CN103923166A

CN103923166A - 竹叶抗氧化肽的分离与纯化方法

Info

Publication number: CN103923166A
Application number: CN201410187223.3A
Authority: CN
Inventors: 张国栋; 唐晓芳; 江燕竹; 王金娟
Original assignee: Xihua University
Current assignee: Xihua University
Priority date: 2014-05-05
Filing date: 2014-05-05
Publication date: 2014-07-16

Abstract

本发明公开了竹叶抗氧化肽的分离与纯化方法，它涉及竹叶营养、功能成分的提取技术领域，它的分离与纯化方法为：(1)、竹叶粗蛋白的提取；(2)、离子层析：(3)、凝胶过滤层析；(4)、超氧阴离子自由基清除能力测定；(5)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：(a)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(b)、相对分子质量的计算；(6)、反相高效液相色谱。它利用了蛋白质的不同性质处理大量的高浓度的多肽蛋白质溶液，进行简单分离的同时使多肽蛋白浓缩，条件温和、操作简便，杂质少，为保健和医疗行业提供更多的资源，实用性强。

Description

竹叶抗氧化肽的分离与纯化方法

技术领域：

本发明涉及竹叶抗氧化肽的分离与纯化方法，属于竹叶营养、功能成分的提取技术领域。

背景技术：

竹为禾本科竹亚科，茎为木质多年生常绿植物，具有生长迅速，再生能力强的特点，是极其重要的植物资源，全世界记载的竹类植物约有60多属,1200多种，面积约有20000万hm²，主要分布于热带、亚热带至暖温带地区，而中国则是世界上产竹最多的国家之一。在中国境内拥有的竹类植物约有40多属500余种，竹林面积约有400万hm²，约占我国森林面积的3％，占世界竹林面积的25％，而四川作为全国产竹基地之一，竹产量非常丰富。竹子全身都是宝，竹材可以用与水利工程、房屋建筑、工艺美术品、生活用的各类器具、人造板、造纸业等，还可制成竹碳作为除臭剂、净化剂等；竹笋还是受人们喜爱的食品,竹叶及其嫩茎是动物界活化石大熊猫的专一食料，阔叶竹的叶也常被用来包裹食物，如我国的粽子和日本的寿司等；在我国少数民族地区还有饮用竹筒茶、竹叶茶，吃竹米饭的习惯。竹叶作为竹材料加工过程中的剩余物，大多数作为畜类青饲料或者腐烂后成为有机肥，还没有充分地利用它的价值,且可再生利用，可见竹叶是一类数量极大的潜在资源。

竹叶，在我国拥有悠久的食用和药用的历史，具有清热解毒的功效，在《神农本草经》、《本草纲目》、《本经逢原》、《药品化义》以及《中药大辞典》等医书专著中均有记载：“凉心缓脾”、“明目利九窍”、“治上焦风邪烦热”、“清痰止渴”、“生津利尿”、“杀小虫”等，并且在1998年，竹叶被卫生部批准列入了药食两用的天然植物名单。

