CN114306584B - 蛋白酶k及其复合酶在制备病毒抑制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白酶K及其复合酶在制备病毒抑制剂中的应用。首先本发明发现蛋白酶K对冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒具有一定的抑制和杀灭作用，能够显著降低病毒效价，可作为病毒抑制剂，用于制备治疗冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒感染的药物，也可用于制备动物饲料；其次，本发明发现由蛋白酶K和中性蛋白酶组成的复合酶对冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒均具有显著的抑制和杀灭作用，能够显著降低病毒效价，且其效果显著优于同剂量的蛋白酶K及中性蛋白酶，可作为病毒抑制剂，用于制备治疗冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒感染的药物；也可用于制备动物饲料，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白酶K及其复合酶在制备病毒抑制剂中的应用。
背景技术
蛋白酶家族中的蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，能够消化富含二硫键的天然角蛋白，来源于林伯氏白色念球菌。近年来，蛋白酶K的应用不仅仅局限在医疗诊断及科研领域。在实现规模化工业生产的前提下，蛋白酶K还可以替代作用范围较窄的其它蛋白酶，应用于工业制革、造纸、饲料等行业中。
中性蛋白酶属于其中一种内切酶，可水解处理各种蛋白质肽键，释放氨基酸或者多肽，其最适pH值为7.0左右。中性蛋白酶具有无工业污染、催化反应速度快、反应条件适应性宽等优点，因此在众多行业中都有应用，例如皮革、纺织、化工、食品、医药等，具有重要的工业价值。
本发明发现，蛋白酶K对冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒具有一定的抑制和杀灭作用，能够显著降低病毒效价，可作为病毒抑制剂，用于制备治疗冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒感染的药物，也可用于制备动物饲料。而且由蛋白酶K和中性蛋白酶组成的复合酶对冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒均具有显著的抑制和杀灭作用，能够显著降低病毒效价，且其效果显著优于同剂量的蛋白酶K及中性蛋白酶，可作为病毒抑制剂，用于制备治疗冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒感染的药物；也可用于制备动物饲料，具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白酶K及其复合酶在制备病毒抑制剂中的应用。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种蛋白酶K在制备抑制病毒复制或抑制病毒感染的药物中的应用。
优选地，所述病毒包括冠状病毒(PEDV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、口蹄疫病毒(FMDV)。
优选地，所述蛋白酶K加入药学上可接受的辅料或载体制成药学上可接受的任一剂型。
第二方面，本发明提供了一种蛋白酶复合酶，所述蛋白酶复合酶包括蛋白酶K和中性蛋白酶，所述蛋白酶K和中性蛋白酶的重量比为：2-8：8-2。
优选地，所述蛋白酶K和中性蛋白酶的重量比为：6-8：4-2。
优选地，所述蛋白酶K和中性蛋白酶的重量比为：6：4。
第三方面，本发明提供了上述第二方面所述的蛋白酶复合酶在制备抑制病毒复制或抑制病毒感染的药物中的应用。
优选地，所述病毒包括冠状病毒(PEDV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、口蹄疫病毒(FMDV)。
优选地，所述蛋白酶复合酶加入药学上可接受的辅料或载体制成药学上可接受的任一剂型。
第四方面，本发明提供了上述第二方面所述的蛋白酶复合酶在制备动物饲料中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明发现蛋白酶K对冠状病毒(PEDV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、口蹄疫病毒(FMDV)均具有一定的抑制和杀灭作用，能够显著降低病毒效价，可作为病毒抑制剂，用于制备治疗冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒感染的药物，也可用于制备动物饲料；
(2)本发明发现由蛋白酶K和中性蛋白酶组成的复合酶对冠状病毒(PEDV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、口蹄疫病毒(FMDV)具有更显著的抑制和杀灭作用，能够显著降低病毒效价，且其效果显著优于同剂量的蛋白酶K及中性蛋白酶，可作为病毒抑制剂，用于制备治疗冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒感染的药物；也可用于制备动物饲料，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法若无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买。
以下实施例所述中性蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述蛋白酶K的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
以下列实施例中所述的冠状病毒(PEDV CV777)、非洲猪瘟病毒(ASFV CN/GS/2018)、口蹄疫病毒(FMDV/O/17002)来源于来自国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)；所述实验均在国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)完成。
实施例1蛋白酶K及蛋白酶K与中性蛋白酶组成的复合酶对冠状病毒的抑制
1.蛋白酶K及蛋白酶K与中性蛋白酶组成的复合酶待测样品的配置
配制1000ml的病毒消毒液，分别按表1所示，称取蛋白酶K，中性蛋白酶，海藻糖和稳定剂，加去离子水室温搅拌溶解，用0.22μm的滤器在无菌的环境下过滤除菌，得待测样品。
表1待测样品的配置
2.复合酶处理对冠状病毒的抑制作用
(1)复合酶与病毒共孵育：用MEM培养基将复合酶稀释成不同浓度，将0.1mL PEDV原液(TCID50＝1×106/0.1mL)与等体积上述不同浓度待测样品混合，对照组为病毒和等体积的含10％FBS的MEM培养基混合液，于16℃分别作用1min、10min和30min后，再分别用含10％FBS的MEM稀释1000倍；
(2)病毒接种细胞：然后将细胞培养板中培养液吸出，把上述稀释好的复合酶与病毒混合液按复合酶浓度大小分别依次加入相应96孔板孔中，每个浓度重复四孔，每孔0.2mL。对照组：阴性对照为含10％FBS的MEM；阳性对照分为同条件处理后的FMDV；病毒抑制剂对照为1000倍稀释的卫可消毒液(含10％FBS的MEM稀释)。对照组的每孔加入量为0.2ml。然后置37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
(3)病毒抑制作用检测：采用qPCR检测病毒RNA的CT值，采用药典标准方法检测病毒的TCID50。
3.结果
结果如下表2所示，未加上述待测样品前，冠状病毒悬液中病毒效价均为107.8TCID50/g；加入上述待测样品处理后1h，冠状病毒悬液中病毒效价均降低，说明上述待测样品对冠状病毒具有一定的抑制作用。其中，中性蛋白酶处理后病毒效价仅降低至105.6TCID50/g；而蛋白酶K处理后病毒效价降低至103.9TCID50/g；不同组成的蛋白酶K与中性蛋白酶复合酶处理后病毒效价分别降低至102.9TCID50/g、102.4TCID50/g、103.5TCID50/g、104.5TCID50/g；其中相较于蛋白酶K，蛋白酶K(8mg/L)+中性蛋白酶(2mg/L)及蛋白酶K(6mg/L)+中性蛋白酶(4mg/L)处理显著降低了冠状病毒的病毒效价，对冠状病毒具有更显著的抑制作用。
表2冠状病毒的病毒效价检测结果
| 蛋白酶K(10mg/L) | 107.8TCID50/g | 103.9TCID50/g |
| 蛋白酶K(8mg/L)+中性蛋白酶(2mg/L) | 107.8TCID50/g | 102.9TCID50/g |
| 蛋白酶K(6mg/L)+中性蛋白酶(4mg/L) | 107.8TCID50/g | 102.4TCID50/g |
| 蛋白酶K(4mg/L)+中性蛋白酶(6mg/L) | 107.8TCID50/g | 103.5TCID50/g |
| 蛋白酶K(2mg/L)+中性蛋白酶(8mg/L) | 107.8TCID50/g | 104.5TCID50/g |
| 中性蛋白酶(10mg/L) | 107.8TCID50/g | 105.6TCID50/g |
实施例2蛋白酶K及蛋白酶K与中性蛋白酶组成的复合酶对非洲猪瘟病毒的抑制
1.蛋白酶K及蛋白酶K与中性蛋白酶组成的复合酶待测样品的配置
同实施例1。
2.复合酶处理对非洲猪瘟病毒的抑制作用
(1)复合酶与病毒共孵育：用DMEM培养基将复合酶稀释成不同浓度，将0.1mL ASFV原液(HAD50＝2×103/0.1mL)与等体积不同浓度待测样品混合，对照组为病毒和等体积的含10％FBS的MEM培养基混合液，于16℃分别作用1min、10min和30min后，再分别用含10％FBS的DMEM稀释1000倍；
(2)病毒接种细胞：然后将细胞培养板中培养液吸出，把上述稀释好的复合酶与病毒混合液按复合酶浓度大小分别依次加入相应96孔板孔中，每个浓度重复四孔，每孔0.2mL。对照组：阴性对照为含10％FBS的DMEM；阳性对照分为相同条件处理后的ASFV；病毒抑制剂对照为1000倍稀释的卫可消毒液(含10％FBS的DMEM稀释)。对照组的每孔加入量为0.2mL。然后置37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
(3)病毒抑制作用检测：采用qPCR检测病毒核酸CT值，采用红细胞吸附试验检测病毒的HAD50。
3.结果
结果如下表3所示，未加上述待测样品前，非洲猪瘟病毒悬液中病毒效价均为108.2TCID50/g；加入上述待测样品处理后1h，非洲猪瘟病毒悬液中病毒效价均降低，说明上述待测样品对非洲猪瘟病毒具有一定的抑制作用。其中，中性蛋白酶处理后病毒效价仅降低至105.5TCID50/g；而蛋白酶K处理后病毒效价降低至103.5TCID50/g；不同组成的蛋白酶K与中性蛋白酶复合酶处理后病毒效价分别降低至102.7TCID50/g、102.1TCID50/g、102.9TCID50/g、104.2TCID50/g；其中相较于蛋白酶K，蛋白酶K(8mg/L)+中性蛋白酶(2mg/L)及蛋白酶K(6mg/L)+中性蛋白酶(4mg/L)处理显著降低了非洲猪瘟病毒的病毒效价，对非洲猪瘟病毒具有更显著的抑制作用。
表3非洲猪瘟病毒的病毒效价检测结果
| 蛋白酶K(10mg/L) | 108.2TCID50/g | 103.5TCID50/g |
| 蛋白酶K(8mg/L)+中性蛋白酶(2mg/L) | 108.2TCID50/g | 102.7TCID50/g |
| 蛋白酶K(6mg/L)+中性蛋白酶(4mg/L) | 108.2TCID50/g | 102.1TCID50/g |
| 蛋白酶K(4mg/L)+中性蛋白酶(6mg/L) | 108.2TCID50/g | 102.9TCID50/g |
| 蛋白酶K(2mg/L)+中性蛋白酶(8mg/L) | 108.2TCID50/g | 104.2TCID50/g |
| 中性蛋白酶(10mg/L) | 108.2TCID50/g | 105.5TCID50/g |
实施例3蛋白酶K及蛋白酶K与中性蛋白酶组成的复合酶对口蹄疫病毒的抑制
1.蛋白酶K及蛋白酶K与中性蛋白酶组成的复合酶待测样品的配置
同实施例1。
2.复合酶处理对口蹄疫病毒的抑制作用
(1)复合酶与病毒共孵育：用MEM培养基将复合酶稀释成不同浓度，将0.1mL FMDV原液(TCID50＝1×106/0.1mL)与等体积不同浓度待测样品混合，对照组为病毒和等体积的含10％FBS的MEM培养基混合液，于16℃分别作用1min、10min和30min后，再分别用含10％FBS的MEM稀释1000倍；
(2)病毒接种细胞：然后将细胞培养板中培养液吸出，把上述稀释好的复合酶与病毒混合液按复合酶浓度大小分别依次加入相应96孔板孔中，每个浓度重复四孔，每孔0.2mL。对照组：阴性对照为含10％FBS的MEM；阳性对照分为同条件处理后的FMDV；病毒抑制剂对照为1000倍稀释的卫可消毒液(含10％FBS的MEM稀释)。对照组的每孔加入量为0.2mL。然后置37℃，5％CO2培养箱中培养48h。
(3)病毒抑制作用检测：采用qPCR检测病毒RNA的CT值，采用药典标准方法检测病毒的TCID50。
3.结果
结果如下表4所示，未加上述待测样品前，口蹄疫病毒悬液中病毒效价均为108.5TCID50/g；加入上述待测样品处理后1h，口蹄疫病毒悬液中病毒效价均降低，说明上述待测样品对口蹄疫病毒具有一定的抑制作用。其中，中性蛋白酶处理后病毒效价仅降低至105.8TCID50/g；而蛋白酶K处理后病毒效价降低至103.8TCID50/g；不同组成的蛋白酶K与中性蛋白酶复合酶处理后病毒效价分别降低至102.9TCID50/g、102.2TCID50/g、103.4TCID50/g、104.6TCID50/g；其中相较于蛋白酶K，蛋白酶K(8mg/L)+中性蛋白酶(2mg/L)及蛋白酶K(6mg/L)+中性蛋白酶(4mg/L)处理显著降低了口蹄疫病毒的病毒效价，对口蹄疫病毒具有更显著的抑制作用。
表4口蹄疫病毒的病毒效价检测结果
| 蛋白酶K(10mg/L) | 108.5TCID50/g | 103.8TCID50/g |
| 蛋白酶K(8mg/L)+中性蛋白酶(2mg/L) | 108.5TCID50/g | 102.9TCID50/g |
| 蛋白酶K(6mg/L)+中性蛋白酶(4mg/L) | 108.5TCID50/g | 102.2TCID50/g |
| 蛋白酶K(4mg/L)+中性蛋白酶(6mg/L) | 108.5TCID50/g | 103.4TCID50/g |
| 蛋白酶K(2mg/L)+中性蛋白酶(8mg/L) | 108.5TCID50/g | 104.6TCID50/g |
| 中性蛋白酶(10mg/L) | 108.5TCID50/g | 105.8TCID50/g |
上述结果表明，蛋白酶K及中性蛋白酶对上述冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒具有一定的抑制和杀灭效果，其中蛋白酶K对冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒具有良好的抑制和杀灭作用，能够显著降低病毒效价，可作为病毒抑制剂，用于制备治疗冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒感染的药物，也可用于制备动物饲料；而且由蛋白酶K和中性蛋白酶组成的复合酶对冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒均具有更显著的抑制和杀灭作用，能够显著降低病毒效价，且其效果显著优于同剂量的蛋白酶K及中性蛋白酶，可作为病毒抑制剂，用于制备治疗冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒感染的药物；也可用于制备动物饲料，具有广泛的应用前景。
序列表
<110> 百川开泰生物技术（北京）有限公司
<120> 蛋白酶K及其复合酶在制备病毒抑制剂中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcatcagc ttaaagagaa tcaaacaaat ttcctctcca aaaacgcgat tgcgcaatca 60
gaactctctg caccaaatga caaggctgtc aagcagtttt tgaaaaagaa cagcaacatt 120
tttaaaggtg acccttccaa aaggctgaag cttgttgaaa gcacgactga tgcccttgga 180
tacaagcact ttcgatatgc gcctgtcgtt aacggagtgc caattaaaga ttcgcaagtg 240
atcgttcacg tcgataaatc cgataatgtc tatgcggtca atggtgaatt acacaatcaa 300
tctgctgcaa aaacagataa cagccaaaaa gtctcttctg aaaaagcgct ggcactcgct 360
ttcaaagcta tcggcaaatc accagacgct gtttctaacg gagcggccaa aaacagcaat 420
aaagccgaat taaaagcgat agaaacaaaa gacggcagct atcgtcttgc ttacgacgtg 480
acgattcgct atgtcgagcc tgaacctgca aactgggaag tcttagttga cgccgaaaca 540
ggcagcattt taaaacagca aaataaagta gaacatgccg ccgccactgg aagcggaaca 600
acgctaaagg gcgcaactgt tcctttgaac atctcttatg aaggcggaaa atatgttcta 660
agagatcttt caaaaccaac aggcacccaa atcatcacat atgatttgca aaacagacaa 720
agccgccttc cgggcacgct tgtctcaagc acaacgaaaa catttacatc ttcatcacag 780
cgggcagccg ttgacgcaca ctataacctc ggtaaagtgt acgattattt ttattcaaac 840
tttaaacgaa acagctatga taacaaaggc agtaaaatcg tttcttccgt tcactacggc 900
actcaataca ataacgctgc atggacagga gaccagatga tttacggtga tggcgacggt 960
tcattcttct ctccgctttc cggctcatta gatgtgacag cgcatgaaat gacacatggc 1020
gtcacccaag aaacagccaa cttgatttat gaaaatcagc caggtgcatt aaacgagtct 1080
ttctctgacg tattcgggta ttttaacgat acagaagact gggacatcgg tgaagacatt 1140
acggtcagcc agcctgctct tcgcagcctg tccaacccta caaaatacaa ccagcctgac 1200
aattacgcca attaccgaaa ccttccaaac acagatgaag gcgattatgg cggtgtacac 1260
acaaacagcg gaattccaaa caaagccgct tacaacacca tcacaaaact tggtgtatct 1320
aaatcacagc aaatctatta ccgtgcgtta acaacgtacc tcacgccttc ttccacgttc 1380
aaagatgcca aggcagctct cattcagtct gcccgtgacc tctacggctc aactgatgcc 1440
gctaaagttg aagcagcctg gaatgctgtt ggattgtaa 1479
<210> 2
<211> 1167
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgagaaga gagaggctga agctgctcct gccgttgagc agagatccga agctgcacct 60
ctgattgaag ccagaggtga gatggttgcc aacaagtaca ttgtcaagtt caaggaggga 120
tctgccttgt ctgctctgga tgctgctatg gagaagattt ctggcaaacc agaccatgtc 180
tacaagaacg tcttctctgg attcgctgcc accttggatg agaacatggt tcgtgttcta 240
cgtgctcatc cagatgttga gtacattgaa caggatgctg ttgtcaccat caacgctgca 300
cagaccaacg ctccttgggg attggctaga atctcctcta cctcaccagg tacctctacc 360
tactactatg acgaatctgc aggtcaaggt tcctgcgtct acgtgattga cactggtatt 420
gaagcctctc atccagagtt cgaaggtaga gcccagatgg tcaagaccta ctatgcttcc 480
tctcgtgatg gtaacggtca cggcactcac tgcgctggta ctgttggctc cagaacctac 540
ggtgttgcca agaagactca aatcttcggt gtcaaagttc tggatgacaa cggctctggt 600
cagtactcta ccatcattgc tggtatggac ttcgttgcct ctgaccataa caatcgtaac 660
tgtcctaaag gtgtcgttgc ctccttgtct ctaggtggag gttactcctc ttcagtcaac 720
tctgctgcag ccagattgca atcctctggt gtcatggttg ctgtcgctgc aggtaacaac 780
aatgctgatg ccaggaacta ctctccagcc tctgaacctt ctgtctgcac tgttggtgct 840
actgacagat acgaccgtag atcctcattc tccaactacg gatctgttct ggacatcttc 900
gctcctggta cctctatctt gtccacctgg attggtggtt ccacaagatc catctctggt 960
acctctatgg ctactccaca cgttgctgga ttggctgcct acttgatgac tctgggtcgt 1020
actactgctg ccaatgcttg cagatacatt gccgacactg ccaacaaagg cgacttatcc 1080
aacattccat tcggtactgt caacttgctg gcttacaaca actaccaagc tcaccatcac 1140
caccatcact aatgagaatt cgctagc 1167
Claims (5)
1.蛋白酶K在制备抑制病毒复制或抑制病毒感染的试剂中的应用；所述蛋白酶K的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述病毒为冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒。
2.一种蛋白酶复合酶，其特征在于，所述蛋白酶复合酶包括蛋白酶K和中性蛋白酶，所述蛋白酶K和中性蛋白酶的重量比为：6-8：4-2；所述蛋白酶K的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述中性蛋白酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求2所述的蛋白酶复合酶，其特征在于，所述蛋白酶K和中性蛋白酶的重量比为：6：4。
4.如权利要求2-3任一所述的蛋白酶复合酶在制备抑制病毒复制或抑制病毒感染的试剂中的应用；所述病毒为冠状病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒。
5.如权利要求2-3任一所述的蛋白酶复合酶在制备动物饲料中的应用。
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-
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|---|
| 蛋白酶对水环境中病毒的灭活作用;吕文洲;环境科学;第25卷(第5期);第93-96页 * |
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