0.45g碱性蛋白酶和0.45g胶原蛋白酶，调整溶液的pH至7.5，于55°C下酶解4h，再调整溶液pH至5.5，加入0.1g木瓜蛋白酶，于55°C下酶解2h，酶解结束后，往酶解液中加入0.24L的无水酒精，于常温下静置45min后，过滤除去沉淀，继续往滤液中缓慢添加0.81L的无水酒精，放在4°C下静置16h可以获得70g左右的沉淀物，该沉淀物用0.35L的蒸馏水溶解后，加入0.7g的活性炭，在40°C下脱色1h后，通过5000rpm离心、过滤除去活性炭，最后通过冷冻干燥获得23g左右水分含量约为5%的鲍鱼脏器多糖，并对鲍鱼脏器多糖的理化性质和抗肿瘤活性进行测定。

实施例3

1kg的鲍鱼内脏利用3L含有1.0%乙二胺四乙酸二钠-1.5%柠檬酸钠的冷水（pH5）搅碎后，在15°C下搅拌萃取60min，通过5000rpm离心除去不溶物后，获得4.5L的上清液缓慢加入10.5L的无水酒精中，放在4°C下静置12h获得约95g左右的沉淀物，该沉淀物用0.7L的蒸馏水溶解后，加入0.3g碱性蛋白酶和0.4g胶原蛋白酶，调整溶液的pH至8.0，于50°C下酶解3h，再调整溶液pH至6.0，加入0.3g木瓜蛋白酶，于50°C下酶解3h，酶解结束后，往酶解液中加入0.3L的无水酒精，于常温下静置60min后，过滤除去沉淀，继续往滤液中缓慢添加1.8L的无水酒精，放在4°C下静置12h可以获得72g左右的沉淀物，该沉淀物用0.5L的蒸馏水溶解后，加入1.0g的活性炭，在35°C下脱色2h后，通过5000rpm离心、过滤除去活性炭，最后通过冷冻干燥获得27g左右水分含量约为5%的鲍鱼脏器多糖，并对鲍鱼脏器多糖的理化性质和抗肿瘤活性进行测定。

其中鲍鱼脏器多糖的总糖含量采用苯酚-硫酸法，以半乳糖作为标准品进行检测；蛋白含量采用凯氏定氮法进行检测；糖醛酸采用硫酸咔唑法进行检测；单糖组成采用高效液相色谱法测定；体外抗肿瘤活性主要考察了鲍鱼脏器多糖对人体乳腺癌细胞和人体肝癌细胞生长抑制的影响。

根据紫外扫描图谱（图1A-图1C），可以发现由实施例1、实施例2、实施例3获得的鲍鱼脏器多糖在260-280nm处都没有明显的吸收峰，表明本发明提供的鲍鱼多糖的制备工艺可以有效地去除蛋白。

表1鲍鱼脏器多糖的化学组成

	总糖含量 (%)	蛋白含量 (%)	糖醛酸含量 (%)
				实施例1	86.08	5.65	25.29
实施例2	90.86	4.37	24.42
				实施例3	86.48	4.32	27.11

根据表1的结果，3个实施例提取的鲍鱼脏器多糖中的蛋白含量都降至5%左右，总糖含量都大于85%，再次表明本发明鲍鱼多糖的制备工艺去除蛋白效果较好。表1的结果还显示了制备的鲍鱼脏器多糖中糖醛酸含量高达25%左右，说明了提取的鲍鱼脏器多糖为酸性多糖。对提取的鲍鱼脏器多糖的单糖组成进行分析（如表2），

表2鲍鱼脏器多糖的单糖摩尔组成比例

	甘露糖	鼠李糖	葡萄糖酸	葡萄糖	半乳糖	岩藻聚糖
							实施例1	4.9	8.3	11.5	7.2	50.7	17.4
实施例2	4.4	9.1	11.8	7.5	51.3	15.9
							实施例3	3.7	7.4	11.3	7.2	53.8	16.6

