CN115125216B - 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于噬菌体的技术领域，具体涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用。所述噬菌体MSP15的保藏编号为CCTCC NO：M20211527。所述噬菌体MSP15具有较高效价，温度稳定性好，在50℃仍能保持高活性；pH稳定性好，最适pH值为7～10；并且具有较强的裂解能力；可于室温下稳定存活，于4℃下长期保持活性，能为噬菌体制剂提供优良的菌株资源，为临床MRSA感染患者提供一种新的有效的治疗手段，挽救很多MRSA感染重症患者的生命，也可被制备为各种产品的有效成分应用于环境消毒，有效控制环境中MRSA的污染，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于噬菌体的技术领域，具体涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌是引起人类感染性疾病的主要病原菌，目前临床上主要还是通过抗生素进行相应的治疗，但该菌很容易获得抗生素耐药性，从第一例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的发现至今， MRSA的感染几乎遍及全球，已成为医院内和社区感染的重要病原菌之一，耐药范围日益扩大，耐药程度也日益严重。近70年来，由于抗生素的广泛使用，耐药性金黄色葡萄球菌不断出现，美国 1999～2005年因感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)而入院的患者增加1倍多，其中诊断为败血症的患者增加81.2％，耐药性细菌的出现，导致医疗费用的增加、临床预后的下降，严重增加了人民的医疗负担，成为人民生命健康的重大威胁。而新型抗生素的开发周期较长，使临床上往往面临无药可用的境地。
由于MRSA对多种抗菌药物具有广泛耐药性，对其可用的仅为万古霉素等糖肽类抗菌药物(以万古霉素、替考拉宁为代表)，但近年来糖肽类抗生素的治疗也逐渐遇到疗效下降的问题，甚至在90年代后期又出现了耐万古霉素MRSA(VISA)。在抗生素治疗MRSA 感染疗效逐渐下降的前提下，本研究跳出传统思维，提出以裂解性噬菌体治疗MRSA感染，从而解决临床上MRSA感染的抗生素耐药难题。因此，寻找控制耐药菌的新对策十分迫切。目前有望替代抗生素的控菌手段有抗菌肽、噬菌体等。其中，噬菌体的发现早于抗生素，后因抗生素的普及而被忽视。如今，耐药菌株的流行使噬菌体治疗再次受到关注。噬菌体是自然界中天然存在的以细菌为宿主的病毒，其中裂解型噬菌体可吸附于宿主菌并将其裂解，达到杀菌的目的。与传统的抗生素疗法相比，还有许多其他优点。首先，与抗生素不同，噬菌体能特异杀伤靶细菌，且不会因破坏机体正常菌群而引起继发感染；其次，因噬菌体本身能变异，从而有更加多样的噬菌体能对耐某些噬菌体细菌的出现作出迅速反应；同时，噬菌体及其产物对真核细胞影响较小，因此不良反应相对较少；另外，研究噬菌体疗法所用资金与开发一种有效的新型抗生素相比更经济。
耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)是国内临床上主要的耐药性致病菌之一，其治疗是临床上面临的棘手的问题，尽快开展相关的研究工作非常必要。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体MSP15，其拉丁文名称为Staphylococcus aureus phage MSP15，其保藏编号为 CCTCC NO：M20211527，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年12月03日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编 430072。
本发明还提供了一种组合物，所述组合物中含有上述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体MSP15。
本发明还提供了一种噬菌体MSP15在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物的应用。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体MSP15，其保藏编号为CCTCCNO：M20211527，所述噬菌体MSP15具有较高效价，为8.5×109PFU/mL；其最佳MOI为10-5，体现较强的裂解能力；温度稳定性好，在50℃仍能保持高活性；pH稳定性好，最适pH 值为7～10；并且具有较强的裂解能力；
(2)本发明的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体MSP15具有以下的优势：作为烈性噬菌体，其对宿主菌株具有强的裂解作用，受细菌耐药的影响小，并具有较强的宿主特异性，过依赖感染者的宿主菌进行复制，对皮肤表面和肠道内的肠道正常菌群不会有任何影响，同时其对MRSA具有较广的宿主范围；
