CN115044561B - 一株高效裂解溶藻弧菌噬菌体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高效裂解溶藻弧菌噬菌体PVA23及其用途，该溶藻弧菌噬菌体的菌种保藏编号为CGMCC No.24119，头部为二十面体，长尾，为有尾噬菌体目长尾噬菌体科。该溶藻弧菌噬菌体具有效价高、裂解率高、增殖力强、潜伏期短、爆发量大的特点，且安全性高、环境友好，并具有良好的温度和酸碱耐受能力，能适应更严苛的应用环境，且其感染复数极低，能够快速有效地杀灭溶藻弧菌，预防溶藻弧菌病害，尤其能够快速有效抑制人工养殖对虾养殖池中溶藻弧菌的生长，在水产养殖及其他环境中的溶藻弧菌防控方面具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高效裂解溶藻弧菌噬菌体及其应用。
技术背景
水产品是世界上人类第三大食物蛋白质来源。随着水产养殖业的快速发展，水产养殖业中发现的病害频率不断上升。弧菌菌株产生溶血素、酪蛋白酶、脂肪酶、明胶酶和磷脂酶等多种毒力因子，对水产养殖动物健康造成危害，据相关报道是鱼、虾和贝类致命的病原菌。溶藻弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性菌，广泛分布于全球沿海水域，是引起鱼、虾、贝类细菌病中最常见的弧菌种类之一，引起海洋经济动物大量死亡，造成巨大的经济损失，也可引起人类的弧菌病。近几十年来，抗生素已被用于控制水产养殖动物中常见的细菌感染，并取得了显著的应用效果。但由于细菌的多重耐药、残留化学物质的积累和微生物的转换等原因，其存在一定的局限性，许多弧菌菌株已经对抗生素的使用产生了抗药性，而且近年来，许多国家开始限抗。因此，替代疗法来控制弧菌菌株引起的感染越来越受到人们的关注。
噬菌体是一种可以感染并杀死其特定宿主的病毒，在过去的十年中，噬菌体已被成功地用于控制人类的几种致病性感染。近年来，一些研究者对噬菌体治疗水产养殖动物进行了探索。例如，据报道噬菌体鸡尾酒会杀死从水产养殖虾中分离出的相关弧菌菌株，并控制水生鱼类养殖中耐药细菌的扩散。因此，它们被认为是水产养殖中作为病原菌抗菌物质的抗生素和化学品的替代品。与抗生素相比，噬菌体疗法具有专一性强、环境友好、成本低廉等优点，是一种很有前景的预防和防治弧菌疾病方法。
本发明通过致病性溶藻弧菌的分离，进而分离得到一株裂解性溶藻弧菌噬菌体，并对其生物学性质和防控溶藻弧菌病害的实践应用进行了研究，为开发防控溶藻弧菌的噬菌体制剂提供了噬菌体来源，为开发防控和治疗溶藻弧菌的抗生素替代物奠定了一定的基础。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株裂解性溶藻弧菌噬菌体及其应用，该噬菌体效价高、裂解率高、增殖力强、潜伏期短、爆发量大，对溶藻弧菌具有强力裂解和杀灭作用，其液体制剂能快速有效地抑制人工养殖对虾养殖池中溶藻弧菌的生长，有效降低溶藻弧菌含量，预防溶藻弧菌病害，在水产养殖动物的溶藻弧菌病害防控方面具有重要的应用价值，并为开发防控溶藻弧菌的抗菌制剂提供了噬菌体来源。
本发明的技术方案具体如下：
本发明的第一个方面，提供了一株溶藻弧菌噬菌体，其宿主为溶藻弧菌VA11，该溶藻弧菌噬菌体命名为PVA23，分离自山东省青岛市某水产市场，已于2021年12月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24119。
进一步的，电镜下观察到，该噬菌体头部为二十面体，长尾，头部直径约46.10 nm，尾部长约139.32nm，为有尾噬菌体目长尾噬菌体科，将其命名为PVA23。
进一步的，该噬菌体裂解率较高，在已经分离鉴定出的71株溶藻弧菌中，其可裂解44株，裂解率约为60%-65%。
进一步的，该噬菌体宿主专一性强，不裂解除溶藻弧菌以外的其他弧菌属细菌，也不裂解非弧菌属细菌。
进一步的，该噬菌体增殖力强，感染复数MOI为0.000001~100，最低为0.000001，最佳MOI为0.001。此时，噬菌体纯化液的效价为3×1012PFU/mL ~5×1012PFU/mL。
进一步的，该噬菌体具有良好的温度耐受力，温度为-80℃~60℃，在-80℃的条件下可长期保存，效价稳定；在60℃的条件下活性稳定，效价不低于109PFU/mL。
进一步的，该噬菌体具有良好的pH耐受力，pH为4~12，在pH为5~11的范围内作用2h，活性保持稳定，效价不低于109PFU/mL；在pH为4和12时，也有噬菌体存活，效价不低于103PFU/mL。
进一步的，该噬菌体对氯仿不敏感。
本发明的第二个方面，提供了高效裂解溶藻弧菌的噬菌体PVA23在制备防控溶藻弧菌的抗菌剂中的用途。