结果表明鲍鱼脏器多糖中半乳糖含量（摩尔比例）超过了50%，其次是岩藻聚糖的含量，而葡萄糖含量只占了7%左右。另外，提取的鲍鱼脏器多糖的重均分子量大约为43ku左右（数据未显示）。

另一方面，还考察了鲍鱼脏器多糖对人体乳腺癌细胞和人体肝癌细胞生长抑制的影响（图2和图3），结果表明提取的鲍鱼脏器多糖对两种肿瘤细胞的生长抑制作用都有明显量效关系，尤其对人体乳腺癌细胞生长的抑制效果更为明显。

综上所述，本发明对鲍鱼内脏利用含有金属螯合剂的冷水萃取，萃取液通过蛋白酶解和酒精分级沉淀，再利用活性炭脱色去杂和干燥可以获得主要成分为半乳糖、总糖含量大于85%的酸性多糖，而且制备的多糖具有明显抑制乳腺癌细胞和肝癌细胞生长繁殖的生物活性。本发明提取工艺简便，成本低，为鲍鱼内脏高值化利用开辟新途径。

上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims

1.一种鲍鱼脏器多糖的制备方法，其特征在于：(1)冷水萃取：以鲍鱼内脏为原料，利用2-4倍原料质量的含有金属螯合剂的冷水搅碎后，在10～20°C下通过搅拌萃取30-120min，通过离心除去不溶物，获得冷水萃取溶液；(2)酒精沉淀：将获得的冷水萃取溶液缓慢加到酒精中，使溶液中的酒精浓度达到70-80%，放在4°C下静置8-16h，获得沉淀物；(3)蛋白酶解：先将获得的沉淀物用蒸馏水溶解，再用碱性蛋白酶和胶原蛋白酶酶解3-5h后，然后用木瓜蛋白酶酶解1-3h，获得酶解液；(4)酒精分级沉淀：往酶解液中缓慢添加酒精，使酶解液中的酒精浓度达到30-40%后，于常温下静置30-60min，过滤除去沉淀后，继续往滤液中缓慢添加酒精，使滤液中的酒精最终浓度达到70-80%，放在4°C下静置8-16h，获得沉淀物；(5)活性炭脱色、除杂：将步骤(4)获得的最终沉淀物用蒸馏水溶解后，加入沉淀物质量的1.0-2.0%的活性炭，在30-40°C下进行脱色1-3h，通过离心、过滤除去活性炭，获得鲍鱼脏器多糖溶液；(6)干燥：鲍鱼脏器多糖溶液通过冷冻干燥或喷雾干燥制备成鲍鱼脏器多糖。

2.如权利要求1所述的鲍鱼脏器多糖的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的含有金属螯合剂的冷水的pH为5-7。

3.如权利要求1所述的鲍鱼脏器多糖的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的金属螯合剂的质量百分浓度为1-5%。

4.如权利要求1所述的鲍鱼脏器多糖的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠、葡萄糖酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠中的一种或多种组合。

5.如权利要求1所述的鲍鱼脏器多糖的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的蒸馏水的用量按质量比为酒精沉淀物的5-10倍。

6.如权利要求1所述的鲍鱼脏器多糖的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的蛋白酶的用量按质量比为：碱性蛋白酶和胶原蛋白酶为酒精沉淀物的0.5-1.0%，木瓜蛋白酶为酒精沉淀物的0.1-0.5%。

7.如权利要求1所述的鲍鱼脏器多糖的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，利用碱性蛋白酶和胶原蛋白酶进行酶解时，溶液的pH为7.5-8.5，温度为45～55°C；利用木瓜蛋白酶进行酶解时，溶液的pH为5.5-6.5，温度为45～55°C。

8.如权利要求1所述的鲍鱼脏器多糖的制备方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述的蒸馏水的用量按质量比为酒精沉淀物的5-10倍。