竹叶提取物(Extract of Bamboo Leaves,Ebl)是指从竹叶中提取的含有黄酮类及其甙类、活性多糖类、特种氨基酸及其肽类等一系列化合物构成的混合物，具有抑菌、抗血栓、抗氧化、调节血脂、抗疲劳、抗衰老、除草、杀虫等作用，且无毒副作用具有良好的安全性，可以应用于食品、化妆品、医药、农业等行业中。马世玉等研究了竹叶提取液对衰老组织的抗氧作用，结果表明，竹叶提取液能显著提高大鼠脑组织、心肌组织和血清中的SOD(超氧化歧化酶)、GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)，抑制MDA(丙二醛)和脂褐素的含量，起到保护脑和心脏等，对抗D-半乳糖所致衰老退行性变的作用。另外，还有研究表明竹叶提取物具有清除O2·—、·OH和抑制脂质氧化的能力。张伟等测定了淡竹叶的乙醇醋酸、乙醇、水三种提取液对食品致病菌的抑制作用，发现三种提取液对食品致病菌：伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、魏氏梭菌、肉毒梭菌均有不同程度的抑制作用，并与提取液浓度、作用时间成正效应关系。傅剑云等人研究了竹叶抗氧化物对大鼠的急性、亚慢性毒性，结果表明在实验研究条件下，竹叶抗氧化物急性毒性根据GB15193-94急性分类，属实际无毒类；亚慢性毒性为按大鼠90天喂养试验剂量组各指标测定均未见明显毒性反应。在国外也有相关文献的报道：柴田等进行了竹叶提取物药理学方面的研究，结果表明竹叶提取物对食道、膀胱、肾脏、肝、肺以及子宫癌有显著的疗效；从箬竹叶中提取的Bamfolin粉末，对肝腹水瘤AH39有100％的抑制作用，对鼻咽癌、上腭癌、腹腔癌、胃癌、卵巢癌、食道癌和肉瘤等均有不同程度的疗效，而且长期服用对肝脏、血液均无副作用；有动物实验表明，竹叶提取物能促进血清中SOD的活性，能显著抑制乳腺肿瘤、乳腺肥大增生，对动物的生长发育无副作用；日本研究者从竹叶中提取出具有高效、无毒副作用天然可食的防霉防腐剂，能够有效的抑制细菌、霉菌以及酵母，可以应用于蔬菜水果、肉质品以及饲料中。在国内，2004年4月竹叶提取物作为一种抗氧化剂被卫生部批准列入国家标准，被广泛应用于油脂、肉制品、饮料类、水产品及其制品等方面，目前竹叶提取物及其相关产品已有上市，如竹康宁、金沙源、AOB等，并有小批量出口到其它国家，市场反应良好。

本专利首次揭示了竹叶内含有一种天然抗氧化肽。自由基是指包含有一个未配对电子的原子、原子团、分子或离子。在生物体中，氧化代谢是细胞存活所必须的，但物质氧化的负面效应是其会在体内产生大量的自由基和其它活性氧从而改变机体的氧化还原状态。其中与机体生命活动有关的自由基则包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)两大类，活性氧是指氧在生物体内通过单电子还原产生化学性质活泼的物质,它们包括超氧阴离子自由基、过氧化氢和羟基自由基等；活性氮则是指是NO及NO/O₂、NO/O₂·—反应生成的系列含氮化合物。

生物体自由基的产生按来源可以分为内源性和外源性，体内一些分子，例如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素C和巯基在氧化的过程中会产生自由基，而一些经由酶催化的电子转移及氧化还原的反应中也会产生自由基。同时外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等也会使人体产生许多活性氧自由基，如某些抗生素、抗癌药物等经机体摄取后容易在体内产生自由基，而电磁辐射和粒子辐射可直接或间接的在体内产生自由基，吸烟时也会产生大量的自由基，并且一些非有机微粒如石棉、石英或矽尘的吸入，使吞噬细胞在肺部产生自由基。

在正常生理状态下，自由基的浓度处于正常状态，参与机体的生理、生化过程，具有一定的生理功能：机体的免疫、信号传导、解毒、吞噬等作用，如白血球利用自由基来杀死外来的微生物，体内一些分解代谢的反应须要自由基来催化，血管的舒张和部分神经、消化系统讯号的传导要借助于自由基，而且在机体内自由基的产生和清除是平衡的，所以此时自由基不仅不会损伤组织，而且还具有独特的生理作用。但是当机体自由基产生过多时，超过机体抗氧化防御系统对自由基的清除能力或者抗氧化体系出现故障，体内自由基就会失衡，从而会引起DNA、脂类和糖类等物质的氧化损伤，在生物体内会使细胞受损并引发多种疾病如癌症、糖尿病、神经系统疾病、缺血再灌注损伤、风湿性关节炎以及其他疾病和衰老，而在食品中脂质过氧化则会破坏食品的质量和安全，一方面产生浓重的不良气味，刺喉的辛辣味，使食品变质降低其货架期，另一方面脂肪氧化的产物往往具有很强的生理毒性，破坏人体的健康。因此为预防人类疾病发生和食品的变质，清除体内和食品中过量的自由基以及抑制脂质过氧化就显得异常重要。

凡能干扰自由基链反应中链引发和链增长过程,清除自由基保护机体的化合物统称为自由基捕获剂(scavenger)或抗氧化剂(antioxidant)。对生物体来说，抗氧化剂可以通过阻碍氧化过程的发生或氧化反应链的发展来抑制或延缓氧化过程，从而在一定程度上预防疾病或延缓衰老；而对食品来说，抗氧化剂能够延缓或阻止食品由于空气的氧化作用而引起的氧化腐败、褪色、褐变等，并对维生素类和必需氨基酸等一些容易氧化的营养成分起保护作用。

抗氧化剂按来源可分为人工合成抗氧化剂和天然抗氧化剂两类。合成抗氧化剂如没食子酸丙酯(PG)、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、抗坏血酸酯类、特丁基对苯二酚(TBHQ)等，多用于食品中以防止酸败和油脂类的氧化。天然抗氧化剂则是从动、植物体或微生物中提取出来的消除活性氧自由基的抗氧化物质，如维生素C、植酸、茶叶中的茶多酚、大豆异黄酮、海藻多糖、辅酶Q10、肌肽等。虽然人工合成抗氧化剂的抗氧化性能良好，但可能对人体有潜在的毒副作用。有研究表明某些人工合成抗氧化剂对肝、肺等组织有不良的影响，有的可能具有致畸、致癌的副作用，许多国家对某些合成抗氧化剂进行了严格的限制或禁止，在日本BHA只能用于棕榈油和棕榈仁油的抗氧化作用。

因此从自然界中寻找高效、廉价、低毒的天然抗氧化剂成为目前抗氧化剂发展的一个必然趋势。具有抗氧化性质的多肽蛋白类物质被称为抗氧化多肽蛋白。多肽蛋白具有乳化型特性能够在油水界面起到介导作用，与油脂具有很好的亲和力，对于清除生物体内过量自由基，抑制脂质过氧化具有重要的意义，并且具有良好的安全性，被食用后可以为机体提供营养。国内外研究人员己从不同来源的生物体中提取到各种具有抗氧化活性的多肽蛋白类物质，研究最多的是肌肽和谷胱甘肽、SOD等，此外，还有各种天然蛋白酶解物中具有一定抗氧化活性混合肽如大豆肽。所以抗氧化肽有着很好的应用价值，但是目前并没有竹叶抗氧化肽的研究报道，也缺乏一种好的方法可以将竹叶内的抗氧化肽分离出来并进行纯化，比较浪费竹叶资源，对保健行业和治疗行业也是一大损失。

发明内容：

针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供竹叶抗氧化肽的分离与纯化方法。

本发明的竹叶抗氧化肽的分离与纯化方法，它的分离与纯化方法为：1、竹叶粗蛋白的提取：准确称取竹叶粉20克于干净烧杯中，料液比1:20加入pH7.2、4℃预冷50mmol/L磷酸缓冲液400ml，搅拌均匀在4℃层析柜或冰箱中静置12小时，经纱布过滤去掉残渣，滤液经过冷冻离心(4℃，8000g，20min)，留取上清液，待用。采用硫酸铵沉淀法初步提取竹叶中的多肽蛋白，将固体硫酸铵缓慢加入到上清液中至终浓度为40％饱和度，同时使用磁力搅拌器缓慢搅拌，然后静置1h以上，在4℃、10000g离心15min，弃去沉淀，收集上清液，在40％饱和度的硫酸铵上清液中加固体硫酸铵至80％饱和度，静置1h以上，在4℃、10000g离心15min，收集沉淀，用10ml磷酸缓冲液溶解所得沉淀即得到竹叶蛋白粗提液。将80％硫酸铵盐析的蛋白粗提液，装入去离子水清洗过的透析袋，用pH7.2、50mmol/L磷酸缓冲液4℃下进行透析除盐，中间多次更换缓冲液，透析好的粗提液4℃保存备用，对所得的粗提样品进行超氧阴离子清除自由基能力检测；

