CN113943768B - 一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，包括备料、制备初步纯化、二次纯化以及三次纯化等步骤，其中在备料时将准备的玉米蛋白粉干燥并进行再加工，然后将再加工后的玉米蛋白粉粉碎后配置成玉米蛋白粉含量为9％～15％的玉米蛋白粉溶液，制备时用淀粉酶水解玉米蛋白粉中的淀粉并过滤洗涤，收集滤渣进行皂化除去脂肪，再次过滤洗涤，然后在高压脉冲电场中处理。优点在于：本发明所值得玉米抗氧化肽可制备成相应的解救剂，在饮酒后或饮酒前服用，小肽分子能迅速进入血液，醒酒快速见效；除醒酒作用外，本醒酒剂还具有护肝健身，恢复疲劳功能，可作为保健品长期饮(服)用，饮料剂口感好，颗粒剂和胶囊剂则便于外出时携带。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法。
背景技术
米蛋白粉是玉米淀粉生产中的主要副产品，含有大约60％的蛋白质，主要为玉米醇溶蛋白(68％)、谷蛋白(22％)和球蛋白(1.2％)。由于玉米蛋白粉组成复杂，水溶性差，赖氨酸和色氨酸含量很低，限制了它在食品工业中的应用，并且由于其价格低廉，当今在国内主要将玉米蛋白粉用于饲料工业，这样浪费了宝贵的蛋白资源。通过酶法水解不仅可以提高玉米蛋白的水溶性，便于利用我国有限的蛋白质资源，而且通过进一步分离纯化水解产物得到具有抗氧化、降血压、抗疲劳、醒酒等功能特性。
玉米活性肽来自于玉米蛋白的水解产物，是由分子量很小(一般集中在1000以下)，但活性很高的短肽组成的混合低聚肽。小分子肽比等量氨基酸具有更高的生物活性和营养价值，肽类和氨基酸几乎均可以通过小肠绒毛上皮细胞完全被吸收利用，进入到血液中，然后输送到生物体的各个部位，为此，玉米活性肽的开发具有广泛的应用前景，而且随着科技的发展，人们意识的提高及保健意识的增强，玉米活性肽的药食同源性将更加显示出其广阔的应用前景。但是由于从各种蛋白质酶解产物中提取的抗氧化肽的氨基酸组成和结构差别很大，没有一个固定的氨基酸组成，而且酶解产物成分也非常复杂，因此分离纯化高活性的玉米肽相当困难。目前对于肽类物质分离提纯常用的方法包括：离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳等。而在工业化中则应用具有分子筛功能的膜分离技术，但分离膜抗污染能力差，膜通量衰减严重，而且分离过程中对操作参数的控制随意性太大，利用膜分离手段分离后的肽多是一种分子量范围较广的产物，活性和纯度相对比较低，影响产品的质量等。
为此，本发明在前人研究的基础上，进一步探寻高效、先进的提取分离纯化技术，使玉米蛋白水解物更精确在一定的范围内得到分离，提高玉米蛋白肽的抗氧化活性。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，而提出的一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、备料
将准备的玉米蛋白粉干燥并进行再加工，然后将再加工后的玉米蛋白粉粉碎后配置成玉米蛋白粉含量为9％～15％的玉米蛋白粉溶液；
S2、制备
用淀粉酶水解玉米蛋白粉中的淀粉并过滤洗涤，收集滤渣进行皂化除去脂肪，再次过滤洗涤，然后在高压脉冲电场中处理，并在 50-55℃环境下使用复合酶进行酶解4-6h，最后经过离心干燥得到食品级抗氧化肽的粗肽溶液；
S3、初步纯化
将粗肽溶液经过截留分子量为3μm～0.1μm的微滤膜系统进行过滤，除去大分子杂质，得到微滤膜透过液；
将所述微滤膜透过液经过截留分子量为50～200kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜透过液；
将所述超滤膜透过液经过截留分子量为500～1000Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜截留液为第一次纯化物；
S4、二次纯化
取上述超滤膜截留液以8％～4％醋酸水溶液、0.1％的TFA水溶液与100％乙腈溶液的混合溶液进行等度、梯度洗脱，收集洗脱组分，得第二次纯化物；
S5、三次纯化
取上述第二次纯化物进行凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱进行分离纯化得到最终纯化物；
S6、成品
取最终纯化物干燥，即得纯化后的玉米抗氧化肽成品。
步骤二中酶解选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶。
在上述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法中，步骤二中皂化时将过滤、洗涤的提取物和和碱性液体分别加热至45～55℃，加热后的提取物和加热后的碱性液体混合后进行皂化反应2～4h，并加入溶有添加剂的盐水溶液，皂化反应完全后得到皂基，充分过滤洗涤所得滤渣即完成皂化。
在上述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法中，皂化选用的碱性液体为pH8～10的Na2CO3水溶液，皂化后过滤洗涤的温度为75℃。
在上述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法中，步骤二中的高压脉冲电场处理方式为：以5～10mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度15～30KV/cm、脉冲频率20～40Hz、脉冲时间1s～ 3s，得到高压脉冲电场处理液。
在上述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法中，步骤四的二次纯化过程中8％～4％醋酸水溶液与100％乙腈溶液的体积分数比为85％:15％，等度洗脱时间为20min；0.1％的TFA水溶液与所述100％乙腈溶液的体积分数比为69％:31％～45％:55％，梯度洗脱时间为50min～60min。
在上述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法中，在二次步纯化过程中，以八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，进行等度洗脱；然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，收集含有抗氧化肽的纯化物。
在上述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法中，步骤五三次纯化过程中的凝胶过滤柱层析是指：将得到的样品溶液通过交联葡聚糖凝胶 G-50过滤柱后，再用洗脱液来洗脱该过滤柱，收集第3个洗脱峰部分的溶液，所述的交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱的柱长为1000mm，直径为26mm，所述的洗脱液是PH值为6的0.1mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
在上述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法中，离子交换柱层析是指：将凝胶过滤柱层析收集到的第3个洗脱峰部分的溶液通过羧甲基 -交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该阳离子交换柱，收集第5个洗脱峰部分的溶液，所述的羧甲基 -交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱的柱长为300mm，直径为26mm，该操作中使用的洗脱液是含1mol/L氯化钠的PH值为6的0.1mol/L 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
在上述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法中，反相高压液相色谱是指：将离子交换柱层析收集到的第5个洗脱峰部分的溶液通过C18反相柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该C18反相柱，洗脱液梯度范围在15％-65％，洗脱速度为0.7ml/min，总洗脱时间为70min，收集洗脱时间在20.5min-21.3min之间流出的溶液，所述的C18反相柱的柱长为300mm，直径为5mm，该操作中使用的缓冲液是含三氟乙酸的乙腈缓冲液，其中三氟乙酸与乙腈的体积比为1∶999。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：
1、将高活性的玉米抗氧化肽从酶解混合物中分离出来，并进行纯化。此方法最大的优势是在达到工业化水平的基础上，筛选得到具有抗氧化活性的水解产物，可以分离出纯度相对较高的玉米抗氧化肽，其纯度达到较高；
2、本发明所值得玉米抗氧化肽可制备成相应的解救剂，在饮酒后或饮酒前服用，小肽分子能迅速进入血液，醒酒快速见效；除醒酒作用外，本醒酒剂还具有护肝健身，恢复疲劳功能，可作为保健品长期饮(服)用，饮料剂口感好，颗粒剂和胶囊剂则便于外出时携带。
附图说明
图1为本发明制备的玉米抗氧化肽应用于醒酒剂时的试验组酒后酒精测试值随时间变化图。
具体实施方式
以下实施例仅处于说明性目的，而不是想要限制本发明的范围。
实施例1
一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、备料
将准备的玉米蛋白粉干燥并进行再加工，然后将再加工后的玉米蛋白粉粉碎后配置成玉米蛋白粉含量为9％的玉米蛋白粉溶液；
S2、制备
用淀粉酶水解玉米蛋白粉中的淀粉并过滤洗涤，收集滤渣进行皂化除去脂肪，再次过滤洗涤，然后在高压脉冲电场中处理，并在 50-55℃环境下使用复合酶进行酶解4-6h，最后经过离心干燥得到食品级抗氧化肽的粗肽溶液；
S3、初步纯化
将粗肽溶液经过截留分子量为3μm～0.1μm的微滤膜系统进行过滤，除去大分子杂质，得到微滤膜透过液；
将所述微滤膜透过液经过截留分子量为50kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜透过液；
将所述超滤膜透过液经过截留分子量为500Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜截留液为第一次纯化物；
S4、二次纯化
取上述超滤膜截留液以8％醋酸水溶液、0.1％的TFA水溶液与100％乙腈溶液的混合溶液进行等度、梯度洗脱，收集洗脱组分，得第二次纯化物；
S5、三次纯化
取上述第二次纯化物进行凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱进行分离纯化得到最终纯化物；
S6、成品
取最终纯化物干燥，即得纯化后的玉米抗氧化肽成品。
步骤二中酶解选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶。
步骤二中皂化时将过滤、洗涤的提取物和和碱性液体分别加热至 45℃，加热后的提取物和加热后的碱性液体混合后进行皂化反应2h，并加入溶有添加剂的盐水溶液，皂化反应完全后得到皂基，充分过滤洗涤所得滤渣即完成皂化。
皂化选用的碱性液体为pH8的Na2CO3水溶液，皂化后过滤洗涤的温度为75℃。
步骤二中的高压脉冲电场处理方式为：以5mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度15KV/cm、脉冲频率20Hz、脉冲时间1s，得到高压脉冲电场处理液。
步骤四的二次纯化过程中醋酸水溶液与乙腈溶液的体积分数比为85％:15％，等度洗脱时间为20min；0.1％的TFA水溶液与所述100％乙腈溶液的体积分数比为69％:31％，梯度洗脱时间为50min。
在二次步纯化过程中，以八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，进行等度洗脱；然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，收集含有抗氧化肽的纯化物。
步骤五三次纯化过程中的凝胶过滤柱层析是指：将得到的样品溶液通过交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱后，再用洗脱液来洗脱该过滤柱，收集第3个洗脱峰部分的溶液，所述的交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱的柱长为1000mm，直径为26mm，所述的洗脱液是PH值为6的0.1mol/L 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
离子交换柱层析是指：将凝胶过滤柱层析收集到的第3个洗脱峰部分的溶液通过羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该阳离子交换柱，收集第5个洗脱峰部分的溶液，所述的羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱的柱长为 300mm，直径为26mm，该操作中使用的洗脱液是含1mol/L氯化钠的 PH值为6的0.1mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
反相高压液相色谱是指：将离子交换柱层析收集到的第5个洗脱峰部分的溶液通过C18反相柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该 C18反相柱，洗脱液梯度范围在15％-65％，洗脱速度为0.7ml/min，总洗脱时间为70min，收集洗脱时间在20.5min-21.3min之间流出的溶液，所述的C18反相柱的柱长为300mm，直径为5mm，该操作中使用的缓冲液是含三氟乙酸的乙腈缓冲液，其中三氟乙酸与乙腈的体积比为1∶999。
实施例2
一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、备料
将准备的玉米蛋白粉干燥并进行再加工，然后将再加工后的玉米蛋白粉粉碎后配置成玉米蛋白粉含量为15％的玉米蛋白粉溶液；
S2、制备
用淀粉酶水解玉米蛋白粉中的淀粉并过滤洗涤，收集滤渣进行皂化除去脂肪，再次过滤洗涤，然后在高压脉冲电场中处理，并在 50-55℃环境下使用复合酶进行酶解6h，最后经过离心干燥得到食品级抗氧化肽的粗肽溶液；
S3、初步纯化
将粗肽溶液经过截留分子量为3μm～0.1μm的微滤膜系统进行过滤，除去大分子杂质，得到微滤膜透过液；
将所述微滤膜透过液经过截留分子量为200kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜透过液；
将所述超滤膜透过液经过截留分子量为1000Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜截留液为第一次纯化物；
S4、二次纯化
取上述超滤膜截留液以4％醋酸水溶液、0.1％的TFA水溶液与100％乙腈溶液的混合溶液进行等度、梯度洗脱，收集洗脱组分，得第二次纯化物；
S5、三次纯化
取上述第二次纯化物进行凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱进行分离纯化得到最终纯化物；
S6、成品
取最终纯化物干燥，即得纯化后的玉米抗氧化肽成品。
步骤二中酶解选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶。
步骤二中皂化时将过滤、洗涤的提取物和和碱性液体分别加热至 55℃，加热后的提取物和加热后的碱性液体混合后进行皂化反应4h，并加入溶有添加剂的盐水溶液，皂化反应完全后得到皂基，充分过滤洗涤所得滤渣即完成皂化。
皂化选用的碱性液体为pH10的Na2CO3水溶液，皂化后过滤洗涤的温度为75℃。
步骤二中的高压脉冲电场处理方式为：以10mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度30KV/cm、脉冲频率40Hz、脉冲时间3s，得到高压脉冲电场处理液。
步骤四的二次纯化过程中醋酸水溶液与100％乙腈溶液的体积分数比为85％:15％，等度洗脱时间为20min；0.1％的TFA水溶液与所述100％乙腈溶液的体积分数比为45％:55％，梯度洗脱时间为60min。
在二次步纯化过程中，以八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，进行等度洗脱；然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，收集含有抗氧化肽的纯化物。
步骤五三次纯化过程中的凝胶过滤柱层析是指：将得到的样品溶液通过交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱后，再用洗脱液来洗脱该过滤柱，收集第3个洗脱峰部分的溶液，所述的交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱的柱长为1000mm，直径为26mm，所述的洗脱液是PH值为6的0.1mol/L 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
离子交换柱层析是指：将凝胶过滤柱层析收集到的第3个洗脱峰部分的溶液通过羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该阳离子交换柱，收集第5个洗脱峰部分的溶液，所述的羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱的柱长为 300mm，直径为26mm，该操作中使用的洗脱液是含1mol/L氯化钠的 PH值为6的0.1mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
反相高压液相色谱是指：将离子交换柱层析收集到的第5个洗脱峰部分的溶液通过C18反相柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该 C18反相柱，洗脱液梯度范围在15％-65％，洗脱速度为0.7ml/min，总洗脱时间为70min，收集洗脱时间在20.5min-21.3min之间流出的溶液，所述的C18反相柱的柱长为300mm，直径为5mm，该操作中使用的缓冲液是含三氟乙酸的乙腈缓冲液，其中三氟乙酸与乙腈的体积比为1∶999。
实施例3
一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，包括以下步骤：
S1、备料
将准备的玉米蛋白粉干燥并进行再加工，然后将再加工后的玉米蛋白粉粉碎后配置成玉米蛋白粉含量为12％的玉米蛋白粉溶液；
S2、制备
用淀粉酶水解玉米蛋白粉中的淀粉并过滤洗涤，收集滤渣进行皂化除去脂肪，再次过滤洗涤，然后在高压脉冲电场中处理，并在 50-55℃环境下使用复合酶进行酶解5h，最后经过离心干燥得到食品级抗氧化肽的粗肽溶液；
S3、初步纯化
将粗肽溶液经过截留分子量为3μm～0.1μm的微滤膜系统进行过滤，除去大分子杂质，得到微滤膜透过液；
将所述微滤膜透过液经过截留分子量为100kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜透过液；
将所述超滤膜透过液经过截留分子量为800Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜截留液为第一次纯化物；
S4、二次纯化
取上述超滤膜截留液以6％醋酸水溶液、0.1％的TFA水溶液与100％乙腈溶液的混合溶液进行等度、梯度洗脱，收集洗脱组分，得第二次纯化物；
S5、三次纯化
取上述第二次纯化物进行凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱进行分离纯化得到最终纯化物；
S6、成品
取最终纯化物干燥，即得纯化后的玉米抗氧化肽成品。
步骤二中酶解选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶。
步骤二中皂化时将过滤、洗涤的提取物和和碱性液体分别加热至 50℃，加热后的提取物和加热后的碱性液体混合后进行皂化反应3h，并加入溶有添加剂的盐水溶液，皂化反应完全后得到皂基，充分过滤洗涤所得滤渣即完成皂化。
皂化选用的碱性液体为pH9的Na2CO3水溶液，皂化后过滤洗涤的温度为75℃。
步骤二中的高压脉冲电场处理方式为：以5～10mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度25KV/cm、脉冲频率30Hz、脉冲时间2s，得到高压脉冲电场处理液。
步骤四的二次纯化过程中醋酸水溶液与100％乙腈溶液的体积分数比为85％:15％，等度洗脱时间为20min；0.1％的TFA水溶液与所述100％乙腈溶液的体积分数比为50％:50％，梯度洗脱时间为55min。
在二次步纯化过程中，以八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，进行等度洗脱；然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，收集含有抗氧化肽的纯化物。
步骤五三次纯化过程中的凝胶过滤柱层析是指：将得到的样品溶液通过交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱后，再用洗脱液来洗脱该过滤柱，收集第3个洗脱峰部分的溶液，所述的交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱的柱长为1000mm，直径为26mm，所述的洗脱液是PH值为6的0.1mol/L 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
离子交换柱层析是指：将凝胶过滤柱层析收集到的第3个洗脱峰部分的溶液通过羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该阳离子交换柱，收集第5个洗脱峰部分的溶液，所述的羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱的柱长为 300mm，直径为26mm，该操作中使用的洗脱液是含1mol/L氯化钠的 PH值为6的0.1mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
反相高压液相色谱是指：将离子交换柱层析收集到的第5个洗脱峰部分的溶液通过C18反相柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该 C18反相柱，洗脱液梯度范围在15％-65％，洗脱速度为0.7ml/min，总洗脱时间为70min，收集洗脱时间在20.5min-21.3min之间流出的溶液，所述的C18反相柱的柱长为300mm，直径为5mm，该操作中使用的缓冲液是含三氟乙酸的乙腈缓冲液，其中三氟乙酸与乙腈的体积比为1∶999。
试验例一
人体醒酒验证试验
称取玉米抗氧化肽粉20kg、天然苹果汁20kg、柠檬酸0.2kg、阿斯巴甜0.1kg、Vc0.03kg，乳酸0.3kg和柠檬酸钠0.2kg混合，加水至总体积至100L，制得玉米抗氧化肽醒酒剂；
随机选取4组被检人员，每组10人，男女各半，第1组为“饮酒不饮玉米抗氧化肽醒酒剂”组，第2～4组为“饮酒后饮用玉米抗氧化肽醒酒剂”组(每人饮用小肽饮料100mL)，且2～4组分别引用实施例1～3所值得的玉米抗氧化肽粉对应的醒酒剂，采用呼吸式酒精测试仪分别在酒后20分钟、30分钟、40分钟各时段对被检人员的呼气进行测试。测试仪的数据间接反应出体内酒精浓度值，两组被检人员的酒精测试值随时间变化的情况分别如图1所示。
图中可见第1组人员酒后体内酒精浓度随时间的自然变化，可得人体可以将酒精代谢，但是速度慢。图中为第2～4组人员酒精在体内自然变化柱形图明显低于第一组，可见酒精数据随时间变化而明显降低，说明饮酒后饮用本玉米抗氧化肽醒酒剂对酒精代谢效果显著，证明本发明玉米抗氧化肽可明显加速体内酒精的代谢，具有明显的醒酒效果。
试验例二
本发明利用高效液相色谱仪对本发明生产的蛋白肽的分子量分布进行测定，其中本发明制备的玉米抗氧化肽的分子量主要分布在 300～2000道尔顿，其中实施例1制备的胶原肽的分子量集中在470 道尔顿(Da)附近区域；实施例2为1150Da和390Da；实施例3为1800Da和460Da。
据报道，与氨基酸和蛋白多肽比较，低于2000道尔顿的寡肽不仅易于人体吸收代谢，而且具有良好的生物活性。对制备的玉米抗氧化肽的DPPH自由基和羟自由基清除率、还原力测定进行测定，结果如果表1所示。由表1可知，实施例1～3制备的玉米抗氧化肽的DPPH自由基清除能力虽然与谷胱甘肽还有一定的差距，但羟自由基清除能力已经接近谷胱甘肽，表明利用本发明制备的玉米抗氧化肽具有良好的抗氧化能力。还原力也达到0.88以上，是一种较理想的抗氧化肽。
表1测定记录表。
Claims (4)
1.一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、备料
将准备的玉米蛋白粉干燥并进行再加工，然后将再加工后的玉米蛋白粉粉碎后配置成玉米蛋白粉含量为9％～15％的玉米蛋白粉溶液；
S2、制备
用淀粉酶水解玉米蛋白粉中的淀粉并过滤洗涤，收集滤渣进行皂化除去脂肪，再次过滤洗涤，然后在高压脉冲电场中处理，并在50-55℃环境下使用蛋白酶复合酶进行酶解4-6h，最后经过离心干燥得到食品级抗氧化肽的粗肽溶液；
S3、初步纯化
将粗肽溶液经过截留分子量为3μm～0.1μm的微滤膜系统进行过滤，除去大分子杂质，得到微滤膜透过液；
将所述微滤膜透过液经过截留分子量为50～200kDa的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜透过液；
将所述超滤膜透过液经过截留分子量为500～1000Da的卷式超滤膜纯化系统进行过滤，得到超滤膜截留液为第一次纯化物；
S4、二次纯化
取上述超滤膜截留液分别以8％～4％醋酸水溶液与100％乙腈溶液以及0.1％的TFA水溶液与100％乙腈溶液的混合溶液进行等度以及梯度洗脱，收集洗脱组分，得第二次纯化物；
S5、三次纯化
取上述第二次纯化物进行凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱进行分离纯化得到最终纯化物；
S6、成品
取最终纯化物干燥，即得纯化后的玉米抗氧化肽成品；
步骤二中皂化时将过滤、洗涤的提取物和和碱性液体分别加热至45～55℃，加热后的提取物和加热后的碱性液体混合后进行皂化反应2～4h，皂化反应完全后得到皂基，充分过滤洗涤所得滤渣即完成皂化；
皂化选用的碱性液体为pH8～10的Na 2 CO 3 水溶液，皂化后过滤洗涤的温度为75℃；
步骤四的二次纯化过程中8％～4％醋酸水溶液与100％乙腈溶液的体积分数比为85％:15％，等度洗脱时间为20min；0.1％的TFA水溶液与所述100％乙腈溶液的体积分数比为69％:31％～45％:55％，梯度洗脱时间为50min～60min；
步骤五中三次纯化过程中的凝胶过滤柱层析是指：将得到的样品溶液通过交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱后，再用洗脱液来洗脱该过滤柱，收集第3个洗脱峰部分的溶液，所述的交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱的柱长为1000mm，直径为26mm，所述的洗脱液是PH值为6的0.1mol/L的Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4 缓冲溶液；
离子交换柱层析是指：将凝胶过滤柱层析收集到的第3个洗脱峰部分的溶液通过羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该阳离子交换柱，收集第5个洗脱峰部分的溶液，所述的羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱的柱长为300mm，直径为26mm，该操作中使用的洗脱液是含1mol/L氯化钠的PH值为6的0.1mol/L的Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4 缓冲溶液；
反相高压液相色谱是指：将离子交换柱层析收集到的第5个洗脱峰部分的溶液通过C18反相柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该C18反相柱，洗脱液梯度范围在15％-65％，洗脱速度为0.7ml/min，总洗脱时间为70min，收集洗脱时间在20.5min-21.3min之间流出的溶液，所述的C18反相柱的柱长为300mm，直径为5mm，该操作中使用的缓冲液是含三氟乙酸的乙腈缓冲液，其中三氟乙酸与乙腈的体积比为1∶999。
2.根据权利要求1所述的一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于，步骤二中的蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶与中性蛋白酶组成的复合酶。
3.根据权利要求1所述的一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于，步骤二中的高压脉冲电场处理方式为：以5～10mL/min流速经蠕动泵泵送至高压脉冲电场处理室，电场强度15～30KV/cm、脉冲频率20～40Hz、脉冲时间1s～3s，得到高压脉冲电场处理液。
4.根据权利要求1所述的一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于，在二次纯化过程中，以八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为固定相，以醋酸为流动相A1，乙腈为流动相B，检测波长为260nm，进行等度洗脱；然后再以0.1％的TFA的水溶液为流动相A2，乙腈为流动相B，检测波长为225nm，进行梯度洗脱，收集含有抗氧化肽的纯化物。
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| CN104957359A (zh) * | 2015-06-26 | 2015-10-07 | 肇庆焕发生物科技有限公司 | 用玉米蛋白粉生产食品级抗氧化肽的方法 |
| CN105237622A (zh) * | 2015-09-09 | 2016-01-13 | 齐齐哈尔大学 | 玉米抗氧化活性肽及其制备方法 |
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2021
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104957359A (zh) * | 2015-06-26 | 2015-10-07 | 肇庆焕发生物科技有限公司 | 用玉米蛋白粉生产食品级抗氧化肽的方法 |
| CN105237622A (zh) * | 2015-09-09 | 2016-01-13 | 齐齐哈尔大学 | 玉米抗氧化活性肽及其制备方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| 玉米ACE 抑制肽的制备工艺及中试生产;王晓杰 等;食品与发酵工业;第42卷(第7期);158-163 * |
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