CN111138523A - 一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法 - Google Patents
一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111138523A CN111138523A CN201911255550.7A CN201911255550A CN111138523A CN 111138523 A CN111138523 A CN 111138523A CN 201911255550 A CN201911255550 A CN 201911255550A CN 111138523 A CN111138523 A CN 111138523A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chicken interferon
- solution
- recombinant chicken
- interferon
- renaturation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,属于生物技术领域,其工艺流程包括重组鸡干扰素α复性液预处理、阳离子交换层析、及镍亲和层析。其特征在于重组鸡干扰素α复性液预处理:调节原液PH至3.0‑3.5。透析液体积/复性液体积=40,透析时间12‑18h,透析在4℃环境下进行。阳离子交换层析洗脱速度为80‑100μg/mL。镍柱亲和层析:上样前,将阳离子交换层析洗脱液调节PH用1M NaOH调节至PH 7.平衡液PBS配比为:20mM NaH2PO4,0.5M NaCl,pH 7.4。洗脱液为PH 7.0,浓度500mM咪唑。洗脱速度为50‑100μg/mL。本发明方法制备的重组鸡干扰素α纯度>99.0%,内毒素<100EU/mL,生物学活性保持在纯化前的99%以上。在显著提升干扰素纯度以及明显去除内毒素的同时,很好的保持其生物学活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法。
背景技术
干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的糖蛋白,通过抑制病毒DNA 和RNA的复制达到预防和治疗效果。1957年自Isaacs和Lindenmann发现干扰素以来,干扰素已经显示出了极强的抗病毒、免疫调节活性和广阔的应用前景。由于干扰素具有强大的抗病毒作用,目前有许多研究报道用于治疗家禽病毒性疾病。大量研究结果表明,重组鸡干扰素α在用于防治鸡禽流感、传染性法氏囊炎、传染性支气管炎等病毒性疾病时,具有显著的抗病毒效果。重组鸡干扰素是采用基因工程技术将动物体内天然干扰素基因亚克隆入原核表达载体,继而转入受体细胞,构建工程菌。通过工程菌发酵表达,分离纯化等步骤最终获得的高纯度干扰素产品。
重组鸡干扰素α采用大肠埃希菌作为表达系统进行发酵生产,在纯化前必须通过高压匀浆、超生破碎等方法将工程菌破壁,以释放蛋白,然后对包涵体蛋白进行变性溶解、再复性,因此大量的杂蛋白包括其他小分子杂质会存于复性液中,同时,细胞壁内的脂多糖也大量释放到缓冲液中,达到几万到几十万EU/mL的内毒素,这是重组鸡干扰素α溶液中杂蛋白及内毒素的主要来源。
通用的内毒素去除方法。水溶液中去除内毒素的方法通常有超滤、活性炭吸附、化学降解和柱层析法等,各有优缺点,由于内毒素来源和工艺的多样性,在重组蛋白的内毒素去除时常采用多个工艺过程的结合。
发明内容
本发明的目的是提供一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,以保证产品生物活性的同时,提高纯度、去除其内毒素,提升产品质量指标。
本发明主要通过对复性液预处理(pH调节、透析等)、离子交换层析、亲和柱层析组合的方法,使内毒素在蛋白纯化过程中逐步被去除的同时,最大限度的提高其生物活性回收率,提高收益,降低成本。最终使内毒素含量及蛋白纯度达到质量标准。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案是:一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,包括如下步骤:
(1)重组鸡干扰素α复性液预处理:调节所述重组鸡干扰素α复性液原液 pH至2.8-3.2,用35-50倍重组鸡干扰素α复性液体积、浓度为15-25mM的磷酸盐缓冲液,使用截留分子量为7KD的透析袋透析12-18h,经离心弃沉淀,得上清;
(2)阳离子交换层析:①平衡:阳离子柱子用0.015M-0.025M磷酸盐缓冲液平衡;②上样:将所述步骤(1)的上清进行上样;③淋洗:0.015M-0.025M磷酸盐缓冲液淋洗平衡;④洗脱:用浓度为0.5M-1M NaCl、0.015M-0.025M磷酸盐缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;
(3)镍柱亲和层析:①平衡:将镍-琼脂糖凝胶FF柱用20mM PBS进行平衡;②上样:将阳离子交换层析洗脱液调节PH至6.5-7.5,然后将所述步骤(2) -④的洗脱液进行上样;③再平衡:用20mM PBS进行再平衡;④洗脱:用6.5-7.5,浓度为500mM咪唑,以50-100μg/mL的流速进行洗脱,收集洗脱液,得到重组鸡干扰素α纯化品。
优选地,所述步骤(1)中,磷酸盐缓冲液为浓度为15-25mM的NaH2PO4溶液。
优选地,所述步骤(1)中,所述磷酸盐缓冲液的pH 2.8-3.2。
优选地,所述步骤(1)中,所述透析的温度条件为:4℃-8℃。
所述步骤(1)中,前期预处理直接决定了层析效果,通过透析出去小分子杂质,提高层析后的回收率,并且使重组鸡干扰素α复性液呈现澄清,避免后续处理堵塞层析柱。
重组鸡干扰素α复性液原液的pH以及磷酸盐缓冲液的浓度和pH控制,有效防止了复性液中有效蛋白的析出,显著提高了蛋白的回收率和活性。而在不调节重组鸡干扰素α复性液原液的pH的情况下(原始PH为8.5左右)直接进行透析,过程中有大量沉淀物析出,蛋白含量丢失率高达50%以上。本重组鸡干扰素α在pH2.8-3.2条件下蛋白稳定性最好,并且小于其等电点,保证了后续阳离子交换层析时与层析柱的高效结合。为了减少复性中小分子物质对层析的影响。
优选的,所述步骤(1)中,调节所述重组鸡干扰素α复性液原液pH至3.0。
本发明中,重组鸡干扰素α在pH3.0条件下蛋白稳定性更优。
优选地,所述步骤(1)中,磷酸盐缓冲液体积为重组鸡干扰素α复性液体积的40倍,透析时间12-16h。复性体积和时间都非常重要,直接决定了透析是否成功,如果透析失败,后续层析纯化都必然失败,而透析体积和时间决定了最终透析后的液体中的小分子或盐类物质浓度不影响后续层析柱的吸附效果。
优选地,所述步骤(1)中,离心条件为:9000r/min,离心20min。
所述步骤(2)中,由于内毒素分子带负电,通过重组鸡干扰素α复性液预处理后重组鸡干扰素α带正电,所以选用阳离子交换层析能够很好的将内毒素分子与重组鸡干扰素α分开,达到初次分离的目的。
优选地,所述步骤(2)中,磷酸盐缓冲液为NaH2PO4溶液。
优选的,所述步骤(2)①平衡、③淋洗、④洗脱中,磷酸盐缓冲液pH为 6.0。
