CN108840926A - 液体畜禽血红蛋白的高效制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其包括以下步骤：步骤一、向畜禽血液中加入抗凝剂，搅拌均匀后得畜禽血样；步骤二、将畜禽血样置于离心机中分离，分别得血球与血清；步骤三、用等渗液清洗血球1～4次，收集清洗沉淀物，得净化后的血球；步骤四、向净化后的血球中加入纯水搅拌均匀，得溶血液，血球与纯水的体积比为1～3:1，将溶血液置于高压均质机中处理，离心后收集上层清液即得液体畜禽血红蛋白。本发明的制备方法能够大大提升生产效率和破膜效果，所得血红蛋白被氧化少、纯度高，为后期高附加值产品开发提供优质原料。本发明工艺操作简便，设备通用性好，有利于形成规模化生产。

Description

液体畜禽血红蛋白的高效制备方法

技术领域

本发明涉及畜禽血液加工技术领域。更具体地说，本发明涉及一种液体畜禽血红蛋白高效制备方法。

背景技术

畜禽血液营养丰富，含有200多种功能成分，蛋白含量16.4～18.9％，包含人体必需的8种氨基酸，尤其以赖氨酸和亮氨酸含量高，还含有钙、磷、镁、钾、铁等微量元素及多种维生素、糖类、脂类。畜禽血液约占动物体重的5～8％，屠宰后可收集血液量占屠宰体重的4～5％，其中含有丰富的营养和生物活性物质，尤其是蛋白质含量丰富可与瘦肉媲美，所以血液在西方素有“液体肉”之称，血液中蛋白质的必需氨基酸总量高于人乳和全蛋，特别是赖氨酸的含量很高，接近9％，完全符合人类和畜禽有机体的需要，被广泛应用于各个行业。

国外利用畜禽血液的历时较长，已有对于血液的深度开发利用。瑞典在1976年，屠宰收集血液的10％以供食用，20世纪80年代爱尔兰和德国达到5％，丹麦达到2％。发达国家在饲料、食品、化工、医药、肥料、葡萄酒等方面取得突破性进展。德国、英国、日本、比利时等国家将血液制成液态饲料、着色剂或营养补充剂；法国葡萄酒工业广泛应用血液制品作为酒类的澄清剂；美国从牛血浆蛋白中提取血纤维制品。国内在饲料、食品中的应用广泛，其中食品的着色剂和应用复合酶技术将血液中大分子降解为多肽和氨基酸。血红蛋白肽不仅具有良好的营养性，而且具备极佳的生理功能，可以作为保健食品和功能食品，可以提供易于人体吸收的有机铁、多肽、氨基酸，有实验证明蛋白肽在预防癌症、降低血脂、抗动脉硬化、促进免疫等方面表现出良好效果，在制药行业中，血红素不仅可以作为胆红素原料，还可以作为制备抗癌药物。临床上多使用作为补铁剂，可以被人体直接吸收，副作用小。以氧化血红蛋白为原料制备元布林二钠可用于治疗急性肝炎、慢性衍生型肝炎、慢性活动性肝炎。另外，血红素去除铁离子后，再在卟啉环上修饰得到血卟啉类药物，用于发现和治疗肿瘤。红细胞中分离提取出SOD，SOD的开发利用成为医药、食品、化妆品的热门研究和应用课题。从鸡血中提取的SOD具有明显的抗氧化活性，可以治疗类风湿性关节炎、慢性多发性关节炎以及放射治疗后的炎症等。

血球中血红蛋白的提取纯度与提取效率，对于后期的产品生产和开发是非常重要的前提准备。之前的研究或生产从血球中提取血红蛋白均采用纯水搅拌破膜或超声破膜的方法，存在着效率低(70-80％之间)，时间长(40min以上)，连续性差的弊端。此外，现有技术中提取的血红蛋白腥味较重，抑菌性较差导致保质期较短。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其制备工艺简单，所用原料廉价易得，能够获得纯度高、无腥味、具有较好抑菌性能的液态畜禽血红蛋白。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其包括以下步骤：

步骤一、向畜禽血液中加入抗凝剂，搅拌均匀后得畜禽血样；

步骤二、将畜禽血样置于离心机中分离，分别得血球与血清；

步骤三、用等渗液清洗血球1～4次，收集清洗沉淀物，得净化后的血球；

步骤四、向净化后的血球中加入纯水搅拌均匀，得溶血液，血球与纯水的体积比为1～3:1，将溶血液置于高压均质机中处理，离心分离后收集上层清液即得液体畜禽血红蛋白；

各步骤均在4～8℃下进行。

优选的是，所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，所述步骤一中，畜禽血液在加入抗凝剂之前，还经过了预处理，具体为：采集干净的畜禽血液，采用60～100目不锈钢网进行过滤，即得。

优选的是，所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，步骤四中，高压均质机的压力为30～60MPa，高压均质处理的时间为10～15s。

优选的是，所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，所述步骤二中，离心机采用转速为14000～16000rpm的管式离心机。

优选的是，所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，所述步骤三中每次清洗中，加入的所述等渗液与所述血球的体积比为0.5～2:1，加入所述等渗液后在速度为24～36rpm下搅拌时间15～20min后过滤，收集沉淀物。

