CN1626551A

CN1626551A - 一种复合干扰素的纯化方法

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Publication number: CN1626551A
Application number: CN 200310121343
Authority: CN
Inventors: 刘永东; 李京京; 王芳薇; 苏志国
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2003-12-12
Publication date: 2005-06-15
Anticipated expiration: 2023-12-12
Also published as: CN1259336C

Abstract

本发明提供一种复合干扰素的纯化方法，包括如下步骤：将经常规方法发酵并收集的包涵体变性得到的复合干扰素，边搅拌边加入缓冲液D，然后在可以透过分子量50000以下的透析袋中，于缓冲液E中透析，进行复合干扰素蛋白质的复性；分出上清液，在装有强阳离子交换介质的层析柱上用缓冲液F和缓冲液G梯度洗脱，得到纯化的复合干扰素。本方法不仅能完全去除分子量在3～4万的杂蛋白，而且能将复性中间体与完全复性的蛋白基本分开，从而所得复合干扰素纯度高，产品结构也更均一。

Description

一种复合干扰素的纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种重组复合干扰素(Consensus interferon，IFN-α-con1)的制备工艺，特别涉及用阳离子交换介质一步纯化重组复合干扰素的方法。

背景技术

干扰素(IFN，Interferon)是一类具有广谱的抗病毒、抗增殖和免疫调节，可以激活自然杀伤细胞(NK cell)等多种功能的细胞素的总称。其为由多种诱导剂诱导细胞产生的结构类似、功能相近、具有生物活性的低分子糖蛋白，是一类重要的细胞因子。干扰素一般分为I型和II型，I型包括IFN-α、IFN-β和IFN-ω，其中IFN-α又可分成25种以上一级结构存在差异的亚型；II型包括IFN-γ。这些干扰素分别由不同的基因编码产生，生物活性各异。目前临床上使用的干扰素大都是通过基因重组技术生产得到。DNA重组技术生产干扰素的优点在于此方法可以高纯度、大批量地生产干扰素。

1981年，美国安进(Amgen)公司的研究人员首次合成了一种非天然的I型干扰素(Consensus interferon，IFN-α-con1，复合干扰素)。这种复合干扰素结构上与普通干扰素相近，具有166个氨基酸残基，其中大约30％位置上的氨基酸与IFN-β相同，60％以上的氨基酸与IFN-γ相同，只有20个位置上的氨基酸与临床上最常使用的IFN-α2a的相应位置的氨基酸不同。但是复合干扰素的生物活性却是普通干扰素的2～20倍。因而成为研究的热点。美国专利4695623、4897471、5372808已公开了复合干扰素具有广谱的干扰素活性，有较强的抗病毒和抗肿瘤以及激活NK细胞的活性，可以用于治疗疾病。中国专利97193506公开了应用复合干扰素治疗丙型肝炎的方法，中国专利98114663公开了重组复合干扰素的制备方法和治疗乙型肝炎和丙型肝炎的用途。这些已有的研究都表明复合干扰素治疗慢性丙型肝炎效果显著，特别是在降低血清病毒负荷和治疗其它干扰素治疗无效或复发的病人方面，优于其它类型的干扰素。

目前复合干扰素的制备方法一般包括复合干扰基因的人工构建、并由含此DNA序列表达载体的宿主细胞发酵，最后是纯化处理。其中的纯化步骤对于复合干扰素的产品质量至关重要。对于纯化步骤，目前大多采用阴离子交换和凝胶过滤相结合，或阴离子交换与疏水层析相结合的两步纯化方法。但是这两种纯化方法的效果均不佳，一方面，不能有效去除分子量在3～4万左右的两种杂蛋白，因此纯化产品纯度不是很高；另一方面，复合干扰素在稀释复性时，复性上清液中总是会含有部分未完全复性的复性中间体，使用这两种纯化方法对复性中间体基本无分离效果，从而纯化的产品结构不均一。

发明内容

本发明的目的在于克服已有的复合干扰素的纯化方法纯化产品纯度不是很高、纯化的产品结构不均一的缺陷，从而提供一种不仅能完全去除分子量在3～4万的杂蛋白，而且能将复性中间体与完全复性的蛋白基本分开，从而所得产品不仅纯度高，而且产品结构也更均一的复合干扰素的纯化方法。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供一种复合干扰素的纯化方法，包括如下步骤：

1)将经常规方法发酵并收集的包涵体变性得到的复合干扰素，边搅拌边加入缓冲液D，所加入的缓冲液D与复合干扰素的体积比为40～100∶1，然后将混合液静置过夜；

2)将步骤1)经静置的混合液装入可以透过分子量50000以下的透析袋中，于缓冲液E中透析12～24小时，进行复合干扰素蛋白质的复性，缓冲液E与混合液的体积比为5～20∶1；

