CN110468110B - 一种副溶血弧菌噬菌体及其在刺参疾病预防中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一株能够特异性裂解副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)菌株的噬菌体分离物，及该噬菌体在海参疾病预防领域中的应用，从而提高海参养殖企业的经济效益，并从源头保障食品安全。该副溶血弧菌噬菌体vB_VpaP_VP‑ABTNL‑1，其保藏编号为CGMCC No.17991。本发明提供的副溶血弧菌噬菌体应用于刺参疾病预防中，可有效预防养殖过程中副溶血弧菌的感染。

Description

一种副溶血弧菌噬菌体及其在刺参疾病预防中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株能够特异性裂解副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)菌株的噬菌体分离物及其在海参疾病预防领域中的应用。
背景技术
刺参(Apostichopus japonicus)是我国北方沿海地区最具规模的经济类海水养殖动物，具有极高的药用价值和商业价值。2017年我国海参总产量达22.0万吨、养殖面积达21.9万公顷，其中辽宁、山东、福建占据绝大部分。目前我国海参行业产值已超过500亿元。然而，近年随着刺参养殖规模和养殖密度的迅速增大，养殖水体逐渐恶化，病害问题也日趋严重。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能引起刺参参体溃烂至死亡，引发各类继发性细菌感染，严重限制海参养殖业的持续健康发展。同时副溶血弧菌也是一种重要的食源性致病菌，极易引起人类的急性水样粪便和痉挛性腹痛，成为辽宁地区引起感染性腹泻的主要致病菌之一。
目前，对副溶血弧菌感染的防治措施以预防为主，治疗为辅，据报道，发病后使用抗生素的治疗效果并不理想，且容易产生大量耐药菌株和药物残留等问题。因此，有效避免环境中水质恶化及微生物的大量繁殖是防控此类疾病的重点。通过噬菌体这种绿色的生物抑制剂可有效的预防池底微生物大量增殖，维持养殖环境微生态平衡。
噬菌体是一种感染、抑制和杀死易感细菌的病毒。裂解性噬菌体(以下简称噬菌体)能够特异性感染宿主细菌并将其裂解，利用这一特性可以将噬菌体应用于抗菌治疗。近年来，随着细菌对抗生素耐药性的增加，噬菌体疗法作为一种有效的抗生素替代疗法再次进入了大众的视野。到目前为止，噬菌体疗法对动物和人类的某些疾病具有治疗和预防的作用。目前，在美国以及一些东欧国家，噬菌体已经成功地应用于动物性食品生产过程中，并批准使用一系列控制沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、李斯特菌、金黄色葡萄球菌等细菌性感染的噬菌体产品。《2019年全国水产养殖用药减量行动方案》指出，通过各地实施水产养殖用药减量行动，参与行动养殖企业使用兽药总量同比平均减少5％以上，使用抗生素类兽药平均减少20％以上；农业农村部《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案(2018—2021年)》也指出，要在2020年底实现饲料零药物添加，并鼓励积极探索使用兽用抗菌药替代品，逐步减少促生长兽用抗菌药使用品种和使用量，提高健康养殖水平。
噬菌体作为预防和治疗水产养殖中细菌疾病药物的几种应用模式已有记载，包括拌饲投喂、肌内或腹腔内给药、肛门插管以及浸没或直接释放于培养体系中。虽然每种应用模式各有利弊，但主要取决于细菌病原体的性质。基于幼年刺参的池塘养殖模式和弧菌爆发特点，开发一种能够在刺参倒池过程中用于浸浴或直接喷洒于池塘的噬菌体制剂。
发明内容
为了预防海参养殖中由副溶血弧菌引起的疾病，降低由该病引起的死亡率，本发明提供了一种副溶血弧菌噬菌体，本发明同时提供了该噬菌体在刺参疾病预防中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种副溶血弧菌噬菌体vB_VpaP_VP-ABTNL-1，所述噬菌体以副溶血弧菌为宿主分离得到，命名为vB_VpaP_VP-ABTNL-1。该噬菌体于2019年6月13日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC No.17991，分类命名为副溶血弧菌噬菌体。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
本发明副溶血弧菌噬菌体vB_VpaP_VP-ABTNL-1透射电镜观察表明，该噬菌体为有尾噬菌体目，短尾噬菌体科，头部衣壳直径为190±1.1nm，尾部长9±1.2nm；一步生长曲线表明该噬菌体感染宿主菌的潜伏期约30min，裂解量约125PFU/感染细胞，裂解性较强。
本发明另一方面还提供了副溶血弧菌噬菌体vB_VpaP_VP-ABTNL-1在海参疾病预防中的应用，使用本发明副溶血弧菌噬菌体菌液对疾病爆发期的刺参进行浸浴或将本发明副溶血弧菌噬菌体液稀释后进行参池喷洒，每隔5天浸浴或喷洒1次，连续进行3次，每次施用用量≥107pfu/m3养殖水体，可以达到治疗或预防相应疾病的效果。
本发明第三方面提供了一种包含上述副溶血弧菌噬菌体vB_VpaP_VP-ABTNL-1的杀菌剂。
本发明有益效果：
1.副溶血弧菌感染是刺参养殖过程中严重的细菌性疾病，使用本发明裂解性噬菌体，以浸浴的方式施用噬菌体，可降低副溶血弧菌丰度，有效预防养殖过程中副溶血弧菌的感染，提高幼年刺参成活率，减少经济损失。
2.使用本发明噬菌体控制副溶血弧菌，替代抗生素防治细菌性感染，可减少抗生素在刺参养殖过程中的使用量，降低耐药菌株的出现几率，提高抗生素治疗其他疾病的作用效果。从源头上维护养殖业生产安全、动物源性食品安全、公共卫生安全和生态环境安全。
3.本发明噬菌体制剂可代替传统化药、抗生素的使用，具有无公害，无残留，廉价、高效抗菌等特点，是一种应用前景广阔、潜力巨大的天然杀菌剂。
附图说明
图1副溶血弧菌VP-ABTNL菌落；
图2噬菌体vB_VpaP_VP-ABTNL-1的噬菌斑；
图3透射电镜观察噬菌体vB_VpaP_VP-ABTNL-1形态；
图4噬菌体vB_VpaP_VP-ABTNL-1的一步生长曲线；
图5噬菌体防控刺参副溶血弧菌感染的应用效果；
图6噬菌体悬浮液在刺参养殖场的应用。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
噬菌体的筛选和纯化
(一)水样采集及处理
(1)宿主菌的准备
采集刺参养殖场患病刺参的样本，使用TCBS培养基，分离副溶血弧菌疑似菌落。提取意思菌株的基因组DNA，采用PCR方法扩增致病菌16s rDNA。测序后，NCBI比对(MG589511)，鉴定为副溶血弧菌，命名为副溶血弧菌VP-ABTNL。
将副溶血弧菌VP-ABTNL接种于2216E固体培养基中，保存于4℃冰箱中。筛选用宿主菌经28℃过夜培养，挑取单个菌落，接种于2216E液体培养基中，28℃振荡培养8h后，用于分离噬菌体，附图1。
(2)水样的处理
取来自于大连某刺参养殖场及大连市某水产市场排污口废水样品各200mL，混合后对水样做预处理：加入CaCl2、MgCl2，使其终浓度为1mmol/L，作用大约10min。
(二)水样噬菌体的富集
将上述经过预处理的水样，10000g离心5min，收集上清；将上清过0.22μm滤膜，除菌体、杂质等其他成分，即得噬菌体原液；取10mL滤液加入处于对数生长期(接种后5h左右，噬菌体终浓度达到106-107CFU/mL时，即对数生长期)的50mL菌液中，28℃过夜培养12-18h，目的是使噬菌体数量扩增，观察并记录；收集菌液，10000g离心5min，收集上清，再过滤膜(0.22μm)，即得增殖后的噬菌体上清液。
(三)噬菌体的筛选
采用双层平板法进行噬菌体的鉴定，下层为1.5％琼脂的2216E固体培养基，置于4℃备用，用前放于28℃，约30min；上层为0.7％琼脂2216E培养基，将上层培养基加热溶解，放置于50℃的水浴锅中待用，取8支10mL离心管，分别加1mL宿主菌液，吸取噬菌体悬浮液进行梯度稀释至10-6，将7种不同浓度梯度的噬菌体稀释液分别取出10μL，加到10mL离心管中，设置一个对照组，仅加入1mL宿主菌液和10μL 2216E培养基，在28℃下作用10min，加入5mL含0.5％琼脂的2216E培养基充分混匀后，立刻加到上层，待凝固后，倒置培养24h后观察有无噬菌斑形成。如果在平板上形成空斑则说明在滤液内有针对该宿主菌的裂解性噬菌体存在。
(四)噬菌体的纯化
初次分离的噬菌斑的大小、形状不一致，对分离的噬菌体进一步的纯化，使噬菌体在平板上形成大小及形态一致的噬菌斑，附图2。用无菌200μL枪头挑取形态大小有明显差异的噬菌斑各一个，将其分别加入到1mL无菌PBS的离心管中，涡旋震荡1min，置于4℃，4h，使噬菌体充分释放入PBS中；4℃、10000g离心5min，收集上清，过膜(0.22μm)，将噬菌体虑液进行梯度稀释，双层培养，重复3次上述操作，直至出现的噬菌斑形态、大小完全一致为止，即得到纯化噬菌体。噬菌体电镜照片见附图3。纯化后的噬菌体于2019年6月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为副溶血弧菌噬菌体，保藏号CGMCC No.17991。
(五)噬菌体的富集与扩增
采用液体增殖法进行增殖。具体的方法如下：将噬菌体液按一定比例加入到培养12h的宿主菌液中，再于28℃摇床中培养12h，将混合液于4℃、10000g离心5min，去处细菌碎片，上清液用0.22μm的滤膜过滤，即可获得高效价的噬菌体富集液。
实施例2
噬菌体一步生长曲线测定
噬菌体感染复数(multiplicity of infection,MOI)是指初始感染时加入噬菌体和宿主菌数量的比值。在宿主菌液中加入感染复数为0.1的噬菌体，混匀，28℃静置，吸附15min；4℃11000rpm离心10min，弃上清，沉淀用2216E液体培养基重悬，重复上述离心操作，除尽未吸附的噬菌体。沉淀重悬于100mL 2216E液体培养基中，此时计时为T0＝0；28℃120rpm培养，每隔10min取样测定噬菌体效价。
结果显示，该噬菌体感染宿主菌的潜伏期约30min，裂解量约125PFU/cell，裂解性较强，结果见附图4。
实施例3
安全性实验
选取26只8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，30g±2g，随即分为两组，每组各13只，其中实验组腹腔注射给予本发明噬菌体109pfu/kg的噬菌体液，对照组给予等量生理盐水，连续给予20天后，将小鼠脱颈处死，尸检，其肺部、肝脏、肾脏、腹腔均未发现病变症状，初步验证此计量噬菌体液对小鼠没有影响，具有安全性。
实施例4
噬菌体防控由副溶血弧菌引起的海参疾病应用效果分析
取购自大连某海参养殖厂健康海参40只，随机分成四组，每组10只，采用浸浴方式处理各组。
第一组：阴性对照组。加入副溶血弧菌菌液至终浓度为3×106CFU/mL。
第二组：阳性对照组。加入副溶血弧菌菌液至终浓度为3×106CFU/mL，6h后加入强力霉素至终浓度5mg/L。
第三组：噬菌体实验组。加入噬菌体至终浓度2×106PFU/mL，6h后加入副溶血弧菌菌液至终浓度为3×106CFU/mL(MOI＝1)。
第四组：噬菌体实验组。加入至噬菌体终浓度为2×107CFU/mL，6h后加入副溶血弧菌菌液至终浓度3×106PFU/mL(MOI＝10)。
观察各组刺参的生存状态，统计存活率，结果附图5。由图5可以看出，噬菌体可有效提高受感染刺参的存活率，较高剂量组的效果与抗生素组无显著性差异(p<0.05)，起到良好的预防效果。
实施例5
NaCl-PEG方法纯化噬菌体裂解液(1010PFU/ml)，50L发酵罐扩大培养，板式过滤器并0.22μm滤膜过滤，收集滤液于30L塑料桶中(106PFU/ml)。在刺参腐皮病爆发高峰期间(2018年8月-10月)，每隔12-15天，收集刺参进行倒池浸浴噬菌体悬浮液，浸浴时间20-30分钟，随后将刺参及噬菌体悬浮液一同泼洒入养殖池中，设置三组平行，对照组为抗生素处理组，处理方式同上，考察周期为3次倒池周期，统计刺参增重情况。具体实施细节如下：
实验场次一：大连某海珍品有限公司
时间：2018.8.16-2018.9.20
刺参规格：平均体重2g健康幼参
参池个数：实验组6池(每池20方水体)
噬菌体产品：每次倒池施用20L/池的噬菌体进行浸浴。
养殖条件：水温控制14±1℃，盐度28-30g/L；实验过程养殖池采用24h曝气，避光的方式养殖；每天投喂饲料一次。
噬菌体悬浮液初步应用结果统计如下表1所示，
表1
Figure BDA0002199753240000061
由表1可以看出，浸浴本发明噬菌体，可有效预防刺参疾病爆发，提高刺参生长性能。
实施例6
NaCl-PEG方法纯化噬菌体裂解液(1010PFU/ml)，50L发酵罐扩大培养，板式过滤器并0.22μm滤膜过滤，收集滤液于30L塑料桶中(106PFU/ml)。在刺参腐皮病爆发高峰期间(2019年3月-5月)，每隔12-15天，收集刺参进行倒池浸浴噬菌体悬浮液，浸浴时间20-30分钟，随后将刺参及噬菌体悬浮液一同泼洒入养殖池中，设置三组平行，对照组为抗生素处理组，处理方式同上，考察周期为3次倒池周期，统计刺参增重情况。在实施例5基础上进行更大规模应用效果考察，具体实施细节如下：
实验场次二：大连某大型刺参育苗有限公司
时间：2019.3.06-2019.4.20
刺参规格：平均体重1g健康幼参
参池个数：实验组20池(每池30方水体)
噬菌体产品：每次倒池施用30L/池的噬菌体进行浸浴。
养殖条件：水温控制16±1℃，盐度28-30g/L；实验过程养殖池采用24h曝气，避光的方式养殖；每天投喂饲料一次。
噬菌体悬浮液扩大规模应用结果统计如表2所示：
表2
Figure BDA0002199753240000071
由表2可以看出，浸浴本发明噬菌体，在更大规模的应用上，也可有效预防刺参疾病爆发，提高刺参免疫力和生长性能。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (2)

1.一株副溶血弧菌噬菌体(Vibrio parahaemolyticus phage)在制备由副溶血弧菌引起的刺参疾病预防药物中的应用，其特征在于，所述副溶血弧菌噬菌体的保藏编号为CGMCCNo.17991，所述应用为，将刺参进行倒池，浸浴于噬菌体的悬浮液中，或将噬菌体悬浮液稀释后对参池进行喷洒。
2.一种杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂包含权利要求1中所述副溶血弧菌噬菌体。
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