2、离子层析：a、DEAE-Sephadex A-50的处理和层析柱的填装：称取一定量的DEAE-Sephadex A-50，用起始缓冲液(50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.2)浸泡，沸水浴2h，完全溶胀之后，用起始缓冲液清洗并采用倾倒法除去其中的细小颗粒，将处理好的离子交换剂上柱，利用重力沉降法装填1.6cm×18cm柱子，装填好的层析柱致密均匀、无气泡，最终柱体积为16ml。将层析柱与起始缓冲液储液器，恒流泵和紫外检测仪相连(λ＝280nm，0.05A)，检测密闭性并用起始缓冲液洗脱层析柱，使其达到交换平衡，并将紫外检测仪调零，为保持蛋白质活性，试验操作可在4℃层析柜中进行，另外此时所有设备和试剂均应在4℃预冷；b、加样：样品经过冷冻离心(10000g，15min，4℃)除去颗粒物，取澄清液，加样前先将层析柱上端拧开，利用重力作用将床面多余的缓冲溶液自然排干，当床面刚好暴露时将层析柱下端阀门关闭此时柱内液体不能流出，用吸管将预处理好的样品加到床面上，此时不能破坏床面的平整，以免造成区带的扭曲和倾斜，然后打开柱下端阀门，受重力作用样品溶液进入床面，最后用起始缓冲液加入柱内床面上2-3cm处，拧紧层析柱上口；c、洗脱：首先用起始缓冲液洗涤柱床，将起始条件下不能被吸附的物质从柱中洗去，在色谱图上形成穿透峰，洗涤过程需进行到峰后紫外吸收重新回到初始值附近为止，洗涤过程完成之后，开始进行梯度洗脱，洗脱液为pH7.2，50mmol/L磷酸缓冲液，NaCl浓度在0-0.5mol/L呈线性变化；d、样品收集：将洗脱出的溶液用蛋白质自动部分收集仪收集，收集体积为每管4ml，流速为1ml/min，将收集好的蛋白溶液进行超氧阴离子清除自由基能力检测，收集280nm峰和超氧阴离子自由基清除活性峰重叠区域，经透析除盐，冷冻干燥，备用；e、DEAE-Sephadex A-50的再生、清洗和储存：用高浓度NaCl溶液清洗色谱柱可以除去以离子键与交换剂结合的物质，当色谱柱上结合了以非离子键吸附的污染物，可在DEAE-Sephadex A-50清洗pH范围内进行碱酸交替清洗，在彻底清洗后可浸泡在含20％乙醇的0.2mol/L乙酸中于4～8℃保存；

3、凝胶过滤层析：a、SephadexG-75的预处理：SephadexG-75干粉采用洗脱液浸泡，沸水浴3h，溶胀过程中不要过分搅拌，以防颗粒破碎，凝胶充分溶胀后用倾倒法将不易沉下的较细颗粒除去，将溶胀后凝胶抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h，搅拌后继续用倾倒法除去悬浮的较细颗粒；b、装柱：将层析柱垂直装好，关闭出口，加入洗脱液约1cm高，将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积约1～2cm高时，打开柱出口让水流出，同时不断缓慢加入凝胶悬液，高径比为48/1.6，体积为96.5ml；c、平衡：将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml/min；d、加样与洗脱：将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将2ml样品(15mg/ml)，沿层析柱管壁小心加入，加完后打开层析底端出口，当样品液面降至与凝胶面相平时关闭层析柱出口，用少量洗脱液洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右，接上恒流泵，调节好流速(0.5ml/min)，开始洗脱；e、收集与测定：用部分收集器收集洗脱液，每管2ml。紫外检测仪280nm处检测，绘制洗脱曲线，同时测定其超氧阴离子自由基清除活性大小，收集280nm峰和超氧阴离子自由基清除活性峰重叠区域，将收集液冷冻干燥，备用；

4、超氧阴离子自由基(O2·—)清除能力测定：a、实验试剂的配制：

A液(pH＝8.2，50mmol/L Tris-HCl缓冲液，内含1mmol/L EDTA-2Na)：量取2.1ml浓HCl，加蒸馏水定容到250ml，得到0.1mol/L HCl溶液；称取三羟甲基氨基甲烷3g，加蒸馏水溶解，再加入114.5ml0.1mol/L HCl溶液，用蒸馏水定容至500ml，制得pH8.2、浓度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲液液；

