CN117603308A - 一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽及其制备方法与应用，属于生物活性肽技术领域。本发明提供的抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1（NPILQPY）、SEQ ID NO.2（PILQPY）、SEQ ID NO.3（PILQPYR）所示的玉米肽中的至少一种。本发明提供的新的具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附作用的玉米肽，具有显著拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性，可以用于制备拮抗幽门螺旋杆菌感染功效的药品，为幽门螺旋杆菌感染的防治提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于生物活性肽技术领域，尤其涉及一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽及其制备方法与应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性菌，呈螺旋状、微需氧。幽门螺旋杆菌感染引起的疾病有胃炎、消化道溃疡等，严重者可能会导致胃癌。
目前，幽门螺旋杆菌感染的治疗方案主要为抗生素疗法。但随着幽门螺旋杆菌对抗生素的耐药性逐年上升，其根除率也在下降，并且服用抗生素具有很多副作用。因此，开发抗生素的替代疗法对于拮抗幽门螺旋杆菌感染具有重要的意义。
来源于食物组分中的拮抗幽门螺旋杆菌感染功效的活性物质，具有安全、基本无副作用等优点，是现阶段的研究热点。玉米蛋白富含疏水性氨基酸，且一级结构中具有多种潜在生物活性的肽序列，是制备抗粘附活性肽的良好原料。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽，所述玉米肽为一种新的活性肽，具备拮抗幽门螺旋杆菌粘附人胃粘膜上皮细胞的作用。
本发明的另一目的在于提供上述抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽的制备方法及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽，所述玉米肽包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1（NPILQPY）、SEQ ID NO.2（PILQPY）、SEQ ID NO.3（PILQPYR）所示的玉米肽中的至少一种。本发明所述的玉米肽更优选的包括NPILQPY、PILQPY和PILQPYR中的两种以上。
本发明还提供了一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽的制备方法，包括如下步骤：用复合蛋白酶Protamex 1.6水解玉米黄粉，得到玉米蛋白水解物；对所述玉米蛋白水解物进行分离纯化，收集小于1000 Da且抗幽门螺旋杆菌粘附活性最高的组分，进行质谱测序，经数据库序列比对，化学合成即得上述玉米肽；所述复合蛋白酶Protamex 1.6的用量以玉米黄粉中蛋白重量计，为每g蛋白添加1000 U复合蛋白酶Protamex 1.6；所述水解的温度为50 ℃，所述水解的时间为120 min，所述水解的pH为7.0。
在本发明中，进行水解前，优选的将玉米黄粉与水混合，得到悬浊液。本发明所述悬浊液中玉米黄粉的质量浓度优选为15%（w/v）。在本发明中，所述玉米黄粉优选的为经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉，所述玉米黄粉可以充分的去掉与蛋白质紧密结合的淀粉物质，有利于蛋白质的水解。本发明对所述玉米黄粉的来源没有特殊限定，采用本领域市售的经挤压膨化后去淀粉的玉米黄粉均可。
在本发明中，水解结束后，优选的还需进行灭酶反应，所述灭酶反应的温度优选为100℃，时间优选为10 min。灭酶反应结束后，优选的还包括对所述灭酶反应后的混合物进行离心，所述离心的转速优选为4000 r/min，时间优选为10 min，离心结束后，取上清液，即为含有上述玉米肽的玉米蛋白水解物。
在本发明中，所述分离纯化的方式优选的包括凝胶色谱分离和离子交换色谱分离；所述凝胶色谱分离为Sephadex G-25凝胶色谱；所述离子交换色谱分离为Mono Q离子交换色谱。本发明优选的采用LC-MS/MS进行所述质谱测序。本发明对所述质谱测序的过程和步骤没有特殊限定，采用本领域中常规质谱测序步骤即可。
本发明还提供了上述玉米肽或上述玉米肽制备方法在制备拮抗幽门螺旋杆菌粘附的产品中的应用。在本发明中，所述产品优选的包括药品。
本发明还提供了一种防治幽门螺旋杆菌感染或粘附的产品，所述产品的活性成分包括上述的玉米肽。本发明对所述产品中玉米肽的用量没有特殊限定，根据制备的产品常规添加即可。在本发明所述产品中，优选的还包括辅料和/或其他活性成分。当所述产品中还包括其他活性成分时，本发明对所述其他活性成分的类型、功效和用量均没有特殊限定，依据制备的产品合理添加即可。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种新的具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附作用的玉米肽，该种玉米肽具有显著拮抗幽门螺旋杆菌粘附的活性，可以用于制备拮抗幽门螺旋杆菌感染功效的药品，为幽门螺旋杆菌感染的防治提供技术支持。