优选的,所述步骤(2)-①中,所述平衡具体为:阳离子柱子用0.02M,pH6.0 磷酸盐缓冲液平衡3-4个柱体积。
优选的,所述步骤(2)-③中,所述淋洗具体为:0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液淋洗脱3-4个柱体积。
优选的,所述步骤(2)-④中,用浓度为1M NaCl、0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液。
在该优选条件下,蛋白在层析柱理化性质更加稳定,在保证洗脱效率的同时,最终的蛋白回收率最好。
优选的,所述步骤(2)-④中,所述洗脱的流速为80-120μg/mL。
更优选的,所述步骤(2)-④中,阳离子交换层析洗脱速度为100μg/mL。
本发明对于洗脱速度优选设定为100μg/mL,其中,洗脱太慢影响效率,过快也不合适,可能洗脱不完全。
所述步骤(3)中,经过(2)的初步分离于纯化,一些非特异性结合蛋白可能存在,由于本重组鸡干扰素α蛋白含有6个his便签,所以选用镍柱进一步纯化蛋白、分离内毒素,达到精纯。
优选的,所述步骤(3)中,所述PBS组成为:20mM NaH2PO4,20mM咪唑, 0.5M NaCl,pH7.0-7.5。
优选的,所述步骤(3)-①中,平衡:所述PBS的体积用量为2-5个柱体积的。
优选的,所述步骤(3)-②中,将阳离子交换层析洗脱液调节至PH 7.0。
优选的,所述步骤(3)-③中,所述PBS的体积用量为2-5个柱体积。
优选的,所述步骤(3)-④中,洗脱液为PH 7.0,浓度500mM咪唑,洗脱速度为100μg/mL。
结合镍柱特性,挂柱必须在中性或弱碱性条件下,再结合干扰素产品要求(PH7.0)。所以需调节至7.0,咪唑浓度、洗脱速度直接影响的是洗脱后产品的纯度和回收率。
所述步骤(3)①平衡和④洗脱中,咪唑浓度的确定特设置为低浓度,主要是利用低浓度咪唑进行平衡,防止非特异性结合。
本发明的另一目的是提供由上述提取方法获得的重组鸡干扰素α纯化品。
所述重组鸡干扰素α的分子量大小为19kd。
经测定,重组鸡干扰素α脱毒纯化品的蛋白纯度>99.0%;内毒素去除率>99.0%。生物学活性保持原液的99%以上(通过生物学活性测定与原液比较)。
有益效果:
本法明通过对重组鸡干扰素α复性液纯化并去内毒素,获得了蛋白纯度>99.0%;内毒素去除率>99.0%。生物学活性保持原液的99%以上(通过生物学活性测定与原液比较)。
(1)重组鸡干扰素α复性液预处理:
本发明通过调控重组鸡干扰素α复性液在pH2.8-3.2条件下,使得其具有良好的蛋白稳定性,并且小于其等电点,保证了后续阳离子交换层析时与层析柱的高效结合。为了减少复性中小分子物质对层析的影响。而忽略对于调控重组鸡干扰素α复性液的控制,则会产生不同程度的沉淀,同时有效防止了复性液中有效蛋白的析出,显著提高了蛋白的回收率和活性。
本发明对于透析体积和时间的掌握,显著提高了透析效果,有效过滤掉了小分子物质,同时避免了小分子或盐类物质浓度不影响后续层析柱的吸附效果。
(2)阳离子交换层析:根据干扰素原液的等电点、内毒素带电情况及pH 选择的方法,在吸附干扰素蛋白的同时,内毒素分子不被吸附,可以透过层析柱,再通过平衡、洗脱得到干扰素蛋白。
(3)镍柱亲和层析:通过镍柱和干扰素目的标签特异性亲和结合,可以将目的蛋白和杂蛋白分离开。而且可以进一步去除内毒素分子,获得高纯度干扰素。
经过步骤(2)的初步分离与纯化,一些非特异性结合蛋白可能存在,由于本重组鸡干扰素α蛋白含有6个his便签,所以选用镍柱进一步纯化蛋白、分离内毒素,达到精纯。
本步骤中,咪唑浓度的确定特设置为低浓度,主要是利用低浓度咪唑进行平衡,防止非特异性结合。
附图说明
图1为蛋白的检测结果,其中,1.Maker,2.镍柱洗脱液,3.阳离子柱洗脱液, 4.透析后原液,5.透析前原液。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
以下发明实施例中所用的重组鸡干扰素α复性液为前期已经通过基因工程方法构建的重组菌经过发酵、离心、破碎、变性及复性所得(重组鸡干扰素α复性液来源于申请号为201410755900.7的发明专利《重组鸡干扰素α及其制备方法》说明书56-77段,基因工程菌的构建和表达以及说明书78-86段重组鸡干扰素α的发酵工艺)。
实施例1重组鸡干扰素α复性液中重组鸡干扰素α的纯化、内毒素的去除
(1)重组鸡干扰素α复性液预处理:
重组鸡干扰素α复性液预处理:取重组鸡干扰素α复性液200ml(重组鸡干扰素α的初始纯度为90.5%,内毒素含量>10000EU/mL,蛋白含量为453.2μg/mL,生物学活性为7.0×108IU/mg),用1.0M HCl和1.0M NaOH调节原液PH至3.0;
用8000mL(重组鸡干扰素α复性液40倍体积),PH 3.0,浓度为20mM的 NaH2PO4磷酸盐缓冲液作为透析液,并使用截留分子量为7KD的透析袋进行透析 16h,然后,以9000r/min,离心20min,弃沉淀,取上清。测定其蛋白含量为 450.8μg/mL,测得蛋白总量为90.2mg,透析过程蛋白回收率达99.5%;
其中,透析的温度条件为:4℃-8℃。
(2)阳离子交换层析:选北京博尔西科5mL预装阳离子柱(CM)
①平衡:用20ml 0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液平衡。②上样:原液透析离心后上样,总上样量为:450.8μg/mL×200mL=90.2mg。③淋洗:20mL0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液淋洗衡。④用浓度为0.5M NaCl、0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液,100μg/mL速度进行洗脱,紫外检测至OD280无吸收为洗脱完全,收集洗脱液130mL,蛋白浓度0.659mg/mL;总蛋白:85.67mg,回收率:85.67mg/90.2mg=95.0%。测定其纯度为95.7%,内毒素含量<200EU/ml,内毒素去除率>80%;
其中,步骤(2)中,磷酸盐缓冲液均为NaH2PO4溶液。
(3)镍柱亲和层析:选北京博尔西科5mL预装阳离子柱
①平衡:用20mL的20mM PBS(20mM NaH2PO4,20mM咪唑,0.5M NaCl, pH 7.4)进行平衡。②上样:将阳离子交换层析洗脱液用1M NaOH调节PH至 7.0,然后上样,总上样量为85.67mg。③再平衡:再用20mL的20mM PBS(20mM NaH2PO4,20mM咪唑,0.5M NaCl,pH 7.4,进行再平衡。④洗脱:用PH 7.0,浓度为500mM咪唑,以50μg/mL速度进行洗脱,紫外检测至OD280无吸收为洗脱完全。
共收集洗脱液37mL,蛋白浓度为2.21mg/mL,总蛋白:81.77mg,回收率:81.77mg/85.67mg=95.4%。测定其蛋白纯度为99.8%,内毒素含量<100EU/ml, 内毒素去除率>99.0%。通过细胞病变抑制法测定其生物学活性为:
7.8×1011IU/mg,生物学活性保持原液的99%以上(通过生物学活性测定与原液比较)