优选的是，所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，所述抗凝剂与畜禽血液的体积比为1:12～15，所述抗凝剂包括重量比为1:10～12的抗凝混合物和纯净水，所述抗凝混合物的制备方法为：

a、按照重量比为4～5:4～5:1分别称取三聚磷酸钠、柠檬酸钠和氯化钠，分别粉碎过80～100目筛网并将三种粉碎物混合，得第一混合粉；

b、按重量份数，称取2～5份的生姜、3～4份的大葱、4～6份的洋葱和1～3份的辣椒籽，分别粉碎成粉末并混合，得第二混合粉，将所述第二混合粉浸泡于20～30份的40～60℃下的乙醇中，超声振荡10min，静置20～30min后过滤得第一滤液和第一滤渣；

c、称取5～8份的薄荷茎、3～6份的菊花和2～4份的金银花，分别洗净、切碎并混合均匀，得第一混合物，向所述第一混合物中加入20～30份的纯净水，加热至80～90℃熬煮，30～40min后趁热过滤，得第二滤液和第二滤渣；

d、将所述第一滤液和所述第二滤液混合得第一混合液，并浓缩至第一混合液原体积的五分之一，得浓缩液，将所述浓缩液与所述第一混合粉按照重量比为1:3的比例进行混合，得第二混合物，将所述第二混合物冷冻干燥，即得。

优选的是，所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，步骤三中所述等渗液为体积比为20:1的等渗盐水和所述浓缩液的混合物，等渗盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠水溶液。

优选的是，所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，步骤四中的纯水中加入有保护剂，纯水与所述保护剂的体积比为1:0.02，所述保护剂的制备方法为：

i、按重量份数计，分别称取4～7份的黄玉米粒、6～9份的洋葱和3～8份的纯水混合后打浆，得第三混合物，将所述第三混合物置于温度为80～90℃下蒸煮30～40min，自然冷却后过500目筛得第三滤液和第三滤渣，期间每隔10min向所述第三混合物中加入1～2份的柠檬汁，并搅拌5min；

ii、称取2～5份的松树皮、1～3份的绿茶叶、1～3份的茄子皮、2～4份的苹果皮、0.5～1.0份的葡萄籽和0.3～0.8份的核桃衣，分别洗净后混合得第四混合物，向所述第四混合物中加入5～8份的正己烷，充分搅拌后置于反应釜中，加压至0.2MPa处理10～20min后降至常压，过500目筛得第四滤液和第四滤渣；

iii、称取0.01～0.03份的抗坏血酸钠加入纯净水搅拌使其完全溶解，得抗坏血酸钠水，将第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液和抗坏血酸钠水按照体积比为1:1:2:1.5:0.1的比例混合，即得所述保护剂。

优选的是，所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，步骤四中，在置于高压均质机之前，向所述溶血液中加入其重量的0.003倍的粒径为0.02～0.05mm的添加剂，并进行超声震荡处理5～10min，期间向所述溶血液中通入惰性气体除氧；

所述添加剂的制备方法具体为，将所述第一滤渣、所述第二滤渣、所述第三滤渣和所述第四滤渣按照重量比为1:1:1:1的比例混合均匀，得第五混合物，将所述第五混合物置于温度为100～120℃，压力为0.2～0.4Mpa的反应釜中处理20～30min，得第六混合物，将所述第六混合物冷冻干燥，并粉碎至粒径为0.02～0.05mm的粉末，即得所述添加剂。

本发明至少包括以下有益效果：

1、本发明大大提升了血红蛋白的制备效率和纯度；本发明的制备方法简单、生产效率高；工艺中采用等渗液洗脱避免了常规洗脱过程中采用水洗方法导致血球破碎损失，物料损耗减少明显；采用均质破膜工艺，大大提升生产效率和破膜效果，所得血球蛋白被氧化少、纯度高，为后期高附加值产品开发提供优质原料。本发明工艺操作简便，设备通用性好，有利于形成规模化生产；

2、相比常规的破膜技术，本发明采用高压均质的方法进行破膜，加快破膜速率，在保证破膜率的同时，减少血红蛋白的流失和受损，血红蛋白和其他杂质能够很好的分离开来，不用经过额外的超滤、过柱等操作即可获得纯度较高的血红蛋白，简化了提纯工艺，降低了制备成本；

3、本发明的抗凝剂中除了包括有常规的抗凝物质三聚磷酸钠、柠檬酸钠和氯化钠，还在其中添加了具有抑菌、去味功效的物质，具体的选用生活中常见的生姜、大葱、洋葱和辣椒籽作为原料从中提取杀菌的有效物质，对畜禽血液中的病原菌等具有很好的抑制作用，薄荷茎、菊花和金银花的提取物能够去除畜禽血液中的血腥味；在等渗液中也加入适量的抑菌和去味物质，将血球外表面的病原菌等杀灭，去除血球的血腥味；

4、本发明在破膜过程中采用纯水作为介质，在纯水中加入保护剂，保护剂中含有常规的抗氧化物质抗坏血酸钠，能够对破膜而出的血红蛋白及时的保护起来，避免血红蛋白被氧化而导致血红蛋白的损失，保护剂中还含有从天然物质黄玉米粒、洋葱、松树皮、绿茶叶、茄子皮、苹果皮、葡萄籽和核桃衣中提取的天然抗氧化物质，增强了抗坏血酸钠的抗氧化性能，黄玉米粒中含有大量的维生素C、花青素以及抗氧化活性剂，不仅起到抗氧化的作用，还能够与其他原料相互配合，协调增效；洋葱中还有微量元素硒具有较强的抗氧化性，还含有植物杀菌素大蒜素，有很强的杀菌抑菌能力；松树皮、绿茶叶、茄子皮、苹果皮、葡萄籽和核桃衣都是日常生活中常见的物质，廉价易得，其提取物中含有极佳的抗氧化物质；