附图说明
图1为菌落浓度与菌悬液光密度值（OD600）的标准曲线；
图2为异硫氰酸荧光素（FITC）荧光强度值和OD600的标准曲线；
图3为本发明试验的技术路线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
（1）玉米蛋白水解物的制备
取经挤压膨化并去除淀粉的玉米黄粉（购自黑龙江龙凤玉米开发有限公司），加水配制成底物浓度为15%（w/v）的悬浊液，然后用复合蛋白酶Protamex 1.6（丹麦诺维信有限公司）进行水解，水解条件为：加酶量1000 U/g蛋白（以玉米黄粉中蛋白的重量计），水解温度50℃，水解时间120 min，水解pH 7.0，水解结束后100℃加热灭酶10 min，水解物在4000r/min离心10 min并弃去沉淀，所得上清液为玉米蛋白水解物。
（2）玉米蛋白水解物的凝胶色谱分离
所使用的凝胶色谱柱为Sephadex G-25，将步骤（1）中得到的玉米蛋白水解物采用凝胶色谱分离得到不同分子量组分的多肽混合物，上样浓度20 mg/mL，上样量5 mL，洗脱液为pH 7.0的20 mM PBS缓冲溶液，流速为2 mL/min，检测波长为214 nm；测定各分子量组分的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性，具体方法为：
1）利用H. pylori ATCC 43504菌株（购自于美国模式培养物集存库）作为抗粘附活性试验测定菌株。在37℃条件下将经过冻存的H. pylori ATCC 43504菌株解冻，先与液体培养基（3 g大豆蛋白胨、2.5 g K2HPO4、17 g胰蛋白胨和5 g NaCl，加入1 L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1 Mpa灭菌1 h）混合，随后将其接种于斜面培养基（15 g胰蛋白胨、5 g大豆蛋白胨、15 g琼脂、5 g NaCl和950 mL去离子水，搅拌溶解调节pH值至7.2，121℃、0.1 Mpa灭菌1 h，在培养基冷却至45℃左右，加入50 mL无菌的脱纤维羊血，混匀后，倒入试管制作斜面培养基）上，在37℃微需氧（5% O2，85% N2，10% CO2）条件下，培养48~72 h，得到的菌液可进行菌种传代和抗粘附活性检测。
将传代的H. pylori ATCC 43504的菌液，进行四次10倍梯度稀释获得五种不同浓度的菌液，在600 nm条件下测定幽门螺旋杆菌菌液的OD值，同时通过平板涂布法计算菌落浓度，建立菌落浓度与OD600的标准曲线，如图1所示。
2）冻存人胃粘膜上皮细胞（GES-1）解冻后移入细胞培养瓶中，细胞培养基组成为1%青链霉素混合液、10%胎牛血清和89% DMEM培养基。在37℃，5% CO2条件下孵育至单层细胞形成，胰蛋白酶-EDTA消化传代，离心，用不含抗生素的细胞培养基重悬，调整细胞浓度为3×105 cells/mL。将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100 μL，在37℃，5% CO2培养箱中培养孵育24 h，用于拮抗H. pylori ATCC 43504粘附活性的测定实验。
3）异硫氰酸荧光素（FITC）标记幽门螺旋杆菌
制备FITC浓度为2 mg/mL的DMSO溶液，无菌滤膜过滤处理。按照1：1的体积比将步骤1）中制备得到的传代的H. pylori ATCC43504的菌液与其混匀，在避免光照的条件下，生化摇摆台上混合30 min后，在4500 r/min的转速下离心处理3 min，除去上清液，经过1×PBS缓冲液洗涤3次，除去多余的FITC，最后将菌液在液体培养基（3 g大豆蛋白胨、2.5 gK2HPO4、17 g胰蛋白胨和5 g NaCl，加入1 L去离子水，混合摇匀溶解后调节pH值至7.2，121℃、0.1 Mpa灭菌1 h）上稀释至OD600值在0.1左右（108 cfu/mL），备用。
4）FITC荧光强度值与OD600标准曲线的构建
将上步中经过FITC标记处理的幽门螺旋杆菌菌液，按照四次10倍梯度稀释，在激发波长485 nm和发射波长530 nm条件下，测量其荧光强度值，与此同时在600 nm条件下测OD值，建立FITC荧光强度值和OD600的标准曲线，如图2所示。
5）各分子量组分拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性试验
将步骤（2）中制备得到的各分子量组分使用100% DMEM培养基，配制一定浓度的各分子量组分溶液，按照1：1（v/v）的比例与步骤3）中经过FITC标记过的菌液在室温避光条件下进行混合30 min，使各分子量组分的终浓度为4 mg/mL，得到混合后的菌液。
向有胃粘膜上皮细胞（GES-1）的96孔板中分别加入100 μL混合后的菌液，以加入100 μL100% DMEM培养基为阴性对照组，在培养箱中放置90 min。然后将溶液去除，用PBS缓冲液清洗3次，随即，将PBS缓冲液按照每孔100 μL量加入，在发射波长530 nm、激发波长485nm条件下进行荧光强度值的测定，根据图1和图2，计算出阴性对照组和试验组的菌落浓度，采用以下公式计算粘附拮抗率：
收集小于1000 Da组分且拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性最高的组分用于离子交换色谱分离。
（3）离子交换色谱分离
Mono Q离子交换色谱
步骤（2）中分离得到的最高活性组分使用Mono Q离子交换色谱进一步分离。将上一步凝胶色谱所得最高活性组分过0.22 μm的微孔滤膜，所得样品蛋白浓度为2 mg/mL，上样量2 mL，所述Mono Q离子交换色谱的洗脱液A：pH 7.0的20 mM的PBS缓冲液，洗脱液B：pH7.0含1 mol/L NaCl的的20 mM PBS缓冲液，流速为1 mL/min，检测波长214 nm，梯洗体积为20 mL，峰组分每管收集1 mL；测定各管收集液的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性（具体方法同步骤（2）的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性测定方法），收集拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性最高的组分备用。
（4）LC-MS/MS质谱测序
将步骤（3）中得到的组分脱盐冻干后进行质谱测序（委托北京百泰派克生物科技有限公司进行），经数据库序列比对，得到氨基酸序列分别为NPILQPY（SEQ ID NO.1）、PILQPY（SEQ ID NO.2）和PILQPYR（SEQ ID NO.3）的具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米肽。
实施例2
实施例1所得玉米肽拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的测定
委托上海强耀生物科技有限公司合成实施例1所得的三种玉米肽NPILQPY（SEQ IDNO.1）、PILQPY（SEQ ID NO.2）和PILQPYR（SEQ ID NO.3），测定其拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性。具体测定方法同实施例1步骤（2）中记载的检测方法（即将实施例1步骤（2）中的5）的各分子量组分分别替换为NPILQPY、PILQPY或PILQPYR，其余均同实施例1步骤（2）的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性检测方法）。
结果显示，当玉米肽NPILQPY的浓度为4 mg/mL时，其拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性为52.52%。
当玉米肽PILQPY的浓度为4 mg/mL时，其拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性为46.39%。
当玉米肽PILQPYR的浓度为4 mg/mL时，其拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性为34.25%。
实施例3
实施例1步骤（1）所得玉米蛋白水解物拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的测定
具体测定方法同实施例1步骤（2）中记载的检测方法（即将实施例1步骤（2）中的5）的各分子量组分替换为实施例1步骤（1）所得玉米蛋白水解物，其余均同实施例1步骤（2）的拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性检测方法）。共进行六个平行试验。
结果显示，当玉米蛋白水解物的浓度为4 mg/mL时，其拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性为34.13±3.1%。
由以上结果可以看出，本发明提供的玉米肽和玉米蛋白水解物具备拮抗幽门螺旋杆菌粘附的作用。
上述试验的技术路线如图3所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽，其特征在于，所述玉米肽包括氨基酸序列如SEQID NO.1-3所示的玉米肽中的至少一种。
2.一种抗幽门螺旋杆菌粘附的玉米肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：用复合蛋白酶Protamex 1.6水解玉米黄粉，得到玉米蛋白水解物；对所述玉米蛋白水解物进行分离纯化，收集小于1000 Da且抗幽门螺旋杆菌粘附活性最高的组分，进行质谱测序，经数据库序列比对，化学合成即得权利要求1所述玉米肽；所述复合蛋白酶Protamex 1.6的用量以玉米黄粉中蛋白量计，为每g蛋白添加1000 U复合蛋白酶Protamex 1.6；所述水解的温度为50 ℃，所述水解的时间为120 min，所述水解的pH为7.0。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化的方式包括凝胶色谱分离和离子交换色谱分离；所述凝胶色谱分离为Sephadex G-25凝胶色谱；所述离子交换色谱分离为Mono Q离子交换色谱。
4.权利要求1所述玉米肽或权利要求2-3任意一项所述制备方法在制备拮抗幽门螺旋杆菌粘附的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括药品。
6.一种防治幽门螺旋杆菌感染或粘附的产品，其特征在于，所述产品的活性成分包括权利要求1所述的玉米肽。
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