3)从步骤2)经透析的混合液中分出上清液，得到复性的复合干扰素溶液；

4)用缓冲液F平衡装有强阳离子交换介质的层析柱，介质装填高度为5～25cm，将步骤3)的已复性的复合干扰素溶液调pH至3.5～6.0后上柱，上样量不超过15mg/ml，然后用2倍柱体积的缓冲液F淋洗，再用5～10倍柱体积的含缓冲液G和缓冲液F的混合液进行梯度洗脱，淋洗时的流速为50～200cm/min，收集第二个蛋白洗脱峰时的洗脱液，最后将此洗脱液浓缩，得到纯化的复合干扰素。

所述步骤1)的缓冲液D为100mM Tris+0.5M精氨酸+0.2mMEDTA(乙二胺四乙酸二钠)，用HCl调pH至8.3；

所述步骤2)的缓冲液E为25mM Tris-HCl，pH8.3；

所述步骤4)的强阳离子交换介质包括SP Sepharose FF，SP-Sepharose XL，SP-Sepharose Big Bead，SE-纤维素或S-葡聚糖，优选为SP Sepharose XL(Aarmacia)；

所述步骤4)的缓冲液F为pH3.5～6.0的5～50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，柠檬酸-柠檬酸钠，磷酸氢二钠-柠檬酸，柠檬酸-氢氧化钠-盐酸，乙酸钠-乙酸，磷酸二氢钾-氢氧化钠，优选为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠；

所述步骤4)的缓冲液G为1M NaCl溶于所述步骤4)的缓冲液F中；

所述步骤4)的上样量优选为8～10mg/ml；

所述步骤4)的流速优选为150cm/min；

所述步骤4)用于梯度淋洗的混合缓冲液中缓冲液G占混合缓冲液总体积的10～60％。

与现有技术相比，本发明提供的纯化方法使用阳离子交换介质，在比复合干扰素等电点更酸性的pH值条件下将其吸附于介质上，然后改变洗脱剂的离子强度，将复合干扰素洗脱下来。本方法所得的复合干扰素纯度高，产品结构也更均一，可以完全去除分子量在3～4万的杂蛋白，而且能将复性中间体与完全复性的蛋白基本分开，所得蛋白活性回收率为60％，产品纯度大于99％，抗病毒活性为1～2×10⁹IU/mg。另外，该方法步骤简单，仅一步层析即可达到纯化效果，比已有技术的二步法节省工艺和操作人员，从而成本低廉，易于推广。

附图说明

图1为本发明的纯化方法纯化复合干扰素的层析图谱。

具体实施方式

实施例1、复合干扰素的生产

本发明使用的未经纯化的复合干扰素是使用常规方法将复合干扰基因人工构建、并由含此DNA序列表达载体的宿主细胞发酵而得，具体发酵过程如下：

选用大肠杆菌BL21为宿主菌，菌株保存在-80℃。挑取复合干扰素工程菌(由中科院微生物所唐宏研究员提供)在氨卞抗性LB平板上划线，于37℃温室培养12～24小时。挑取单菌落，接种于3毫升液体LB培养基(氨卞，1～50mg/ml)，于37℃摇床以240rpm的速度培养12～24小时，测OD₆₀₀为1.0～2.0时转接2次种子液，同样条件下培养，OD₆₀₀达1.0～2.0时按5～10％的比例接入发酵培养基，37℃，通气量为0.8～1.2vvm，转速400～700rpm。培养过程中，用氨水和盐酸调节pH在7.0-7.4；OD值升高时加补料培养基250ml。通过调节补料速度及转速，控制DO在20～50％。菌体进入对数生长期后(OD₆₀₀＝2.0)加入1‰IPTG开始诱导，诱导2～8小时后停止。离心收集菌体，复合干扰素以包涵体形式存于细胞中，SDS-PAGE分析其含量占细胞总蛋白的15％，冷冻保存。

所述发酵培养基是按下述比例配制的：胰蛋白胨2g/L，酵母提取物2g/L，12水磷酸氢二钠7g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸铵8g/L，氯化铵0.2g/L，微量元素60ml/L；其中的微量元素包括MnSO₄·5H₂O 0.001g/L，CaCl₂·6H₂O 0.004g/L，Na₂MO₄·2H₂O 0.002g/L，ZnCl₂ 0.002g/L，CuSO₄·5H₂O 0.001g/L，H₃BO₄ 0.0005g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02g/L，CoCl₂·2H₂O 0.02g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L。