5、第一滤渣、第二滤渣、第三滤渣和第四滤渣混合均匀、消毒灭菌处理后得到添加剂，将经过有效物质提取后的残渣充分利用，残渣中含有部分杀菌、去味的有效物质，废物利用能够进一步降低成本；颗粒状的添加剂加入至溶血液中，在高压均质过程中，增加血球的碰撞面和碰撞力度，加快血球的破膜速率，血球在破膜能够及时的被保护剂和添加剂中的抗氧物质保护起来，减少血红蛋白的流失。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法的工艺流程图；

图2为本发明所述的破膜实验验证工艺路线。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验验证：

1、洗脱实验验证

表1、2、3为本发明所述的液态畜禽血红蛋白高效制备方法对鸡血中细胞基本成分测定以及不同料液比和洗脱次数对血细胞中灰分的影响；

表1鸡血细胞基本成分测定

血细胞	蛋白(湿重)	灰分(湿重)	灰分(干重)	水分
					含量(％)	18.91-25.01	1.49-2.07	5.69-6.20	63.64-67.02

表2不同料液比例(等渗液与血细胞的体积比)(R＝0.9％NaCl：血细胞)洗脱后血细胞中灰分含量(％)

R	灰分干重	SD	p<0.05
				3:1	5.81	0.23	a
2:1	5.39	0.07	ab
				1:1	4.68	0.11	c
1:2	5.50	0.24	a
				1:3	5.04	0.38	bc

注：SD是标准差的意思。p<0.05是统计学中显著差异的意思。A,b,c同样是统计学的差异标识符号。

表3不同洗脱次数(1-4次)洗脱后血细胞中的灰分含量(％)

次数	R	灰分干重	SD	p<0.05
					4	1:1	4.66	0.10	d
3	1:1	4.68	0.11	d
					2	1:1	5.05	0.16	c
1	1:1	6.40	0.05	a
					0	0:1	5.81	0.10	b
1	3:1	6.18	0.27	a

最终确定料液比例(等渗液与血细胞的体积比)1:1，3次洗脱，脱灰效果最佳，灰分干重4.68％(<5％)。

2、破膜实验验证

针对原有操作破膜率低的现状，如图2所示提供三种破膜工艺路线，优化出最佳的物理破膜工艺参数，使破膜率＞80％。

2.1常压匀浆

2.1.1试验目的：探究匀浆转速、料液比例、时间、温度对血细胞破膜的影响；优化最佳常压匀浆破膜工艺。

2.1.2试验方法：通过蛋白含量判定破膜效果。

2.1.2试验条件：

匀浆转速：3000-8000rpm/min；

料液比例：2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5；(血细胞与水的体积比)

时间：15-150min；

温度：0-65℃；

离心：8000rpm，20min，4℃。

2.1.3试验结果：

表4不同匀浆转速的血细胞破膜率(％)

匀浆转速(rpm/min)	破膜率	SD	p<0.05
				3000	75.03	0.40	e
3500	77.68	0.66	d
				4000	78.80	0.12	c
4500	78.73	0.39	c
				5000	78.32	1.31	c
6000	80.31	0.90	b
				7000	82.83	1.14	a
8000	78.69	0.95	c

表5不同匀浆比例的血细胞破膜率(％)

比例(血细胞：水)	破膜率	SD	p<0.05
				2:1	74.67	2.94	c
1:1	80.34	1.79	a
				1:2	76.05	0.71	b
1:3	74.57	0.87	c
				1:4	68.74	1.76	d
1:5	67.85	0.82	d

表6不同匀浆时间的血细胞破膜率(％)

匀浆时间(min)	破膜率	SD	p<0.05
				10.00	67.55	0.92	h
15.00	74.57	0.87	g
				20.00	76.76	0.45	f
30.00	78.64	1.36	e
				40.00	80.42	1.27	d
50.00	80.57	1.02	d
				60.00	81.88	1.23	c
90.00	94.20	1.22	a
				120.00	94.02	0.78	a
150.00	91.95	1.05	b

表7不同匀浆温度的血细胞破膜率(％)

匀浆温度(℃)	破膜率	SD	p<0.05
				0	74.57	0.87	d
25	76.93	0.81	c
				35	82.08	0.48	b
45	84.25	0.50	a
				55	74.18	1.25	d
65	77.03	0.82	c
				65	77.03	0.82	c

在单因素实验结果的基础上，采用中心组合(Box-Behnken)实验设计方案，以料水比例(A)、匀浆时间(B)、匀浆转速(C)为考察变量，以血细胞破膜率(R1，％)为响应值设计响应面实验。

表8常压匀浆血细胞破膜响应面分析因素水平编码表

水平	料水比例(W)	匀浆时间(min)	匀浆转速(rpm)
				-1	1:2	15	3000
0	5:4	37.5	4000
				1	2:1	60	5000

表9常压匀浆血细胞破膜响应面分析试验设计及结果

试验号	料液比例	匀浆时间(min)	匀浆转速(rpm)	破膜率(％)	SD
						1	1:2	15.0	4000	79.78	0.51
2	5:4	60.0	5000	91.34	2.43
						3	5:4	60.0	3000	84.62	1.10
4	5:4	37.5	4000	94.19	0.79
						5	5:4	37.5	4000	95.52	0.39
6	2:1	60.0	4000	87.35	2.90
						7	5:4	15.0	3000	79.20	2.67
8	2:1	37.5	5000	87.50	0.82
						9	5:4	37.5	4000	94.82	0.24
10	2:1	15.0	4000	84.75	1.45
						11	1:2	37.5	3000	82.55	0.99
12	5:4	15.0	5000	83.33	0.66
						13	5:4	37.5	4000	95.70	1.00
14	1:2	37.5	5000	89.60	2.13
						15	2:1	37.5	3000	87.06	0.57
16	1:2	60.0	4000	90.28	0.67
						17	5:4	37.5	4000	94.73	0.66