B液(邻苯三酚溶液)：称取0.378g邻苯三酚，用0.01mol/L HCl溶液溶解定容至500ml，得浓度为3mmol/L的邻苯三酚溶液；

b、邻苯三酚自氧化速率的测定

取5.5ml A液于15ml的比色管中，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃水浴中预热过的B液，迅速摇匀后倒入比色皿，用紫外分光光度计在325nm下每隔30s测定一次吸光度，共反应5min，将自氧化速率控制在0.060～0.065A/min，将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V₀，以A液为空白对照，记录结果；

c、加入样品液后邻苯三酚自氧化速率的测定

取(5.5-x)ml A液，xml样品液于15ml的比色管中，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃水浴中预热过的B液，迅速摇匀后倒入比色皿，用紫外分光光度计在325nm下每隔30s测定一次吸光度，共反应5min，将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示加入样品液后邻苯三酚自氧化速率V₁，以pH8.2Tris-HCl缓冲液为空白对照，记录结果；

d、计算抑制率

S (%) = = \frac{V_{0} - V_{1}}{V_{0}} \times 100

式中：V₀为邻苯三酚自氧化时反应速率；

V₁为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率；

5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：

a、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的竹叶抗氧化肽的纯度；

b、相对分子质量的计算：

1、分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心距分离胶顶端的距离，按以下计算相对迁移率：

相对迁移距离＝蛋白质分子迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)

2、分析图谱，绘制标准曲线，以标准蛋白的相对分子质量的对数为纵坐标，相对迁移距离为横坐标作图，根据样品蛋白质分子的相对迁移距离，从标准曲线上查出其相对分子质量，

log Mr＝K-bX

其中，Mr为分子量，X为相对迁移率，K、b均为常数；

6、反相高效液相色谱：反相高效液相色谱的分离条件及参数：①色谱柱填料0.5μm，C18为反相柱，尺寸为10mm×250mm；②样品：将冷冻干燥的竹叶抗氧化肽用去离子水溶解，经0.45μm滤膜过滤，进样量20μl，流速1ml/min；③流动A：去离子水，含0.1％三氟乙酸，经0.45μm滤膜过滤；④流动B：纯乙腈，含0.1％三氟乙酸，经0.45μm滤膜过滤；⑤洗脱条件：以流动相B体积分数为0％-100％线性梯度变化作为洗脱液。

本发明的有益效果为：它可以有效的将竹叶中的抗氧化肽进行分离并纯化，其利用了蛋白质的不同性质处理大量的高浓度的多肽蛋白质溶液，进行简单分离的同时使多肽蛋白浓缩，条件温和、操作简便，杂质少，为保健和医疗行业提供更多的资源，实用性强。

附图说明：

为了易于说明，本发明由下述的具体实施及附图作以详细描述。

图1为本发明中使用到的主要试剂列表，

图2为本发明中使用到的主要仪器列表。

具体实施方式：

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图中示出的具体实施例来描述本发明。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

本具体实施方式采用以下技术方案：它的分离与纯化方法为：1、竹叶粗蛋白的提取：准确称取竹叶粉20克于干净烧杯中，料液比1:20加入pH7.2、4℃预冷50mmol/L磷酸缓冲液400ml，搅拌均匀在4℃层析柜或冰箱中静置12小时，经纱布过滤去掉残渣，滤液经过冷冻离心(4℃，8000g，20min)，留取上清液，待用。采用硫酸铵沉淀法初步提取竹叶中的多肽蛋白，将固体硫酸铵缓慢加入到上清液中至终浓度为40％饱和度，同时使用磁力搅拌器缓慢搅拌，然后静置1h以上，在4℃、10000g离心15min，弃去沉淀，收集上清液，在40％饱和度的硫酸铵上清液中加固体硫酸铵至80％饱和度，静置1h以上，在4℃、10000g离心15min，收集沉淀，用10ml磷酸缓冲液溶解所得沉淀即得到竹叶蛋白粗提液。将80％硫酸铵盐析的蛋白粗提液，装入去离子水清洗过的透析袋，用pH7.2、50mmol/L磷酸缓冲液4℃下进行透析除盐，中间多次更换缓冲液，透析好的粗提液4℃保存备用，对所得的粗提样品进行超氧阴离子清除自由基能力检测；