所述补料培养基是按下述比例配制的：甘油51g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，7水硫酸镁0.85g/L。

包涵体中的蛋白以聚集体形式存在，无生物活性，需变性溶解再复性才能恢复天然活性。取一定量菌体，以1∶5(W∶V)的比例用缓冲液A(25mM Tris-HCl，pH8.0)充分悬浮。在冰浴中超声破菌。超声功率200W，超声2分(超5秒，间隔5秒)，停2分。反复4次。破菌完毕后10000rpm，30min离心，收集包涵体。之后用包涵体洗涤液(1mM巯基乙醇+1mM EDTA-Na+0.05％Triton X-100)洗涤包涵体，10000rpm，离心30min。收集到的包涵体可冻存于-70度冰箱保存，也可立即变性溶解。

按1∶5(包涵体重量W∶变性剂体积V)的比例加入变性剂100ml(8M脲+0.5mM巯基乙醇+25mM Tris-HCl，pH8.0)。磁力搅拌数小时。12000rpm，离心30min后收集上清，SDS-PAGE测得变性的复合干扰素纯度为65％。

实施例2、重组复合干扰素的纯化

将实施例1中经常规方法发酵并收集的包涵体变性得到的纯度为65％的复合干扰素，边搅拌边加入缓冲液D(100mM Tris+0.5M精氨酸+0.2mM EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，用HCl调pH至8.3)，所加入的缓冲液D与复合干扰素的体积比为40∶1，然后将混合液静置过夜。

然后将此混合液装入可以透过分子量8000的透析袋中，于缓冲液E(25mMTris-HCl，pH8.3)中透析12小时，进行复合干扰素蛋白质的复性，缓冲液E与混合液的体积比为5∶1；离心或过滤除去白色聚集物，分出上清液，即为复性的复合干扰素的溶液，复性蛋白浓度为0.3mg/ml，SDS-PAGE测得复合干扰素纯度为90％，蛋白复性率70％。

自装2.6×20的层析柱，采用的介质为商用的Amarcial SP Sepharose XL强阳离子交换介质，介质装填高度为5cm，并用缓冲液F(20mM乙酸钠-乙酸，pH3.5)平衡层析柱，将已复性的复合干扰素溶液用1M乙酸调pH至3.5后上柱，上样量为15mg/ml，然后用2倍柱体积的缓冲液F淋洗，再用5倍柱体积的缓冲液G(20mM乙酸钠-乙酸，pH3.5，1M NaCl)和缓冲液F的混合液进行梯度洗脱，缓冲液G占缓冲液G和缓冲液F总体积的体积百分数从10～60％，淋洗时的流速为50cm/min，收集第二个蛋白洗脱峰(层析图如图1所示)，最后将此洗脱液浓缩，即为纯化的复合干扰素。

使用还原型SDS-PAGE分析该纯化的复合干扰素为单带，纯度为99.2％，分子量19200，使用氧化型SDS-PAGE分析该纯化的复合干扰素同样为单带。纯化步骤活性回收率为75％，抗病毒活性为1.2×10⁹IU/mg。

实施例3、重组复合干扰素的纯化

将实施例1中经常规方法发酵并收集的包涵体变性得到的纯度为65％的复合干扰素，边搅拌边加入缓冲液D(100mM Tris+0.5M精氨酸+0.2mM EDTA，用HCl调pH至8.3)，所加入的缓冲液D与复合干扰素的体积比为100∶1，然后将混合液静置过夜；

然后将此混合液装入可以透过分子量50000的透析袋中，于缓冲液E(25mMTris-HCl，pH8.3)中透析24小时，进行复合干扰素蛋白质的复性，缓冲液E与混合液的体积比为20∶1；离心或过滤除去白色聚集物，分出上清液，即为复性的复合干扰素的溶液，复性蛋白浓度为0.8mg/ml，SDS-PAGE测得复合干扰素纯度为90％，蛋白复性率70％。

自装2.6×20的层析柱，采用的介质为商用的SP Sepharose FF强阳离子交换介质，介质装填高度为25cm，并用缓冲液F(50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH6.0)平衡层析柱，将已复性的复合干扰素溶液用1M磷酸调pH至6.0后上柱，上样量为10mg/ml，然后用2倍柱体积的缓冲液F淋洗，再用10倍柱体积的缓冲液G(50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH6.0，1M NaCl)和缓冲液F的混合液进行梯度洗脱，缓冲液G占缓冲液G和缓冲液F总体积的体积百分数从10～60％，淋洗时的流速为150cm/min，收集第二个蛋白洗脱峰，最后将此洗脱液浓缩，即为纯化的复合干扰素。

使用还原型SDS-PAGE分析该纯化的复合干扰素为单带，纯度为99.6％，分子量19400左右，使用氧化型SDS-PAGE分析该纯化的复合干扰素同样为单带。纯化步骤活性回收率为76％，抗病毒活性为1.9×10⁹IU/mg。

实施例4、重组复合干扰素的纯化

将实施例1中经常规方法发酵并收集的包涵体变性得到的纯度为65％的复合干扰素，边搅拌边加入缓冲液D(100mM Tris+0.5M精氨酸+0.2mM EDTA，用HCl调pH至8.3)，所加入的缓冲液D与复合干扰素的体积比为60∶1，然后将混合液静置过夜；

然后将此混合液装入可以透过分子量20000的透析袋中，于缓冲液E(25mMTris-HCl，pH8.3)中透析18小时，进行复合干扰素蛋白质的复性，缓冲液E与混合液的体积比为15∶1；离心或过滤除去白色聚集物，分出上清液，即为复性的复合干扰素的溶液，复性蛋白浓度为0.5mg/ml，SDS-PAGE测得复合干扰素纯度为90％，蛋白复性率70％。

自装2.6×20的层析柱，采用的介质为商用的SP-Sepharose Big Bead强阳离子交换介质，介质装填高度为15cm，并用缓冲液F(5mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH4.0)平衡层析柱，将已复性的复合干扰素溶液用1M磷酸调pH至4.0后上柱，上样量为8mg/ml，然后用2倍柱体积的缓冲液F淋洗，再用8倍柱体积的缓冲液G(5mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH4.0，1M NaCl)和缓冲液F的混合液进行梯度洗脱，缓冲液G占缓冲液G和缓冲液F总体积的体积百分数从10～60％，淋洗时的流速为200cm/min，收集第二个蛋白洗脱峰，最后将此洗脱液浓缩，即为纯化的复合干扰素。

使用还原型SDS-PAGE分析该纯化的复合干扰素为单带，纯度为99.1％，分子量19100左右，使用氧化型SDS-PAGE分析该纯化的复合干扰素同样为单带。纯化步骤活性回收率为75％，抗病毒活性为1.8×10⁹IU/mg。

使用本发明提供的纯化方法，得到的复合干扰素纯度高，产品结构也更均一，可以完全去除分子量在3～4万的杂蛋白，而且能将复性中间体与完全复性的蛋白基本分开，所得蛋白活性回收率达到60％以上，产品纯度大于99％，抗病毒活性为1～2×10⁹IU/mg。

Claims

1、一种复合干扰素的纯化方法，包括如下步骤：

4)用缓冲液F平衡装有强阳离子交换介质的层析柱，介质装填高度为5～25cm，将步骤3)的已复性的复合干扰素溶液调pH至3.5～6.0后上柱，上样量不超过15mg/ml，然后用2倍柱体积的缓冲液F淋洗，再用5～10倍柱体积的含缓冲液G和缓冲液F的混合液进行梯度洗脱，淋洗时的流速为50～200cm/min，收集第二个蛋白洗脱峰时的洗脱液，最后将此洗脱液浓缩，得到纯化的复合干扰素；

所述步骤1)的缓冲液D为100mM Tris、0.5M精氨酸和0.2mM乙二胺四乙酸二钠，用HCl调pH至8.3；

所述步骤2)的缓冲液E为25mM Tris-HCl，pH8.3；

所述步骤4)的缓冲液F为pH3.5～6.0的5～50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，柠檬酸-柠檬酸钠，磷酸氢二钠-柠檬酸，柠檬酸-氢氧化钠-盐酸，乙酸钠-乙酸或磷酸二氢钾-氢氧化钠；

所述步骤4)的缓冲液G为1M NaCl溶于所述步骤4)的缓冲液F中；

2、如权利要求1所述的复合干扰素的纯化方法，其特征在于，所述步骤4)的强阳离子交换介质为SP Sepharose FF，SP-Sepharose XL，SP-Sepharose Big Bead，SE-纤维素或S-葡聚糖。

3、如权利要求1所述的复合干扰素的纯化方法，其特征在于，所述步骤4)的缓冲液F为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠。

4、如权利要求1所述的复合干扰素的纯化方法，其特征在于，所述步骤4)的上样量为8～10mg/ml。

5、如权利要求1所述的复合干扰素的纯化方法，其特征在于，所述步骤4)淋洗时的流速为150cm/min。