CN106011091A - 一种从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化sod冻干粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法,将三角帆蚌软体组织破碎后,经过匀浆、超滤、盐析、超滤、热变性、柱层析、脱盐与浓缩、冻干等工序,最后得到SOD冻干粉产品。本发明使用珍珠采收后的蚌肉组织做原料,在沉淀杂蛋白时采用无机盐,沉淀效果好,省时省力,适于规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程的技术领域,特别是涉及一种珍珠加工下脚料——三角帆蚌蚌肉中提取、纯化超氧化物歧化酶SOD的方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是一种广泛存在于生物体内,能清除生物体内的超氧阴离子自由基(O2-),维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶,具有抗辐射损伤、抗衰老和抗癌等重要作用。目前,不同来源的SOD已被应用于治疗炎症、自身免疫性疾病、肺水肿、肿瘤等疾病的诊治,并广泛应用于医学、食品和化妆品等众多领域。
自1969 年首次从牛红细胞中分离出 SOD 以来,人们相继从动植物和微生物中分离和纯化出了SOD。但由于疯牛病等疾病的影响,陆生动物血液等组织来源的SOD提取及其应用受到了很大的限制,从植物和微生物中提取SOD的方法多采用分步盐析、有机溶剂和层析等方法,这些方法普遍存在生产工艺复杂、成本高、周期长等缺点。从水产品中提取纯化SOD的报道相对较少,牡蛎等海产贝类由于个体小且本身经济价值较高,利用这些海产贝类难以大规模提取SOD。而利用珍珠采收后丰富的蚌肉废弃物资源进行SOD提取纯化与应用则更少见报道。
我国是淡水珍珠养殖大国,三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是我国特有的淡水育珠蚌,由该蚌生产的珍珠占国际珍珠总产量的近90%。三角帆蚌多在1-2龄左右进行植珠,经3-4年养殖后采收珍珠,单个蚌体可达1kg左右,杀蚌采珠后会产生大量的蚌肉:以年产约1000吨珍珠估算,蚌肉可达2-3万吨。但目前蚌肉资源除了进行简单加工做饲料等用途外,大部分被采珠同时直接搅碎排放,不仅极大地浪费了蚌肉资源,还严重污染了环境。蚌肉营养丰富,除含有丰富的蛋白质外,还含用超氧化物歧化酶
(SOD) 等生物活性物质,对蚌肉进行 SOD的提取和利用将极大提高珍珠养殖的附加值、减少环境污染,产生良好的经济和社会效益。
发明内容
针对现有技术的上述技术问题,本发明的目的是提供了一种从三角帆蚌蚌肉中提取、纯化SOD冻干粉的方法,使用珍珠采收后的蚌肉组织做原料,在沉淀杂蛋白时采用无机盐,沉淀效果好,省时省力,适于规模化生产。
为达到上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:
一种从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法,包括以下步骤:将三角帆蚌软体组织破碎后,经过匀浆、超滤、 盐析、超滤、热变性、柱层析、脱盐、浓缩和冻干, 最后得到SOD 冻干粉产品。
所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法,包括以下步骤:
(1)匀浆:收集珍珠采集后的三角帆蚌,挖取所有蚌肉称重,以蚌肉和匀浆缓冲液1:1的比例混匀,用高速匀浆机匀浆,搅拌0.5-1h,离心去碎组织细胞碎片,取上清液;
(2)超滤:将步骤(1)中的上清液用可截留分子量为45kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤,取滤液;
(3)盐析:将超滤液用硫酸铵进行盐析分离,4℃静置2-3h, 10000g离心15-20min,收集沉淀;
(4)二次超滤:将沉淀物用蒸馏水溶解,用可截留分子量为5-8kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤,浓缩SOD,并去除盐类和其他小分子物质,取滤液;
(5)热变性:将浓缩液在60-70℃条件下加热变性10-15min,冷却后,10000g离心15-20min,去除杂蛋白,收集上清;
(6)层析纯化:将上述热变性溶液上样到预先用平衡液平衡的DEAE52纤维素柱中,经过液平衡,再用洗脱液进行梯度洗脱,收集下柱液;
(7)脱盐与浓缩:将上述的蛋白洗脱液装于透析袋内,在0-4℃,流动条件下进行透析除盐12-24h;再用聚乙二醇浓缩透析液,形成透析浓缩液;
(8)冻干:将步骤(7)中的透析浓缩液进行低温冷冻,并放置于冻干机中,进行真空冷冻干燥,得到SOD冻干粉。
所述的蚌肉匀浆缓冲液采用含5mmol/L CuCl2的0.15mol/L NaCl溶液。
所述盐析的硫酸铵为90%饱和度,结合超滤,去除45 kDa以上和5-8 kDa的小分子蛋白质。
所述热变性所采用的条件为:60-70℃条件下加热变性10-15min。
所述离子交换层析所采用的平衡液为pH8.0的25mmol/LTris-HCl,洗脱液为pH8.0,含0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl。
上述透析除盐所用的透析液为高纯水;所用聚乙二醇为PEG 4000-20000。
本发明从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法具有以下几个特点:
1、本发明采用的原料上使用珍珠采收后的软体组织,不加抗凝剂,这样省时省力,适于规模化生产。
2、本发明在沉淀杂蛋白时不用有毒害作用的氯仿,也不用易挥发的乙醇,而用无机盐,不仅沉淀效果好,又减少了环境污染和对生产人员的身体伤害。
3、本发明利用SOD蛋白酶耐热的特点,通过膜超滤,去除45KDa以上的大分子蛋白,利用90%饱和度的中性盐硫酸铵沉淀SOD效果好、活性高;然后利用二次超滤,去除盐离子和小分子杂质等,得到SOD蛋白酶。
4、本发明综合生物与化学方法,采用高效分离、提取及纯化技术,生产方法简单、周期短、污染小,适用于大规模工业化生产。经检测,采用本方法提取的SOD,其单位酶活可以达到 1200U/mg 以上。
5、本发明从水产品--三角帆蚌中提取SOD蛋白酶,而且是从珍珠采收下脚料--蚌肉中提取生物酶制剂,有利于为丰富的蚌肉资源的开发利用提供新出路,提高珍珠养殖的附加值、减少环境污染,为食品和医学领域提供SOD酶制剂,产生良好的经济和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但本发明的保护范围并不限于此。
实施例
1
收集采珠后的三角帆蚌蚌肉1kg,沥干水分;
配制1000ml NaCl溶液,加入1.0325g CuCl2.2H2O,溶解后作为抽提缓冲溶液;将蚌肉用高速匀浆机匀浆,操作条件为4℃条件下,3000rpm,匀浆10min;10000g离心15min,取上清;
将上清液用可截留分子量为45 kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤,得滤液300ml;
加入固体硫酸铵至60%饱和度,4 ℃静置2h,10000g离心15min,取上清;上清中再加入固体硫酸铵至90%饱和度,4℃静置2h,离心20min,收集沉淀;
将沉淀物用蒸馏水溶解,用可截留分子量为5-8kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤,取滤液;
将超滤液先在70℃条件下加热变性15min,再在65℃,15min,冰浴冷却后,10000g,离心15min,去除杂蛋白,收集上清;
预先用pH8.0的25mmol/LTris-HCl平衡液平衡DEAE 52纤维素柱;将热变性溶液上样到柱中,经12h平衡,再用pH8.0,含0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl溶液以2ml/min的速度进行梯度洗脱,收集下柱液;
将层析洗脱液装于截留分子量为5 KDa的透析袋内,在4℃,流动条件下进行透析除盐24h;再在透析外加入PEG 4000浓缩透析液;
将上述透析浓缩液预先在-40℃进行急冻,然后放置于冷冻干燥机,得到SOD酶冻干粉。经检测,SOD比活性为1520 U/mg,蛋白含量96.5%。
实施例
2
收集采珠后的三角帆蚌蚌肉5kg,沥干水分;
先配制5000ml NaCl溶液,然后加入5.1625g CuCl2.2H2O,配置抽提缓冲溶液;将蚌肉,用高速匀浆机匀浆在2℃条件下,3000rpm,匀浆10min;42℃,10000g离心15min,取上清;
将上清液用可截留分子量为45kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤,得滤液1450ml;
加入固体硫酸铵至45%饱和度,不断搅拌,4℃静置3h,10000g离心15min,取上清;上清中再加入固体硫酸铵至90%饱和度,4℃静置3h;4℃,12000g离心15min,收集沉淀;