实施例2重组鸡干扰素α复性液中重组鸡干扰素α的纯化、内毒素的去除
(1)重组鸡干扰素α复性液预处理:
重组鸡干扰素α复性液预处理:取重组鸡干扰素α复性液200ml(重组鸡干扰素α的初始纯度为90.5%,内毒素含量>10000EU/mL,蛋白含量为453.2μg/mL,生物学活性为7.0×108IU/mg),用1.0M HCl和1.0M NaOH调节原液PH至3.2;
用9000mL(重组鸡干扰素α复性液45倍体积),PH 3.3,浓度为24mM的 NaH2PO4磷酸盐缓冲液作为透析液,并使用截留分子量为7KD的透析袋进行透析 12h,然后,以9000r/min,离心20min,弃沉淀,取上清。测定其蛋白含量为 451.9μg/mL,测得蛋白总量为90.4mg,透析过程蛋白回收率达99.7%;
其中,透析的温度条件为:4℃-8℃。
(2)阳离子交换层析:选北京博尔西科5mL预装阳离子柱(CM)
①平衡:用20ml 0.025M的磷酸盐缓冲液平衡。②上样:原液透析离心后上样, 总上样量为:451.9μg/mL×200mL=90.4mg。③淋洗:20ml 0.025M的磷酸盐缓冲液淋洗衡。④用浓度为0.6M NaCl、0.025M磷酸盐缓冲液,120μg/mL速度进行洗脱,紫外检测至OD280无吸收为洗脱完全,收集洗脱液130mL,蛋白浓度 0.662mg/mL;总蛋白:86.06mg,回收率:86.06mg/90.4mg=95.2%。测定其纯度为9.62%,内毒素含量<200U/ml,内毒素去除率>80%;
其中,步骤(2)中,磷酸盐缓冲液均为NaH2PO4溶液。
(3)镍柱亲和层析:选北京博尔西科5mL预装阳离子柱
①平衡:用20mL的20mM PBS(20mM NaH2PO4,20mM咪唑,0.5M NaCl, pH 7.4)进行平衡。②上样:将阳离子交换层析洗脱液用1M NaOH调节PH至 7.0,然后上样,总上样量为86.06mg。③再平衡:再用20mL的20mM PBS(20mM NaH2PO4,20mM咪唑,0.5M NaCl,pH 7.4,进行再平衡。④洗脱:用PH 7.5,浓度为500mM咪唑,以60μg/mL速度进行洗脱,紫外检测至OD280无吸收为洗脱完全。
共收集洗脱液38mL,蛋白浓度为2.16mg/mL,总蛋白:82.02mg,回收率: 82.02mg/86.06mg=95.3%。测定其蛋白纯度为99.5%,内毒素含量<100EU/ml, 内毒素去除率>99.0%。通过细胞病变抑制法测定其生物学活性为:7.6×1011 IU/mg,生物学活性保持原液的99%以上(通过生物学活性测定与原液比较)
实施例3重组鸡干扰素α复性液中重组鸡干扰素α的纯化、内毒素的去除
(1)重组鸡干扰素α复性液预处理:
重组鸡干扰素α复性液预处理:取重组鸡干扰素α复性液200ml(重组鸡干扰素α的初始纯度为90.5%,内毒素含量>10000EU/mL,蛋白含量为453.2μg/mL,生物学活性为7.0×108IU/mg),用1.0M HCl和1.0M NaOH调节原液pH至3.0;
用8000mL(重组鸡干扰素α复性液40倍体积),pH 3.0,浓度为20mM的 NaH2PO4磷酸盐缓冲液作为透析液,并使用截留分子量为7KD的透析袋进行透析 18h,然后,以9000r/min,离心20min,弃沉淀,取上清。测定其蛋白含量为 452.3μg/mL,测得蛋白总量为90.5mg,透析过程蛋白回收率达99.8%;
其中,透析的温度条件为:4℃-8℃。
(2)阳离子交换层析:选北京博尔西科5mL预装阳离子柱(CM)
①平衡:用20ml 0.015M磷酸盐缓冲液平衡。②上样:原液透析离心后上样, 总上样量为:452.3μg/mL×200mL=90.5mg。③淋洗:20mL0.0015M磷酸盐缓冲液淋洗衡。④用浓度为1M NaCl、0.025M磷酸盐缓冲液,80μg/mL速度进行洗脱,紫外检测至OD280无吸收为洗脱完全,收集洗脱液130mL,蛋白浓度0.669 mg/mL;总蛋白:86.98mg,回收率:86.98mg/90.5mg=96.1%。测定其纯度为 95.9%,内毒素含量<200EU/ml,内毒素去除率>80%;
其中,步骤(2)中,磷酸盐缓冲液均为NaH2PO4溶液。
(3)镍柱亲和层析:选北京博尔西科5mL预装阳离子柱
①平衡:用20mL的20mM PBS(20mM NaH2PO4,20mM咪唑,0.5M NaCl, pH 7.4)进行平衡。②上样:将阳离子交换层析洗脱液用1M NaOH调节PH至 7.5,然后上样,总上样量为86.98mg。③再平衡:再用20mL的20mM PBS(20mM NaH2PO4,20mM咪唑,0.5M NaCl,pH 7.4,进行再平衡。④洗脱:用PH 7.5,浓度为500mM咪唑,以100μg/mL速度进行洗脱,紫外检测至OD280无吸收为洗脱完全。
共收集洗脱液35mL,蛋白浓度为2.42mg/mL,总蛋白:84.71mg,回收率: 84.71mg/86.98mg=97.4%。测定其蛋白纯度为99.8%,内毒素含量<100EU/ml, 内毒素去除率>99.0%。通过细胞病变抑制法测定其生物学活性为: 7.9×1011IU/mg,生物学活性保持原液的99%以上(通过生物学活性测定与原液比较)
对比例1不同提取工艺对于重组鸡干扰素α复性液中蛋白提取率、内毒素去除率的影响
(1)重组鸡干扰素α复性液预处理(制备方法同实施例1):
重组鸡干扰素α复性液预处理:取重组鸡干扰素α复性液200ml(重组鸡干扰素α的初始纯度为90.5%,内毒素含量>10000EU/mL,蛋白含量为453.2μg/mL,生物学活性为7.0×108IU/mg);
用1.0M HCl和1.0M NaOH调节原液PH至3.0,用8000mL(重组鸡干扰素α复性液40倍体积),PH 3.0,浓度为20mM的NaH2PO4磷酸盐缓冲液作为透析液,并使用截留分子量为7KD的透析袋进行透析16h,然后,以9000r/min,离心20min,弃沉淀,取上清。测定其蛋白含量为450.8μg/mL,透析过程蛋白回收率达99.5%;其中,透析的温度条件为:4℃-8℃。
(2)镍柱亲和层析:选北京博尔西科5mL预装阳离子柱(同实施例1的步骤(3))
①平衡:用20mL的20mM PBS(20mM NaH2PO4,20mM咪唑,0.5M NaCl, pH 7.4)进行平衡。②上样:将透析离心后上清液液用1M NaOH调节PH至7.0,然后上样,总上样量为85.67mg。③再平衡:再用20mL的20mM PBS(20mM NaH2PO4,20mM咪唑,0.5M NaCl,pH 7.4,进行再平衡。④洗脱:用PH 7.0,浓度为500mM咪唑,以50μg/mL速度进行洗脱,紫外检测至OD280无吸收为洗脱完全。
共收集洗脱液45mL,蛋白浓度为1.82mg/mL,总蛋白:81.72mg,回收率: 81.72mg/90.2mg=90.6%。测定其蛋白纯度为95.8%,内毒素含量<500EU/ml,内毒素去除率>95.0%。通过细胞病变抑制法测定其生物学活性为:6.8×1011IU/mg,生物学活性保持原液的99%以上(通过生物学活性测定与原液比较)
对应技术效果:与本发明实施例1、2、3相比可见,对比例1在不经过阳离子层析步骤时,对照组虽然在生物学活性保持原液的99%以上,但其内毒素去除率仅为95%,蛋白纯度仅仅为95.8%,均低于实验组。
