CN117757757A - 一株沙门氏菌噬菌体及其应用 - Google Patents
一株沙门氏菌噬菌体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，公开了一株沙门氏菌噬菌体及其应用，所述的一株沙门氏菌噬菌体为一株沙门氏菌噬菌体vB_SenM_P9，所述的菌株已于2023年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为Salmonella phage P9，保藏编号为：CCTCC M 20231900，本发明公开一株沙门氏菌噬菌体，命名为vB_SenM_P9；该噬菌体具有宽裂解谱，且基因组未发现与溶原、耐药及毒力相关的基因，表明其用于药物及杀菌产品研发的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一株沙门氏菌噬菌体及其应用。
背景技术
沙门氏菌属于革兰氏阴性肠道杆菌，是一种常见的食源性致病菌和典型的人兽共患病原菌。感染沙门氏菌后多表现为肠道疾病，如腹泻、呕吐、肠胃炎等，症状较轻，但其易从肠道扩散至机体其它部位，引发侵袭性疾病，如败血症、脑膜炎、骨髓炎，甚至造成死亡事件。由于抗生素在全球范围内，尤其是医疗和养殖业中的大量使用，沙门氏菌耐药菌株不断出现，迫切需要研发新型抗生素替代药物，以控制耐药性沙门氏菌引起的感染。
噬菌体是一种细菌病毒，通过对细菌的特异性吸附完成裂解或者自身的溶原周期。噬菌体分为烈性噬菌体和温和性噬菌体。烈性噬菌体通过裂解细菌达到繁殖后代的目的。烈性噬菌体感染宿主后，尾丝蛋白与宿主表面的受体特异性结合，随后将自身的遗传物质注入宿主细胞内，借助宿主细胞的代谢系统来复制核酸、合成蛋白质及各种所需的酶类，随后宿主细胞在基因编码的裂解性蛋白的作用下从内部裂解，释放子代噬菌体同时达到裂解细胞的作用。近些年，随着耐药菌株的不断出现，抗生素疗法和应用受到限制。因此，在“后抗生素时代”，噬菌体疗法又重新受到了广大研究人员的重视。噬菌体相对于传统抗生素治疗有着高度特异性、高效性、易获得等特点，能在不影响机体正常菌群的情况下，快速杀灭特定病原菌，且对耐药菌株也有良好的杀灭效果。国内外研究均显示噬菌体在防控细菌感染方面表现出巨大潜力。目前，尽管已有一些沙门氏菌噬菌体的研究报道，但具有宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体较少。因此，分离获得对沙门氏菌具有广谱杀菌活性的噬菌体，开发利用噬菌体防治沙门氏菌引起的感染具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一株沙门氏菌噬菌体及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一株沙门氏菌噬菌体，所述的一株沙门氏菌噬菌体为一株沙门氏菌噬菌体vB_SenM_P9，所述的菌株已于2023年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为Salmonella phage P9，保藏编号为：CCTCC NO:M 20231900。
上述的沙门氏菌噬菌体vB_SenM_P9作为有效成分在制备预防和/或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病药物中的用途。
一种用于杀灭沙门氏菌的组合物，包含权利要求1所述的噬菌体vB_SenM_P9作为有效活性成分。
优选的，所述组合物为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂中的一种。
上述的沙门氏菌噬菌体vB_SenM_P9在杀灭人、动物和空间环境中沙门氏菌的应用。
优选的，所述人包括感染或者疑似感染沙门氏菌的人群；所述动物包括感染或者疑似感染沙门氏菌的所有动物；可用权利要求1所述的噬菌体进行紧急的预防和治疗。
优选的，所述空间环境包括医疗环境、自然环境、动物养殖环境，所述动物养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料；所述医疗环境包括如病房、处置室；所述自然环境包括森林、土壤、河流；通过喷洒沙门氏菌噬菌体vB_SenM_P9以消减环境中的沙门氏菌，从而达到净化环境的目的。
本发明的有益效果为：
本发明公开一株沙门氏菌噬菌体，命名为vB_SenM_P9；该噬菌体具有宽裂解谱，且基因组未发现与溶原、耐药及毒力相关的基因，表明其用于药物及杀菌产品研发的安全性；对O4、O7、O8、O9、O10、O19血清型的沙门氏菌均有杀菌活性；其可以单独或与其他物质复配使用，为体内外沙门氏菌感染治疗以及环境中沙门氏菌的消毒净化提供一种安全、无毒的噬菌体治疗药物和消杀产品。
附图说明
图1为噬菌体vB_SenM_P9噬菌斑图；
图2为噬菌体vB_SenM_P9形态观察图；
图3为噬菌体vB_SenM_P9的MOI测定结果图；
图4为噬菌体vB_SenM_P9的一步生长曲线测定结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明的噬菌体是由发明人分离自污水的新型噬菌体，该噬菌体具有呈正二十面体的头部和可伸缩的尾部；噬菌体在LB琼脂培养基上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为0.5-2mm。已于2023年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231900，地址：中国武汉，武汉大学。
实施例1噬菌体分离及制备：噬菌体的分离过程在下文中详细描述。本发明中的污水样品采自长春市长春公园，宿主菌为肠道沙门氏菌9，来自云南大理。采集污水，用纱布过滤，6,000rpm离心10min，取上清，用处理过的污水代替ddH2O配制LB培养基(100mL)；培养基内加入1mL过夜培养的宿主细菌，37℃培养10-12h；取培养物1mL，12,000rpm离心5min，上清用0.22μm滤器过滤形成噬菌体原液并保存，将得到的滤液用于空斑测试，以检查是否包括能够裂解宿主细菌的噬菌体。
空斑测试：以2％的比例在5mLLB液体培养基中接种肠道沙门氏菌9，37℃振荡培养过夜。取0.1mL上述制备的细菌培养液滴于平板正中央，用涂布棒将菌液均匀地涂开；待其晾干后，取上述噬菌体原液20ul滴于其中一个区域；待自然晾干后，置于37℃培养箱培养10h后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。
如果有空斑形成，证明有噬菌体存在。取噬菌体原液0.1mL，进行一系列的10倍稀释。取10-2、10-4和10-6稀释液各0.1mL与宿主菌培养物0.1mL混匀，室温作用15min后，加入约7mL，45℃，LB半固体培养基中，混匀后迅速倾倒入1.5％LB琼脂培养基平板上层，摇匀平置10min，待其凝固，置于37℃温箱培养8h后观察，获得形成单个噬菌斑的双层平板。
实施例2噬菌体扩增和纯化：在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌的枪头挑取直径大、较圆且透亮的单个噬菌斑，接种于5mLLB液体培养基中，加入噬菌体宿主菌液200μL，混匀，室温作用15min，37℃培养10-14h，12,000rpm，4℃离心1min，取上清；重复双层平板实验，如此反复挑取4-5次单个噬菌斑，将噬菌体纯化成大小一样的噬菌斑。
取1mL新鲜培养的宿主菌，加300μL噬菌体裂解液(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例)。37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入800mLLB液体培养基，37℃摇床振荡培养6-8h，12,000rpm，4℃离心10min，取上清，即为噬菌体裂解液。
PEG纯化：在噬菌体裂解液中加入RNaseA、DNaseⅠ至终浓度均为1μg/mL，室温放置30min；加入NaCl至终浓度为1mol/L，混合均匀后，冰浴1-2h；4℃离心机，8,000rpm离心15-20min后收集上清；按每100mL 10g的量加入PEG-8000，轻轻搅拌使其溶解，冰浴2h以上，使噬菌体在PEG-8000作用下形成沉淀；4℃离心机，12,000rpm离心10-20min，回收沉淀的噬菌体颗粒，加2mLSM液，充分洗涤沉淀，室温作用1h；加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30s；4℃5,000rpm离心10min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体。
采用双层平板法检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体液进行10倍梯度稀释，取相应的几个梯度的噬菌体稀释液各0.1mL与宿主菌液0.1mL充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养10h左右，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数。选择出现100-200个左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价。纯化的噬菌体如图1所示，噬菌体在1.5％的LB琼脂培养基中可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为0.5-2mm。
纯化的噬菌体自命名为vB_SenM_P9，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学，邮编430072，保藏号：CCTCC NO:M 20231900，分类命名：沙门氏菌噬菌体(Salmonella phage P9)，保藏日期为2023年10月16日。
实施例3噬菌体vB_SenM_P9透射电镜观察：取实施例2中PEG纯化的噬菌体做电镜观察，具体操作步骤为：加10μL样本滴在铜网上，待其沉淀15min，用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸(PTA)染色1-2min，干燥后使用透射电镜(日立H-7650)观察；观测结果如图2所示，噬菌体vB_SenM_P9头部呈正二十面体，头部直径约为75nm，尾长约125nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV)2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_SenM_P9属于肌尾病毒科(Myoviridae)。
实施例4噬菌体vB_SenM_P9的最佳MOI测定：最佳MOI测定：将培养至对数期的菌液调到浓度为108CFU/mL，然后按照噬菌体/细菌的比例为0.001、0.01、0.1、1和10、100将噬菌体与菌液进行混合，转接到LB液体培养基中，在37℃振荡培养4h。将培养液在4℃进行10,000rpm离心15min，用0.22μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤得到噬菌体增值液，利用双层平板法对增值液进行滴度测定，滴度最高的噬菌体/细菌比例即为最佳MOI，结果如图3所示，噬菌体vB_SenM_P9的MOI为10-1时，噬菌体滴度最高，可以达到1×109PFU/mL，因此，噬菌体vB_SenM_P9的最佳MOI是10-1。
实施例5噬菌体vB_SenM_P9的一步生长曲线测定：一步生长曲线测定：将培养至对数期的宿主菌与噬菌体按照最佳MOI的比例进行混合，在4℃放置15min，用新鲜LB液体培养基将沉淀悬起，将悬浊液37℃振荡培养，于0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min，分别取一次样品测定噬菌体的滴度，从而绘制出噬菌体感染细菌的一步生长曲线，结果如图4所示，噬菌体vB_SenM_P9的潜伏期是15min，整个裂解周期持续70min。
实施例6噬菌体vB_SenM_P9宿主谱分析：将实施例2获得的噬菌体vB_SenM_P9效价调整为109PFU/mL备用。试验选择62株沙门氏菌为对象，使用空斑试验对噬菌体vB_SenM_P9的宿主谱进行测定，具体操作如下：
分别取待测菌株的过夜培养物0.1mL，用涂棒分别将它们在LB琼脂平板上涂制成均匀的菌苔。取10μL噬菌体滴加在菌苔表面，待液滴干燥后倒置于37℃培养箱培养12-16h，观察结果，如有空斑产生则记为“+”，否则为“-”，结果如表1所示：
表1噬菌体vB_SenM_P9沙门氏菌宿主谱分析
由表1可知，噬菌体vB_SenM_P9能在50株沙门氏菌(血清型包括O4、O7、O8、O9、O10、O19)的平板上产生空斑，裂解率为80.6％(50/62)，表明噬菌体vB_SenM_P9对沙门氏菌具有很宽裂解谱。
本发明公开一株沙门氏菌噬菌体，命名为vB_SenM_P9；该噬菌体具有宽裂解谱，且基因组未发现与溶原、耐药及毒力相关的基因，表明其用于药物及杀菌产品研发的安全性；对O4、O7、O8、O9、O10、O19血清型的沙门氏菌均有杀菌活性；其可以单独或与其他物质复配使用，为体内外沙门氏菌感染治疗以及环境中沙门氏菌的消毒净化提供一种安全、无毒的噬菌体治疗药物和消杀产品。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一株沙门氏菌噬菌体，其特征在于，所述的一株沙门氏菌噬菌体为一株沙门氏菌噬菌体vB_SenM_P9，所述的菌株已于2023年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为Salmonella phage P9，保藏编号为：CCTCC M 20231900。
2.如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体vB_SenM_P9作为有效成分在制备预防和/或治疗由沙门氏菌引起的感染性疾病药物中的用途。
3.一种用于杀灭沙门氏菌的组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的噬菌体vB_SenM_P9作为有效活性成分。
4.根据权利要求3所述的一种用于杀灭沙门氏菌的组合物，其特征在于，所述组合物为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂中的一种。
5.如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体vB_SenM_P9在杀灭人、动物和空间环境中沙门氏菌的应用。
6.根据权利要求5所述的一株沙门氏菌噬菌体的应用，其特征在于，所述人包括感染或者疑似感染沙门氏菌的人群；所述动物包括感染或者疑似感染沙门氏菌的所有动物。
7.根据权利要求5所述的一株沙门氏菌噬菌体的应用，其特征在于，所述空间环境包括医疗环境、自然环境、动物养殖环境，所述动物养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料；
所述医疗环境包括如病房、处置室；
所述自然环境包括森林、土壤、河流。
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