2.1.4试验结论：

通过响应面设计得出常压匀浆破膜的最佳工艺：料水比例6:5、匀浆时间45min、匀浆转速4000rpm，理论破膜率95.82％。

2.2超声破膜

2.2.1试验目的：探究超声功率、料液比例、时间对血细胞破膜的影响；优化最佳超声破膜工艺。

2.2.2试验方法：通过蛋白含量判定破膜效果。

2.2.3试验条件：

超声功率：200-600W；

料液比例(血细胞与水的体积比)：2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5；

时间：20-150min；

离心：8000rpm，20min，4℃。

2.2.4试验结果：

表10不同超声功率的血细胞破膜率(％)

超声功率(W)	破膜率	SD	p<0.05
				200	72.73	3.23	c
300	73.59	1.57	c
				400	79.03	1.61	a
500	77.40	1.32	b
				600	72.92	1.61	c
600	72.92	1.61	c

表11不同超声比例的血细胞破膜率(％)

表12不同超声时间的血细胞破膜率(％)

超声时间(min)	破膜率	SD	p<0.05
				20	77.82	1.21	f
40	82.18	0.21	e
				60	86.23	0.58	d
90	88.86	0.52	c
				120	93.44	0.65	b
150	97.08	1.33	a

在单因素实验结果的基础上，采用中心组合(Box-Behnken)实验设计方案，以料水比例(A)、超声时间(B)、超声功率(C)为考察变量，以血细胞破膜率(R1，％)为响应值设计响应面实验。

表13血细胞超声破膜响应面分析因素水平编码表

水平	料水比例(W)	超声时间(min)	超声功率(W)
				-1	1:2	20	300
0	5:4	40	400
				1	2:1	60	500

表14血细胞超声破膜响应面分析试验设计及结果

试验号	料液比例	超声时间(min)	超声功率(W)	破膜率(％)	SD
						1	5:4	40	400	89.41	1.11
2	5:4	60	300	85.90	1.01
						3	2:1	60	400	88.04	0.90
4	2:1	20	400	82.59	0.79
						5	5:4	40	400	89.69	0.97
6	1:2	20	400	78.20	1.17
						7	5:4	40	400	90.12	0.74
8	5:4	40	400	90.05	1.04
						9	5:4	20	300	80.25	1.63
10	2:1	40	500	84.06	1.31
						11	5:4	20	500	80.89	1.33
12	1:2	40	300	80.14	1.32
						13	5:4	60	500	87.24	0.46
14	2:1	40	300	83.57	1.21
						15	5:4	40	400	90.59	0.89
16	1:2	60	400	86.41	1.50
						17	1:2	40	500	81.97	0.75

2.2.5试验结论：

通过响应面设计得出超声破膜的最佳工艺：料水比例4:3、匀浆时间50min、超声功率400W，理论破膜率91.09％。

2.3高压均质破膜

2.3.1试验目的：探究料液比例、均质压力对血细胞破膜的影响。

2.3.2试验方法：通过蛋白含量判定破膜效果。

2.3.3试验条件：

压力：10-50MPa；

料液比例(血细胞与水的体积比)：2:1、1:1、1:2、1:3、1:4；

离心：8000rpm，20min，4℃。

2.3.4试验结果：

表15不同均质压力的血细胞破膜率(％)

表16不同均质比例的血细胞破膜率(％)

比例(血细胞：水)	破膜率	SD	p<0.05
				3:1	96.78	0.75	b
2:1	98.38	0.60	a
				1:1	90.83	1.15	b
1:2	90.22	0.29	b
				1:3	76.70	1.14	d
1:4	88.47	1.36	c

2.3.5试验结论：

随着压力的增大，破膜率上升；压力为50MPa时。破膜率达到最大，为100％；随着溶剂量的增加，破膜效率下降，料液比例(血细胞与水的体积比)为2:1时破膜率最高，为98.38％。

由以上实验验证得出，血球与等渗液料液比例1:1，3次洗脱效果最佳。采用均质方法破膜，血细胞与水的体积比为2:1，压力为50MPa时，破膜效率最高。

根据以上实验验证，高压均质破膜的破膜率远远高于常压匀浆和超声破膜工艺。

<实施例1>

如图1所示，本发明提供一种液体畜禽血红蛋白的高校制备方法，各步骤的温度均在4℃下进行，其包括以下步骤：

步骤一、采集干净的畜禽血液，采用60目不锈钢网进行过滤，并向畜禽血液滤液中加入抗凝剂，搅拌均匀后得畜禽血样；其中，抗凝剂为重量比为4:4:1的三聚磷酸钠:柠檬酸钠:氯化钠混合，使用1:10水溶解制得的，按照抗凝剂与畜禽血液的体积比为1:12的比例加入到畜禽血液中，加入抗凝剂的畜禽血液经过换热器冷却后，进入到储存罐中，保证温度为4℃，搅拌转速为12rpm；

步骤二、将畜禽血样置于离心机中分离，分别得血球与血清；其中，离心机采用转速为14000～16000rpm的管式离心机；

步骤三、用等渗液清洗血球1次，收集清洗沉淀物，得净化后的血球；其中，每次清洗中，加入的所述等渗液与所述血球的体积比为0.5:1，加入所述等渗液后在速度为24rpm下搅拌时间15min后过滤，收集沉淀物；所述等渗液为质量浓度为0.9％的氯化钠水溶液；

步骤四、向净化后的血球中加入纯水搅拌均匀，血球与纯水的体积比为1:1，得溶血液，将溶血液置于高压均质机中处理10s，然后收集上层清液即得液体畜禽血红蛋白；其中，高压均质机的压力为30MPa。

