CN108456244A

CN108456244A - 玉米抗氧化活性肽及其制备方法

Info

Publication number: CN108456244A
Application number: CN201810402952.4A
Authority: CN
Inventors: 刘晓兰; 郑喜群; 王晓杰; 金杜欣
Original assignee: Qiqihar University
Current assignee: Qiqihar University
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2035-09-09
Also published as: CN108456243B; CN105237622A; CN105237622B; CN108456244B; CN108456243A

Abstract

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种玉米肽及其制备方法。本发明提供了一种玉米肽，所述玉米肽的氨基酸序列为：KSCAPLAS。所述玉米肽具有高抗氧化活性，经测定，其对DPPH自由基清除的IC₅₀值为0.13mg/mL，对超氧阴离子自由基清除的IC₅₀值为0.41mg/mL。本发明还提供了上述玉米肽的制备方法，以经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉为原料，采用蛋白酶协同酶解方式，获得具有抗氧化活性的多肽混合物，再通过超滤、离子交换层析、凝胶层析、反相色谱，逐级收集高活性且分子量在600‑1400Da范围内的组分，最后通过质谱测序获得六个玉米肽的氨基酸序列；化学合成后评估玉米肽的体外抗氧化活性，最终获得玉米肽KSCAPLAS。

Description

玉米抗氧化活性肽及其制备方法

本申请是以申请号为“CN201510565561.0”、发明名称为“玉米抗氧化活性肽及其制备方法”的中国专利申请为基础提出的分案申请。本申请全部内容源自母案申请文件记载。

技术领域

本发明涉及三个新的、高抗氧化活性的玉米肽及制备方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

氧化反应在疾病产生过程中发挥重要作用，如癌症、衰老、动脉硬化、心血管疾病、糖尿病、阿尔茨海默病等。这些负面健康状况的产生归因于细胞成分的氧化性损伤，如细胞膜、脂蛋白、酶和核酸等。在食品中，氧化反应也可以直接影响食品质量，通常与食品的风味和质地的改变有关。氧化反应是自由基产生过量和/或内源性抗氧化成分消耗导致的。因此，在机体和食品中抑制氧化反应和自由基的形成是非常重要的。适量摄入抗氧化剂可以明显降低机体内的自由基水平，在保持身体健康和预防疾病发面发挥重要作用。同时，在食品中掺入抗氧化剂可以保持食品的质量和营养。

按照来源不同，抗氧化剂分为两种类型：合成抗氧化剂和天然抗氧化剂。合成抗氧化剂，如BHT、BHA、TBHQ等，被认为存在安全隐患，严重限制了其在食品工业的应用；而天然抗氧化剂由于具有安全、高活性、易吸收、无副作用和分布广泛等优点而备受关注。目前，抗氧化肽已经从许多食品蛋白中分离得到，如大豆蛋白、油菜籽蛋白、水稻胚乳蛋白、小麦胚芽蛋白、大麦谷蛋白等。

玉米黄粉(Corn GlutenMeal缩写CGM)为玉米湿法生产淀粉过程产量最大的副产物，其内含约60％的蛋白质，由玉米醇溶蛋白(zein，68％)、谷蛋白(glutelin，22％)、球蛋白(globulins，1.2％)和白蛋白(albumin)组成。玉米黄粉虽然是一种资源丰富、成本低廉的天然植物蛋白原料，但是由于其中赖氨酸和色氨酸的含量都不高，显然为一种非全营养蛋白。另外，玉米黄粉所含的蛋白质难溶于水，组成又比较复杂，口感还十分粗糙，因此，无论是在食品领域还是在饲料行业都很少有人问津。甚至有不少地方还将之与其它副产物一起不加回收就白白地自然排放掉了，这不仅是对粮食资源的一种极大浪费，同时也对生态环境造成了一定程度的污染。因此，如果能对玉米蛋白进行修饰并应用于食品工业，其市场价值将大大增大。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供三个新的、高抗氧化活性的玉米肽，由于该产品的生产原料是玉米黄粉，首先为这种长期被冷落、被遗弃的天然资源提供了一种有效的利用途径，同时还开发出了三个具有防治疾病、抗衰老等功能，可以做为食品、医药、化妆品等产品添加剂使用的抗氧化活性肽。本发明要解决的另一个技术问题是提供这三个新的、高抗氧化活性玉米肽的制备方法。