2、离子层析：a、DEAE-Sephadex A-50的处理和层析柱的填装：称取一定量的DEAE-Sephadex A-50，用起始缓冲液(50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.2)浸泡，沸水浴2h，完全溶胀之后，用起始缓冲液清洗并采用倾倒法除去其中的细小颗粒，将处理好的离子交换剂上柱，利用重力沉降法装填1.6cm×18cm柱子，装填好的层析柱致密均匀、无气泡，最终柱体积为16ml。将层析柱与起始缓冲液储液器，恒流泵和紫外检测仪相连(λ＝280nm，0.05A)，检测密闭性并用起始缓冲液洗脱层析柱，使其达到交换平衡，并将紫外检测仪调零，为保持蛋白质活性，试验操作可在4℃层析柜中进行，另外此时所有设备和试剂均应在4℃预冷；b、加样：样品经过冷冻离心(10000g，15min，4℃)除去颗粒物，取澄清液，加样前先将层析柱上端拧开，利用重力作用将床面多余的缓冲溶液自然排干，当床面刚好暴露时将层析柱下端阀门关闭此时柱内液体不能流出，用吸管将预处理好的样品加到床面上，此时不能破坏床面的平整，以免造成区带的扭曲和倾斜，然后打开柱下端阀门，受重力作用样品溶液进入床面，最后用起始缓冲液加入柱内床面上2-3cm处，拧紧层析柱上口；c、洗脱：首先用起始缓冲液洗涤柱床，将起始条件下不能被吸附的物质从柱中洗去，在色谱图上形成穿透峰，洗涤过程需进行到峰后紫外吸收重新回到初始值附近为止，洗涤过程完成之后，开始进行梯度洗脱，洗脱液为pH7.2，50mmol/L磷酸缓冲液，NaCl浓度在0～0.5mol/L呈线性变化；d、样品收集：将洗脱出的溶液用蛋白质自动部分收集仪收集，收集体积为每管4ml，流速为1ml/min，将收集好的蛋白溶液进行超氧阴离子清除自由基能力检测，收集280nm峰和超氧阴离子自由基清除活性峰重叠区域，经透析除盐，冷冻干燥，备用；e、DEAE-Sephadex A-50的再生、清洗和储存：用高浓度NaCl溶液清洗色谱柱可以除去以离子键与交换剂结合的物质，当色谱柱上结合了以非离子键吸附的污染物，可在DEAE-Sephadex A-50清洗pH范围内进行碱酸交替清洗，在彻底清洗后可浸泡在含20％乙醇的0.2mol/L乙酸中于4-8℃保存；

A液(pH8.2，50mmol/L Tris-HCl缓冲液，内含1mmol/L EDTA-2Na)：量取2.1ml浓HCl，加蒸馏水定容到250ml，得到0.1mol/L HCl溶液；称取三羟甲基氨基甲烷3g，加蒸馏水溶解，再加入114.5ml0.1mol/L HCl溶液，用蒸馏水定容至500ml，制得pH8.2、浓度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲液液；

b、邻苯三酚自氧化速率的测定

c、加入样品液后邻苯三酚自氧化速率的测定

d、计算抑制率

S (%) = = \frac{V_{0} - V_{1}}{V_{0}} \times 100

式中：V₀为邻苯三酚自氧化时反应速率；

V₁为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率；

5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：a、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的竹叶抗氧化肽的纯度；b、相对分子质量的计算：

相对迁移距离＝蛋白质分子迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)

log Mr＝K-bX

其中，Mr为分子量，X为相对迁移率，K、b均为常数；

6、反相高效液相色谱：反相高效液相色谱的分离条件及参数：①色谱柱填料0.5μm，C18为反相柱，尺寸为10mm×250mm；②样品：将冷冻干燥的竹叶抗氧化肽用去离子水溶解，经0.45μm滤膜过滤，进样量20μl，流速1ml/min；③流动A：去离子水，含0.1％三氟乙酸，经0.45μm滤膜过滤；④流动B：纯乙腈，含0.1％三氟乙酸，经0.45μm滤膜过滤；⑤洗脱条件：以流动相B体积分数为0％～100％线性梯度变化作为洗脱液。

