CN111187757A - 大肠杆菌噬菌体及其应用与杀菌组合物及其应用 - Google Patents

大肠杆菌噬菌体及其应用与杀菌组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种大肠杆菌噬菌体及其应用与杀菌组合物及其应用。所述大肠杆菌噬菌体FM1017于2019年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19156，分类命名为大肠杆菌噬菌体。该噬菌体既能裂解生物体内的肠致病性大肠杆菌，也能裂解环境中的肠致病性大肠杆菌，可以单独或与其他物质复配使用，为消毒净化环境提供一种安全、无毒的噬菌体消杀产品。其可用于开发预防或治疗肠致病性大肠杆菌感染药物，建立使用该噬菌体预防或治疗肠致病性大肠杆菌感染的使用方法。

Description

大肠杆菌噬菌体及其应用与杀菌组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌噬菌体及其应用与杀菌组合物及其应用。
背景技术
在畜牧养殖场内，由于大量致病菌的存在，导致其环境，水源都受大量致病菌污染，当致病菌浓度达到一定值时。就会给畜禽类机体造成致病性伤害。其中肠致病性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC) 广泛存在于自然界的土壤、水和农产品及林产品中，是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌，初生幼畜被ETEC 感染后，常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡，发病率和死亡率均很高。
抗生素类药物是治疗ETEC感染的最佳选择，其在治疗中也被广泛应用。但长期使用抗生素会使病原菌产生极高的耐药性，对机体伤害巨大，所以急需有效的替代方法。
噬菌体是感染细菌的极小微生物。噬菌体感染细菌并在细菌细胞内增殖。完全增殖后，破坏细菌细胞壁逃离宿主，体现其杀菌能力。噬菌体感染特异性高，特定噬菌体仅感染特异性细菌，说明其只能杀死特定细菌并且不会伤害其他细菌。由于噬菌体杀死细菌的独特能力和抗生素的禁用，噬菌体被优先考虑为替代常规抗生素的新型抗菌剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大肠杆菌噬菌体及其应用与杀菌组合物及其应用。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案。
本发明第一方面提供一种大肠杆菌噬菌体，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体FM1017，所述大肠杆菌噬菌体FM1017于2019年12月27 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.19156。
本发明第二方面提供一种杀菌组合物，所述杀菌组合物中含有第一方面所述的大肠杆菌噬菌体。
作为上述技术方案的进一步改进，所述杀菌组合物为溶液、悬浮液、粉末、喷雾剂或软膏形式。
作为上述技术方案的进一步改进，所述杀菌组合物还含有载体。
作为上述技术方案的进一步改进，所述载体包括水、油、表面活性剂、蛋白胨中的至少一种。
本发明第三方面提供第一方面所述的大肠杆菌噬菌体，或第二方面所述的杀菌组合物在杀灭大肠杆菌中的应用。
作为上述技术方案的进一步改进，所述大肠杆菌为肠致病性大肠杆菌。
作为上述技术方案的进一步改进，所述大肠杆菌噬菌体的感染复数≥ 0.01。
作为上述技术方案的进一步改进，所述大肠杆菌噬菌体的感染复数为 0.01～0.1。
本发明第四方面提供第一方面所述的大肠杆菌噬菌体，或第二方面所述的杀菌组合物在制备预防或治疗大肠杆菌感染的药物中的应用。
作为上述技术方案的进一步改进，所述大肠杆菌为肠致病性大肠杆菌。
本发明的有益效果：
本发明提供一种能裂解肠致病性大肠杆菌的噬菌体。该噬菌体既能裂解生物体内的肠致病性大肠杆菌，也能裂解环境中的肠致病性大肠杆菌，可以单独或与其他物质复配使用，为消毒净化环境提供一种安全、无毒的噬菌体消杀产品。其可用于开发预防或治疗肠致病性大肠杆菌感染药物，建立使用该噬菌体预防或治疗肠致病性大肠杆菌感染的使用方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为温度与噬菌体产斑量的关系。
图2为噬菌体pH值稳定性的测定结果。
图3为噬菌体FM1017的一步生长曲线。
图4为模拟治疗效果照片。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～ 3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK (K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/ 或B包括(A和B)和(A或B)。
