CN111575243A - 坎氏弧菌噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种有效裂解坎氏弧菌的坎氏弧菌噬菌体及其应用。该坎氏弧菌噬菌体具有特定的核苷酸序列。本发明实施例所提供的坎氏弧菌噬菌体能够特异性裂解坎氏弧菌，效价较高，从而可以在单独或混合使用后起到对水产养殖坎氏弧菌病害的有效控制。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，尤其是涉及一种坎氏弧菌噬菌体及其应用。
背景技术
近年来，我国水产养殖业迅猛发展，收益颇丰，但养殖病害在此发展过程中也逐渐成为制约水产养殖发展的首要问题之一。目前，主要的养殖病害种类中，细菌性病害的危害性最为严重，而这之中又以弧菌属(Vibrio)的病原菌危害最大。弧菌病害流行面广、传播快、发病率和死亡率高，是水产养殖病害研究的重点。坎氏弧菌(Vibrio campbellii)是一种革兰氏阴性、兼性厌氧的常见菌，是水产养殖动物的重要条件致病菌，可以引起养殖对虾暴发红腿病、鲍鱼患脓毒败血症等，还与螺类和养殖幼鱼的发病相关，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。
水产养殖业中解决坎氏弧菌病害的常用方法是抗生素药物，但这些抗生素药物在长期的大量使用过程中，带来了诸如环境污染、耐药性产生以及食品安全等问题。因此，养殖人员逐渐将关注重点转移到微生物防治上。微生物防治病菌侵害的方法大体包括拮抗菌防治法、蛭弧菌防治法和噬菌体防治法。以噬菌体防治法为例，噬菌体是侵染细菌的病毒，分为烈性噬菌体和温和噬菌体，温和噬菌体在侵入细菌后不会引起宿主细胞裂解，只是将自己的基因组整合到宿主的基因组上，伴随着宿主基因组同步复制，不能够引起宿主的细胞裂解，一般不会出现有害影响宿主细胞。而烈性噬菌体在短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、装配、裂解这五个阶段从而实现其繁殖的目的。烈性噬菌体在进入菌体后就会改变宿主的性质，使之成为制造噬菌体的工厂，大量产生新的噬菌体，最后导致菌体裂解死亡。而噬菌体防治法也正是基于这一原理来达到防治病菌侵害的目的。因此，有必要提供一种能够有效裂解坎氏弧菌的噬菌体。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种有效裂解坎氏弧菌的坎氏弧菌噬菌体及其应用。
第一方面，本发明的一个实施例提供了一种坎氏弧菌噬菌体，该坎氏弧菌噬菌体具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明实施例的坎氏弧菌噬菌体至少具有如下有益效果：
本发明实施例所提供的坎氏弧菌噬菌体能够特异性裂解坎氏弧菌，效价较高，从而可以在单独或混合使用后起到对水产养殖坎氏弧菌病害的有效控制。
第二方面，本发明的一个实施例提供了一种组合物，该组合物包括上述的坎氏弧菌噬菌体。包括该坎氏弧菌噬菌体的组合物在保证噬菌体有效量的前提下，可以有效防治坎氏弧菌。该组合物因而可以是诸如用于杀灭坎氏弧菌、抑制坎氏弧菌生长和相关炎症反应、防治坎氏弧菌所引起的水产动物疾病等作用的组合物，具体像抗菌剂、水体净化剂、添加剂等产品。
根据本发明的一些实施例的组合物，除上述的坎氏弧菌噬菌体外，还包括辅料。辅料的成分根据组合物的具体应用不同而发生相应的改变，可以是诸如缓冲液、表面活性剂、明胶、海藻酸盐、葡萄糖、蔗糖、麦芽糊精等至少一种。
根据本发明的一些实施例的组合物，其剂型选自粉剂、水剂、冻干剂、凝胶剂、霜剂或膏剂。利用辅料将噬菌体等有效成分包装成为不同剂型的产品，从而适应于具体的应用场景，更有效、更针对性地杀灭或抑制坎氏弧菌感染。
第三方面，本发明的一个实施例提供了上述的坎氏弧菌噬菌体在制备抗菌剂、水体净化剂或饲料添加剂中的应用。上述的坎氏弧菌噬菌体可以应用到抗菌剂、水体净化剂、饲料添加剂等产品中，实现对坎氏弧菌的特异性高效杀菌或预防相应的感染的目的。
根据本发明的一些实施例的应用，抗菌剂、水体净化剂、饲料添加剂用于预防和/或杀灭坎氏弧菌。
第四方面，本发明的一个实施例提供了一种杀灭水体中的坎氏弧菌的方法，包括以下步骤：
向水体投入上述的坎氏弧菌噬菌体；或投入上述的组合物。
将上述的坎氏弧菌噬菌体或包含该噬菌体的组合物按照有效浓度投入水体中，可以有效杀灭水体中的坎氏弧菌，从而种苗投进水体前达到有效预防坎氏弧菌感染的目的。
第五方面，本发明的一个实施例提供了一种水产品的处理方法，包括以下步骤：
将非活体的水产品与上述的坎氏弧菌噬菌体，或上述的组合物混合。
将非活体的水产品与上述的坎氏弧菌噬菌体或组合物进行混合后，能够有效杀灭水产品中的坎氏弧菌，起到食品安全保护剂的作用。
附图说明
图1是本发明的实施例4的坎氏弧菌噬菌体对菌株编号为40-2的坎氏弧菌裂解结果。
图2是本发明的实施例6的坎氏弧菌噬菌体对坎氏弧菌的杀灭效果。
图3是本发明的实施例7的15天虾苗实验的对比实验结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
坎氏弧菌噬菌体的分离、纯化和扩增
本实施例中使用的菌种来源如下：
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC17802，购自广东省微生物保藏中心；
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ATCC33787，购自广东省微生物保藏中心；
哈氏弧菌(Vibrio harveyi)ATCC33842，购自广东省微生物保藏中心；
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)ATCC35654，购自广东省微生物保藏中心；
其他菌株，均为广东海大畜牧兽医研究院有限公司分离保藏。
1.噬菌体的分离
采自野外的环境中的水样品，利用多层纱布对采集的水样品进行初步过滤，然后将滤液置于4℃，10000g离心15min。取上清液20mL加入事先灭菌的锥形瓶中，并加入20mL双倍浓缩的液体培养基与处在对数期的坎氏弧菌40-2 400μL，37℃过夜培养。次日，培养液经5000rpm离心10min，用0.22μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤，将滤液放于4℃备用，得到噬菌体原液0，收集于无菌离心管中，贴好标签，4℃保存备用。
取200μL噬菌体0原液，加入20mL双倍浓缩的2216E液体培养基与400μL对数期的坎氏弧菌40-2菌液，37℃过夜培养。次日，培养液经5000rpm离心10min，用0.22μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤，将滤液放于4℃备用，得到噬菌体原液Ⅰ，收集于无菌离心管中，贴好标签，4℃保存备用。
取200μL噬菌体I原液，加入5mL的2216E液体培养基与200μL对数期的坎氏弧菌40-2菌液37℃过夜培养。次日，培养液5000rpm离心10min，用0.22μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤，将滤液放于4℃备用，得到噬菌体原液II，收集于无菌离心管中，贴好标签，4℃保存备用。
采用双层平板法，用无菌SM缓冲液对噬菌体原液II进行倍比稀释，得到噬菌体稀释液，取对数期的坎氏弧菌40-2菌液100μL与适当稀释梯度的噬菌体稀释液100μL混匀，然后加入到5mL半固体培养基中，混匀后倒入事先准备的固体琼脂平板上，制成双层平板。凝固后倒置于37℃隔水式电热恒温培养箱中培养。
2.噬菌体的纯化
从双层平板上挑取1个边缘光滑、透明的较大噬菌斑，接种到1mL的无菌SM缓冲液中，4℃过夜。用SM缓冲液将这1mL噬菌体液进行倍比稀释，取适当梯度的噬菌体液100μL与对数生长期的细菌I菌液100μL中，37℃振荡培养6h，4℃，10000r/min离心，上清液用0.22μm滤膜过滤除菌后，用双层琼脂平板法重复培养5次，即可得到纯化的噬菌体。
3.噬菌体扩增
从经纯化后的噬菌体的双层平板上挑取1个边缘光滑、透明的较大噬菌斑，接种到1mL的无菌SM缓冲液中，4℃过夜。取500μL含噬菌体的SM缓冲液与500μL对数期生长的坎氏弧菌40-2于5mL液体培养基中，37℃振荡培养6h。收集培养液于4℃，10000g，15min离心，0.22μm孔径的一次性滤器对上清液进行过滤，滤液即为噬菌体增殖液，放于4℃备用。
实施例2
噬菌体的测序
取实施例1制得的噬菌体100mL，加入终浓度1μg/mL的DNaseI，RNaseA，37℃条件下孵育60min后加入5.84g NaCl(终浓度1mol/L)，溶解后置于冰浴中1h。
4℃条件下，11000rpm离心10min，将上清转移至新的离心管中。加入固体PEG8000(终浓度10％)，完全溶解后，冰浴1h。4℃条件下，11000rpm离心20min，用少量SM液重悬沉淀。加入等体积的氯仿异戊醇抽提，温和震荡30s，8000rpm离心1min后，吸取上清，重复抽提至澄清。
再次加入DNase I、RNase A至终浓度1μg/mL，37℃反应30～60min。加入EDTA至终浓度20mmol/L，同时每1mLSM液中加入10μL10％SDS。使用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取。凝胶电泳验证DNA后用Eppendorf BioPhotometer Plus测定其浓度和纯度。产物送至测序公司测序。
测序结果显示，实施例1纯化得到的坎氏弧菌噬菌体具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。以该核苷酸序列可以人工合成实施例1筛选得到的坎氏弧菌噬菌体。
实施例3
噬菌体效价测定
用SM缓冲液对实施例1中的噬菌体增殖液进行连续10倍倍比稀释，得到相应稀释度的噬菌体稀释液。取适当稀释度的噬菌体稀释液100μL与培养至对数期的坎氏弧菌40-2菌液100μL混合，静置3-5min铺双层板，37℃培养箱培养8h后进行噬菌斑计数。结果显示该坎氏弧菌噬菌体的效价较高，能达到1010pfu/mL以上。
实施例4
坎氏弧菌噬菌体裂解谱的确定
将不同的细菌单菌落活化至对数生长期，分别取菌液200μL滴到固体平板中，然后用无菌涂布棒将菌液涂布均匀至吸收，取10μL噬菌体增殖液分别滴到固体平板表面，在超净台内放置30min后置于37℃培养箱中培养8-12h。观察平板表面是否有噬菌体空斑出现。
结果如下表1和图1所示，图1是本发明的实施例4的坎氏弧菌噬菌体对菌株编号为40-2的坎氏弧菌裂解结果，从图1中可以看出，平板表面有大量的噬菌体透明空斑，表明该宿主菌对实施例中的坎氏弧菌噬菌体敏感。
表1.坎氏弧菌噬菌体裂解谱
从表1中可以看出，本发明实施例所提供的坎氏弧菌噬菌体能够特异性裂解坎氏弧菌，对于弧菌属的其它弧菌以及其它属的细菌不具有相应的裂解效果。
实施例5
噬菌体热稳定性实验
取效价约108pfu/mL的噬菌体增殖液1.0mL于无菌EP管中，分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的恒温水浴锅中作用1h，待作用时间结束后取出，进行10倍倍比稀释后用双层平板法进行计数，重复三次取平均值，观察噬菌体效价的变化，结果如下表2所示。
表2.噬菌体热稳定性实验结果
从表2中可以看到，本发明实施例所提供的噬菌体可以耐受20℃至60℃的温度环境。在20℃至60℃作用1h，噬菌体效价变化不大；在70℃作用1h，噬菌体效价降为0；这说明分离到的噬菌体可以耐受60℃高温。
实施例6
噬菌体对虾肉样品的杀菌效果评价
噬菌体效价：107pfu/mL，100μL；
坎氏弧菌计数：107cfu/mL，100μL。
评价方法如下：
(1)从市场买回活虾，用灭菌的手术刀剪在超净工作台中，去除虾壳，将虾肉切成面积为1×1cm的小块(约1g)，将肉块过火焰然后放在一次性平皿中备用。
(2)在超净工作台中，将100μL坎氏弧菌菌液均匀涂布在肉块表面。
(3)15min后，实验组滴加100μL噬菌体在肉块表面，对照组滴加100μL PBS在肉块表面。
(4)将制备好的样品置于25℃，于1h、2h、3h、6h、12h时对坎氏弧菌计数。
结果如图2所示，图2是本发明的实施例6的坎氏弧菌噬菌体对坎氏弧菌的杀灭效果，从图中可以看出，实验组样品在短时间内的细菌数目显著减少，说明噬菌体能够杀灭样品中的坎氏弧菌，起到食品安全保护剂的作用。
实施例7
15天虾苗实验
1.虾苗暂养
将虾苗放入装有人工海水的塑料水箱内暂养24h。暂养期间每12h换水一次，持续充氧。
同时取虾苗原水体涂TCBS板检验有无弧菌。
2.坎氏弧菌扩增
挑取菌株编号40-2的单菌落接种于2216E液体培养基中，置于37℃恒温振荡培养箱中培养3-4h(菌落数增殖至109cfu/mL)，将培养液4000rpm离心20min后取沉淀，用无菌生理盐水洗涤三次后复溶，4℃冷藏备用。
3.噬菌体施用实验
每组取50条虾，4组，实验各组别在暂养后细菌/噬菌体的添加条件设置如下表3所示。
细菌量108cfu/mL，20mL，加入细菌30min后，再按照MOI加入1.6×109pfu/mL的噬菌体20mL。
不加细菌和/或不加噬菌体时，加入等体积的生理盐水。
表3.实验组别添加条件
| 噬菌体 | 不加噬菌体 | |
| 细菌 | 组1 | 组2 |
| 不加细菌 | 组3 | 组4 |
添加细菌/噬菌体后隔0、12h、24h、36h、48h后，每组挑3条虾，其他虾继续养殖。
4.噬菌体和细菌的检测
各组取出的3条虾加入1ml PBS，用组织破碎机将虾绞碎，离心；
(1)取上清液过滤，梯度稀释，铺双层平板，噬菌斑计数，检测虾肉中的噬菌体含量。
(2)取沉淀，加入1ml PBS，涡旋混匀，梯度稀释，100ul涂TCBS板，菌落计数，检测虾肉中的坎氏弧菌含量。
结果如图3所示，图3是本发明的实施例7的15天虾苗实验的对比实验结果，从图中可以看出，在水体中使用噬菌体后，能够显著降低虾体内的弧菌含量，从而减少虾苗的发病机会。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
广东海大畜牧兽医研究院有限公司
<120> 坎氏弧菌噬菌体及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21219
<212> DNA
<213> Vibrio phage
<400> 1
tcgcagttcg ctacacgcag gacgcttttt cacgttctgg ttggttgtgg cctgttgatg 60
ctaaaggtga gccgcttaaa gctaccagtt atatggctgt tggtttctat gtggctaaat 120
acgttaacaa aaagtcagat atggaccttg ctgctaaagg tctaggagct aaagaatgga 180
acaactcact aaaaaccaag ctgtcgctac ttcccaagaa gctgttcaga atcagaatga 240
gccgcaactt cgggatgaaa atgctcacaa tgacaaatct gtccacggag tgcttaatcc 300
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gcaggaaaca ctgacgttct tactgacgca gaagaaaacg tgcgtcaaaa attacgtgca 1320
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tagacatttt tactttttat gtccctcatc gtcacgttta tggtgaacag tggattaagt 1740
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ccgaggctaa ccctaatgag cttaatcaag atgatgctcg ttatggtttc cgttgctgcc 1980
atctcaaaaa catttggact gctccgcttc ctcctgagac tgagctttct cgccaaatga 2040
cgacttctac cacatctatt gacattatgg gtctgcaagc tgcttatgct aatttgcata 2100
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ttttgatgcc gaccctaaat tttttgcctg tttggttcgc tttgagtctt cttcggttcc 3180
gactaccctc ccgactgcct atgatgttta tcctttggat ggtcgccatg atggtggtta 3240
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ttggttggac ttggtggcaa gtctgccgct gataaaggaa aggatactcg tgattatctt 3780
gctgctgcat ttcctgagct taatgcttgg gagcgtgctg gtgctgatgc ttcctctgct 3840
ggtatggttg acgccggatt tgagaatcaa aaagagctta ctaaaatgca actggacaat 3900
cagaaagaga ttgccgagat gcaaaatgag actcaaaaag agattgctgg cattcagtcg 3960
gcgacttcac gccagaatac gaaagaccag gtatatgcac aaaatgagat gcttgcttat 4020
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caacagcagg tttccgagat tatgcgccaa atgcttactc aagctcaaac ggctggtcag 4140
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acgcaggacg ctttttcacg ttctggttgg ttgtggcctg ttgatgctaa aggtgagccg 5460
cttaaagcta ccagttatat ggctgttggt ttctatgtgg ctaaatacgt taatcttccg 5520
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tccatctgtg ctttcgccat gatttcggcc acaccaagcg tgaaagcgag agacgttgac 5760
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gctgttacgt attcgatttt gtaatcgtta cgtttaccga tttcatccca catgtcgact 6960
tcaaagcctt gtagcttgtc ttgctttaca aaagtaaacg ggaagtagcg acctgacata 7020
ccaactttga cttcagtagc ggcttgtacg gttgctgccg acagtgcaat ggctgcaacg 7080
gcaaccttaa tccagttttt cataatacat ctccataatt ttatggttgg aaatactact 7140
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tgatgacggt gtcttcaact tcgaaggtgg ttgttacgca aaaaccatca aactttctaa 20700
agaagcggag ccggacatct acaacgcaat tcgtcgtgat gcactgctag aaaacgtaac 20760
agtacgtggc gatggctcta tcgactttga tgatggttcg aaaacagaaa acacacgtgt 20820
ttcttaccct atctaccata tcgataatat cgttaagcca gtatcaaaag gcggtcacgc 20880
gaataaagtg atcttcctat cagccgatgc atttggcgta ctgcctccag tatctaaatt 20940
gacacccgag caaactaagt accacttcct gtctggcttt accgccaaac tagcgggaac 21000
agagcgcggt attactgagc caacaccaac tttctctgct tgtttcggcg cggcgttcct 21060
aacgcttcac ccaactaaat acgcagaagt actggttaaa cgcatggaag cagcaggcgc 21120
tgaggcttac ctagtgaata ctggttggaa cggcactggc aaacgtatct ctattcaaga 21180
tacacgcgga attattgatg ccattcttga tggttcgat 21219
Claims (8)
1.一种坎氏弧菌噬菌体，其特征在于，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的坎氏弧菌噬菌体。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，还包括辅料。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型选自粉剂、水剂、冻干剂、凝胶剂、霜剂或膏剂。
5.权利要求1所述的坎氏弧菌噬菌体在制备抗菌剂、水体净化剂或饲料添加剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂、所述水体净化剂或所述饲料添加剂用于预防和/或杀灭坎氏弧菌。
7.一种杀灭水体中的坎氏弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：向所述水体中投入权利要求1所述的坎氏弧菌噬菌体，或投入权利要求2至4任一项所述的组合物。
8.一种水产品的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：将非活体的所述水产品与权利要求1所述的坎氏弧菌噬菌体混合，或与权利要求2至4任一项所述的组合物混合。
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