本发明实施例通过调控重组鸡干扰素α的pH控制(即控制重组鸡干扰素α复性液原液pH至2.8-3.2,并配合透析过程中磷酸盐缓冲液的pH控制,pH 2.8-3.2),使重组鸡干扰素α带正电,而内毒素分子带负电,所以再通过阳离子交换层析时,干扰素可以通过离子交换吸附在层析柱凝胶介子上,而带负电的内毒素分子不能被吸附,这样可以在高效分离重组鸡干扰素α和内毒素分子。
上文实施例和对比例以及下文中涉及蛋白浓度、蛋白重量、内毒素测定方法、生物学活性用细胞病变抑制法的数据的测定方法具体为:
所述蛋白浓度和蛋白重量的测定方法人用干扰素蛋白含量测定方法的Lowry 法(中国药典2015);
所述内毒素测定方法为参照《中华人民共和国兽药典》2015一部附录"细菌内毒素检测法"进行检验;
生物学活性用细胞病变抑制法,方法参照于中国药典2015。
详见以下是测定方法:
(1)Lowry法
人用干扰素蛋白含量测定方法的Lowry法,最终确立了Lowry法作为重组鸡干扰素α的定量方法。
1.1试验材料,见表1
表1蛋白质含量测定试验材料一览表
1.2试验方法
1)缓冲液配制与标准蛋白稀释
(1)0.1mol/L酒石酸钾溶液
(2)0.04mol/L硫酸铜溶液
(3)4%碳酸钠溶液
(4)0.8%氢氧化钠溶液
(5)碱性铜溶液
量取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液各0.5mL,4%碳酸钠溶液与0.8%氢氧化钠溶液各25mL,摇匀,即得。本液临用配制。
(6)100μg/mL BSA
标准蛋白溶液的制备用水将蛋白标准品定量稀释至每1mL含1mg,作为储备液。精密量取储备液2.5mL置25mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即为每1mL含100μg的标准蛋白质溶液。
2)测定法
精密量取标准蛋白溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分别置于试管中,加水至1mL,加碱性铜溶液5mL,摇匀,室温放置10分钟,快速加入酚试剂0.5mL摇匀,室温放置30分钟,显色后,紫外-可见分光光度法在波长 650nm处测定吸光度(呈色后,如果发现浑浊,经每分钟3000转离心15分钟后,取上清液测定)。准确量取与供试品等量的供试品溶解液置试管内,加水至1mL,自“加碱性铜溶液5mL”起,同法操作,作为空白对照。每个浓度测定三个重复,将三个重复结果中与另外两个差距较大的排除后取平均值即为最后吸光度值。
(2)细菌内毒素检查法
1、检验规程
1.1技术依据与原理
细菌内毒素在钙离子,镁离子参与下,激活鲎试剂中c因子,活化的c因子激活b因子,活化的b因子激活凝固酶原生成凝固酶,促使凝固蛋白原生成凝固蛋白,在支联酶作用下形成凝胶。利用鲎试剂产生凝集反应来检测或定量内毒素的方法。
1.2材料
1.2.1试剂
供试品:重组鸡干扰素α(注射液),由天津生机集团股份有限公司提供。
细菌内毒素检查用水:内毒素含量小于0.003EU/mL且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水,购自堪江安度斯生物有限公司。
细菌内毒素工作标准品:购自堪江安度斯生物有限公司,每支10EU。
鲎试剂:购自堪江安度斯生物有限公司,0.5mL/支。(λ=0.25EU/mL)
1.2.2主要仪器设备
旋涡混合器、封口膜、试管(10mm×75mm)、吸管、摄子(金属)、金属盒等等。
实验中使用的所有玻璃器具经常规洗液浸泡后,取出再用自来水、纯化水依次冲洗干净(可用纯化水浸泡),备用。
试验中所用的器皿,需要经过250℃干烤30分钟以上备用,以除去外源性内毒素。除去外源性力毒素的玻璃器皿应在规定期限内使用(如果玻璃器皿用锡箔纸包装,在不打开包装的情况下可在两周内使用),否则须再次处理,以防可能存在的外源性内毒素污染。
1.3具体检测内容及方法
1.3.1确定细菌内毒素限值
按照公式L=K/M计算。M为每公斤每小时临床最大用药剂量,依据药品使用说明书确定,注射时间若不足1小时,按1小时计算。K为每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/(Kg·h)表示,人生物制品注射剂K=5EU/(Kg·h)
本室重组鸡干扰素α按效价计算:每公斤每小时临床最大用重组鸡干扰素α剂量2×106IU(每瓶用于1000只鸡(每只鸡按照0.5g体重计算),L为 5EU/2×106IU=2.5×10- 6EU/单位,每支重组鸡干扰素α成品1.0×109IU,则每支重组鸡干扰素α内毒素限值为2500EU。
1.3.2确定最大有效稀释倍数(MVD)
最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数(MVD),在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定 MVD:MVD=CL/λ
其中L为供试品的细菌内毒素限值:c为供试品溶液的浓度,λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/mL),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
本产品重组鸡干扰素α注射液为液体制剂,MVD=c l/λ,其中c为1,l为 250EU/mL,λ为0.25EU/mL,MVD=c l/λ=1000。
1.3.3鲎试剂灵敏度复核试验
在本检查法规定的条件下,使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ML标示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时,应进行鲎试剂灵敏度复核试龄。
根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成 2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液,每稀释一步应在旋涡混合器上混匀30秒。取复溶后的0.1mL/支规格的鲎试剂原安瓶18支,其中16管分别加入0.1mL不同浓度的内毒素标准溶液,每一个内毒素浓度平行做4管;另外2 管加入0.1mL细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入(37±1)℃的恒温器中,保温(60±2)分钟。
当最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0.25λ管均为阴性,阴性对照管为阴性,试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值,即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)
λc=lg-1(∑X/4)
式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