本具体实施方式中使用到的主要试剂见图1。

本具体实施方式中使用到的主要仪器见图2。

本具体实施方式的主要原理是将抗氧化多肽从竹叶中分离出来，得到高纯度的具有抗氧化生物活性的多肽蛋白，以竹叶为原料，用缓冲液浸提得到竹叶多肽蛋白液，再采用一系列蛋白分离纯化技术得到具有抗氧化活性的高纯度多肽蛋白。在蛋白质分离纯化过程中以清除超氧离子自由基活性为指标，先使用硫酸铵沉淀技术，然后依次是采用离子交换层析和凝胶过滤层析，得到高纯度的抗氧化多肽，所选择的每一种技术都是利用了蛋白质的不同性质，硫酸铵沉淀技术能处理大量的高浓度的多肽蛋白质溶液，进行简单分离的同时使多肽蛋白浓缩，该法条件温和、操作简便。离子交换层析则利用了多肽蛋白的带电量除去大部分杂蛋白质，凝胶过滤层析则利用多肽蛋白的分子量进行分离并附带有除盐作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.竹叶抗氧化肽的分离与纯化方法，其特征在于：它的分离与纯化方法为：(1)、竹叶粗蛋白的提取：准确称取竹叶粉20克于干净烧杯中，料液比1:20加入pH7.2、4℃预冷50mmol/L磷酸缓冲液400ml，搅拌均匀在4℃层析柜或冰箱中静置12小时，经纱布过滤去掉残渣，滤液经过冷冻离心(4℃，8000g，20min)，留取上清液，待用；采用硫酸铵沉淀法初步提取竹叶中的多肽蛋白，将固体硫酸铵缓慢加入到上清液中至终浓度为40％饱和度，同时使用磁力搅拌器缓慢搅拌，然后静置1h以上，在4℃、10000g离心15min，弃去沉淀，收集上清液，在40％饱和度的硫酸铵上清液中加固体硫酸铵至80％饱和度，静置1h以上，在4℃、10000g离心15min，收集沉淀，用10ml磷酸缓冲液溶解所得沉淀即得到竹叶蛋白粗提液；将80％硫酸铵盐析的蛋白粗提液，装入去离子水清洗过的透析袋，用pH7.2、50mmol/L磷酸缓冲液4℃下进行透析除盐，中间多次更换缓冲液，透析好的粗提液4℃保存备用，对所得的粗提样品进行超氧阴离子清除自由基能力检测；(2)、离子层析：(a)、DEAE-Sephadex A-50的处理和层析柱的填装：称取一定量的DEAE-Sephadex A-50，用起始缓冲液(50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.2)浸泡，沸水浴2h，完全溶胀之后，用起始缓冲液清洗并采用倾倒法除去其中的细小颗粒，将处理好的离子交换剂上柱，利用重力沉降法装填1.6cm×18cm柱子，装填好的层析柱致密均匀、无气泡，最终柱体积为16ml，将层析柱与起始缓冲液储液器，恒流泵和紫外检测仪相连(λ＝280nm，0.05A)，检测密闭性并用起始缓冲液洗脱层析柱，使其达到交换平衡，并将紫外检测仪调零，为保持蛋白质活性，试验操作可在4℃层析柜中进行，另外此时所有设备和试剂均应在4℃预冷；(b)、加样：样品经过冷冻离心(10000g，15min，4℃)除去颗粒物，取澄清液，加样前先将层析柱上端拧开，利用重力作用将床面多余的缓冲溶液自然排干，当床面刚好暴露时将层析柱下端阀门关闭此时柱内液体不能流出，用吸管将预处理好的样品加到床面上，此时不能破坏床面的平整，以免造成区带的扭曲和倾斜，然后打开柱下端阀门，受重力作用样品溶液进入床面，最后用起始缓冲液加入柱内床面上2～3cm处，拧紧层析柱上口；(c)、洗脱：首先用起始缓冲液洗涤柱床，将起始条件下不能被吸附的物质从柱中洗去，在色谱图上形成穿透峰，洗涤过程需进行到峰后紫外吸收重新回到初始值附近为止，洗涤过程完成之后，开始进行梯度洗脱，洗脱液为pH7.2，50mmol/L磷酸缓冲液，NaCl浓度在0～0.5mol/L呈线性变化；(d)、样品收集：将洗脱出的溶液用蛋白质自动部分收集仪收集，收集体积为每管4ml，流速为1ml/min，将收集好的蛋白溶液进行超氧阴离子清除自由基能力检测，收集280nm峰和超氧阴离子自由基清除活性峰重叠区域，经透析除盐，冷冻干燥，备用；(e)、DEAE-Sephadex A-50的再生、清洗和储存：用高浓度NaCl溶液清洗色谱柱可以除去以离子键与交换剂结合的物质，当色谱柱上结合了以非离子键吸附的污染物，可在DEAE-Sephadex A-50清洗pH范围内进行碱酸交替清洗，在彻底清洗后可浸泡在含20％乙醇的0.2mol/L乙酸中于4～8℃保存；(3)、凝胶过滤层析：(a)、SephadexG-75的预处理：SephadexG-75干粉采用洗脱液浸泡，沸水浴3h，溶胀过程中不要过分搅拌，以防颗粒破碎，凝胶充分溶胀后用倾倒法将不易沉下的较细颗粒除去，将溶胀后凝胶抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h，搅拌后继续用倾倒法除去悬浮的较细颗粒；(b)、装柱：将层析柱垂直装好，关闭出口，加入洗脱液约1cm高，将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积约1～2cm高时，打开柱出口让水流出，同时不断缓慢加入凝胶悬液，高径比为48/1.6，体积为96.5ml；(c)、平衡：将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml/min；(d)、加样与洗脱：将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将2ml样品(15mg/ml)，沿层析柱管壁小心加入，加完后打开层析底端出口，当样品液面降至与凝胶面相平时关闭层析柱出口，用少量洗脱液洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右，接上恒流泵，调节好流速(0.5ml/min)，开始洗脱；(e)、收集与测定：用部分收集器收集洗脱液，每管2ml,紫外检测仪280nm处检测，绘制洗脱曲线，同时测定其超氧阴离子自由基清除活性大小，收集280nm峰和超氧阴离子自由基清除活性峰重叠区域，将收集液冷冻干燥，备用；(4)、超氧阴离子自由基(O2·—)清除能力测定：(a)、实验试剂的配制：