<实施例2>

如图1所示，本发明提供一种液体畜禽血红蛋白的高校制备方法，各步骤的温度均在8℃下进行，其包括以下步骤：

步骤一、采集干净的畜禽血液，采用100目不锈钢网进行过滤，并向畜禽血液滤液中加入抗凝剂，搅拌均匀后得畜禽血样；其中，抗凝剂为重量比为5:5:1的三聚磷酸钠：柠檬酸钠：氯化钠混合，使用1:10水溶解制得的，按照抗凝剂与畜禽血液的体积比为1:15的比例加入到畜禽血液中，加入抗凝剂的畜禽血液经过换热器冷却后，进入到储存罐中，保证温度为4℃，搅拌转速为24rpm；

步骤二、将畜禽血样置于离心机中分离，分别得血球与血清；其中，离心机采用转速为16000rpm的管式离心机；

步骤三、用等渗液清洗血球4次，收集清洗沉淀物，得净化后的血球；其中，每次清洗中，加入的所述等渗液与所述血球的体积比为2:1，加入所述等渗液后在速度为36rpm下搅拌时间20min后过滤，收集沉淀物；所述等渗液为质量浓度为0.9％的氯化钠水溶液；

步骤四、向净化后的血球中加入纯水搅拌均匀，得溶血液，血球与纯水的体积比为3:1，将溶血液置于高压均质机中处理15s，然后收集上层清液即得液体畜禽血红蛋白；其中，高压均质机的压力为60MPa。

<实施例3>

如图1所示，本发明提供一种液体畜禽血红蛋白的高校制备方法，各步骤的温度均在6℃下进行，其包括以下步骤：

步骤一、采集干净的畜禽血液，采用80目不锈钢网进行过滤，并向畜禽血液滤液中加入抗凝剂，搅拌均匀后得畜禽血样；其中，抗凝剂为重量比为4.5:4.5:1的三聚磷酸钠：柠檬酸钠：氯化钠混合，使用1:10水溶解制得的，按照抗凝剂与畜禽血液的体积比为1:14的比例加入到畜禽血液中，加入抗凝剂的畜禽血液经过换热器冷却后，进入到储存罐中，保证温度为4℃，搅拌转速为16rpm；

步骤二、将畜禽血样置于离心机中分离，分别得血球与血清；其中，离心机采用转速为15000rpm的管式离心机；

步骤三、用等渗液清洗血球3次，收集清洗沉淀物，得净化后的血球；其中，每次清洗中，加入的所述等渗液与所述血球的体积比为1:1，加入所述等渗液后在速度为30rpm下搅拌时间18min后过滤，收集沉淀物；所述等渗液为质量浓度为0.9％的氯化钠水溶液；

步骤四、向净化后的血球中加入纯水搅拌均匀，得溶血液，血球与纯水的体积比为2:1，将溶血液置于高压均质机中处理13s，然后收集上层清液即得液体畜禽血红蛋白；其中，高压均质机的压力为45MPa。

<实施例4>

步骤一、采集干净的畜禽血液，采用60目不锈钢网进行过滤，并向畜禽血液滤液中加入抗凝剂，搅拌均匀后得畜禽血样；

其中，所述抗凝剂与畜禽血液的体积比为1:12，所述抗凝剂包括重量比为1:10的抗凝混合物和纯净水，所述抗凝混合物的制备方法为：

a、按照重量比为4:4:1分别称取三聚磷酸钠、柠檬酸钠和氯化钠，分别粉碎过80目筛网并将三种粉碎物混合，得第一混合粉；

b、按重量份数，称取2份的生姜、3份的大葱、4份的洋葱和1份的辣椒籽，分别粉碎成粉末并混合，得第二混合粉，将所述第二混合粉浸泡于20份的40℃下的乙醇中，超声振荡10min，静置20min后过滤得第一滤液和第一滤渣；

c、称取5份的薄荷茎、3份的菊花和2份的金银花，分别洗净、切碎并混合均匀，得第一混合物，向所述第一混合物中加入20份的纯净水，加热至80℃熬煮，30min后趁热过滤，得第二滤液和第二滤渣；

d、将所述第一滤液和所述第二滤液混合得第一混合液，并浓缩至第一混合液原体积的五分之一，得浓缩液，将所述浓缩液与所述第一混合粉按照重量比为1:3的比例进行混合，得第二混合物，将所述第二混合物冷冻干燥，即得。

步骤二、将畜禽血样置于离心机中分离，分别得血球与血清，其中，离心机采用转速为14000rpm的管式离心机；

步骤三、用等渗液清洗血球1次，收集清洗沉淀物，得净化后的血球，其中，每次清洗中，加入的等渗液与血清的体积比为0.5:1，加入所述等渗液后在速度为24rpm下搅拌时间15min后过滤，收集沉淀物；等渗液为体积比为20:1的等渗盐水和所述浓缩液的混合物，等渗盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠水溶液；

步骤四、向净化后的血球中加入纯水搅拌均匀，血球与纯水的体积比为1:1，得溶血液，向溶血液中加入其重量的0.003倍的粒径为0.02mm的添加剂，并进行超声震荡处理5min，期间向所述溶血液中通入惰性气体除氧；将溶血液置于高压均质机中处理10s，压力控制在30MPa，收集高压均质处理后的上层清液即得液体畜禽血红蛋白；