需要注意的是,当实测灵敏度诚0.5λ~2λ(包括0.5λ~2.0λ,λ为鲎试剂灵敏的标示值)时,方可用子细菌内毒素检查,并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度(结果见表2-3)。
1.3.4干扰试验预试验
取一支重组鸡干扰素α产品。按照拟定内毒素限值,加内毒素检查用水稀释至不超过MVD规定的系列稀释度:1:100、1:200、1:400、1:800、1:1000。使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验,每一稀释倍数下做2支供试品管和4支供试品阳性对照(即含2.0λ和0.25λ浓度标准内毒素的该浓度的供试品稀释液);
预试验结果判断:
当阴性对照为阴性,阳性对照为阳性时,实验为有效;当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性,供试品阳性对照2管为阳性时,供试品阳性对照0.25λ管均为阴性时,认为供试品在该浓度下不干扰实验,此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。
即可选择该稀释倍数和相邻浓度进行正式干扰实验。
1.3.5干扰试验
重组鸡干扰素α产品1:800稀释,按表2制备各系列溶液。参照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作,记录供试液的干扰情况。
表2凝胶法干扰试验溶液的制备
1.3.6细菌内毒素检测
取重组鸡干扰素α产品,取鲎试剂,每支加入0.5mL细菌内毒素检测用水溶解,从中取1支加入0.1mL 2λ的细菌内毒素标准品作为阳性对照,1支加入 0.1mL细菌内毒素检测用水作为阴性对照,其余每2支作平行加入各稀释度的重组鸡干扰素α溶液0.1mL。将试管中溶液轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入 (37±1)℃的恒温器中,保温(60±2)min后观察结果。
1.4结果与观察
1.4.1干扰试验结果
观察该结果时,只有当重组鸡干扰素α溶液(A)和阴性对照溶液(D)的平行管都为阴性且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时,试验方为有效,计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。当Es在0.5λ~2λ(包括0.5λ和 2λ)及Et在0.5Es~2Es(包括0.5Es和2Es)时,认为供试品在该浓度下无干扰作用.若重组鸡干扰素α溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰,应将重组鸡干扰素α溶液进行不超过MVD的进一步稀释,再重复干扰试险。本实验结果表明重组鸡干扰素α产品溶液1:800稀译对鲎试剂检测无干扰。
当进行新药的内毒素检查试验前或无内巧素检查项的品种建立内毒素检査法时,须进行干扰试验,当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时,须重新进行干扰试验。
1.4.2细菌内毒素检测结果判定
凝胶限度试验按表3制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除的供试品溶液来制备A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表3凝胶限度试验溶液的制备
注:A为供试品溶液;B为供试品阳性对照;C为阳性对照;D为阴性对照
结果判断保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性,阳性对照溶液C的平行管均为阳性,试验有效。
若溶液A的两个平行管均为阴性,判定供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性,判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性,另一管为阴性,需进行复试,复试时,溶液A需做4支平行管,若所有平行管均为阴性,则判定供试品符合规定;否则判定供试品不符合规定。
(3)细胞病变抑制法
1、检验规程
1.1技术依据与原理
本检测方法根据重组鸡干扰素α可以保护鸡胚成纤维细胞(CEF)免受水泡性口炎病毒(Vesicμlar Stomatitis Virus,VSV)的侵害作用的原理,以干扰素抑制病毒致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)现象作为检测其活性的方法。即以每毫升干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50%)免受病毒攻击的稀释度的倒数定为干扰素单位(或称效价),常以国际单位(IU)表示,并用国家标准品校正结果。该结果经用结晶紫染料对存活CEF细胞染色,然后用脱色液脱色后,用酶标仪以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果,按 Reed-Munch法计算出所测定干扰素的生物学活性。
1.2材料、仪器、试剂的制备及基本要求
1.2.1材料
1、SPF鸡胚:够自有实验动物生产许可证资质的单位。
2、水泡性口炎病毒(VSV):购自中国食品药品检定研究院,按照《重组鸡干扰素α注射液制造及检验试行规程(草案)》检测合格后使用。其在CEF上的TCID50 应≥5.0×105/0.1mL。
3、重组人干扰素标准品又称标化干扰素:重组人干扰素α2b国家标准品,购自中国食品药品检定研究院。
1.3仪器
酶标仪、生物安全柜、净化工作台、二氧化碳培养箱、正置显微镜、倒置显微镜等。
1.4试剂
1.4.1 DMEM培养液
取DMEM培养基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至1000mL,加青霉素105IU和链霉素105IU,再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存。
1.4.2完全培养液
量取新生牛血清10mL,加DMEM培养液90mL。4℃保存。
1.4.3测定培养液
量取新生牛血清7mL,加DMEM培养液93mL。4℃保存。
1.4.4攻毒培养液
量取新生牛血清3mL,加MEM或RPMI 1640培养液97mL。4℃保存。
1.4.5消化液
取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g,加水溶解并稀释至1000mL,经121℃15分钟灭菌。
1.4.6染色液
取结晶紫50mg,加无水乙醇20mL溶解后,加水稀释至100mL,即得。
1.4.7脱色液
取无水乙醇50mL、乙酸0.1mL,加水稀释至100mL。
1.4.8PBS
取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000mL,经121℃15分钟灭菌。
1.5主要操作步骤
1.5.1标准品溶液的制备
取重组人干扰素α2b国家标准品,按说明书复溶后,用营养液稀释至每lmL 含10000IU,在96孔细胞培养板中做4倍梯度稀释,每个稀释度做复孔,共做 10个稀释度(1-10孔)。
1.5.2供试品溶液的制备
将供试品溶液用测定培养液稀释至蛋白含量约0.1mg/mL,然后在96孔细胞培养板中,从1:100开始依次做4倍梯度稀释,每个稀释度做复孔,共做10个稀释度(1~10孔)。
1.5.3测定法
取孵育10日龄发育良好的SPF鸡胚。参照《中国兽药典》三部中“细胞单层制备法”中“鸡胚成纤维(CEF)单层的制备”方法进行制备鸡胚成纤维细胞,用完全培养液配制成每1mL含5.0×105~6.0×105个细胞的细胞悬液。
CEF细胞在培养条件下呈贴壁生长状态。常规下细胞按1:2~1:4传代,每周2~3次,于营养液中生长。具体操作简述为:将长满单层细胞瓶内培养液弃去,用PBS洗2次后消化和收集细胞,将5.0×105~6.0×105个细胞的细胞悬液接种于96孔细胞培养板中,每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24 小时。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种CEF细胞的培养板中,每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒(Vesicμlar StomatitisVirus,VSV)(-70℃保存)用攻毒培养液稀释至约100TCID50,每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳培养24小时第11号孔为病毒对照,不加干扰素保护,加病毒攻击;第12号孔为细胞对照,不加干扰素保护,也不加病毒攻击。
1.5.4结果观察
每隔24h培养物置倒置显微镜下观察。首先观察"细胞对照孔"和“病毒对照孔”,镜检病毒对照孔可见细胞圆缩脱落而细胞对照孔正常。然后弃去细胞培养板中的上清液,每孔加入染色液50μl,室温放置30分钟后,用流水小心冲去染色液,并吸干残留水分,每孔加入脱色液100μl,室温放置3~5分钟。混匀后,用酶标仪以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸光度,记录测定结果。根据Reed-Muench法计算:
距离比例=(高于50%的百分数-50%)/(高于50%的百分数-低于50%的百分数)
根据距离比例求出重组鸡干扰素实验室活性单位X2、人干扰素国家标准品的实验室工作单位R2。
1.5.5工作单位修正以国际单位表示
各实验室所测得的干扰素单位,习惯上一般都称为改实验室“工作单位”;为了表明某种干扰素效价的高低,就必须用国家(际)干扰素标准品加以修正。具体修正方法如下:R1:R2=X1:X2
R1:重组人干扰素国家标准品的标准工作单位
R2:在相同条件下测定的重组人干扰素标准品的实验室工作单位
X1:待检重组鸡干扰素修正后的工作单位
X2:待检重组鸡干扰素测定的实验室工作单位
实验例1透析液体积以及透析时间对于对阳离子交换层析的影响
为了验证透析液体积以及透析时间对于阳离子交换层析的影响,因此通过设置不同透析液体积以及透析时间来测定其对阳离子交换层析的影响,其中用阳离子柱最大结合蛋白量来表征该影响。
(一)透析液体积对于对阳离子交换层析的影响
(1)重组鸡干扰素α复性液预处理:
重组鸡干扰素α复性液预处理:取重组鸡干扰素α复性液200ml(纯度90.5%,内毒素含量>10000EU/mL,蛋白含量为453.2μg/mL,生物学活性为7.0×108 IU/mg);
用1.0M HCl和1.0M NaOH调节α复性液原液PH至3.0,用不同体积, PH 3.0,浓度为20mM的磷酸盐缓冲液作为透析液,并使用截留分子量为7KD 的透析袋进行透析12h,然后,以9000r/min,离心20min,弃沉淀,取上清。
(2)阳离子交换层析:选北京博尔西科5mL预装阳离子柱(CM)
①平衡:用20ml 0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液平衡。②上样:原液透析离心后上样,总上样量为:450.8μg/mL×200mL=90.2mg。③淋洗:20mL0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液淋洗衡。④用浓度为0.5M NaCl、0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液,100μg/mL 速度进行洗脱,紫外检测至OD280无吸收为洗脱完全,收集洗脱液130mL。
最终通过最后一步测定洗脱液中,测定洗脱下来的蛋白含量反推阳离子柱最大结合蛋白量,即洗脱下多少蛋白就证明结合了多少蛋白。
将不同透析液体积进行以下分组:
其中:实验组为:实验组1:40倍体积;实验组2:50倍体积;
对照组为:对照组1:20倍体积;对照组2:30倍体积。
表4透析液体积对阳离子交换层析的影响
(二)透析时间对于阳离子交换层析的影响
(1)重组鸡干扰素α复性液预处理:
重组鸡干扰素α复性液预处理:取重组鸡干扰素α复性液200ml(纯度90.5%,内毒素含量>10000EU/mL,蛋白含量为453.2μg/mL,生物学活性为7.0×108 IU/mg);
用1.0M HCl和1.0M NaOH调节α复性液原液PH至3.0,用40倍重组鸡干扰素α复性液体积,PH 3.0,浓度为20mM的磷酸盐缓冲液作为透析液,并使用截留分子量为7KD的透析袋进行透析,透析不同的时间,然后,以9000r/min,离心20min,弃沉淀,取上清。
(2)阳离子交换层析:选北京博尔西科5mL预装阳离子柱(CM)
①平衡:用20ml 0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液平衡。②上样:原液透析离心后上样,总上样量为:450.8μg/mL×200mL=90.2mg。③淋洗:20mL0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液淋洗衡。④用浓度为0.5M NaCl、0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液,100μg/mL 速度进行洗脱,紫外检测至OD280无吸收为洗脱完全,收集洗脱液130mL,
最终通过最后一步测定洗脱液中,测定洗脱下来的蛋白含量反推阳离子柱最大结合蛋白量,即洗脱下多少蛋白就证明结合了多少蛋白。
将不同透析时间进行以下分组:
表5透析时间对阳离子交换层析的影响
通过洗脱时间可以看出,对照组3,在洗脱时间延长至20小时,阳离子柱最大结合蛋白量已经无明显增加的趋势,因此提取时间的延长无疑增加了蛋白提取的时间成本。
实验例2洗脱液中氯化钠浓度对于蛋白回收的影响
为了证明本发明纯化方法中,测定洗脱液不同浓度对于洗脱液蛋白回收率的影响。按照本发明实施例1步骤(1)(2)对蛋白鸡干扰素α复性液进行预处理:阳离子交换层析,唯一不同的是步骤(2)-④中,NaCl的浓度不同,分别选择浓度为0.2M、0.5M、0.8M、1.0M的NaCl进行洗脱,并分别测定步骤(2) 经过洗脱后,蛋白鸡干扰素α的蛋白回收率(即纯度)
表6不同氯化钠浓度对于洗脱液蛋白回收率的影响
氯化钠浓度(M) | 洗脱液蛋白回收率(%) |
0.2 | 46.2 |
0.5 | 95.7 |
0.8 | 96.1 |
1 | 96.2 |
