CN114672467A - 一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法 - Google Patents
一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114672467A CN114672467A CN202210373646.9A CN202210373646A CN114672467A CN 114672467 A CN114672467 A CN 114672467A CN 202210373646 A CN202210373646 A CN 202210373646A CN 114672467 A CN114672467 A CN 114672467A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phage
- vibrio parahaemolyticus
- litopenaeus vannamei
- preventing
- treating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 title claims abstract description 53
- 241000238553 Litopenaeus vannamei Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 12
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 12
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 241000701553 Myoviridae Species 0.000 description 3
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000237519 Bivalvia Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001533364 Portunus trituberculatus Species 0.000 description 1
- 241001417495 Serranidae Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000005276 aerator Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000020639 clam Nutrition 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003640 drug residue Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 101150013736 gyrB gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000514 hepatopancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- -1 pplication Species 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
- A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
- C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F2303/00—Specific treatment goals
- C02F2303/04—Disinfection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Birds (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Hydrology & Water Resources (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于微生物领域，公开了一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法。本发明利用双层平板法，将副溶血弧菌JGB080708‑1作为宿主，从养殖池水中分离出副溶血弧菌噬菌体Vp‑PV1。噬菌体Vp‑PV1效价高达8.9×109pfu/mL，防治副溶血弧菌JGB080708‑1效果显著，对于治疗副溶血弧菌引起的病害和开发噬菌体微生态制剂具有重大意义。
Description
技术领域
本发明提供了一种副溶血弧菌噬菌体及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
副溶血弧菌作为一种嗜温嗜盐及兼性厌氧革兰阴性短杆菌，广泛分布于世界各地近海岸的海水以及海底沉积物中。该细菌是造成鱼贝虾蟹等海水养殖动物暴发疾病的重要病原之一，可感染石斑鱼、文蛤、凡纳滨对虾、三疣梭子蟹等多种水产动物，对海水养殖业造成了较大的经济损失。目前，水产养殖生产中仍主要通过抗菌药物及消毒剂等化学药物防治弧菌引起的疾病，然而滥用化学药物会造成诸多问题，如细菌产生耐药性，养殖水环境微生态遭到破坏等，而且药物残留还会带来食品安全问题。因此，水产养殖中亟需寻找安全、有效的抗生素替代品用以防控水产动物细菌性疾病。
高密度养殖导致水产养殖动物疾病频发，其中细菌性疾病更是严重制约了水产养殖业的可持续发展。抗生素是目前的主流抗菌手段，但其大规模滥用使得细菌耐药性问题越发严重。耐药菌株的出现不仅在水产养殖行业的发展中产生问题，还危机到水产品的安全及人类公共安全。因此，寻找安全、有效、绿色的抗生素替代品用以防控水产动物细菌性疾病迫在眉睫。
噬菌体作为一种能够进入细菌体内破坏细菌的细胞结构以及引起细菌致死的微生物，其抗菌机理为“吸附-侵入-增殖-成熟-释放”，受到侵染的病原菌裂解释放出更多的子代噬菌体去侵染更多的病原菌，直到有害菌彻底杀灭。噬菌体具有专一性强、不易产生抗性、代谢快、易开发及成本低等优点，在水产养殖业防治细菌性疾病方面具有广阔的应用前景。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌病的方法，所述方法可被用于防治副溶血弧菌感染导致的疾病，且解决致病菌耐药性而导致用药无效等问题。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法，取凡纳滨对虾养殖池水为采集样品，离心后用微孔滤膜过滤上清液；将滤液、宿主菌菌悬液和2216E液体培养基混合后放置于恒温培养箱中培养，培养后重复上述离心、过滤操作，收集滤液为噬菌体原液；采用双层平板法对噬菌体进行分离，挑取透明噬菌斑进行纯化，重复若干次直至噬菌斑大小基本一致，得到防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的噬菌体。
进一步的，在12000rpm条件下离心10min。
进一步的，将滤液、宿主菌菌悬液和2216E液体培养基混合后放置于37℃恒温培养箱中培养12h。
进一步的，将副溶血弧菌接种在含有2％Nacl的5ml肉汤培养基中，37℃、150r/min转速条件下恒温过夜培养。
本发明还提供一种水体消毒方法，在水体中添加上述的噬菌体。
进一步的，处理温度为40～60℃。
进一步的，处理pH为7。
本发明还提供一种凡纳滨对虾饲料，所述饲料中添加上述的噬菌体。
进一步的，按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体与饲料混合均匀。
本发明副溶血弧菌噬菌体Vp-PV1，透射电镜观察表明，该噬菌体为有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科(Myoviridae)，头部呈正六边形，头部衣壳直径约为89.1nm，尾部长约为222.7nm，一步生长曲线表明该噬菌体感染宿主菌的潜伏期约为40min，裂解期约为30min，裂解量约83.2PFU/感染细胞，裂解性较强。在pH处于7时，噬菌体效价最高，为3.16×109PFU/mL。该噬菌体在pH 3～12的区间内都具有活性，这说明该噬菌体具有良好的酸碱耐受性。此噬菌体可特异性地裂解本实验室保存的副溶血弧菌JGB080708-1(16S rRNA基因GenBank登录号为GQ205448、gyrB基因序列登录号为GQ205453)，最佳感染复数为100。
一株用于防治凡纳滨对虾副溶血弧菌病的噬菌体，其分离和扩培包括如下步骤：
步骤A：宿主菌的分离纯化，本发明的副溶血弧菌从大量的凡纳滨对虾的病虾肝胰腺中分离获得；
步骤B：宿主菌的扩大培养，将副溶血弧菌接种在含有2％Nacl的5ml肉汤培养基中，37℃、150r/min转速条件下恒温过夜培养；
步骤C：噬菌体分离，从大量的池塘养殖水中分离获得；
步骤D：噬菌体扩培，对分离出的噬菌体进行扩培；
步骤E：噬菌体用于防治副溶血弧菌的裂解生长曲线测定；
本发明提供了一种水体消毒剂，其主要成分为上述副溶血弧菌噬菌体。进一步的，副溶血弧菌噬菌体的浓度为8.9×109PFU/mL。此浓度下，水体消毒剂的杀菌效果最显著，上述水体消毒剂使用便捷，可高效控制养殖环境中副溶血弧菌的数量。
进一步的，所述水体清洁剂可生产制备为不同剂型，对水体实现杀菌消毒的作用，剂型包括溶液剂、分散体、混悬剂和粉剂。
本发明还提供一种凡纳滨对虾的饲料添加剂，有效成分包括上述副溶血弧菌噬菌体。在对虾饲料中加入上述噬菌体作为饲料添加剂，可抑制因副溶血弧菌引起的疾病，减小发病率，提高成活率。进一步的，饲料中副溶血弧菌噬菌体满足含量在8.9×107PFU/g以上的条件时，对凡纳滨对虾防治由副溶血弧菌感染的疾病作用效果最显著。
进一步的，上述噬菌体通过浸浴的方式作用于凡纳滨对虾后，在上述虾体内注射致病性副溶血弧菌，实验结果表明浸浴噬菌体能够明显降低对虾的死亡率，有效提高保护率。进而推断，在对虾虾苗分塘前，噬菌体制剂的应用能够防治因副溶血弧菌引起的死亡，提高对虾的存活率。
有益效果
本发明利用双层平板法从扬州高邮凡纳滨对虾养殖废水中分离到一株噬菌体，该噬菌体对副溶血弧菌具有强烈的裂解作用，可由宿主菌特异性扩增，且产量高(其效价可达8.9×109PFU/mL)，为工业化生产噬菌体及其应用提供了较好的来源。
上述噬菌体单次泼洒养殖水体后，可以有效降低水体中副溶血弧菌的数量，将噬菌体作为饲料添加进行拌料后投喂凡纳滨对虾，或者在对虾虾苗分塘处理前用噬菌体浸浴，可以高效预防和治疗因副溶血弧菌引起的疾病，降低死亡率，提高成活率，减小养殖风险。
附图说明
图1为本发明的噬菌体Vp-PV1的噬菌斑形态；
图2为本发明的噬菌体Vp-PV1的电子显微镜观察结果；
图3为噬菌体Vp-PV1的一步生长曲线图；
图4为噬菌体Vp-PV1的热稳定性检测结果；
图5为噬菌体Vp-PV1的pH稳定性检测结果。
具体实施方式
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1噬菌体的分离与鉴定
(1)噬菌体分离及纯化
取江苏如东凡纳滨对虾养殖池水为采集样品，在12000rpm条件下离心10min,用0.22μm微孔滤膜过滤上清液。将滤液、宿主菌菌悬液和2216E液体培养基混合后放置于37℃恒温培养箱中培养12h，培养后重复上述离心、过滤操作，收集滤液为噬菌体原液。
采用双层平板法对噬菌体进行分离，挑取透明噬菌斑进行纯化，如此重复3-5次，直至噬菌斑大小基本一致，直径约为3-4mm，如图1。由此得到一株噬菌体，并将其命名为Vp-PV1。
(2)噬菌体的电镜观察
在铜网上滴取20μL噬菌体原液，自然沉淀15min，多余的液体用滤纸从侧面吸去，在铜网滴加15μL 2％的磷钨酸(PTA)，染色10min，用滤纸吸去染色液，干燥后用透射电镜观察并拍照。形态结果参见图2，噬菌体Vp-PV1为有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科，头部呈正六边形，头部衣壳直径约为89.1nm，尾部长约为222.7nm。
实施例2检测噬菌体生物学特性
(1)噬菌体效价的测定
利用盐水对噬菌体原液进行10倍梯度的稀释，取各个稀释梯度下100μL噬菌体稀释液，同时将其和100μL对数期宿主菌悬液进行充分混合。28℃培养12h，直到能够清楚观察到噬菌斑为止。上述步骤重复3次，最后取噬菌斑为30～300之间的平板进行计数，计算效价。
(2)噬菌体最佳感染复数(MOI)的测定
根据MOI是1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001的百分比，依次吸取100μL，添加到含有2％NaCl的5ml肉汤培养基中，37℃、150r/min转速条件下恒温培养3h，提取上清液并过滤，采用双层平板测定不同感染复数下的效价，结果如表1所示。
表1噬菌体的最佳感染复数(MOI)测定结果
当MOI处于0.01时其效价为8.9×109PFU/mL达到最高，从而确定噬菌体的最佳感染复数为0.01。
(3)噬菌体对宿主裂解曲线(一步生长曲线)
以MOI为100的比值均匀混合500μL噬菌体和500μL的宿主菌，于37℃温度下培养30min，将其放在转速为10 000r/min离心机中高速离心3min，弃去上清液，用LB培养基将剩余的噬菌体洗涤除净。将沉淀吹打后移入含2％NaCl的5mL新鲜肉汤，置于37℃摇床培养，分别在0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120min时间进行取样，测定噬菌体滴度同时制作噬菌体的一步生长曲线。
由图3可知噬菌体HH109在0～40min时处于潜伏期，裂解期为30min，其效价最高可达8.9×109PFU/mL，在感染的早期阶段宿主菌浓度是1.07×106CFU/mL。进而计算得出其平均裂解量为83.2PFU/细胞，该结果反映了噬菌体的生长速率较快，繁殖效率较高。
(4)噬菌体对温度和pH稳定性的测定
取效价是8.9×109PFU/mL的噬菌体液1.0mL在无菌EP管内，在40～70℃的范围内，每10℃为一个梯度分别进行水浴处理0.5、1、1.5h，等到温度不再发生变化后，依次取100μL，利用双层平板法对以上噬菌体恒温培养1d，测定其效价。
具体结果参照图4，在不同控制温度下，噬菌体Vp-PV1在40℃时，裂解效价最高，可达7.9×109PFU/mL(1.5h)。在外界温度为50℃的情况下，对其处理半小时之后效价显著降低，而后趋于稳定。在60℃条件下，效价随温度的升高和处理时间的延长而逐步下降至3.16×108PFU/mL。70℃水浴0.5小时，噬菌体即失活。通过热稳定分析表明，噬菌体HH109在40～60℃范围内活性较稳定，在超过60℃条件下难以长时间存活。
利用酸碱中和的方法调配pH，将100μL噬菌体液分别在pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的含2％NaCl的肉汤培养基中进行充分混匀，将其放置在37℃恒温培养箱内进行培养，最后准确测定其效价。
由图5可以发现，在pH处于7时，噬菌体效价最高，为3.16×109PFU/mL。该噬菌体在pH 3～12的区间内都具有活性，这说明该噬菌体具有良好的酸碱耐受性。
实施例4：噬菌体水体消毒试验
5L无菌海水，每桶放入10尾凡纳滨对虾，加热棒控温使温度保持在23℃增氧机连接小气泵增氧，在体系中加入一定体积的副溶血弧菌JGB080708-1，将最终浓度调至1.0×106CFU/mL，1.5h后把不同稀释浓度的噬菌体Vp-PV1分别加入海水中，使其最终感染复数为100：1和10:1，攻毒组加入等体积的2216E培养基，每组设置平行。分组详情和水体消毒试验效果图见表2。于2、6、12、24h后用涂布平板法检测水体中副溶血弧菌的数目，数据如表3所示。
表2水体消毒试验分组
表3水体消毒试验副溶血弧菌残留量(CFU/mL)
噬菌体在养殖水体中能够显著降低副溶血弧菌高达3个数量级的活菌数目，所以噬菌体能够作为水体消毒剂杀灭副溶血弧菌。
实施例5：噬菌体预防副溶血弧菌感染凡纳滨对虾效果测定
(一)噬菌体拌料饲喂凡纳滨对虾预防副溶血弧菌效果测定
每组选取50只规格大小一致且体重为6g左右的健康凡纳滨对虾，实验组设置双平行，且按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体与饲料混合均匀。对照组按照同样剂量用2216E培养基浸泡饲料后饲喂。1.5h后给所有对虾注射副溶血弧菌，剂量为1×106CFU/只。记录各组48h内死亡对虾数目并计算保护率，具体结果如表4所示。
表4噬菌体拌料对副溶血弧菌的预防效果
由数据可见，噬菌体拌料可以有效地防治副溶血弧菌，减少死亡率，提高成活率，一定程度上降低了养殖风险。
(二)浸浴噬菌体预防副溶血弧菌感染凡纳滨对虾效果测定
每组选取50只规格大小一致且体重为6g左右的健康凡纳滨对虾，实验组设置平行试验，浸浴效价为1×108PFU/ml的噬菌体，对照组加入2216E培养基，2h后给对虾注射剂量为1×106CFU/只的副溶血弧菌，养殖期间正常饲喂。记录48h内的死亡数目并计算保护率，可由表5知具体结果。
表5浸浴噬菌体对副溶血弧菌的预防效果
结果表明，浸浴噬菌体能有效防治凡纳滨对虾感染副溶血弧菌。结合(一)可知，浸浴与拌料同时应用能够降低对虾的死亡率，提高保护率，从而降低养殖风险，增强养殖效益。
Claims (10)
1.一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法，其特征在于，取凡纳滨对虾养殖池水为采集样品，离心后用微孔滤膜过滤上清液；将滤液、宿主菌菌悬液和2216E液体培养基混合后放置于恒温培养箱中培养，培养后重复上述离心、过滤操作，收集滤液为噬菌体原液；采用双层平板法对噬菌体进行分离，挑取透明噬菌斑进行纯化，重复若干次直至噬菌斑大小基本一致，得到防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的噬菌体。
2.根据权利要求1所述的防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法，其特征在于，在12000rpm条件下离心10min。
3.根据权利要求1所述的防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法，将滤液、宿主菌菌悬液和2216E液体培养基混合后放置于37℃恒温培养箱中培养12h。
4.根据权利要求1所述的防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法，其特征在于，将副溶血弧菌接种在含有2％Nacl的5ml肉汤培养基中，37℃、150r/min转速条件下恒温过夜培养。
5.根据权利要求1所述的防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法，其特征在于，噬菌体MOI为0.01。
6.一种水体消毒方法，其特征在于，在水体中添加权利要求1所述的噬菌体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，处理温度为40～60℃。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，处理pH为7。
9.一种凡纳滨对虾饲料，其特征在于，所述饲料中添加权利要求1所述的噬菌体。
10.根据权利要求9所述的凡纳滨对虾饲料，其特征在于，按照体积与质量比为5％的添加量，将噬菌体与饲料混合均匀。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210373646.9A CN114672467A (zh) | 2022-04-11 | 2022-04-11 | 一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210373646.9A CN114672467A (zh) | 2022-04-11 | 2022-04-11 | 一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114672467A true CN114672467A (zh) | 2022-06-28 |
Family
ID=82077298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210373646.9A Pending CN114672467A (zh) | 2022-04-11 | 2022-04-11 | 一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114672467A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018117462A2 (ko) * | 2016-12-21 | 2018-06-28 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Ｖｉｂ-ＰＡＰ-4 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 |
| KR101915486B1 (ko) * | 2017-05-10 | 2018-11-08 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-7 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 |
| CN110317792A (zh) * | 2019-06-03 | 2019-10-11 | 台州学院 | 副溶血弧菌噬菌体vp-hyp2及其应用 |
| CN111172119A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-05-19 | 青岛诺安百特生物技术有限公司 | 具有宽裂解谱的新副溶血弧菌噬菌体、其特异性引物及其应用 |
| CN113201501A (zh) * | 2020-08-06 | 2021-08-03 | 青岛诺安百特生物技术有限公司 | 一株具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体及其应用 |
-
2022
- 2022-04-11 CN CN202210373646.9A patent/CN114672467A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018117462A2 (ko) * | 2016-12-21 | 2018-06-28 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Ｖｉｂ-ＰＡＰ-4 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 |
| KR101915486B1 (ko) * | 2017-05-10 | 2018-11-08 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Vib-PAP-7 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도 |
| CN110317792A (zh) * | 2019-06-03 | 2019-10-11 | 台州学院 | 副溶血弧菌噬菌体vp-hyp2及其应用 |
| CN111172119A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-05-19 | 青岛诺安百特生物技术有限公司 | 具有宽裂解谱的新副溶血弧菌噬菌体、其特异性引物及其应用 |
| CN113201501A (zh) * | 2020-08-06 | 2021-08-03 | 青岛诺安百特生物技术有限公司 | 一株具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210046131A1 (en) | Wide-spectrum salmonella phage and application thereof | |
| CN109207440B (zh) | 弧菌噬菌体及其杀菌组合物制备方法和应用 | |
| CN113583971B (zh) | 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用 | |
| CN113201501A (zh) | 一株具有跨种裂解能力的弧菌噬菌体及其应用 | |
| CN109310721B (zh) | 噬菌体菌株及其应用 | |
| CN113201505B (zh) | 一株具备跨种裂解能力的溶藻弧菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 | |
| CN111575243B (zh) | 坎氏弧菌噬菌体及其应用 | |
| CN111363724B (zh) | 一种新型噬菌体、噬菌体混合制剂及其在防治水貂出血性肺炎的药物中的应用 | |
| CN115197919B (zh) | 弧菌噬菌体组合物及其制备方法和应用 | |
| CN114480302B (zh) | 一株海藻希瓦氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 | |
| CN111057681A (zh) | 一株噬菌体及其应用 | |
| CN113430176B (zh) | 一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体rdp-sa-21004及其应用 | |
| CN113444695B (zh) | 一株发酵效率高且临床效果好的大肠杆菌噬菌体及其应用 | |
| CN114672467A (zh) | 一种防治凡纳滨对虾副溶血弧菌的方法 | |
| CN111363723B (zh) | 新型霍乱弧菌噬菌体及其应用 | |
| CN114703150A (zh) | 环境耐受的嗜水气单胞菌噬菌体zpah34及应用 | |
| CN110468110B (zh) | 一种副溶血弧菌噬菌体及其在刺参疾病预防中的应用 | |
| CN111187757A (zh) | 大肠杆菌噬菌体及其应用与杀菌组合物及其应用 | |
| CN113755451B (zh) | 一株大肠杆菌噬菌体gn6及其应用 | |
| CN115161290B (zh) | 一株具有宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体及其用途 | |
| CN113755452B (zh) | 一株大肠杆菌噬菌体gn5及其应用 | |
| CN114736877B (zh) | 一株杀鱼爱德华氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 | |
| CN114763539B (zh) | 一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用 | |
| CN115851617B (zh) | 一种大肠杆菌噬菌体lhe83及其应用 | |
| CN116987674A (zh) | 一株副溶血弧菌噬菌体及其制备的抗菌剂和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |