CN107177652A

CN107177652A - 带鱼抗氧化肽分离纯化方法

Info

Publication number: CN107177652A
Application number: CN201710330813.0A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 赵文浩; 赵玉勤; 丁冬各
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2017-09-19

Abstract

本发明提供了一种带鱼抗氧化肽分离纯化方法，操作步骤为：1）预处理；2）酶解；3）超滤；4）QFF阴离子交换层析；5）凝胶色谱层析；6）高效液相色谱层析。有益效果为：QFF阴离子交换层析，在QFF洗脱中增加了Tris‑HCl缓冲液和硼酸钠，有效地提高了蛋白的挂柱率，避免了部分蛋白在未加NaCl的时候就被洗脱下来，避免了活性蛋白的浪费，提高了活性蛋白的提取率；洗脱速度快，节约能源，降低人力和时间成本，有效保持活性肽的品质；与最初的酶解液相比，最后得到的活性肽的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力和超氧阴离子清除能力大大提高。

Description

带鱼抗氧化肽分离纯化方法

技术领域

本发明涉及多肽分离纯化技术领域，具体是一种带鱼抗氧化肽分离纯化方法。

背景技术

带鱼（Largehead Hairtail），别称刀鱼、牙带鱼，属于脊索动物门、鲈形目，体型呈带状。主要分布于西太平洋和印度洋，在中国的黄海、东海、渤海一直到南海都有分布，和大黄鱼、小黄鱼及乌贼并称为中国的四大海产。

2014年度，舟山市带鱼捕获量达到108104吨，占主要渔获品种的比例达到11.52%。舟山带鱼多以新鲜或加工成各种鱼制品出售，然而带鱼的开发利用依然处于粗加工阶段，高附加值的利用程度较低。

带鱼的平均蛋白含量达到18.4%以上，这使得它成为丰富的蛋白质原材料来源。蛋白质经过酶解等特殊处理，可以制备具备一些特殊生理、保健等功能的生物活性肽。目前，我国对带鱼蛋白的研究虽然取得了一些进展，但是还未能开发出高活性的蛋白，还未能更佳充分地开发利用带鱼资源。因此，对带鱼蛋白的深入研究，开发出具备高附加值的带鱼蛋白产品成为迫在眉睫的问题。

生物活性肽，是指蛋白质中的20种左右天然氨基酸以不同的排列和组合的方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的各种肽类的总称。活性肽和人体代谢和生理调节等具有密切的关系，展现出提高免疫力、抑菌、抗病毒、清除自由基、降血压以及血脂等功效，食用安全性极高。因此，活性肽成为目前食品、药品等领域研究的热点之一并取得了较好的发展态势。

酶解法制备活性肽，条件温和，无需添加剧烈的化学试剂，没有有毒有害物质的生成，多肽回收率较高。这些优点，使得酶解法在蛋白质深加工和活性成分提取领域被深入研究和广泛应用。在生物活性肽的研究中，多肽的纯度和分子量的大小都会对其活性产生很大的影响。蛋白质的氨基酸组成多样、分子量大小差异显著、蛋白分子空间结构复杂多样，且不同的蛋白酶作用于肽链的位点不同，使得水解后获得的酶解产物非常不均。所以需要将活性高的多肽分离纯化，来提高活性肽的性能。

现有技术如授权公告号为CN102495169B的中国发明专利，公开了一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法，属于生物制品分离纯化技术领域。该方法涉及枯草芽孢杆菌 Zj016 氨肽酶和中性蛋白酶复配酶解一种成本低廉的末水条斑紫菜，得到紫菜抗氧化多肽粗品。该粗品利用SephadexG-10、DEAE-52 和 SOURCE3RPC 等色谱手段分离纯化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通过测定 DPPH 消除能力，清除超氧自由基能力，清除羟自由基能力和还原力来综合反映紫菜抗氧化活性肽的抗氧化性。经 RP-HPLC 分析型色谱测定其纯度，Q-TOF-MS 分析鉴定其氨基酸组成，并对其抗氧化活性的稳定性进行研究。该紫菜抗氧化活性肽的纯度不够，使得其抗氧化性能不是很理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能制得纯度高，活性强，分子量小，稳定度高，DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力和超氧阴离子清除能力强的带鱼抗氧化肽分离纯化方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

带鱼抗氧化肽分离纯化方法，具体步骤：

预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块，在去腥液中浸泡去腥，脱脂；

酶解：采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶双步酶解，过滤得到带鱼抗氧化活性肽酶解液；

超滤：将步骤2得到的酶解液超滤，超滤膜规格为900~1200Da，压力为0.6~1.2pa，得到滤过液，冷冻干燥。抗氧化活性强的活性肽的分子量小，通过超滤，可将不具有抗氧化活性或抗氧化活性弱的大分子蛋白质除去，提高活性肽纯度；

QFF阴离子交换层析：在QFF中加入超纯水，缓慢倒入抽滤瓶中，连接抽滤机，抽干其中的气泡，在抽气的过程中，置换蒸馏水，去掉残存的乙醇。抽气完毕后，将QFF溶液沿着玻璃漏斗缓慢装柱，待装柱完毕静置20~40min后，用5~6倍装柱体积，pH为8.2~8.5，浓度为1.2~1.4mol/L的Tris-HCl缓冲液进行平衡。在步骤3干燥得到的粉末中加入缓冲液Tris-HCl，过0.45um微滤膜，去除固体残渣等不溶解的成分。随后，用吸入法上样。上样完毕，分别用Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、0.1mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、0.5mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、1mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠，梯度洗脱1.8~2.2个体积，流速为2.5~3.5 ml/min ，每18~23s收集一管洗脱液，于220nm和280nm处检测吸光值。。Tris-HCl缓冲液pH为8.2~8.5，浓度为1.2~1.4mol/L。按峰合并试管内溶液，得到6个峰的溶液，分别为QFF-1、QFF-2、QFF-3、QFF-4、QFF-5和QFF-6，冷冻干燥备用。在QFF洗脱中增加了Tris-HCl缓冲液和硼酸钠，有效地提高了蛋白的挂柱率，避免了部分蛋白在未加NaCl的时候就被洗脱下来，造成活性蛋白的浪费，提高了活性蛋白的提取率；洗脱速度快，节约能源，降低人力和时间成本，有效保持活性肽的品质；

凝胶色谱层析：用蒸馏水常温浸泡凝胶20~26h，待凝胶充分溶胀，吸去上层悬浮的胶粒，倒入抽滤瓶中，抽真空，排除凝胶颗粒中的气泡，增强对样品的分离效果。先往层析柱中注入1/5~1/3柱体积的超纯水，沿壁连续缓慢注入凝胶，吸耳球轻击层析柱，使凝胶表面平滑且柱内无气泡。以1.6~2.3倍量柱体积的超纯水平衡柱子。在QFF-3冷冻干燥得到的粉末中加入蒸馏水，吸管贴壁缓慢进样，待样品刚好完全流入柱内，吸取蒸馏水，将烧杯及层析柱壁上的样品冲洗干净。流动相为超纯水，流速为1.6~2.4 ml/min，每1.6~2.3min收集一管。使用紫外分光光度计测定每管样品在280nm处的紫外吸收值。按峰合并，得到2个峰的溶液，分别为QFF-3-1和QFF-3-2，冷冻干燥备用。凝胶色谱根据分子量大小不同，将多肽分子分离开来，从而达到纯化分离的目的；

高效液相色谱层析：将QFF-3-1冷冻干燥得到的粉末用乙腈和纯水进行梯度洗脱，梯度洗脱，洗脱时间、洗脱液成份及其百分比和流速依次为：0~5min，乙腈5%，纯水95%，流速0.5~0.7 ml/min；5~10min，乙腈10%，纯水90%，流速0.5~0.7 ml/min；10~20min，乙腈60%，纯水40%，流速0.7~0.9 ml/min；20~30min，乙腈100%，流速0.7~0.9 ml/min；30~40min，乙腈60%，纯水40%，流速0.5~0.7 ml/min；40~50min，乙腈20%，纯水80%，流速0.7~0.9 ml/min。收集洗脱液，旋蒸得到高纯度带鱼抗氧化肽。带鱼抗氧化肽的氨基酸序列为：HSHACASYYCSKFCGTASCTHYLCRVLHPGKLCVCVNCSR。上述方法制得的抗氧化肽纯度很高，DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力和超氧阴离子清除能力很强，与最初的酶解液相比，抗氧化能力提高了很多。

与现有技术相比，本发明的优点在于：采用900~1200Da的超滤膜进行超滤，氧化活性强的活性肽的分子量小，通过超滤，可将不具有抗氧化活性或抗氧化活性弱的大分子蛋白质除去，提高活性肽纯度；QFF阴离子交换层析，在QFF洗脱中增加了Tris-HCl缓冲液和硼酸钠，有效地提高了蛋白的挂柱率，避免了部分蛋白在未加NaCl的时候就被洗脱下来，避免了活性蛋白的浪费，提高了活性蛋白的提取率；洗脱速度快，节约能源，降低人力和时间成本，有效保持活性肽的品质；凝胶色谱层析，采用超纯水为流动相，根据分子量大小不同，将多肽分子分离开来，从而达到纯化分离的目的；高效液相色谱层析，用乙腈和纯水进行梯度洗脱，高度纯化抗氧化肽，与最初的酶解液相比，最后得到的活性肽的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力和超氧阴离子清除能力大大提高。

具体实施例

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

带鱼抗氧化肽分离纯化方法，具体步骤：

1）预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成小块，在去腥液中浸泡去腥，脱脂；

2）酶解：采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶双步酶解，过滤得到带鱼抗氧化活性肽酶解液；

3）超滤：将步骤2得到的酶解液超滤，超滤膜规格为900~1200Da，压力为0.6~1.2pa，得到滤过液，冷冻干燥。抗氧化活性强的活性肽的分子量小，通过超滤，可将不具有抗氧化活性或抗氧化活性弱的大分子蛋白质除去，提高活性肽纯度；

4）QFF阴离子交换层析：在QFF中加入超纯水，缓慢倒入抽滤瓶中，连接抽滤机，抽干其中的气泡，在抽气的过程中，置换蒸馏水，去掉残存的乙醇。抽气完毕后，将QFF溶液沿着玻璃漏斗缓慢装柱，待装柱完毕静置20~40min后，用5~6倍装柱体积，pH为8.2~8.5，浓度为1.2~1.4mol/L的Tris-HCl缓冲液进行平衡。在步骤3干燥得到的粉末中加入缓冲液Tris-HCl，过0.45um微滤膜，去除固体残渣等不溶解的成分。随后，用吸入法上样。上样完毕，分别用Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、0.1mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、0.5mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、1mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠，梯度洗脱1.8~2.2个体积，流速为2.5~3.5 ml/min ，每18~23s收集一管洗脱液，于220nm和280nm处检测吸光值。。Tris-HCl缓冲液pH为8.2~8.5，浓度为1.2~1.4mol/L。按峰合并试管内溶液，得到6个峰的溶液，分别为QFF-1、QFF-2、QFF-3、QFF-4、QFF-5和QFF-6，冷冻干燥备用。在QFF洗脱中增加了Tris-HCl缓冲液和硼酸钠，有效地提高了蛋白的挂柱率，避免了部分蛋白在未加NaCl的时候就被洗脱下来，避免了活性蛋白的浪费，提高了活性蛋白的提取率；洗脱速度快，节约能源，降低人力和时间成本，有效保持活性肽的品质；

5）凝胶色谱层析：用蒸馏水常温浸泡凝胶20~26h，待凝胶充分溶胀，吸去上层悬浮的胶粒，倒入抽滤瓶中，抽真空，排除凝胶颗粒中的气泡，增强对样品的分离效果。先往层析柱中注入1/5~1/3柱体积的超纯水，沿壁连续缓慢注入凝胶，吸耳球轻击层析柱，使凝胶表面平滑且柱内无气泡。以1.6~2.3倍量柱体积的超纯水平衡柱子。在QFF-3冷冻干燥得到的粉末中加入蒸馏水，吸管贴壁缓慢进样，待样品刚好完全流入柱内，吸取蒸馏水，将烧杯及层析柱壁上的样品冲洗干净。流动相为超纯水，流速为1.6~2.4 ml/min，每1.6~2.3min收集一管。使用紫外分光光度计测定每管样品在280nm处的紫外吸收值。按峰合并，得到2个峰的溶液，分别为QFF-3-1和QFF-3-2，冷冻干燥备用。凝胶色谱根据分子量大小不同，将多肽分子分离开来，从而达到纯化分离的目的；

6）高效液相色谱层析：将QFF-3-1冷冻干燥得到的粉末用乙腈和纯水进行梯度洗脱，梯度洗脱，洗脱时间、洗脱液成份及其百分比和流速依次为：0~5min，乙腈5%，纯水95%，流速0.5~0.7 ml/min；5~10min，乙腈10%，纯水90%，流速0.5~0.7 ml/min；10~20min，乙腈60%，纯水40%，流速0.7~0.9 ml/min；20~30min，乙腈100%，流速0.7~0.9 ml/min；30~40min，乙腈60%，纯水40%，流速0.5~0.7 ml/min；40~50min，乙腈20%，纯水80%，流速0.7~0.9 ml/min。收集洗脱液，旋蒸得到高纯度带鱼抗氧化肽。上述方法制得的抗氧化肽纯度很高，DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力和超氧阴离子清除能力很强，与最初的酶解液相比，抗氧化能力提高了很多。

实施例2：

1）预处理：将带鱼去头、去皮、去内脏，用清水冲洗干净，剪成4cm长小块，按料液比1:6加入去腥液，浸泡，浸泡时间为7h。去腥液成份及其最优选重量份为：8份柠檬酸、17份紫苏提取物、0.1份氯化钠、0.5份碳酸氢钠、0.001份乌索酸、30份乙醇、0.04份山柰甙和0.3份维生素E。捣碎，过40目筛，按体积比1:5加入乙酸乙酯，搅拌，脱脂时间为22h。过滤，滤渣中按体积比1:3加入去离子水，用吸管吸掉液面漂浮的油脂，过滤，将滤渣放入电热鼓风干燥箱45℃烘干，得到去脂带鱼粉末。

2）酶解：在带鱼粉末中加入蒸馏水，调节pH为7.0，加入1.5%木瓜蛋白酶，加热，酶解温度为50℃，酶解时间为5.0h。调节pH为8.5，加入3%碱性蛋白酶，加热，酶解温度为45℃，酶解时间为4.5h。酶解结束后沸水浴灭酶，过滤，得到带鱼抗氧化活性肽酶解液。

3）超滤：将步骤2得到的酶解液超滤，超滤膜规格为1000Da，压力为0.8pa，得到滤过液，冷冻干燥。抗氧化活性强的活性肽的分子量小，通过超滤，可将不具有抗氧化活性或抗氧化活性弱的大分子蛋白质除去，提高活性肽纯度；

4）QFF阴离子交换层析：在QFF中加入超纯水，缓慢倒入抽滤瓶中，连接抽滤机，抽干其中的气泡，在抽气的过程中，置换蒸馏水，去掉残存的乙醇。抽气完毕后，将QFF溶液沿着玻璃漏斗缓慢装柱，待装柱完毕静置40min后，用6倍装柱体积，pH为8.4，浓度为1.3mol/L的Tris-HCl缓冲液进行平衡。在步骤3干燥得到的粉末中加入缓冲液Tris-HCl，过0.45um微滤膜，去除固体残渣等不溶解的成分。随后，用吸入法上样。上样完毕，分别用Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、0.1mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、0.5mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、1mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠，梯度洗脱2个体积，流速为3 ml/min ，每20s收集一管洗脱液，于220nm和280nm处检测吸光值。。Tris-HCl缓冲液pH为8.4，浓度为1.3mol/L。按峰合并试管内溶液，得到6个峰的溶液，分别为QFF-1、QFF-2、QFF-3、QFF-4、QFF-5和QFF-6，冷冻干燥备用。在QFF洗脱中增加了Tris-HCl缓冲液和硼酸钠，有效地提高了蛋白的挂柱率，避免了部分蛋白在未加NaCl的时候就被洗脱下来，避免了活性蛋白的浪费，提高了活性蛋白的提取率；洗脱速度快，节约能源，降低人力和时间成本，有效保持活性肽的品质；

5）凝胶色谱层析：称量SepHadex G-15 50g，用蒸馏水常温浸泡24h，待凝胶充分溶胀，吸去上层悬浮的胶粒，倒入抽滤瓶中，抽真空，排除凝胶颗粒中的气泡，增强对样品的分离效果。选择直径2.6cm，柱长为90cm的层析柱，洗净组件，垂直安装于铁架台上。灌胶前，先注入1/4柱体积的超纯水，沿壁连续缓慢注入凝胶，吸耳球轻击层析柱，使凝胶表面平滑且柱内无气泡。以2倍量柱体积的超纯水平衡柱子。称取QFF-3冷冻干燥得到的粉末50mg，充分溶于2mL蒸馏水中，吸管贴壁缓慢进样，待样品刚好完全流入柱内，吸取蒸馏水，将烧杯及层析柱壁上的样品冲洗干净。流动相为超纯水，流速为2ml/min，每2min收集一管。使用紫外分光光度计测定每管样品在280nm处的紫外吸收值。按峰合并，得到2个峰的溶液，分别为QFF-3-1和QFF-3-2，冷冻干燥备用。凝胶色谱根据分子量大小不同，将多肽分子分离开来，从而达到纯化分离的目的；

6）高效液相色谱层析：将QFF-3-1冷冻干燥得到的粉末溶于蒸馏水，过0.45μm 针筒式滤膜。使用高效液相色谱仪（Agilent1260）；色谱柱（Thermo-C18（4.6 × 250，5μm）；进样量20μl，用乙腈和纯水进行梯度洗脱，梯度洗脱，洗脱时间、洗脱液成份及其百分比和流速依次为：0~5min，乙腈5%，纯水95%，流速0.6 ml/min；5~10min，乙腈10%，纯水90%，流速0.6 ml/min；10~20min，乙腈60%，纯水40%，流速0.8ml/min；20~30min，乙腈100%，流速0.8 ml/min；30~40min，乙腈60%，纯水40%，流速0.6 ml/min；40~50min，乙腈20%，纯水80%，流速0.8 ml/min。收集洗脱液，旋蒸得到高纯度带鱼抗氧化肽。上述方法制得的抗氧化肽纯度很高，DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力和超氧阴离子清除能力很强，与最初的酶解液相比，抗氧化能力提高了很多。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大学

<120> 带鱼抗氧化肽分离纯化方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

His Ser His Ala Cys Ala Ser Tyr Tyr Cys Ser Lys Phe Cys Gly Thr

1 5 10 15

Ala Ser Cys Thr His Tyr Leu Cys Arg Val Leu His Pro Gly Lys Leu

20 25 30

Cys Val Cys Val Asn Cys Ser Arg

35 40

Claims

1.带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于以下步骤：

3）超滤：将步骤2得到的酶解液超滤，得到滤过液，干燥；

4）QFF阴离子交换层析：在QFF中加入超纯水，抽气，装柱，平衡，用Tris缓冲液和NaCl溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，检测吸光度，干燥；

5）凝胶色谱层析：用蒸馏水浸泡凝胶，抽真空，装柱，平衡，用超纯水作为流动相，继续纯化分离QFF纯化后的活性肽粉末，收集洗脱液，检测吸光度，干燥；

6）高效液相色谱层析：将凝胶色谱层析纯化分离后的活性肽粉末采用高效液相色谱仪继续分离纯化，用乙腈和纯水进行梯度洗脱，收集洗脱液，旋蒸得到高纯度带鱼抗氧化肽。

2.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤3中超滤膜规格为900~1200Da，压力为0.6~1.2pa。

3.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤4中在QFF中加入超纯水，缓慢倒入抽滤瓶中，连接抽滤机，抽干其中的气泡，在抽气的过程中，置换蒸馏水，抽气完毕后，将QFF溶液沿着玻璃漏斗缓慢装柱，待装柱完毕静置20~40min后，用5~6倍装柱体积，pH为8.2~8.5，浓度为1.2~1.4mol/L的Tris-HCl缓冲液进行平衡。

4.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤4中梯度洗脱液依次为Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、0.1mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、0.5mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠、1mol NaCl+Tris-HCl+0.001mol硼酸钠，Tris-HCl缓冲液pH为8.2~8.5，浓度为1.2~1.4mol/L。

5.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤4中流速为2.5~3.5 ml/min，每18~23s收集一管洗脱液，于220nm和280nm处检测吸光值。

6.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤5中凝胶常温浸泡20~26h，充分溶胀后吸去上层悬浮的胶粒，倒入抽滤瓶中，抽真空。

7.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤5中灌胶前，先注入1/5~1/3柱体积的超纯水，沿壁连续缓慢注入凝胶，吸耳球轻击层析柱，以1.6~2.3倍量柱体积的超纯水平衡柱子。

8.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤5中流速为1.6~2.4 ml/min，每1.6~2.3min收集一管，于280nm处检测紫外吸收值。

9.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的步骤6中采用梯度洗脱，洗脱时间、洗脱液成份及其百分比和流速依次为：0~5min，乙腈5%，纯水95%，流速0.5~0.7 ml/min；5~10min，乙腈10%，纯水90%，流速0.5~0.7 ml/min；10~20min，乙腈60%，纯水40%，流速0.7~0.9 ml/min；20~30min，乙腈100%，流速0.7~0.9 ml/min；30~40min，乙腈60%，纯水40%，流速0.5~0.7 ml/min；40~50min，乙腈20%，纯水80%，流速0.7~0.9 ml/min。

10.根据权利要求1所述的带鱼抗氧化肽分离纯化方法，其特征在于：所述的带鱼抗氧化肽的氨基酸序列为：HSHACASYYCSKFCGTASCTHYLCRVLHPGKLCVCVNCSR。