其中，纯水中加入有保护剂，纯水与所述保护剂的体积比为1:0.02，所述保护剂的制备方法为：

i、按重量份数计，分别称取4份的黄玉米粒、6份的洋葱和3份的纯水混合后打浆，得第三混合物，将所述第三混合物置于温度为80℃下蒸煮30min，自然冷却后过500目筛得第三滤液和第三滤渣，期间每隔10min向所述第三混合物中加入1份的柠檬汁，并搅拌5min；

ii、称取2份的松树皮、1份的绿茶叶、1份的茄子皮、2份的苹果皮、0.5份的葡萄籽和0.3份的核桃衣，分别洗净后混合得第四混合物，向所述第四混合物中加入5份的正己烷，充分搅拌后置于反应釜中，加压至0.2MPa处理10min后降至常压，过500目筛得第四滤液和第四滤渣；

iii、称取0.01份的抗坏血酸钠加入纯净水搅拌使其完全溶解，得抗坏血酸钠水，将第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液和抗坏血酸钠水按照体积比为1:1:2:1.5:0.1的比例混合，即得所述保护剂；

所述添加剂的制备方法具体为，将所述第一滤渣、所述第二滤渣、所述第三滤渣和所述第四滤渣按照重量比为1:1:1:1的比例混合均匀，得第五混合物，将所述第五混合物置于温度为100℃，压力为0.2Mpa的反应釜中处理20min，得第六混合物，将所述第六混合物冷冻干燥，并粉碎至粒径为0.02mm的粉末，即得所述添加剂。

<实施例5>

步骤一、采集干净的畜禽血液，采60～100目不锈钢网进行过滤，并向畜禽血液滤液中加入抗凝剂，搅拌均匀后得畜禽血样；

其中，所述抗凝剂与畜禽血液的体积比为1:15，所述抗凝剂包括重量比为1:12的抗凝混合物和纯净水，所述抗凝混合物的制备方法为：

a、按照重量比为5:5:1分别称取三聚磷酸钠、柠檬酸钠和氯化钠，分别粉碎过100目筛网并将三种粉碎物混合，得第一混合粉；

b、按重量份数，称取5份的生姜、4份的大葱、6份的洋葱和3份的辣椒籽，分别粉碎成粉末并混合，得第二混合粉，将所述第二混合粉浸泡于30份的60℃下的乙醇中，超声振荡10min，静置30min后过滤得第一滤液和第一滤渣；

c、称取8份的薄荷茎、6份的菊花和4份的金银花，分别洗净、切碎并混合均匀，得第一混合物，向所述第一混合物中加入30份的纯净水，加热至90℃熬煮，40min后趁热过滤，得第二滤液和第二滤渣；

d、将所述第一滤液和所述第二滤液混合得第一混合液，并浓缩至第一混合液原体积的五分之一，得浓缩液，将所述浓缩液与所述第一混合粉按照重量比为1:3的比例进行混合，得第二混合物，将所述第二混合物冷冻干燥，即得。

步骤二、将畜禽血样置于离心机中分离，分别得血球与血清，其中，离心机采用转速14000～16000rpm的管式离心机；

步骤三、用等渗液清洗血球4次，收集清洗沉淀物，得净化后的血球，其中，每次清洗中，加入的等渗液与血清的体积比为2:1，加入所述等渗液后在速度为36rpm下搅拌时间20min后过滤，收集沉淀物；等渗液为体积比为20:1的等渗盐水和所述浓缩液的混合物，等渗盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠水溶液；

步骤四、向净化后的血球中加入纯水搅拌均匀，血球与纯水的体积比为3:1，得溶血液，向溶血液中加入其重量的0.003倍的粒径为0.05mm的添加剂，并进行超声震荡处理10min，期间向所述溶血液中通入惰性气体除氧；将溶血液置于高压均质机中处理15s，压力控制在60MPa，收集高压均质处理后的上层清液即得液体畜禽血红蛋白；

其中，纯水中加入有保护剂，纯水与所述保护剂的体积比为1:0.02，所述保护剂的制备方法为：

i、按重量份数计，分别称取7份的黄玉米粒、9份的洋葱和8份的纯水混合后打浆，得第三混合物，将所述第三混合物置于温度为90℃下蒸煮40min，自然冷却后过500目筛得第三滤液和第三滤渣，期间每隔10min向所述第三混合物中加入2份的柠檬汁，并搅拌5min；

ii、称取5份的松树皮、3份的绿茶叶、3份的茄子皮、4份的苹果皮、1.0份的葡萄籽和0.8份的核桃衣，分别洗净后混合得第四混合物，向所述第四混合物中加入8份的正己烷，充分搅拌后置于反应釜中，加压至0.2MPa处理20min后降至常压，过500目筛得第四滤液和第四滤渣；

iii、称取0.03份的抗坏血酸钠加入纯净水搅拌使其完全溶解，得抗坏血酸钠水，将第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液和抗坏血酸钠水按照体积比为1:1:2:1.5:0.1的比例混合，即得所述保护剂；

所述添加剂的制备方法具体为，将所述第一滤渣、所述第二滤渣、所述第三滤渣和所述第四滤渣按照重量比为1:1:1:1的比例混合均匀，得第五混合物，将所述第五混合物置于温度为120℃，压力为0.4Mpa的反应釜中处理30min，得第六混合物，将所述第六混合物冷冻干燥，并粉碎至粒径为0.05mm的粉末，即得所述添加剂。