(b)、邻苯三酚自氧化速率的测定

取5.5mlA液于15ml的比色管中，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃水浴中预热过的B液，迅速摇匀后倒入比色皿，用紫外分光光度计在325nm下每隔30s测定一次吸光度，共反应5min，将自氧化速率控制在0.060～0.065A/min，将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V₀，以A液为空白对照，记录结果；

(c)、加入样品液后邻苯三酚自氧化速率的测定

(d)、计算抑制率

S (%) = = \frac{V_{0} - V_{1}}{V_{0}} \times 100

式中：V₀为邻苯三酚自氧化时反应速率；

V₁为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率；

(5)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：(a)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的竹叶抗氧化肽的纯度；(b)、相对分子质量的计算：

(1)、分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心距分离胶顶端的距离，按以下计算相对迁移率：

相对迁移距离＝蛋白质分子迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)

(2)、分析图谱，绘制标准曲线，以标准蛋白的相对分子质量的对数为纵坐标，相对迁移距离为横坐标作图，根据样品蛋白质分子的相对迁移距离，从标准曲线上查出其相对分子质量，

log Mr＝K-bX

其中，Mr为分子量，X为相对迁移率，K、b均为常数；

(6)、反相高效液相色谱：反相高效液相色谱的分离条件及参数：(a)、色谱柱填料0.5μm，C18为反相柱，尺寸为10mm×250mm；(b)、样品：将冷冻干燥的竹叶抗氧化肽用去离子水溶解，经0.45μm滤膜过滤，进样量20μl，流速1ml/min；(c)、流动A：去离子水，含0.1％三氟乙酸，经0.45μm滤膜过滤；(d)、流动B：纯乙腈，含0.1％三氟乙酸，经0.45μm滤膜过滤；(e)、洗脱条件：以流动相B体积分数为0％-100％线性梯度变化作为洗脱液。