由此说明,本发明中,将洗脱液中的氯化钠浓度控制在0.5-1M的范围内的情况下,其蛋白回收率显著较高。
Claims (9)
1.一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)重组鸡干扰素α复性液预处理:调节所述重组鸡干扰素α复性液原液pH至2.8-3.2,用35-50倍重组鸡干扰素α复性液体积、浓度为15-25mM的磷酸盐缓冲液,使用截留分子量为7KD的透析袋透析12-18h,经离心弃沉淀,得上清;
(2)阳离子交换层析:①平衡:阳离子柱子用0.015M-0.025M磷酸盐缓冲液平衡;②上样:将所述步骤(1)的上清进行上样;③淋洗:0.015M-0.025M磷酸盐缓冲液淋洗平衡;④洗脱:用浓度为0.5M-1M NaCl、0.015M-0.025M磷酸盐缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;
(3)镍柱亲和层析:①平衡:将镍-琼脂糖凝胶FF柱用20mM PBS进行平衡;②上样:将阳离子交换层析洗脱液调节PH至6.5-7.5,然后将所述步骤(2)-④的洗脱液进行上样;③再平衡:用20mM PBS进行再平衡;④洗脱:用6.5-7.5,浓度为500mM咪唑,以50-100μg/mL的流速进行洗脱,收集洗脱液,得到重组鸡干扰素α纯化品。
2.如权利要求1所述的一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,其特征在于:所述步骤(1)中,所述磷酸盐缓冲液的pH 2.8-3.2。
3.如权利要求1所述的一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,其特征在于:所述步骤(1)中,磷酸盐缓冲液体积为重组鸡干扰素α复性液体积的40倍,透析时间12-16h。
4.如权利要求1所述的一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,其特征在于:所述步骤(2)①平衡、③淋洗、④洗脱中,磷酸盐缓冲液pH为6.0。
5.如权利要求1所述的一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,其特征在于:所述步骤(2)-①中,所述平衡具体为:阳离子柱子用0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液平衡3-4个柱体积;
所述步骤(2)-③中,所述淋洗具体为:0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液淋洗脱3-4个柱体积;
所述步骤(2)-④中,用浓度为1M NaCl、0.02M,pH6.0磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求1所述的一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,其特征在于:所述步骤(2)-④中,所述洗脱的流速为80-120μg/mL。
7.如权利要求1所述的一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,其特征在于:所述步骤(3)中,所述PBS组成为:20mM NaH2PO4,20mM咪唑,0.5M NaCl,pH7.0-7.5。
8.如权利要求1所述的一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法,其特征在于:所述步骤(3)-④中,洗脱液为PH 7.0,浓度500mM咪唑,洗脱速度为100μg/mL。
9.由权利要求1-8任一所述方法制备获得的重组鸡干扰素α纯化品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911255550.7A CN111138523A (zh) | 2019-12-10 | 2019-12-10 | 一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911255550.7A CN111138523A (zh) | 2019-12-10 | 2019-12-10 | 一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111138523A true CN111138523A (zh) | 2020-05-12 |
Family
ID=70517864
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911255550.7A Pending CN111138523A (zh) | 2019-12-10 | 2019-12-10 | 一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111138523A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113607903A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-11-05 | 振德医疗用品股份有限公司 | 一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1396176A (zh) * | 2001-07-06 | 2003-02-12 | 阿尔法·瓦瑟曼公司 | 通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法 |
CN1626551A (zh) * | 2003-12-12 | 2005-06-15 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种复合干扰素的纯化方法 |
CN1749274A (zh) * | 2005-07-05 | 2006-03-22 | 北京凯因生物技术有限公司 | 一种新的重组人干扰素α2b的分离纯化方法 |
CN101928341A (zh) * | 2010-06-30 | 2010-12-29 | 深圳科兴生物工程有限公司 | 分离重组人干扰素α1b异构体的纯化工艺及其检测方法 |
CN103804486A (zh) * | 2014-01-20 | 2014-05-21 | 安徽安科生物工程(集团)股份有限公司 | 一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的制备工艺 |
CN103965346A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-08-06 | 王明丽 | 一种rPoIFNα1的分离纯化方法 |
CN106399321A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-02-15 | 华南农业大学 | 一种制备融合表达重组鸡α干扰素的生产工艺 |
CN109134641A (zh) * | 2017-06-19 | 2019-01-04 | 杭州俊丰生物工程有限公司 | 一种鸡干扰素-α的制备方法 |