本发明产品新的、高抗氧化活性玉米肽是以经挤压膨化并去淀粉的玉米黄粉为原料，加入一定比例的水配制底物浓度为10％的悬浊液，先接入碱性蛋白酶Alcalase酶解75min，再接入风味蛋白酶Flavourzyme酶解50min，获得具有抗氧化活性的多肽混合物。采用超滤、离子交换层析、凝胶层析和反相色谱法对该混合物进行分离，最后利用Q-TOF2测定抗氧化活性肽的氨基酸序列。化学合成后评估玉米肽的体外抗氧化活性，最终获得三个新的、高抗氧化活性的玉米肽。玉米肽的氨基酸序列分别为：CSQAPLA、KSCAPLAS和ADCGWPA。三者对DPPH自由基清除的IC₅₀值分别为0.12mg/mL、0.13mg/mL和0.23mg/mL；对超氧阴离子自由基清除的IC₅₀值分别0.39mg/mL、0.41mg/mL和0.19mg/mL。

本发明产品制备的具体方法：

1、玉米蛋白酶解液的制备

取一定量经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉，加入一定比例的水配制底物浓度为10％(m/V)的悬浊液，先用碱性蛋白酶Alcalase进行酶解，酶解条件为：加酶量2％，酶解温度50℃，pH 7.7，时间75min；然后加入风味蛋白酶Flavourzyme进行协同酶解，酶解条件为：加酶量5％，酶解温度53℃，pH 6.4，时间50min。酶解结束后酶解液在100℃条件下加热10min以钝化蛋白酶活力。酶解物在4000r/min离心10min弃沉淀，所得上清液为抗氧化活性肽的混合物。

2、玉米蛋白酶解液的超滤

采用截断分子量6kDa的超滤膜对玉米蛋白酶解液进行超滤处理，获得＞6kDa截留液和＜6kDa透过液两种不同分子量的玉米肽组分。选择分子量＜6kDa的透过液作为下一步分离纯化的样品。

3、Q-Sepharose FastFlow强阴离子交换层析

将超滤所得＜6kDa的透过液稀释10倍，10000r/min离心15min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，50mL滤液进行强阴离子交换层析起始缓冲液：20mmol/LpH8.5Tris-HCl，洗脱液：含1molNaCl的20mmol/L pH 8.5Tris-HCl，梯度洗脱15min，流速：2mL/min，UV_214nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活性，收集高活性部分备用。

4、SephadexG-25凝胶过滤层析

将Q-Sepharose FastFlow的高活力样品冷冻抽干后，用双蒸水溶解后进行凝胶层析脱盐流速2.0mL/min，UV_214nm处检测。同时进行分子量标定，标定用的标准物质为杆菌肽(分子量1400Da)和还原型谷胱甘肽(分子量为600Da)。测定各管收集液的抗氧化活性，收集分子量在600-1400Da范围内且高活性部分备用。

5、反相色谱

①半制备型反相色谱柱确定抗氧化肽的活性区域

称取20mg SephadexG-25分离所得活性组分溶于1mL的2％乙腈水溶液中，用0.22μm微孔滤膜过滤，色谱柱的型号为Pronto SIL C18 流速为1.5mL/min，流动相A为含0.065％TFA的2％乙腈水溶液，流动相B为含0.05％TFA的80％乙腈水溶液，梯度洗脱60min。采用自动部分收集器收集开始出峰时的玉米肽组分，每管收集3mL。测定每管样品的抗氧化活性，确定活性区域在8、11和13管。