进一步的，所述抗菌剂为液体制剂，其特征在于，在实验室规模的养殖水体中，一次性泼洒该液体制剂后，噬菌体在水中的活性（不低于109PFU/mL）能维持48h。
进一步的，所述的噬菌体液体制剂的制备方法如下：
（1）将所述溶藻弧菌噬菌体的宿主菌接种于液体培养基中，35-40℃，160-180rpm, 培养3-4h，得到对数生长期宿主菌液；
（2）挑取已纯化完成的该噬菌体的单个噬菌斑于1 mL PBS缓冲液中，32-42℃浸浴30-40 min，得到该噬菌体浸出液，取100-200 µL噬菌体浸出液与100-200 µL宿主菌液于液体培养基中，35-40℃、160-180 rpm振荡培养至液体变清亮，得到噬菌体增殖液。
（3）将噬菌体的增殖液和宿主菌液同时接种于液体培养基中，35-40℃，160-180rpm, 培养4-6h，得到噬菌体种子液；
（4）将噬菌体种子液和宿主菌液同时接种到装有灭菌液体培养基的发酵罐中，35-40℃，通气条件下，60-80rpm搅拌培养10-12h，得到发酵混合液；
（5）将发酵混合液经离心和膜过滤去除宿主菌，得到噬菌体的纯化液，即该噬菌体的液体制剂。
进一步的，所述步骤（1）中的宿主菌为VA11。
进一步的，所述步骤（3）和（4）中的感染复数MOI均为0.01。
进一步的，所述步骤（4）中发酵罐中的液体培养基为每升海水中含5.0-10.0g蛋白胨和1.0-4.0g酵母浸粉。
进一步的，所述步骤（5）中得到的噬菌体纯化液效价不低于1010PFU/mL。
进一步的，所述的抗菌剂在水产养殖中防控溶藻弧菌的用途。
进一步的，该噬菌体及其抗菌剂能够降低养殖池中溶藻弧菌的含量，预防溶藻弧菌病害。将该液体制剂一次性泼洒到人工养殖对虾养殖池中，效价不低于104PFU/mL；溶藻弧菌噬菌体对溶藻弧菌具有良好的抑制作用，能够快速有效降低养殖池中溶藻弧菌含量。本发明的有益效果：
1、本发明发现并分离了一株溶藻弧菌VA11，并以该溶藻弧菌为宿主分离得到噬菌体PVA23，该噬菌体对对虾养殖环境中溶藻弧菌具有强裂解作用，能快速有效降低溶藻弧菌的含量，在水产养殖动物的溶藻弧菌病害防控方面具有重要的应用价值，为工业化生产用于防治养殖环境中溶藻弧菌噬菌体提供了噬菌体来源。
2、在本发明中，噬菌体PVA23具有高效价，在最佳感染复数下可达3-5×1012PFU/mL。
3、在本发明中，噬菌体PVA23增殖力强、潜伏期短、爆发量大，最低感染复数MOI为0.000001，潜伏期为5-15min，爆发量为190-210PFUs/感染细胞，能快速有效裂解和杀灭宿主病原菌。
4、在本发明中，噬菌体PVA23在60℃的条件下活性稳定，效价不低于109PFU/mL；在pH为4~12的范围内，能保持活性，进一步，在pH为5 -11的范围内作用2h，活性保持稳定，效价不低于109PFU/mL，具有良好的温度耐受性和pH耐受力，能适应更严苛的环境。
5、该噬菌体纯化液在对虾体内的安全性实验显示连续注射给药7d，持续观察30d，未见异常，初步验证其体内安全性。
6、本发明所述噬菌体专一性强、裂解率高、安全性高、环境友好，是一种潜在的安全的有效的抗生素替代物，完全可以用于水产溶藻弧菌病害的防治。
附图说明
图1为噬菌体PVA23在双层琼脂平板上形成的噬菌斑。
图2为噬菌体PVA23的透射电镜图。
图3为噬菌体PVA23的一步生长曲线示意图。
图4为噬菌体PVA23的温度稳定性实验示意图。
图5为噬菌体PVA23的pH稳定性曲线实验示意图。
图6为噬菌体PVA23的氯仿敏感性实验示意图。
图7为噬菌体PVA23在实验室规模的养殖水体中含量变化示意图。
图8为噬菌体PVA23对日照某对虾人工养殖工厂溶藻弧菌防控实验结果。
图9为噬菌体PVA23对烟台某对虾人工养殖工厂溶藻弧菌防控实验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明，本发明所述的溶藻弧菌噬菌体（Vibrio alginolyticus bacteriophage），其宿主为溶藻弧菌VA11，该溶藻弧菌噬菌体命名为PVA23，该溶藻弧菌噬菌体已于2021年12月30日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.24119，分类命名为溶藻弧菌噬菌体（Vibrio alginolyticus bacteriophage）。
实施例1、溶藻弧菌的分离和鉴定
从具有溶藻弧菌细菌性疾病的水产养殖场中取病样及相关水样，采用无菌操作的方法，在TCBS琼脂培养基中划线，37℃过夜培养后，在培养基中呈现圆形且边缘整齐的黄色光滑菌落，直径约2-4mm，挑取典型菌落继续划线纯化4次，然后挑取单菌落接种于5mL的2216E液体培养基中，37℃、170rpm振荡培养4h，得到均匀浑浊的细菌增殖液。再利用溶藻弧菌特异性引物对疑似溶藻弧菌进行PCR扩增，目的片段大小253bp，若PCR结果显示在253bp处有条带，则确定为溶藻弧菌，将其中一株命名为VA11。
实施例2、噬菌体的分离、纯化和增殖
1、宿主菌悬液的制备
挑取宿主菌VA11单菌落接种入5mL的2216E液体培养基中，37℃、170rpm振荡培养4h，得到处于对数生长期的新鲜菌液。
2、噬菌体的分离和纯化
将采自山东省青岛市李沧区某水产市场的污水样品，11000rpm离心5min，取上清液用0.22μm滤膜过滤除菌。取5mL滤液和5mL新鲜宿主菌液，一起加入到50mL灭菌的2216E液体培养基中，置于37℃、170rpm振荡培养过夜，对可能存在的噬菌体进行增殖。取培养液5mL，11000rpm离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤后，得到噬菌体增殖原液，置于4℃保存。
利用双层琼脂平板法分离噬菌体，将噬菌体增殖原液10倍比稀释，分别取100 µL稀释液与100 µL宿主菌液混合，37℃孵育5 min后，将混合液置于约50℃保温的上层琼脂（琼脂浓度为0.7%），混匀后迅速倾倒入下层琼脂(琼脂浓度为1.5%)平皿上，轻轻摇匀。冷却后置于37℃倒置培养过夜。次日，观察成斑情况，如果有噬菌体的存在，双层平板上出现透明、规则的圆形空斑即噬菌斑。
从有明显单个噬菌斑的双层平板中抠取单个噬菌斑于1 mL PBS缓冲液中，42℃浸浴30 min，得到噬菌体浸出液。将浸出液12000 rpm离心5min，上清液用0.22μm滤膜除菌，PBS缓冲液进行10倍比梯度稀释，选择可以得到单个噬菌斑的梯度制备双层平板。以上步骤重复4~5次，直至获得大小、形态和清晰度一致的噬菌斑。
3、噬菌体的增殖和效价的测定
挑取已纯化完成的噬菌体的单个噬菌斑于1 mL PBS缓冲液中，42℃浸浴30 min，得到噬菌体浸出液。取100 µL浸出液与100 µL宿主菌液于5mL液体2216E培养基中，37℃、170rpm振荡培养至液体变清亮，得到噬菌体增殖液。
取噬菌体增殖液5mL，12000 rpm离心5 min，上清液用0.22μm滤膜除菌，PBS缓冲液进行10倍比梯度稀释至109倍，取107、108、109倍稀释度的稀释液100 µL和宿主菌液100 µL制备双层平板，测定噬菌体的效价。噬菌体效价（PFU/mL）=噬菌斑数×稀释倍数×10。
结果表明，经过4代分离纯化后，溶藻弧菌噬菌体PVA23在双层平板上形成直径约0.5mm、规则圆形、透亮的噬菌斑，其成斑图片见图1。该噬菌体使用宿主菌VA11增殖，1.5h即可摇清，效价可达8.6×109PFU/mL。
实施例3、噬菌体的电镜观察
采用磷钨酸负染法，取20 µL噬菌体增殖液（效价109PFU/mL）滴加在铜网上，静置沉淀15 min后，滤纸吸去多余液体，滴加15 µL 2%的磷钨酸染色液，染色5 min，吸去多余的染液，自然干燥后，用透射电镜观察噬菌体形态。
如图2所示，电镜下噬菌体PVA23头部为二十面体，长尾，头部直径约46.10nm，尾部长约139.32 nm，为有尾噬菌体目长尾噬菌体科。
实施例4、噬菌体的裂解谱和宿主范围的检测
1、裂解谱的测定
挑取实验室分离鉴定和保存的养殖场分离到的71株溶藻弧菌进行该噬菌体裂解谱的测定，这些分离株分离自山东、江苏和广西等省区的各市地区的养殖场。
采用点样法。取100 µL各溶藻弧菌的菌悬液加入到5 mL上层琼脂培养基中，充分混匀后迅速铺到下层琼脂平板上，平置待冷却。取该噬菌体增殖液2µL点到含各溶藻弧菌的双层平板上，37℃培养8-12 h，若平板上出现透明圈，则说明该噬菌体可以裂解这株溶藻弧菌。
结果如表1所示，实验发现，上述71株分离株中，带有毒力基因（gryB）的菌株为69株，毒力基因带有率为97.18。对于71株溶藻弧菌，噬菌体PVA23能裂解44株，裂解率约为62%。
表1. 噬菌体PVA23对溶藻弧菌的裂解谱
| 序号 | 菌株名称 | 来源 | 裂解力 | 毒力因子（gryB） |
| 1 | VA0 | 浙江宁波 | ++ | + |
| 2 | VA1 | 浙江宁波 | +++ | + |
| 3 | VA3 | 江苏南通 | + | - |
| 4 | VA5 | 江苏如东 | + | + |
| 5 | VA6 | 江苏如东 | +++ | + |
| 6 | VA7 | 江苏如东 | +++ | + |
| 7 | VA8 | 浙江宁波 | _- | + |
| 8 | VA9 | 浙江宁波 | +++ | + |
| 9 | VA10 | 浙江宁波 | +++ | + |
| 10 | VA11 | 浙江宁波 | +++ | + |
| 11 | VA12 | 浙江宁波 | + | + |
| 12 | VA13 | 江苏南通 | + | + |
| 13 | VA14 | 江苏南通 | +++ | + |
| 14 | VA15 | 江苏南通 | +++ | + |
| 15 | VA16 | 浙江宁波 | ++ | + |
| 16 | VA17 | 浙江宁波 | ++ | - |
| 17 | VA18 | 浙江宁波 | ++ | + |
| 18 | VA19 | 江苏南通 | - | + |
| 19 | VA20 | 江苏南通 | _+ | + |
| 20 | VA21 | 江苏南通 | + | + |
| 21 | VA22 | 江苏南通 | +++ | + |
| 22 | VA23 | 山东青岛 | ++ | + |
| 23 | VA24 | 山东青岛 | ++ | + |
| 24 | VA25 | 山东青岛 | +++ | + |
| 25 | VA26 | 山东青岛 | + | + |
| 26 | VA27 | 山东青岛 | +++ | + |
| 27 | VA28 | 山东青岛 | - | + |
| 28 | VA29 | 山东青岛 | +++ | + |
| 29 | VA30 | 山东青岛 | + | + |
| 30 | VA31 | 山东青岛 | - | + |
| 31 | VA32 | 山东日照 | - | + |
| 32 | VA33 | 山东日照 | - | + |
| 33 | VA34 | 山东日照 | ++ | + |
| 34 | VA35 | 山东日照 | - | + |
| 35 | VA36 | 山东日照 | ++ | + |
| 36 | VA37 | 山东日照 | - | + |
| 37 | VA38 | 山东日照 | - | + |
| 38 | VA39 | 广西南宁 | - | + |
| 39 | VA40 | 广西南宁 | + | + |
| 40 | VA41 | 广西南宁 | - | + |
| 41 | VA42 | 广西南宁 | +++ | + |
| 42 | VA43 | 广西南宁 | - | + |
| 43 | VA44 | 广西南宁 | - | + |
| 44 | VA45 | 广西南宁 | - | + |
| 45 | VA46 | 广西南宁 | - | + |
| 46 | VA47 | 广西南宁 | - | + |
| 47 | VA48 | 广西南宁 | - | + |
| 48 | VA49 | 广西南宁 | ++ | + |
| 49 | VA50 | 广西南宁 | + | + |
| 50 | VA51 | 广西南宁 | - | + |
| 51 | VA52 | 广西南宁 | - | + |
| 52 | VA53 | 广西南宁 | - | + |
| 53 | VA54 | 广西南宁 | + | + |
| 54 | VA55 | 广西南宁 | - | + |
| 55 | VA56 | 广西南宁 | - | + |
| 56 | VA57 | 广西南宁 | ++ | + |
| 57 | VA58 | 广西南宁 | - | + |
| 58 | VA59 | 广西南宁 | + | + |
| 59 | VA60 | 广西南宁 | + | + |
| 60 | VA61 | 山东海阳 | + | + |
| 61 | VA62 | 山东海阳 | - | + |
| 62 | VA63 | 山东海阳 | + | + |
| 63 | VA64 | 山东海阳 | - | + |
| 64 | VA65 | 山东即墨 | + | + |
| 65 | VA66 | 山东即墨 | - | + |
| 66 | VA67 | 山东即墨 | + | + |
| 67 | VA68 | 山东即墨 | + | + |
| 68 | VA69 | 山东胶州 | + | + |
| 69 | VA70 | 山东胶州 | - | + |
| 70 | VA71 | 河北沧州 | +++ | + |
| 71 | VA72 | 河北沧州 | ++ | + |
注：+++，清晰透亮的斑；++，轻微模糊的斑；+，较模糊的斑；–，无斑
2、宿主范围的检测
选取了实验室保存的11株弧菌属非溶藻弧菌和3株非弧菌属细菌进行该噬菌体的宿主范围检测。方法同上。
如表2所示，噬菌体PVA23的宿主专一性很强，对溶藻弧菌具有高度专一性。
表2. 噬菌体PVA23对其他细菌的裂解谱
| 序号 | 菌株名称 | 来源 | 裂解力 |
| 1 | Vibrio parahaemolyticus17802 | ATCC | - |
| 2 | Vibrio parahaemolyticusVP1 | 浙江宁波 | - |
| 3 | Vibrio parahaemolyticusVP3 | 浙江宁波 | - |
| 4 | Vibrio parahaemolyticusVP6 | 江苏如东 | - |
| 5 | Vibrio parahaemolyticusVP8 | 江苏如东 | - |
| 6 | Vibrio choleraeVC1 | 浙江宁波 | - |
| 7 | Vibrio choleraeVC2 | 浙江宁波 | - |
| 8 | Vibrio choleraeVC3 | 江苏南通 | - |
| 9 | Vibrio choleraeVC4 | 江苏南通 | - |
| 10 | Vibrio vulnificusVV1 | 浙江宁波 | - |
| 11 | Vibrio vulnificusVV2 | 浙江宁波 | - |
| 12 | Aeromonas veronii013 | 江苏如东 | - |
| 13 | Pseudomonas aeruginosa05 | 江苏如东 | - |
| 14 | Bacillus subtilis044 | 江苏如东 | - |
注：–，无斑
实施例5、噬菌体的最佳感染复数MOI测定
感染复数MOI为感染时噬菌体数量与细菌数量的比值，最佳MOI为噬菌体达到最佳生长条件时的比值。为了确定最佳的MOI，将噬菌体的储备溶液(8.6×109PFU/mL)10倍比梯度稀释，选取合适浓度的噬菌体稀释液和宿主菌VA11的对数生长期菌液(2.4×107CFU/mL)加到5mL新鲜2216 E液体培养基中，使其感染比例分别为0.0000001、0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100， 37℃、170rpm振荡培养至液体清亮且可见细菌碎片。然后采用双层平板法测定各管中的噬菌体效价。以最高效价所对应的MOI为最佳MOI。
结果如表3所示，当MOI=0.001时，噬菌体PVA23效价最高，为4.2×1012PFU/mL，即噬菌体的最佳MOI为0.001。
表3. 噬菌体PVA23的最佳感染复数测定结果
| 感染复数MOI | 效价（PFU/mL） |
| 0.0000001 | 未摇清 |
| 0.000001 | 7.4×109 |
| 0.00001 | 4.1×1010 |
| 0.0001 | 2.6×1011 |
| 0.001 | 4.2×1012 |
| 0.01 | 1.6×1011 |
| 0.1 | 5×1010 |
| 1 | 1×1010 |
| 10 | 1.2×109 |
| 100 | 1.13×109 |
实施例6、噬菌体的一步生长曲线测定
将噬菌体的储备溶液(8.6×109PFU/mL)和宿主菌VA11的对数生长期菌液(2.4×107CFU/mL)按感染复数为1加到5mL的2216 E液体培养基中，37℃孵育10 min, 12000 × g离心30 s，去上清，再用2216E液体培养基重悬洗涤2次，以除去未吸附的噬菌体，然后用微量2216E液体培养基重悬沉淀，将重悬液转移到预热到37℃的20mL的2216E中，立即置于37℃、170rpm振荡培养，这一时刻定义为t = 0 min, 180 min内每10 min采集样品一次用双层琼脂平板法测定每份样品效价。该噬菌体的爆裂大小为最终游离噬菌体颗粒数与感染细菌细胞初始数的比值。
由图3可知，噬菌体PVA23的潜伏期为10 min，爆发量为203 PFUs/感染细胞，表明该噬菌体具有潜伏期短、爆发量大的特点。
实施例7、噬菌体的温度稳定性实验
将装有1mL噬菌体储备溶液(8.6×109PFU/mL)的EP管，分别于40℃、50℃、60℃和70℃水浴20min、40min、60min，之后与宿主菌VA11铺双层平板测噬菌体效价。
由图4可知，噬菌体PVA23在60℃的条件下活性稳定，效价不低于109PFU/mL，70℃完全失活；另外该噬菌体在-80℃的条件下可长期保存，效价维持稳定。
实施例8、噬菌体的pH稳定性实验
将噬菌体储备溶液(8.6×109PFU/mL)分别与pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的2216E液体培养基混合，37℃水浴2h，作用结束后向混合液中加入适量的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH使混合液的pH值约为7，之后与宿主菌VA11铺双层平板测噬菌体效价。
由图5可知，噬菌体PVA23在pH为5 -11的范围内作用2h，活性保持稳定，效价不低于109PFU/mL，在pH为4和12时，也有噬菌体存活，效价不低于103PFU/mL，表明该噬菌体具有酸碱耐受力，能适应更严苛的环境。
实施例9、噬菌体的氯仿敏感性实验
将氯仿按1%、2%、3%、4%、5%的浓度分别加入噬菌体储备溶液(8.6×109PFU/mL)中，37℃振荡孵育30 min，然后采用双层平板法测定各样品的效价，以不含氯仿的组作为对照。
由图6可知，噬菌体PVA23对氯仿不敏感，各组的效价均不低于109PFU/mL。
实施例10、噬菌体液体制剂的制备
噬菌体PVA23的液体制剂按如下方法和步骤制备:
（1）将宿主菌VA11接种于2216E液体培养基中，37℃，170 rpm, 培养3-4h，得到对数生长期宿主菌液；
（2）挑取已纯化完成的该噬菌体的单个噬菌斑于1 mL PBS缓冲液中，42℃浸浴30min，得到该噬菌体浸出液，取100µL噬菌体浸出液与100µL宿主菌液于2216E液体培养基中，37℃、170rpm振荡培养至液体变清亮，得到噬菌体增殖液。
（3）将噬菌体的增殖液和宿主菌液按照感染复数为0.01同时接种于2216E液体培养基中，37℃，170rpm, 培养4-6h，得到噬菌体种子液；
（4）将噬菌体种子液和宿主菌液感染复数为0.01同时接种到装有灭菌液体培养基的发酵罐中，37℃，通气条件下，70rpm搅拌培养10-12h，得到发酵混合液，铺双层平板测效价；
（5）将发酵混合液经离心和膜过滤去除宿主菌VA11，得到该噬菌体的纯化液，即该噬菌体的液体制剂，铺双层平板测定效价。
经测定，噬菌体PVA23的发酵液效价为4.3×1011PFU/mL，纯化液的效价为9.4×1010PFU/mL，说明离心和过滤处理对噬菌体效价的影响较小。
实施例11、噬菌体液体制剂在水体中的含量变化测定
本实验旨在检测噬菌体PVA23液体制剂在水体中的含量随时间变化情况。实验设置2组，每组15只南美白对虾(平均重10 g)，在适宜的水温26℃和盐度25 ‰条件下，在20 L的玻璃缸中饲养至少72 h。然后每组均加入2 mL噬菌体液体制剂(9.4×109PFU/mL)，组1只添加1次，组2每天同一时间添加1次，每4 h采集水样，采用双层平板法计算噬菌体数，连续检测4 d。同时观察实验中对虾的生存情况。
由图7可知，在实验室规模的养殖水体中，一次性泼洒噬菌体PVA23液体制剂后，第1组中噬菌体的活性（不低于109PFU/mL）能维持48h，之后活性开始下降，而第2组随着每天的添加，噬菌体的活性也随着增加，另外实验期间，各组中的对虾都正常存活。
实施例12、噬菌体安全性实验
实验设置2组，每组15只南美白对虾(平均重10 g)，在适宜的水温26℃和盐度25‰条件下，在20 L的玻璃缸中饲养至少72 h。腹腔注射给予噬菌体，实验组按107PFU/g的剂量注射噬菌体液体制剂，对照组注射等量生理盐水，连续给予7d，并持续观察至30d。每天饲喂体重的3%，换水量为25%。每天记录对虾的存活情况，实验结束后，将对虾解剖，观察其肝胰腺、肌肉和肠道情况。
结果显示，实验组和对照组的对虾均正常存活，解剖观察其肝胰腺、肌肉和肠道，均未发现病变症状，说明在107PFU/g的剂量下，噬菌体液体制剂对对虾无影响，初步验证噬菌体PVA23是安全的。
实施例13、噬菌体液体制剂在防控溶藻弧菌病害上的应用
1、应用于日照某南美白对虾养殖工厂溶藻弧菌防控
该养殖工厂的养殖条件：养殖品种为南美白对虾，健康无病症，平均重8 g，水温26℃，盐度25‰，养殖池大小为30 m3，每天固定时间喂食，每天换水20%。实验前，连续3d从相同深度的每个虾池中取水样，涂布TCBS平板检测各养殖池的弧菌量，根据统计的结果，选择弧菌量稳定且尽可能相近(≥1000 CFU/mL)的养殖池进行实验。实验前2d 停止对选定的养殖池添加任何其他弧菌防治产品，禁食1d。实验分为4组：空白对照组、阳性对照组、噬菌体高剂量组和噬菌体低剂量组，空白对照组不做任何处理，阳性对照组用水产养殖中常用的消毒剂-碘制剂以5g/m3的使用量泼洒养殖池，其余两组分别用噬菌体液体制剂以10 g/m3和5 g/m3的剂量泼洒养殖池。各组均泼洒1次，第1d每4 h取样，之后每12h取样，涂布TCBS平板检测48 h内各组弧菌量的变化。
结果如图8所示，选择了4个弧菌含量稳定且尽可能相近(≥1000 CFU/mL)的养殖池，但这4个养殖池弧菌含量的初始值依然具有一定的差异，它们的初始弧菌量分别为：空白对照组2.69×103CFU/mL，阳性对照组1.78×104CFU/mL CFU/mL，噬菌体低剂量组1.51×103CFU/mL，噬菌体高剂量组1.33×103CFU/mL，由图看出：
⑴在0-8h间，空白对照组和阳性对照组程波动增长，且前者增长明显，低剂量组的弧菌量变化不明显，高剂量组有一定下降，8h时，空白对照组（7.16×103CFU/mL）较初始增加了166.2%，阳性对照组（2.0×104CFU/mL）较初始增加了12.4%，低剂量组（1.41×103CFU/mL）较初始下降了6.6%，高剂量组（1.13×103CFU/mL）较初始降低了15%；
⑵在8-12h间，空白对照组和阳性对照组的弧菌量继续增加，两个噬菌体组的弧菌量则都有较明显的下降，12h时，空白对照组（8.41×103CFU/mL）较初始增加了212.6%，阳性对照组（2.82×104CFU/mL）较初始增加了58.4%，低剂量组（8.91×102CFU/mL）较初始下降了41%，高剂量组（6.17×102CFU/mL）较初始下降了53.6%，其中高剂量组与初始值具有显著性差异；
⑶在12-24h间，空白对照组和阳性对照组的弧菌量还是增加，两个噬菌体组的弧菌量继续下降，24h时，空白对照组（1.45×104CFU/mL）较初始增加了439%，阳性对照组（1.95×104CFU/mL）较初始增加了9.6%，低剂量组（7.23×102CFU/mL）较初始下降了52.1%，高剂量组（4.49×102CFU/mL）较初始下降了66.2%，两个组与初始值均具有显著性差异；
⑷在24-48h间，空白对照组的弧菌量还是增加，阳性对照组轻微降低，两个噬菌体组下降不明显，保持稳定，48h时，空白对照组（9.02×103CFU/mL）较初始增加了235.3%，阳性对照组（1.7×104CFU/mL）较初始降低了4.5%，低剂量组（6.89×102CFU/mL）较初始下降了54.4%，高剂量组（4.19×102CFU/mL）较初始下降了68.5%，两个组与初始值依然均具有显著性差异。
这说明一次性泼洒噬菌体PVA23液体制剂，与消毒剂碘制剂（阳性对照组）相比，其效果要明显的多， 能较快速（12h左右）有效抑制养殖池中溶藻弧菌的生长，降低溶藻弧菌含量，预防溶藻弧菌病害，并存在剂量依赖性。
2、应用于烟台海阳某南美白对虾人工养殖工厂溶藻弧菌防控
该养殖工厂的养殖条件：养殖品种为南美白对虾，平均体重6 g，工厂大部分养殖池中对虾健康无病症，少数几个养殖池存在死虾现象，水温26℃，盐度25‰，养殖池大小为30 m3，每天固定时间喂食，每天换水30%。以存在死虾现象的几个养殖池为实验对象。实验前，连续3d从相同深度的这几个虾池中取水样，涂布TCBS平板检测各养殖池的弧菌量，根据统计的结果，选择弧菌量稳定且尽可能相等(≥1000 CFU/mL)的养殖池进行实验。实验前2d停止对选定的养殖池添加任何其他弧菌防治产品，禁食1d。实验分为4组：空白对照组、阳性对照组1、阳性对照组2和噬菌体组，空白对照组不做任何处理，噬菌体组以5g/m3的剂量泼洒养殖池，两个阳性对照组分别用两种市面上的控弧菌产品，都以5g/m3的剂量泼洒养殖池。各组均泼洒1次，第1d每8 h取样，之后每12h取样，涂布TCBS板检测48 h内各养殖池中弧菌量的变化。
结果如图9所示，选择了4个弧菌量稳定且尽可能相等(≥1000 CFU/mL)的养殖池，但这4个养殖池弧菌量的初始值依然具有一定的差异，它们的初始弧菌量分别为：空白对照组2.57×102CFU/mL，阳性对照组1为1.14×103CFU/mL，阳性对照组2为2.72×104CFU/mL，噬菌体组4.03×103CFU/mL，由图看出：
⑴在0-8h间，空白对照组的弧菌量增加，阳性对照组1变化不明显，阳性对照组2和噬菌体组下降，8h时，空白对照组（8.22×102CFU/mL）较初始增加了219.8%，阳性对照组1（1.16×103CFU/mL）较初始增加了1.8%，阳性对照组2（1.68×104CFU/mL）较初始降低了38.2%，噬菌体组（1.91×103CFU/mL）较初始降低了52.6%，噬菌体组与初始具有显著性差异；
⑵在8-16h间，空白对照组的弧菌量变化不明显，阳性对照组1继续增加，阳性对照组2和噬菌体组继续下降， 16h时，空白对照组（8.13×102CFU/mL）较初始增加了216.3%，阳性对照组1（1.62×103CFU/mL）较初始增加了42.1%，阳性对照组2（1.46×104CFU/mL）较初始降低了46.3%，噬菌体组（1.48×103CFU/mL）较初始降低了63.3%，噬菌体组与初始值具有显著性差异；
⑶在16-24h间，空白对照组和阳性对照组1的弧菌量继续有所升高，阳性对照组2和噬菌体组继续下降，24h时，空白对照组组（8.81×102CFU/mL）较初始增加了242.8%，阳性对照1组（2.48×103CFU/mL）较初始增加了117.5%，阳性对照组2（8.71×103CFU/mL）较初始下降了68%，噬菌体组（1.35×103CFU/mL）较初始降低了66.5%，两个组与各自初始值都具有显著性差异；
⑷在24-48h间，空白对照组和阳性对照组1的弧菌量都有所降低，阳性对照组2和噬菌体组则继续下降，48h时，空白对照组组（6.53×102CFU/mL）较初始增加了154.1%，阳性对照1组（2.04×103CFU/mL）较初始增加了78.9%，阳性对照组2（6.1×103CFU/mL）较初始下降了77.6%，噬菌体组（1.24×103CFU/mL）较初始降低了69.2%，两个组与各自初始值都具有显著性差异；
⑸在48-72h间，空白对照组和阳性对照组1的弧菌量又有所升高，阳性对照组2下降不明显，保持稳定，而噬菌体组则有所回升，72h时，空白对照组组（1.15×103CFU/mL）较初始增加了347.4%，阳性对照1组（1.35×103CFU/mL）较初始增加了18.4%，阳性对照组2（5.89×103CFU/mL）较初始下降了78.3%，噬菌体组（1.46×103CFU/mL）较初始降低了61.8%，两个组与各自初始值均具有显著性差异。
这说明一次性泼洒噬菌体PVA23液体制剂，其效果要比阳性对照组1明显的多；与阳性对照组2相比，其能更快速（8h左右）有效抑制养殖池中溶藻弧菌的生长，降低溶藻弧菌含量，而阳性对照组2发挥较明显的作用在24h左右，但后者的持续作用时间要更长，在72h时抑菌作用稳定，噬菌体在48h-72h防控效果开始变缓慢。因此噬菌体的优势在于快速达到防控弧菌的效果，在应用过程中，可适当增加泼洒次数来延长其作用时间。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一株高效裂解溶藻弧菌的噬菌体PVA23，其命名为溶藻弧菌噬菌体Vibrio alginolyticus bacteriophage PVA23，已于2021年12月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24119。
2.权利要求1所述的高效裂解溶藻弧菌的噬菌体PVA23在制备防控溶藻弧菌的抗菌剂中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗菌剂为液体制剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述液体制剂通过下述步骤制备而成：
（1）将所述溶藻弧菌噬菌体的宿主菌接种于液体培养基中，35-40℃，160-180 rpm，培养3-4h，得到对数生长期宿主菌液；
（2）挑取已纯化完成的该噬菌体的单个噬菌斑于1 mL PBS缓冲液中，32-42℃浸浴30-40 min，得到该噬菌体浸出液，取100-200 µL噬菌体浸出液与100-200 µL宿主菌液于液体培养基中，35-40℃、160-180 rpm振荡培养至液体变清亮，得到噬菌体增殖液；
（3）将噬菌体的增殖液和宿主菌液同时接种于液体培养基中，35-40℃，160-180 rpm，培养4-6h，得到噬菌体种子液；
（4）将噬菌体种子液和宿主菌液同时接种到装有灭菌液体培养基的发酵罐中，35-40℃，通气条件下，60-80rpm搅拌培养10-12h，得到发酵混合液；
（5）将发酵混合液经离心和膜过滤去除宿主菌，得到噬菌体的纯化液，即该噬菌体的液体制剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述宿主菌为，所用感染复数为0.01。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述噬菌体的纯化液的效价不低于1010PFU/mL。
7.根据权利要求2~6任一项所述的用途，其特征在于，所述的抗菌剂在水产养殖中防控溶藻弧菌的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210332738.2A CN115044561B (zh) | 2022-03-31 | 一株高效裂解溶藻弧菌噬菌体及其用途 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115044561A CN115044561A (zh) | 2022-09-13 |
| CN115044561B true CN115044561B (zh) | 2024-07-12 |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111718907A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-09-29 | 青岛诺安百特生物技术有限公司 | 新型溶藻弧菌噬菌体、其组合物及其应用 |
| CN112029733A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-04 | 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 | 一株高裂解性溶藻弧菌噬菌体rdp-vp-19001及其应用 |
Patent Citations (2)
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