本发明提供一种大肠杆菌噬菌体及其应用与杀菌组合物及其应用，具体提供以下技术方案。
本发明第一方面提供一种大肠杆菌噬菌体，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体FM1017，所述大肠杆菌噬菌体FM1017于2019年12月27 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.19156。
大肠杆菌噬菌体FM1017由辽宁地区某鸡场附近污水中分离得到，可特异性裂解大肠杆菌，特别是肠致病性大肠杆菌。大肠杆菌噬菌体FM1017 适宜生长温度为20～37℃，在37℃时，产斑量最高，噬菌斑直径最大，活力最强。大肠杆菌噬菌体FM1017对pH值的适应范围比较广泛，在pH 值4～12时均保持较高的活性；pH值小于4或大于12时，噬菌体的活性迅速下降；该噬菌体在pH值为8时最稳定，存活率最高，活性最强。大肠杆菌噬菌体FM1017对氯仿和乙醚不敏感。在感染复数大于等于0.01时，大肠杆菌噬菌体FM1017感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度较高，最佳感染复数为0.1～0.01。大肠杆菌噬菌体FM1017感染宿主菌后30min内，噬菌体的量没有增加，该阶段处于潜伏期，即大肠杆菌噬菌体FM1017感染宿主菌的潜伏期约30min；感染宿主菌后30min～90min，噬菌体的量急速增加。经安全性评价试验，表明大肠杆菌噬菌体FM1017在对实验动物具有良好安全性的同时可减少实验动物体内肠致病性大肠杆菌含量。
本发明第二方面提供一种杀菌组合物，所述杀菌组合物中含有第一方面所述的大肠杆菌噬菌体。
可以理解的，所述杀菌组合物可用于灭杀环境空间中的大肠杆菌，也可用于杀灭禽畜体表肠致病性大肠杆菌，还可用于预防或治疗大肠杆菌感染。
可选地，所述杀菌组合物为溶液、悬浮液、粉末、喷雾剂或软膏形式。
可选地，所述杀菌组合物还含有载体。
优选地，所述载体包括水、油、表面活性剂、蛋白胨中的至少一种。
本发明第三方面提供第一方面所述的大肠杆菌噬菌体，或第二方面所述的杀菌组合物在杀灭大肠杆菌中的应用。
可以理解的，所述杀灭大肠杆菌可以是杀灭空间环境中肠致病性大肠杆菌，也可以是杀灭禽畜体表肠致病性大肠杆菌。所述空间环境包括养殖环境，所述养殖环境包括料槽地面、墙壁、粪便和垫料等。
可选地，所述大肠杆菌为肠致病性大肠杆菌。
可选地，所述大肠杆菌噬菌体的感染复数≥0.01。
可选地，所述大肠杆菌噬菌体的感染复数为0.01～0.1。
本发明第四方面提供第一方面所述的大肠杆菌噬菌体，或第二方面所述的杀菌组合物在制备预防或治疗大肠杆菌感染的药物中的应用。
所述药物可以用于防治人和动物鸡、猪、牛、鹅、鸭肠出血性大肠杆菌感染。
可以理解的，所述药物可以为溶液、悬浮液、粉末、喷雾剂或软膏形式，所述药物中还含有其他药学上可接受的载体。
可选地，所述大肠杆菌为肠致病性大肠杆菌。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例涉及的菌株、试剂及培养基实施例中涉及的宿主菌、细菌为肠致病性大肠杆菌E.coli 1.2463。
实施例1
噬菌体分离纯化
1、噬菌体分离
将污水样品在4℃离心机中离心后弃杂质，然后用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，留上清液。取上清液与宿主菌一起加入到LB液体培养基中, 温度37℃，转速200r/min，培养16～18h后取出。将混合培养液收集到离心管中，放入4℃离心机中离心去除菌体，设置转速为10000r/min，离心 10min。取离心后的噬菌体上清液使用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，所得滤液即为噬菌体原液。
2、噬菌体验证
吸取0.1mL噬菌体原液与0.1mL宿主菌过夜培养后的菌液滴于空无菌培养上。将约49℃的LB半琼脂培养基，倒入培养基，轻轻旋转平皿尽量使混合液分布均匀，凝固后，放于37℃恒温箱中培养过夜，观察有无噬菌斑生长。如果平板上生长有蚕蚀状的空斑，则可以认为噬菌体原液中确实存在宿主菌的噬菌体。
3、噬菌体纯化
用枪头挑取透亮且直径较大的噬菌斑，置于SM保存液中，吸取其中一部分液体与宿主菌液一起加入到LB液体培养基中，进行液体增殖，6h 后取出混合液，离心，取上清，用SM液作10倍梯度稀释。取稀释液100μL 与宿主菌液100μL混合均匀，加入49℃半琼脂LB培养基中，旋转平皿使混合液分布均匀，凝固后，放入37℃恒温箱中过夜培养。重复以上操作3～5次后，即可获得大小和形状均一的噬菌斑，完成噬菌体的纯化过程。挑取单噬斑置于SM保存液中，放于4℃冰箱保存。
4、噬菌体浓缩
(1)接菌：灭菌后的LB液体培养基中接种宿主菌的一个单菌落，放于 37℃摇床中振荡培养过夜。
(2)转接：三个500mL的锥形瓶分别装有300mL的LB液体培养基，已高压灭菌处理，按1:100的比例接入2mL过夜培养的宿主菌液，放于 37℃摇床中振荡培养至宿主菌处于对数生长初期。
(3)按感染复数为0.1的比例向宿主菌培养液中加入噬菌体，放于37℃摇床中继续振荡培养6h。
(4)将锥形瓶中的混合培养液转移到无菌50mL离心管中，用4℃离心机进行离心，设置转速和时间分别为10000r/min和20min，离心三次以上以去掉细菌碎片。向离心后的上清液中加入DNase I和RNase A至终浓度达到1μg/mL，并且室温静置30min。
(5)向离心后的上清液中加NaCl，终浓度达到1mol/L，NaCl可以促使细菌碎和噬菌体分离。玻璃棒搅拌混合均匀，冰浴1h，4℃离心机进行离心，设置转速和时间为10000r/min和10min，去除细菌碎片，收集上清液。
(6)向裂解上清液中加入PEG8000，其终浓度为10％(每100mL溶液中加入10g的PEG8000)，避免剧烈震荡，轻轻上下颠倒使其混合均匀后，放于4℃冰箱中过夜，在PEG8000的作用下噬菌体颗粒沉淀到管底部。
(7)4℃离心机中离心，设置转速和时间分别为10000r/min和10min，噬菌体颗粒全部沉淀到管底部，弃掉上清，将离心管倒置，计时5min，使残余液体流干，并用移液器吸尽残余液体。
(8)反复用1mL PBS缓冲液重悬噬菌体颗粒沉淀三次。
(9)加入等体积的氯仿进行抽提，氯仿去除PEG8000及细菌碎片，抽提三次。37℃缓慢震荡1min，4℃离心机中离心，4000r/min离心15min，回收含噬菌体的上层水相部分，4℃保存。
5、纯化噬菌体
(1)在14mL离心管中按密度从高到低，依次加入密度为1.7g/mL、1.5 g/mL、1.45g/mL、1.32g/mL的CsCl，各梯度液均为2mL，加样要缓慢轻柔，保持梯度液间界面清晰。
(2)将噬菌体液小心加入到梯度液的上层，4℃离心，25000r/min水平离心2h～2.5h。
(3)沿管壁慢慢插入无菌注射器，吸取淡蓝色噬菌体颗粒。
(4)4℃，用1000倍体积的透析液透析过夜，更换三次透析液，获得纯化的噬菌体。
实施例2
噬菌体的最适生长温度的测定
提前调整好水浴锅温度，将噬菌体放于10℃、20℃、30℃、37℃、 40℃水浴锅中，持续60min后，各取100μL噬菌体液与100μL宿主菌液利用双层琼脂平板法作噬斑实验，待平板凝固后放于相应的温度下培养，重复实验三次，培养10h或者培养过夜，观察结果。重复实验三次。
表1不同温度下噬菌斑形态
Figure BDA0002377266110000091
噬菌体最适生长温度的结果见表1和图1，结果表明：噬菌体在37℃时，产斑量最高，噬菌斑直径最大，即活力最强；在20℃以下，活力迅速降低。
实施例3
噬菌体的pH值稳定性实验
调整LB液体培养基的pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11，每个pH值均取100μL，加入100μL 108pfu/mL的噬菌体液混匀，37℃作用60min。从每管中各取100μL，铺双层琼脂平板，37℃培养过夜，进行噬菌斑计数，测定噬菌体的效价。重复实验三次。
表2噬菌体pH值稳定性的测定结果(单位：pfu/mL)
Figure BDA0002377266110000092
Figure BDA0002377266110000101
噬菌体pH值稳定性的测定结果如表2和图2所示，在pH值4～12时均保持较高的活性，说明该噬菌体对pH值的适应范围比较广泛；pH值小于4或大于12时，噬菌体的活性迅速下降；该噬菌体在pH值为8时最稳定，存活率最高，活性最强，其最适的pH值应为8。
实施例4
氯仿敏感性实验
向1mL 108pfu/mL的噬菌体液中加入50μL氯仿，氯仿终浓度为5％， 4℃放置过夜，吸取上层液体铺双层琼脂板，测定噬菌体效价。对照组噬菌体液中不加氯仿，其余处理完全一致。
实施例5
乙醚敏感性实验
向800μL浓度为108pfu/mL的噬菌体液中加入200μL乙醚，乙醚终浓度为20％，冰浴振荡1h，设置离心转速和时间分别为2000r/min和20 min，吸取上层液体铺双层琼脂板，测定噬菌体效价。对照组噬菌体液中不加乙醚，其余处理完全一致。
表3氯仿敏感性和乙醚敏感性实验结果
Figure BDA0002377266110000102
氯仿敏感性和乙醚敏感性实验结果如表3所示，由表3可知，该噬菌体能耐氯仿和乙醚，处理后噬菌体滴度无明显变化，对氯仿和乙醚不敏感。
实施例6
噬菌体的最佳感染复数(MOI)的测定
感染复数(MOI)的定义为噬菌体与宿主菌数量的比值。
首先，将处于对数生长期的宿主菌用新鲜的LB液体培养液洗涤，然后将细菌的浓度调整为1.0×108cfu/mL。按照感染复数(MOI)分别为0.01，0.1， 1，10和100的比例，将相应数量的噬菌体液加入到已准备好的菌液中，混匀，37℃，200r/min震荡培养8h。将混合培养物4℃离心，用0.22μm微孔滤膜过滤除去菌体，得到裂解液。用双层琼脂平板法测定裂解液中噬菌体的效价，产生最高效价的感染复数即为最佳感染复数(MOI)。同样条件下设置3个重复实验。
表4噬菌体最佳感染复数的测定
Figure BDA0002377266110000111
实验结果，感染复数MOI为0.1和0.01时噬菌体感染宿主菌产生子代噬菌体的滴度分别为1.0×1010pfu/mL和9.9×109pfu/mL，在7个感染复数中噬菌体的滴度最高，因此可以确定噬菌体的最佳感染复数在0.1～0.01之间。
实施例7
噬菌体的一步生长曲线的测定
噬菌体液与宿主菌液以感染复数为0.1的比例加入到新鲜的LB液体培养基中，37℃孵育10min，10000r/min离心1min，弃掉上清，用新鲜的 LB液体洗涤两次。加入等体积37℃预热的LB液体培养基，充分混匀，迅速置于37℃摇床中振荡培养。同时开始计时，在0时刻和每隔5min取样一次，采用双层琼脂平板法测定噬菌体的效价(滴度)。以感染时间为横坐标，噬菌体效价(滴度)为纵坐标，绘制噬菌体的一步生长曲线。同样条件下设置3个重复实验。
结果如图3所示，从图3可以清晰看出噬菌体FM1017感染宿主菌后 30min内，噬菌体的量没有增加，该阶段处于潜伏期，即噬菌体FM1017 感染宿主菌的潜伏期约30min；噬菌体FM1017感染宿主菌后30min～90 min，噬菌体的量急速增加。
实施例8
噬菌体的安全性评价试验
参考Fujii方法，在口服灌胃接种肠致病性大肠杆菌的同时腹腔注射丝裂霉素(2.5mg/kg)，接种细菌的剂量为2×109CFU/只。选取离乳小鼠40 只，随机分为4组，每组10只，口服灌胃接种，接种剂量为2×109CFU/ 只，接菌的同时腹腔注射丝裂霉素(2.5mg/kg体重)。第1组接种前6h 腹腔注射剂量为2×109pfu/只的噬菌体悬液(感染复数为1)；第2组在灌胃接种的同时腹腔注射剂量为2×109pfu/只的噬菌体悬液(感染复数为1)；第3组接种6h后腹腔注射剂量为2×109pfu/只的噬菌体悬液(感染复数为 1)；第4组为对照组，腹腔注射相同剂量的生理盐水。每天记录观察小鼠临床症状。发现死亡的小鼠，死亡后立即剖检。未死亡受试小鼠14d后扑杀剖检。
表5噬菌体的毒性实验
Figure BDA0002377266110000121
噬菌体对小鼠的毒性反应结果如表5所示，经观察噬菌体实验组与对照组小鼠均未出现精神不振、食欲减退、粪便异常及死亡等任何临床症状，剖检没有发现组织脏器任何病理变化，说明该噬菌体不会引起小鼠发生疾病，对实验小鼠具有良好的安全性。图4为第3组小鼠接种细菌后的粪便大肠杆菌计数(图4中左边的培养皿)，及6小时后灌胃噬菌体的粪便大肠杆菌计数照片(图4中右边的培养皿)，表明该噬菌体在对小鼠具有良好安全性的同时可减少小鼠体内肠致病性大肠杆菌含量。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (10)

1.一种大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体为大肠杆菌噬菌体FM1017，所述大肠杆菌噬菌体FM1017于2019年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19156。
2.一种杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物中含有权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体。
3.根据权利要求2所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物为溶液、悬浮液、粉末、喷雾剂或软膏形式。
4.根据权利要求2所述的杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物还含有载体；
优选地，所述载体包括水、油、表面活性剂、蛋白胨中的至少一种。
5.权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体，或权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物在杀灭大肠杆菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌为肠致病性大肠杆菌。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体的感染复数≥0.01。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌噬菌体的感染复数为0.01～0.1。
9.权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体，或权利要求2～4任一项所述的杀菌组合物在制备预防或治疗大肠杆菌感染的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌为肠致病性大肠杆菌。
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