②分析型反相色谱柱分离抗氧化活性肽

将半制备反相色谱柱分离所得活性组分溶于2％乙腈水溶液中，进一步用分析柱进行分离纯化，分析柱的柱型为Xselect CSH检测波长为214nm，流速为1mL/min，上样量为20μL。流动相A为含0.065％TFA的2％乙腈水溶液，流动相B为含0.05％TFA的乙腈。

管组分经过分析柱分离后，获得八个玉米肽，收集每个峰的峰尖部分进行抗氧化活性测定，确定8-II、8-V和8-VII为主要抗氧化活性肽。

管组分获得五个玉米肽，分别为11-I、11-II、11-III、11-IV和11-VI。收集每个玉米肽的峰尖部分进行抗氧化活性的测定，确定11-III和11-VI为主要抗氧化活性肽。

管活性组分经分析柱分离获得九个峰，经与溶剂色谱图作比较，确定13-I、13-III、13-VI、13-VII、13-VIII为溶剂峰，13-II、13-IV、13-V、13-IX为13管的玉米抗氧化肽。通过测定四个玉米肽峰尖部分的抗氧化活性，确定13-V为主要玉米抗氧化肽。

6、质谱测序：

将反相色谱分离出来的8-II、8-V、8-VII、11-III、11-VI和13-V进行质谱测序，结果如表1所示。

表1六种玉米抗氧化肽的氨基酸序列信息

名称	抗氧化活性肽序列	氨基酸个数	分子量/Da
				8-II	Lys-Ser-Cys-Ala-Pro-Leu-Ala-Ser	8	775.29
8-V	Ala-Asp-Cys-Gly-Trp-Pro-Ala	7	719
				8-VII	Ala-Leu-Thr-Ser-Pro-Ala	6	558.29
11-III	Cys-Ser-Gln-Ala-Pro-Leu-Ala	7	688.29
				11-VI	Tyr-Pro-Lys-Leu-Ala-Pro-Asn-Glu	8	930.49
13-V	Tyr-Pro-Gln-Leu-Leu-Pro-Asn-Glu	8	972.49

7、玉米抗氧化肽体外抗氧化活性的测定

将获得的六个玉米抗氧化肽进行化学合成后，测定对DPPH、羟基和超氧阴离子自由基的清除活性和还原力，最终获得三个新的、高抗氧化活性的玉米肽。

本发明的有益效果是：本发明产品具有较高的抗氧化活性，经测定CSQAPLA、KSCAPLAS和ADCGWPA三者对DPPH自由基清除的IC₅₀值分别为0.12mg/mL、0.13mg/mL和0.23mg/mL；对超氧阴离子自由基清除的IC₅₀值分别0.39mg/mL、0.41mg/mL和0.19mg/mL，效果与抗氧化剂维生素C和谷胱甘肽相当，可用作食品、医药、化妆品等产品添加剂使用。

附图说明

图1是本发明的生产工艺流程图。

具体实施方式

实施例1：

1、玉米蛋白酶解液的制备

取一定量经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉，加入一定比例的水配制底物浓度为10％(m/V)的悬浊液，先用碱性蛋白酶Alcalase进行酶解，酶解条件为：加酶量2％，酶解温度50℃，pH7.7，时间75min；然后加入风味蛋白酶Flavourzyme进行协同酶解，酶解条件为：加酶量5％，酶解温度53℃，pH6.4，时间50min。水解结束后酶解液在100℃条件下加热10min以钝化蛋白酶活力。酶解物在4000r/min离心10min弃沉淀，所得上清液为抗氧化活性肽的混合物。

2、玉米蛋白酶解液的超滤

3、Q-Sepharose FastFlow强阴离子交换层析

将超滤所得＜6kDa的透过液稀释10倍，10000r/min离心15min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，滤液进行强阴离子交换层析起始缓冲液：20mmol/LpH8.5Tris-HCl，洗脱液：含1molNaCl的20mmol/L pH 8.5Tris-HCl，梯度洗脱15min，流速：2mL/min，UV_214nm处检测。测定各管收集液的抗氧化活性，收集高活性部分备用。

4、SephadexG-25凝胶过滤层析

5、反相色谱

①半制备型反相色谱柱确定抗氧化肽的活性区域

称取20mg SephadexG-25分离所得活性组分溶于1mL的2％乙腈水溶液中，用0.22μm微孔滤膜过滤，色谱柱的型号为Pronto SIL C18 上样量为500μL，流速为1.5mL/min，检测波长为214nm，流动相A为含0.065％TFA的2％乙腈水溶液，流动相B为含0.05％TFA的80％乙腈水溶液，梯度洗脱60min。采用自动部分收集器收集开始出峰时的玉米肽组分，每管收集3mL。测定每管样品的抗氧化活性。确定活性区域在8、11和13管。反复收集样品后冷冻抽干备用。

②分析型反相色谱柱分离抗氧化活性肽

管组分经过分析柱分离后，获得八个玉米肽，收集每个峰的峰尖部分进行抗氧化活性测定，确定8-Ⅱ、8-Ⅴ和8-Ⅶ为主要抗氧化活性肽。反复收集这三个组分，冷冻抽干，留待质谱测序。

管组分获得五个玉米肽，分别为11-I、11-Ⅱ、11-Ⅲ、11-Ⅳ和11-Ⅵ。收集每个玉米肽的峰尖部分进行抗氧化活性的测定，确定11-Ⅲ和11-Ⅵ为主要抗氧化活性肽。反复收集这两个肽，冷冻抽干，留待质谱测序。

管活性组分经分析柱分离获得九个峰，经与溶剂色谱图作比较，确定13-Ⅰ、13-Ⅲ、13-Ⅵ、13-Ⅶ、13-Ⅷ为溶剂峰，13-Ⅱ、13-Ⅳ、13-Ⅴ、13-Ⅸ为13管的玉米抗氧化肽。通过测定四个玉米肽峰尖部分的抗氧化活性，确定13-Ⅴ为主要玉米抗氧化肽。将该组分多次收集，冷冻抽干，密封保存备用。

6、质谱测序：

将反相色谱分离出来的8-Ⅱ、8-Ⅴ、8-Ⅶ、11-Ⅲ、11-Ⅵ和13-Ⅴ进行质谱测序，获得六个氨基酸序列。

7、玉米抗氧化肽体外抗氧化活性的测定将获得的六个玉米抗氧化肽进行化学合成后，测定对DPPH、羟基和超氧阴离子自由基的清除活性和还原力，最终获得三个新的、高抗氧化活性的玉米肽。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 齐齐哈尔大学

<120> 玉米抗氧化活性肽及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Cys Ser Gln Ala Pro Leu Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2