<实施例6>

步骤一、采集干净的畜禽血液，采用80目不锈钢网进行过滤，并向畜禽血液滤液中加入抗凝剂，搅拌均匀后得畜禽血样；

其中，所述抗凝剂与畜禽血液的体积比为1:14，所述抗凝剂包括重量比为1:11的抗凝混合物和纯净水，所述抗凝混合物的制备方法为：

a、按照重量比为4.5:4.5:1分别称取三聚磷酸钠、柠檬酸钠和氯化钠，分别粉碎过90目筛网并将三种粉碎物混合，得第一混合粉；

b、按重量份数，称取4份的生姜、3.5份的大葱、5份的洋葱和2份的辣椒籽，分别粉碎成粉末并混合，得第二混合粉，将所述第二混合粉浸泡于25份的50℃下的乙醇中，超声振荡10min，静置25min后过滤得第一滤液和第一滤渣；

c、称取7份的薄荷茎、5份的菊花和3份的金银花，分别洗净、切碎并混合均匀，得第一混合物，向所述第一混合物中加入25份的纯净水，加热至85℃熬煮，35min后趁热过滤，得第二滤液和第二滤渣；

d、将所述第一滤液和所述第二滤液混合得第一混合液，并浓缩至第一混合液原体积的五分之一，得浓缩液，将所述浓缩液与所述第一混合粉按照重量比为1:3的比例进行混合，得第二混合物，将所述第二混合物冷冻干燥，即得。

步骤二、将畜禽血样置于离心机中分离，分别得血球与血清，其中，离心机采用转速为15000rpm的管式离心机；

步骤三、用等渗液清洗血球3次，收集清洗沉淀物，得净化后的血球，其中，每次清洗中，加入的等渗液与血清的体积比为1:1，加入所述等渗液后在速度为30rpm下搅拌时间18min后过滤，收集沉淀物；等渗液为体积比为20:1的等渗盐水和所述浓缩液的混合物，等渗盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠水溶液；

步骤四、向净化后的血球中加入纯水搅拌均匀，得溶血液，血球与纯水的体积比为2:1，向溶血液中加入其重量的0.003倍的粒径为0.04mm的添加剂，并进行超声震荡处理8min，期间向所述溶血液中通入惰性气体除氧；将溶血液置于高压均质机中处理13s，压力控制在45MPa，收集高压均质处理后的上层清液即得液体畜禽血红蛋白；

其中，纯水中加入有保护剂，纯水与所述保护剂的体积比为1:0.02，所述保护剂的制备方法为：

i、按重量份数计，分别称取6份的黄玉米粒、7份的洋葱和6份的纯水混合后打浆，得第三混合物，将所述第三混合物置于温度为85℃下蒸煮35min，自然冷却后过500目筛得第三滤液和第三滤渣，期间每隔10min向所述第三混合物中加入1.5份的柠檬汁，并搅拌5min；

ii、称取4份的松树皮、2份的绿茶叶、2份的茄子皮、3份的苹果皮、0.8份的葡萄籽和0.6份的核桃衣，分别洗净后混合得第四混合物，向所述第四混合物中加入6份的正己烷，充分搅拌后置于反应釜中，加压至0.2MPa处理15min后降至常压，过500目筛得第四滤液和第四滤渣；

iii、称取0.02份的抗坏血酸钠加入纯净水搅拌使其完全溶解，得抗坏血酸钠水，将第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液和抗坏血酸钠水按照体积比为1:1:2:1.5:0.1的比例混合，即得所述保护剂；

所述添加剂的制备方法具体为，将所述第一滤渣、所述第二滤渣、所述第三滤渣和所述第四滤渣按照重量比为1:1:1:1的比例混合均匀，得第五混合物，将所述第五混合物置于温度为110℃，压力为0.3Mpa的反应釜中处理25min，得第六混合物，将所述第六混合物冷冻干燥，并粉碎至粒径为0.04mm的粉末，即得所述添加剂。

<实施例7>

一种液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其与实施例6的区别在于，步骤四中，直接将溶血液置于高压均质机中处理13s，压力控制在45MPa，收集高压均质处理后的上层清液即得液体畜禽血红蛋白。其他条件和参数同实施例6。本实施例与实施例6的不同在于不对溶血液做任何处理，也不向纯水和溶血液中加入任何物质(如添加剂和保护剂)。

<实施例8>

一种液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其与实施例6的区别在于，步骤四中，直接将溶血液置于高压均质机中处理13s，压力控制在45MPa，收集高压均质处理后的上层清液即得液体畜禽血红蛋白，其中纯水中加入有保护剂，加入量和保护剂的制备方法同实施例6。其他条件和参数同实施例6。本实施例与实施例6的不同在于不对溶血液做任何处理，不向溶血液中加入添加剂。

<对比例1>

对本发明实施例1～8制得血红蛋白的主要指标进行检测，并统计结果如表17所示：

表17血红蛋白的主要指标

	破膜率/％	血红蛋白的纯度/％	血红蛋白的色泽	血红蛋白的气味
					实施例1	98.8	97.2	暗红色	略有腥味
实施例2	98.6	97.4	暗红色	略有腥味
					实施例3	98.7	97.5	暗红色	略有腥味
实施例4	99.7	99.7	鲜红	无腥味，有清香味
					实施例5	99.8	99.6	鲜红	无腥味，有清香味
实施例6	100	99.8	鲜红	无腥味，有清香味
					实施例7	99.1	98.1	枣红	无腥味
实施例8	99.5	98.6	枣红	无腥味

采用本发明2.1(常压匀浆)和2.2(超声破膜)的工艺条件制备血红蛋白的破膜率分别为95.82％、91.09％，最终血红蛋白产品的纯度为95.7、92.6％；

由表17可知，本发明实施例1～3制得的血红蛋白的破膜率和纯度均高于常压匀浆和超声破膜两种制备工艺的破膜率和纯度，由此可见，高压均质的制备工艺大大提升了血红蛋白的制备效率和纯度；本发明的制备方法简单、生产效率高；工艺中采用等渗液洗脱避免了常规洗脱过程中采用水洗方法导致血球破碎损失，物料损耗减少明显；采用均质破膜工艺，大大提升生产效率和破膜效果，所得血球蛋白纯度高，为后期高附加值产品开发提供优质原料。本发明工艺操作简便，设备造价低，有利于形成规模化生产。

实施例4～6中血球的破膜率和血红蛋白远远优于实施例1～3、实施例7～8，尤其是实施例6的破膜率高达100％，血红蛋白的纯度高达99.8％，后期实验验证中表明，实施例6的血红蛋白相对于血球的提取率高达98％，实施例3为80％，实施例7为91％，实施例8为95％；实施例6优于实施例3、实施例7和实施例8，其主要是由于实施例6中，在抗凝剂、等渗液中加入了具有抗氧化、抑菌和去味的物质，改善血红蛋白的血腥味，大大提升了产品血红蛋白的品质，同时在破膜过程中加入了保护剂和颗粒状的添加剂，加快破膜速度和增大破膜率，保护剂再次减少血红蛋白的损失，增大提取率。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

步骤一、向畜禽血液中加入抗凝剂，搅拌均匀后得畜禽血样；

步骤二、将畜禽血样置于离心机中分离，分别得血球与血清；

步骤三、用等渗液清洗血球1～4次，收集清洗沉淀物，得净化后的血球；

步骤四、向净化后的血球中加入纯水搅拌均匀，得溶血液，血球与纯水的体积比为1～3:1，将溶血液置于高压均质机中处理，离心后收集上层清液即得液体畜禽血红蛋白；

各步骤均在4～8℃下进行。

2.如权利要求1所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其特征在于，所述步骤一中，畜禽血液在加入抗凝剂之前，还经过了预处理，具体为：采集干净的畜禽血液，采用60～100目不锈钢网进行过滤，即得。

3.如权利要求1所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤四中，高压均质机的压力为30～60MPa，高压均质处理的时间为10～15s。

4.如权利要求3所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其特征在于，所述步骤二中，离心机采用转速为14000～16000rpm的管式离心机。

5.如权利要求4所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其特征在于，所述步骤三中每次清洗中，加入的所述等渗液与所述血球的体积比为0.5～2:1，加入所述等渗液后在速度为24～36rpm下搅拌时间15～20min后过滤，收集沉淀物。

6.如权利要求5所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其特征在于，所述抗凝剂与畜禽血液的体积比为1:12～15，所述抗凝剂包括重量比为1:10～12的抗凝混合物和纯净水，所述抗凝混合物的制备方法为：

a、按照重量比为4～5:4～5:1分别称取三聚磷酸钠、柠檬酸钠和氯化钠，分别粉碎过80～100目筛网并将三种粉碎物混合，得第一混合粉；

b、按重量份数，称取2～5份的生姜、3～4份的大葱、4～6份的洋葱和1～3份的辣椒籽，分别粉碎成粉末并混合，得第二混合粉，将所述第二混合粉浸泡于20～30份的40～60℃下的乙醇中，超声振荡10min，静置20～30min后过滤得第一滤液和第一滤渣；

c、称取5～8份的薄荷茎、3～6份的菊花和2～4份的金银花，分别洗净、切碎并混合均匀，得第一混合物，向所述第一混合物中加入20～30份的纯净水，加热至80～90℃熬煮，30～40min后趁热过滤，得第二滤液和第二滤渣；

d、将所述第一滤液和所述第二滤液混合得第一混合液，并浓缩至第一混合液原体积的五分之一，得浓缩液，将所述浓缩液与所述第一混合粉按照重量比为1:3的比例进行混合，得第二混合物，将所述第二混合物冷冻干燥，即得。

7.如权利要求6所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤三中所述等渗液为体积比为20:1的等渗盐水和所述浓缩液的混合物，等渗盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠水溶液。

8.如权利要求7所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤四中的纯水中加入有保护剂，纯水与所述保护剂的体积比为1:0.02，所述保护剂的制备方法为：

i、按重量份数计，分别称取4～7份的黄玉米粒、6～9份的洋葱和3～8份的纯水混合后打浆，得第三混合物，将所述第三混合物置于温度为80～90℃下蒸煮30～40min，自然冷却后过500目筛得第三滤液和第三滤渣，期间每隔10min向所述第三混合物中加入1～2份的柠檬汁，并搅拌5min；

ii、称取2～5份的松树皮、1～3份的绿茶叶、1～3份的茄子皮、2～4份的苹果皮、0.5～1.0份的葡萄籽和0.3～0.8份的核桃衣，分别洗净后混合得第四混合物，向所述第四混合物中加入5～8份的正己烷，充分搅拌后置于反应釜中，加压至0.2MPa处理10～20min后降至常压，过500目筛得第四滤液和第四滤渣；

iii、称取0.01～0.03份的抗坏血酸钠加入纯净水搅拌使其完全溶解，得抗坏血酸钠水，将第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液和抗坏血酸钠水按照体积比为1:1:2:1.5:0.1的比例混合，即得所述保护剂。

9.如权利要求8所述的液体畜禽血红蛋白的高效制备方法，其特征在于，步骤四中，在置于高压均质机之前，向所述溶血液中加入其重量的0.003倍的粒径为0.02～0.05mm的添加剂，并进行超声震荡处理5～10min，期间向所述溶血液中通入惰性气体除氧；

所述添加剂的制备方法具体为，将所述第一滤渣、所述第二滤渣、所述第三滤渣和所述第四滤渣按照重量比为1:1:1:1的比例混合均匀，得第五混合物，将所述第五混合物置于温度为100～120℃，压力为0.2～0.4Mpa的反应釜中处理20～30min，得第六混合物，将所述第六混合物冷冻干燥，并粉碎至粒径为0.02～0.05mm的粉末，即得所述添加剂。