将沉淀物用蒸馏水溶解,用可截留分子量为5-8kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤,收集滤液;
将超滤液先在65℃,预热变性5min,再在60℃,15min,磁力搅拌器加热搅拌;冰浴冷却后,10000g,离心15min,去除杂蛋白,收集上清;
将热变性溶液上样到预先用pH8.0的25mmol/LTris-HCl平衡液平衡DEAE52柱中,经24h平衡,再用pH8.0的含0.1mol/L NaCl的
2.5mmol/L Tris-HCl溶液以1ml/min的速度进行梯度洗脱,收集洗脱液;
将洗脱液装于截留分子量为5 kDa的透析袋内,在4℃,磁力搅拌条件下进行透析除盐12h;再在透析外加入PEG 6000浓缩透析液;
将上述透析浓缩液预先在-30℃进行急冻,然后放置于冷冻干燥机,得到SOD酶冻干粉,经检测SOD比活性为1268 U/mg,蛋白含量95.8%。
上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思,而非对本发明权利保护的限定,凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动,均应落入本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法,其特征在于包括以下步骤:将三角帆蚌软体组织破碎后,经过匀浆、超滤、 盐析、超滤、热变性、柱层析、脱盐、浓缩和冻干, 最后得到SOD 冻干粉产品。
2.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)匀浆:收集珍珠采集后的三角帆蚌,挖取所有蚌肉称重,以蚌肉和匀浆缓冲液1:1的比例混匀,用高速匀浆机匀浆,搅拌0.5-1h,离心去碎组织细胞碎片,取上清液;
(2)超滤:将步骤(1)中的上清液用可截留分子量为45kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤,取滤液;
(3)盐析:将超滤液用硫酸铵进行盐析分离,4℃静置2-3h, 10000g离心15-20min,收集沉淀;
(4)二次超滤:将沉淀物用蒸馏水溶解,用可截留分子量为5-8kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤,浓缩SOD,取滤液;
(5)热变性:将浓缩液在60-70℃条件下加热变性10-15min,冷却后,10000g离心15-20min,去除杂蛋白,收集上清;
(6)层析纯化:将上述热变性溶液上样到预先用平衡液平衡的DEAE52纤维素柱中,经过液平衡,再用洗脱液进行梯度洗脱,收集下柱液;
(7)脱盐与浓缩:将上述的蛋白洗脱液装于透析袋内,在0-4℃,流动条件下进行透析除盐12-24h;再用聚乙二醇浓缩透析液,形成透析浓缩液;
(8)冻干:将步骤(7)中的透析浓缩液进行低温冷冻,并放置于冻干机中,进行真空冷冻干燥,得到SOD冻干粉。
3.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法,其特征在于:所述的蚌肉匀浆缓冲液采用含5mmol/L CuCl2的0.15mol/L NaCl溶液。
4.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法,其特征在于:所述盐析的硫酸铵为90%饱和度,结合超滤,去除45 kDa以上和5-8 kDa的小分子蛋白质。
5.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法,其特征在于所述热变性所采用的条件为:60-70℃条件下加热变性10-15min。
6.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法,其特征在于:所述离子交换层析所采用的平衡液为pH8.0的25mmol/LTris-HCl,洗脱液为pH8.0,含0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl。
7.如权利要求1所述从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化SOD冻干粉的方法,其特征在于:所用聚乙二醇为PEG 4000-20000。
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