(3)在噬菌体应用方面：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体 MSP15的发酵液可于室温下稳定存活，于4℃下长期保持活性，能为噬菌体制剂提供优良的菌株资源，为临床MRSA感染患者提供一种新的有效的治疗手段，挽救很多MRSA感染重症患者的生命，也可被制备为各种产品的有效成分应用于环境消毒，有效控制环境中MRSA 的污染，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为噬菌体MSP15的噬菌斑形态图；
图2为噬菌体MSP15的一步生长曲线图；
图3为噬菌体MSP15制剂悬液的电镜扫描图
图4为噬菌体MSP15菌液的电泳图；
图5为噬菌体MSP15的温度稳定性检测图；
图6为噬菌体MSP15的pH稳定性检测图；
图7为噬菌体MSP15的化学稳定性检测图；
图8为MRSA相关噬菌体蛋白SDS-PAGE染色结果图；
图9为噬菌体MSP15的基因组图谱。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例
一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体MSP15的获取：
1.材料准备
MRSA菌种：从广东省人民医院检验科微生物室获得，进行药敏测定，共55株菌种；
3XLB液体培养基：胰蛋白胨6g+酵母提取物3g+氯化钠 6g+ddH2O 200mL，高压灭菌后用；
LB培养基：胰蛋白胨2g+酵母提取物1g+氯化钠2g+ddH2O 200mL，高压灭菌后用；
上层培养基：胰蛋白胨2g+酵母提取物1g+氯化钠2g+琼脂粉 1.6g+ddH2O 200mL，高压灭菌后用；
底层培养基：胰蛋白胨2g+酵母提取物1g+氯化钠2g+琼脂粉 3g+ddH2O 200mL，高压灭菌后用；
2.噬菌体分离、扩增、纯化：
1)从广东省人民医院污水处理中心采集生活污水0.5～1L，分装至离心管后离心机10000r/min离心20min，取上清，用0.45μM过滤器过滤除菌；
2)菌种悬浮液制备：用接种环挑取少量MRSA菌苔(检验科提供，来自临床患者标本，划线培养得到)接入5mL LB培养基中，37℃下培养过夜制成菌种悬浮液；
3)共培养增殖：取离心过滤后的污水8mL加入3xLB培养基 4mL，并加入菌种悬浮液500μL及10％CaCl2溶液120μL，混匀后于 37℃培养12h，离心机10000r/min离心20min，取上清，用0.45μM 过滤器过滤除菌，得到共培养液；
4)噬菌体分离：取过滤后的共培养液500μL，加入相应的MRSA 宿主菌菌种悬浮液200μL及10％CaCl2溶液7μL，混匀后加入上层培养基，倒入底层培养基制成双层LB平板(双层平板法)，凝固后倒置，并于37℃培养箱中培养5h以上，平板上若有噬菌斑，则用枪头挑取典型、透亮的单个噬菌斑，加至500μL SM Buffer中，置于4℃冰箱过夜，得到SM混合液；
共培养液与MRSA宿主菌菌悬液混合双层平板法培养后，在双层平板上可观察到数量较多形状规则，大小均匀的噬菌斑，如图1所示；
5)噬菌体第一次纯化：从步骤4)500μL SM混合液中取300μL 与相应的MRSA宿主菌菌悬液300μL混匀后加入到5mL LB培养基中，并加入10％CaCl2溶液56μL，于37℃共培养4h以上，离心机 10000r/min离心20min，取上清，用0.45μM过滤器过滤除菌，取过滤后的共培养液500μL，加入相应的MRSA宿主菌菌悬液200ul及 10％CaCl2溶液7μL，混匀后加入上层培养基，倒入底层培养基再次制成双层LB平板，凝固后倒置，并于37℃培养箱中培养5h以上，若有噬菌斑，则用枪头挑取典型、透亮的单个噬菌斑，加至500μL SM Buffer中；
6)噬菌体进一步纯化：重复步骤5)的纯化步骤2次，以进一步纯化噬菌体，最终得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌噬菌体的培养液，并加入20-30％甘油，放置-20℃保藏；
7)宽噬噬菌体筛选：将所获噬菌体与不同菌株(55株)进行交叉裂解实验，即使用点板的方法，测定噬菌体对不同MRSA菌株(55 株)的裂解能力，取MRSA菌悬液200μL加入上层培养基，倒入底层培养基制成双层LB平板，凝固后并将所获的噬菌体培养液1μL 点滴在平板上，待液干后倒置，于37℃培养过夜，观察噬菌斑的形成情况，得到噬菌体对不同细菌的裂解情况并获得裂解谱较广的宽噬噬菌体-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌噬菌体MSP15，如表1所示，为噬菌体MSP15对55株临床病理株的裂解情况。
表1噬菌体MSP15对55株临床病理株的裂解情况
表1中，“++”为可形成形状规则、清晰明亮的噬菌斑；“+”为可形成噬菌斑；“-”为未形成噬菌斑。
由表1可见，噬菌体MSP15对27株MRSA临床病理株具有敏感性，其中有13株表现为强敏感性(可形成形状规则、清晰明亮的噬菌斑)。
将所得噬菌体进行如下生物学特性检测，包括噬菌体效价测定、最佳感染复数(MOI)测定、一步生长试验、电镜观察，噬菌体核酸类型鉴定、噬菌体稳定性检测、MRSA相关噬菌体蛋白SDS-PAGE 染色等。
1.噬菌体效价测定
将纯化好的噬菌体MSP15以连续10倍梯度稀释，每个梯度浓度取100μL，通过上述双层平板法培养，选择合适浓度梯度平板，计算噬菌斑个数，每个浓度梯度做三组重复，最终取平均值计算噬菌体效价。
效价公式：
噬菌体效价(PFU/mL)＝噬菌斑平均数×稀释倍数×10。
通过双层平板法计算各浓度梯度噬菌斑个数，经多次平行试验取平均值后，得出噬菌体MSP15效价为8.5×109PFU/mL。
2.最佳感染复数(MOI)测定
将MRSA菌悬液与不同MOI下的噬菌体制剂混合，在37℃孵育 3.5～5h后，在4℃下10000r/min离心20min，过滤上清液，立即用双层平板法测定上清液中的噬菌体滴度；
该试验至少重复进行了三次，取平均值记录，结果如表2所示：
表2最佳MOI测定
结果显示，当MRSA菌株CFU为108，噬菌体MSPMOI为10-5时，孵育后上清液中的噬菌体滴度最高(1.63×108PFU/mL)，因此噬菌体MSP15的最佳MOI为10-5。
3.一步生长实验
为了测定噬菌体MSP15的一步生长实验，使用其宿主菌进行实验，将其制成菌悬液，加入噬菌体制剂(MOI＝0.1)在37℃条件下吸附20min。然后以10000r/min离心10min，采用双层琼脂平板法测定上清液中噬菌体滴度，记录相应滴度并获得该噬菌体的一步生长曲线，如图2所示，结果显示，该噬菌体有长达80min的潜伏期，随后迎来160min的快速增长期，最后慢慢趋于稳定，稳定于1010～1011 cfu/mL phage。
4.电镜观察
取20μL噬菌体制剂悬液，呈水滴状滴至电镜铜网状栅中，使滴液在铜网上保留片刻(大于1分钟)，2％磷钨酸溶液负染固定1-10 分钟，滤纸吸干后室温自然晾干，在生物透射电子显微镜下观察并拍照，如图3所示，经透射电镜观察显示，噬菌体MSP15具有一较短的尾巴，属于短尾病毒科。
5.噬菌体核酸类型鉴定
将噬菌体液加入超滤管，4℃、11000xg离心10min，用SM缓冲液洗脱超滤管中的噬菌体，加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬浮液中的细胞碎片，温和振荡30s，4℃、3000xg离心15min，回收含噬菌体颗粒的亲水相。去除溶液中宿主菌基因组后，通过酚氯仿异戊醇法提取噬菌体核酸，并进行酶切、电泳跑胶，拍照观察，结果如图4所示，未处理的噬菌体基因组的电泳条带完整可见(泳道2)；噬菌体基因组+RNaseA处理后的电泳条带完整可见(泳道3)，与未处理组的高度一致，说明该基因组核酸不属于RNA类型；噬菌体基因组 +DNase I处理后的电泳条带消失不见(泳道4)，说明该基因组核酸属于DNA类型，以及DNase I完全酶切降解；噬菌体基因组+Mung Bean Nuclease处理后的电泳条带完整可见(泳道5)，说明该基因组核酸属于双链类型。
因此，该噬菌体MSP15的核酸类型为dsDNA(双链DNA)。
6.噬菌体稳定性
1)噬菌体的温度稳定性
在不同温度(25、30、37、40、45、50、55、60、65、70℃)条件下测定该噬菌体的活性，结果如图5所示，噬菌体MSP15在≤50℃环境下能保持高活性，而在＞50℃环境下该噬菌体活性明显降低，当温度≥65℃该噬菌体完全失活。
2)PH稳定性
在不同PH条件(PH＝1、2、4、6、7、8、10、12、13)条件下测定该噬菌体的活性，结果如图6所示，噬菌体MSP15的最适PH 值约为7～10，当PH＞10或PH＜4时噬菌体活性明显降低，当PH≤ 2或PH≥13时，噬菌体完全失活。
3)化学稳定性
在不同氯仿浓度(5％、25％、50％、75％)的条件下测定该噬菌体的活性，结果如图7所示，氯仿对噬菌体MSP15的活性有一定抑制作用，但其抑制作用并不与氯仿浓度呈正比。
7.MRSA相关噬菌体蛋白SDS-PAGE染色
通过SDS-PAGE跑胶及考马斯亮蓝染色检测噬菌体的蛋白含量及蛋白分布的情况，除了已报到的链球菌噬菌体裂解酶Ply C外，ds DNA噬菌体裂解酶的大小一般都在25～40kDa之间，由一个基因独立编码生成，结合图8结果显示该噬菌体的裂解酶蛋白大小在45KDa 以上(约50KDa)。
8.噬菌体基因组测序
为了了解噬菌体MSP15的基因组特征，测定了其全基因组序列，基因组长度为17912bp；噬菌体MSP15的基因组图谱如图9所示。
Claims (3)
1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体MSP15，其特征在于，所述噬菌体MSP15的保藏编号为CCTCC NO：M20211527。
2.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体MSP15。
3.一种权利要求1所述的噬菌体MSP15在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物的应用。
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