Lys Ser Cys Ala Pro Leu Ala Ser

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 3

Ala Asp Cys Gly Trp Pro Ala

1 5

Claims

1.一种玉米肽，其特征在于，所述玉米肽的氨基酸序列为：KSCAPLAS。

2.权利要求1所述玉米肽的制备方法，其特征在于，所述玉米肽是以经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉为原料，采用蛋白酶协同酶解方式，获得具有抗氧化活性的多肽混合物，再依次通过超滤、离子交换层析、凝胶层析、反相色谱，逐级收集高活性且分子量在600-1400Da范围内的组分，最后通过质谱测序获得六个玉米肽的氨基酸序列；化学合成后评估玉米肽的体外抗氧化活性，最终获得对DPPH自由基清除的IC₅₀值为0.13mg/mL，对超氧阴离子自由基清除的IC₅₀值为0.41mg/mL的玉米肽KSCAPLAS。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶协同酶解具体为：取一定量经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉，加入一定比例的水配制底物浓度为质量体积比10％的悬浊液，先用碱性蛋白酶Alcalase进行酶解，酶解条件为：加酶量2％，酶解温度50℃，pH7.7，时间75min；然后向碱性蛋白酶酶解液中加入风味蛋白酶Flavourzyme进行协同酶解，酶解条件为：加酶量5％，酶解温度53℃，pH 6.4，时间50min；酶解结束后协同酶解液在100℃条件下加热10min以钝化蛋白酶活力；得到的酶解物离心弃沉淀，所得上清液为抗氧化活性肽的混合物。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述超滤的具体工序如下：采用截断分子量6kDa的超滤膜对所述具有抗氧化活性的多肽混合物进行超滤处理，获得分子量＞6kDa截留液和分子量＜6kDa透过液的玉米肽组分；选择分子量＜6kDa的透过液作为下一步分离纯化的样品。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述离子交换层析的具体工序如下：所使用的强阴离子交换剂为Q-Sepharose Fast Flow，将超滤所得分子量＜6kDa的透过液稀释10倍，10000r/min离心15min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，50mL滤液进行强阴离子交换层析，所述强阴离子交换层析的层析柱规格为起始缓冲液：20mmol/L pH8.5 Tris-HCl，洗脱液：含1mol NaCl的20mmol/L pH 8.5 Tris-HCl，流速：2mL/min，UV_214nm处检测；测定各管收集液的抗氧化活性，收集高活性部分备用。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶层析采用层析柱规格为的SephadexG-25，将Q-Sepharose Fast Flow的高活力样品冷冻抽干后，用双蒸水溶解后进行凝胶层析脱盐的同时进行分子量标定，标定用的标准物质为分子量1400Da的杆菌肽和分子量为600Da的还原型谷胱甘肽；测定各管收集液的抗氧化活性，收集分子量在600-1400Da范围内且高活性部分备用。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反相色谱的分离步骤包括：

①半制备型反相色谱柱确定抗氧化肽的活性区域

称取SephadexG-25分离所得活性组分溶于2％乙腈水溶液中，用0.22μm微孔滤膜过滤，色谱柱的规格为填料为粒径10μm的ProntoSILC18，流速为1.5mL/min，流动相A为含0.065％TFA的2％乙腈水溶液，流动相B为含0.05％TFA的80％乙腈水溶液；采用自动部分收集器收集开始出峰时的玉米肽组分，每管收集3mL；测定每管样品的抗氧化活性；确定活性区域在8号、11号和13号管；

②分析型反相色谱柱分离抗氧化活性肽

将半制备反相色谱柱分离所得活性组分溶于2％乙腈水溶液中，进一步用分析柱进行分离纯化，分析柱的柱型为3.5μm的XselectCSH，检测波长为214nm，流速为1mL/min，上样量为20μL；流动相A为含0.065％TFA的2％乙腈水溶液，流动相B为含0.05％TFA的乙腈；

8号管组分经过分析柱分离后，获得八个玉米肽，收集每个峰的峰尖部分进行抗氧化活性测定，确定8-II、8-V和8-VII为主要抗氧化活性肽；

11号管组分获得五个玉米肽，分别为11-I、11-II、11-III、11-IV和11-VI；收集每个玉米肽的峰尖部分进行抗氧化活性的测定，确定11-III和11-VI为主要抗氧化活性肽；

13号管活性组分经分析柱分离获得九个峰，经与溶剂色谱图作比较，确定13-I、13-III、13-VI、13-VII、13-VIII为溶剂峰，13-II、13-IV、13-V、13-IX为13号管的玉米抗氧化肽；通过测定四个玉米肽峰尖部分的抗氧化活性，确定13-V为主要玉米抗氧化肽。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述质谱测序为：将反相色谱分离出来的8-II、8-V、8-VII、11-III、11-VI和13-V进行质谱测序，获得六个氨基酸序列；将获得的六个玉米抗氧化肽进行化学合成后，测定对DPPH、羟基和超氧阴离子自由基的清除活性和还原力，最终获得对DPPH自由基清除的IC₅₀值为0.13mg/mL，对超氧阴离子自由基清除的IC₅₀值为0.41mg/mL的玉米肽KSCAPLAS。