-
2019
- 2019-12-10 CN CN201911255550.7A patent/CN111138523A/zh active Pending
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1396176A (zh) * | 2001-07-06 | 2003-02-12 | 阿尔法·瓦瑟曼公司 | 通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法 |
CN1626551A (zh) * | 2003-12-12 | 2005-06-15 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种复合干扰素的纯化方法 |
CN1749274A (zh) * | 2005-07-05 | 2006-03-22 | 北京凯因生物技术有限公司 | 一种新的重组人干扰素α2b的分离纯化方法 |
CN101928341A (zh) * | 2010-06-30 | 2010-12-29 | 深圳科兴生物工程有限公司 | 分离重组人干扰素α1b异构体的纯化工艺及其检测方法 |
CN103965346A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-08-06 | 王明丽 | 一种rPoIFNα1的分离纯化方法 |
CN103804486A (zh) * | 2014-01-20 | 2014-05-21 | 安徽安科生物工程(集团)股份有限公司 | 一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的制备工艺 |
CN106399321A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-02-15 | 华南农业大学 | 一种制备融合表达重组鸡α干扰素的生产工艺 |
CN109134641A (zh) * | 2017-06-19 | 2019-01-04 | 杭州俊丰生物工程有限公司 | 一种鸡干扰素-α的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
刘芃实 等: "不同层析方法纯化重组人干扰素α2a的效果比较", 《中国生物制品学杂志》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113607903A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-11-05 | 振德医疗用品股份有限公司 | 一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法 |
CN113607903B (zh) * | 2021-07-30 | 2024-03-15 | 振德医疗用品股份有限公司 | 一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4342828A (en) | Method for producing substance capable of stimulating differentiation and proliferation of human granulopoietic stem cells | |
CN107384877B (zh) | 一种慢病毒的纯化方法 | |
CN108524929B (zh) | 一种狂犬病疫苗的生产方法 | |
CN111471103A (zh) | 一种新冠病毒(2019-nCOV)的异源抗体及其制备方法 | |
JP2017529092A (ja) | バイオ製品における細菌エンドトキシンを除去する試薬キット、方法及びそのバイオ製品の製造方法 | |
CN111249456A (zh) | 一种狂犬病病毒灭活疫苗的纯化方法 | |
WO2018119746A1 (zh) | 重组ev71病毒样颗粒的纯化及其疫苗制备方法 | |
CN111606978A (zh) | 一种去除大肠杆菌重组表达猪细小病毒vp2蛋白中内毒素的方法 | |
CN111138523A (zh) | 一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法 | |
CN115068592A (zh) | 开封后常温稳定的重组人干扰素α1b滴眼液及制备方法 | |
CN111474357A (zh) | 非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用 | |
CN1749274B (zh) | 一种新的重组人干扰素α2b的分离纯化方法 | |
CN113480632B (zh) | 一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺 | |
CN113398251B (zh) | 一种重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂及其制备方法 | |
CN115677848A (zh) | 一种制备高纯度高稳定性蛋白质的方法 | |
CN101361973A (zh) | 一种治疗水痘的药物及其制备方法 | |
WO2018086997A1 (en) | Method for sampling fluid streams for monitoring contaminants in a continuous flow | |
CN104447977A (zh) | 一种重组人骨形态发生蛋白-2的纯化生产方法 | |
CN110904276A (zh) | 噬菌体在生物制品病毒清除工艺验证中的应用 | |
US20200207806A1 (en) | Manufacture of endotoxin-free hemoglobin-based drug substance and method for endotoxin-free protein purification | |
EP3141594A2 (en) | Method for sampling fluid streams for monitoring contaminants in a continuous flow | |
Lugo | Aseptic processing of biopharmaceuticals | |
Sandle | Removal of endotoxin from protein in pharmaceutical processes | |
CN103145804A (zh) | 猪细小病毒vp2亲和肽及其编码核苷酸 | |
CN110885828B (zh) | 一种白喉毒素的核酸适配体dt01及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200512 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |