KR20110130285A - 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 - Google Patents
황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20110130285A KR20110130285A KR1020100049853A KR20100049853A KR20110130285A KR 20110130285 A KR20110130285 A KR 20110130285A KR 1020100049853 A KR1020100049853 A KR 1020100049853A KR 20100049853 A KR20100049853 A KR 20100049853A KR 20110130285 A KR20110130285 A KR 20110130285A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- bacteriophage
- staphylococcus aureus
- sap26
- present
- phage
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) SAP26에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 박테리오파지 SAP26을 이용하여 균막 형성능이 있는 황색포도상구균을 효과적으로 사멸시키거나 감소시킬 수 있다. 특히 박테리오파지는 세균을 숙주로 하는 바이러스로 사람과 동물 등에는 전혀 작용하지 않는 것으로 알려져 있기 때문에 의약산업, 식품산업, 생명공학 등에 응용이 가능할 뿐 아니라, 항생제 내성에 대한 문제점 없이 유해 세균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 박테리오파지 SAP26을 이용하여 균막 형성능이 있는 황색포도상구균을 효과적으로 사멸시키거나 감소시킬 수 있다. 특히 박테리오파지는 세균을 숙주로 하는 바이러스로 사람과 동물 등에는 전혀 작용하지 않는 것으로 알려져 있기 때문에 의약산업, 식품산업, 생명공학 등에 응용이 가능할 뿐 아니라, 항생제 내성에 대한 문제점 없이 유해 세균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있다.
Description
본 발명은 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) SAP26에 관한 것이다.
황색포도상구균은 병원내 감염을 일으키는 대표적인 세균으로 정상인이나 환경에서도 쉽게 발견되는 상재세균이다. 이 세균은 상처나 면역저하환자, 그리고 외과적 치료부위에 오염된 의료기구 등을 통하여 감염하여 항균제로 치료하기 어려운 내성을 가지고 화농성 질환을 일으킨다. 균의 특성상 의료기구나 비생물체의 표면에 고착하여 오랫동안 생존하고 있기 때문에 일반적인 세제나 알코올류로 완전히 제거가 어렵다. 이를 세균의 균막형성이라 하며 균막형성시 치료가 더욱 어렵고 항균제에도 보다 높은 저항성을 나타낸다. 인체 감염시 균막은 인체의 면역체계에 저항하며, 항균물질에 대한 저항성이 부유 상태의 500배에서 1000배 이상 증가하는 것으로 나타나 항균치료만으로는 효과적인 치료를 기대하기 힘들다. 뿐만 아니라 항균제 내성균의 출현 및 확산 문제가 매우 심각해서 현재까지 개발되어 사용되고 있는 거의 모든 종류의 항균치료제에 내성을 나타내는 슈퍼박테리아까지 출현하여, 항균제 이외의 대체치료제의 개발이 시급하고 절실하게 요구되고 있다.
박테리오파지는 세균에 특이적으로 감염하고 용균을 일으키는 바이러스로 1915년 최초발견 이후 지금까지 다양한 세균성 질병의 치료를 위해 연구되어 왔으며, 80년 전 파지 발견자인 Felix d'Herelle는 최초로 파지를 감염질환의 치료 목적으로 사용하였다.
박테리오파지를 이용한 연구는 과거부터 지금까지 그루지아, 폴란드와 구소련에서는 꾸준히 치료 연구가 진행되고 있으며, 실제 병원성 미생물에 대한 치료에도 사용되고 있다. 1994년, 위절제술 후에 재발한 횡경막 종양에 감염된 내성 대장균에 박테리오파지를 처리하여 깨끗하게 치료하였다. 1995년, 급성 만성 비뇨기염증환자 46명에게 박테리오파지를 처리하여 92%명이 임상적으로 회복되었고, 84%가 병원성 미생물을 완벽히 제거하였다. 1999년, 신생아의 수막염을 일으키는 균인 Klebsiella pueumoniae에 항생제 처리가 실패하여 구강주입을 통해 박테리오파지를 처리하여 치료에 성공하였다. 2001년, 20명의 난치 종양환자에게 2~9주 동안 하루에 3번 구강으로 박테리오파지를 주입하여 치료에 성공하였다. 2001년, 54명의 환자들의 화상부위에 파지를 감염균의 수에 1.5~2배 처리하여 Staphylococcus, Streptococcus, Proteus 등에 감염으로부터 보호하였다. 2002년, 박테리오파지와 생물분해성 혼합물을 상처와 종양에 처리하여 환자 96명중 67명이 회복되었다.
최근 종 선택성에 대한 광범위 효과를 발휘하는 박테리오파지에 대한 탐색과 살균효과의 전달에 대한 약물동력학적 연구가 진행됨에 따라 점차 그 활용가능성이 높아지고 있고 외국의 경우 활발한 관련연구가 진행되고 있지만 국내에서는 파지 관련연구가 시작단계에 불과하다.
세계적인 학술지인 Nature review와 Nature biotechnology에서는 박테리오파지를 이용한 치료에 대하여 소개하면서 치료용 박테리오파지의 선별 방법과 치료방법들에 대하여 자세하게 보고 하였으며, 게놈 유전자의 산물을 이용하여 감염세균의 성장을 억제하는 방법을 소개하였다.
2007년, 미국 식품의약품안전청(FDA)이 당뇨성 발 괴사의 세균감염 치료를 위한 파지 사용 1단계 임상실험을 승인하여 파지를 이용한 동물의 감염질환 치료 뿐 아니라 사람에게도 치료목적으로 사용할 수 있는 길이 열렸다. 2008년, FDA는 살모넬라 특이적 박테리오파지를 이용하여 닭고기 처리과정 중에 살모넬라 오염을 저감하는 방법을 승인하였다. 감염질환의 치료를 위하여 파지 자체를 개발하는 것 뿐 아니라 파지가 가지고 있는 살균 인자(bactericidal factor)를 탐색하여 응용하는 것이 필요하다. 감염질환의 경제적 효과와 보건의료기술 향상에 큰 영향을 줄 것으로 기대되어 국가적 연구지원을 통한 관련기술 및 연구기반 향상이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 다약제 내성 황색포도상구균의 임상분리주로부터 분리된 박테리오파지 SAP26이 황색포도상구균에 대하여 특이적 사멸능을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 황색포도상구균에 대한 탁월한 사멸능을 갖는 박테리오파지(Bacteriophage) SAP26을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지 SAP26을 유효성분으로 함유하는 황색포도상구균 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지 SAP26을 포함하는 항생제 및 소독제를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) SAP26을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 박테리오파지 SAP26은 본 발명에서 처음으로 분리 동정된 것으로서, 그 유전체의 서열 또한 본 발명자에 의해 처음으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 분리된 박테리오파지 SAP26의 전장 유전체를 분리하고 이를 시퀀싱함으로써 파지의 유전체가 약 41 kbp 크기인 이중 가닥 DNA이며 63개의 단백질 암호와 부위(open reading frame, ORF)를 가짐을 확인하였다 (표 2 참조). 또한 본 발명에서 분리된 박테리오파지 SAP26는 메티실린 내성 황색포도상구균과 메티실린 감수성 황색포도상구균 모두에 탁월한 사멸능을 가짐을 확인하였다 (표 1 및 도 4).
본 발명에 있어서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCTC 11665BP인 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 다약제 내성 황색포도상구균의 임상분리주로부터 황색포도상구균에 대하여 사멸능을 가지고 있는 신규한 박테리오파지를 선별하였고, 분리된 박테리오파지를 한국 생명공학연구원의 유전자은행에 2010년 3월 22일자로 기탁하였다.
본 발명에 있어서, 상기 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균 또는 메티실린 감수성 황색포도상구균인 것을 특징으로 한다. 특히 균막이 형성된 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 높은 사멸능을 보였다 (도 4의 b). 또한 낮은 농도의 항균제와 복합적 사용에서는 탁월한 항균능을 보였다 (도 4의 d). 즉 균막이 형성된 황색포도상구균에 항균제를 단독으로 처리하는 경우(도 4의 c)에는 황색포도상구균의 사멸능이 낮았지만 발명의 박테리오파지와 함께 처리하는 경우(도 4의 d)에는 균막이 형성된 황색포도상구균에 본 발명의 박테리오파지가 직접 작용하여 시너지 효과를 얻을 수 있었다. 따라서 본 발명의 박테리오파지 SAP26을 의학 산업, 식품 산업, 생명공학 산업 등에 응용하여 항균제 내성에 대한 문제점 없이 유해 황색포도상구균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 SAP26을 유효성분으로 포함하는 균막 형성능을 가진 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지는 일반 항균제보다 내성세균 출현의 문제가 적고, 세균에만 용균작용을 나타낼 뿐 진핵세포에는 작용하지 않는 선택적 독성이 우수하므로 인체와 동물에 무해하기 때문에 감염병 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 ‘치료’라는 용어는 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 예방; 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지는 상술한 바와 같이 황색포도상구균을 사멸시키고 그것에 의해 형성된 균막을 효과적으로 제거할 수 있으므로, 황색포도상구균에 의해 유발되고 균막 형성으로 인해 만성화된 다양한 질환, 예컨대 유방염, 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염, 및 장염 등에 대한 치료에 효과를 나타낸다. 이러한 목적의 조성물에는 추가적 치료의 효과를 얻기 위하여 이미 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 성분이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 적용될 수 있는 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 성분으로는 메티실린, 옥사실린, 반코마이신 등이 있는데 이에 국한되지 않고 다양한 항생제가 적용될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 1×103 내지 1×1010 pfu/㎖의 박테리오파지를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 SAP26을 유효성분으로 포함하는 화장품용 항균제 및 의약용 항생제를 제공한다.
황색포도상구균은 고초균(Bacillus subtilis), 대장균 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 등과 함께 화장품에서 자주 발견되는 유해균이기도 하다. 화장품은 기름이나 물을 주성분으로 하며, 미생물의 탄소원이 되는 글리세린이나 솔비톨 등과 질소원이 되는 아미노산 유도체, 단백질 등이 배합된 것이 많으므로 세균 등의 미생물 침투가 용이하다. 또한, 식품에 비하여 사용기간이 매우 길기 때문에 미생물에 의한 오염 위험이 훨씬 크다고 할 수 있다. 사용함에 따른 미생물 오염으로 나타나는 변색이나 변취 등으로부터 화장품을 장기간 보호하기 위하여 항균제의 첨가가 필수적이다.
최근 화장품에 가장 널리 사용되고 있는 파라벤류와 같은 합성방부제는 그 위험성이 부각되고 있고, 합성 방부제 함유 화장품이 예상 외로 위험할 수도 있다고 인식되고 있다. 또한, 미국 피부과학회는 합성 방부제를 피부 알레르기 유발 원인물질 2위에 올려놓은 바도 있다. 이와 함께 최근에는 어린이용 제품에 대한 인공 합성 방부제의 사용은 어린 시절부터 방부제 함유제품을 사용하게 함으로써 방부제의 사용기간과 양을 성인에 비해 늘릴 수 있기 때문에 더욱 위험할 수 있다는 우려가 있어 새로운 천연유래의 방부제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 비하여 탁월한 황색포도상구균의 사멸능을 갖고 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거능력이 있는 장점을 갖고 있다. 본 발명의 박테리오파지를 항생제로 이용하게 되면 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 황색포도상구균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 중요한 장점을 갖기 때문에 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 제공될 수 있다. 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항생제 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그 만큼 항생제로서의 제품수명이 길어질 것으로 기대된다.
따라서 황색포도상구균을 사멸시키는 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 ‘항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.
상기 황색포도상구균에 대해 효과적인 사멸능을 갖는 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제는 병원감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고 또한, 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 축산산업의 축사 소독제로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 소독제에 사용되는 박테리오파지는 자연 분해되므로 친환경적이고 액상으로 준비 가능하기 때문에 일반 환경 또는 의료 기구에 존재하는 황색포도상구균을 제가하기 위한 소독제의 용도로서 매우 유용하다. 박테리오파지를 생산하는 비용 또한 항균제 개발과 생산보다 훨씬 경제적이기 때문에 보건산업에서의 박테리오파지의 효용성은 매우 크다고 할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 황색포도상구균을 효과적으로 사멸시키는 것은 질병치료 및 예방 차원에서 매우 중요하다. 이러한 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환을 치료하거나 원인세균을 사멸시키기 위하여 인체 또는 가축 등에 항균제를 투여하고 식자재나 환경에는 물리화학적 요법으로 원인세균을 저감하기도 한다. 그러나 현재 항균제 남용으로 인한 내성 세균의 유행이 국민보건에 크게 위해요소가 되고 있으며 물리화학적 요법은 환경오염과 경제적 비용이 많이 든다는 단점이 있다. 본 발명의 박테리오파지 SAP26은 균막형성능을 가진 황색포도상구균에 대하여 탁월한 사멸능을 나타낸다. 따라서 다양한 질병의 원인이 되는 황색포도상구균을 사멸하는 SAP26은 보건산업 뿐 아니라 식품, 친환경 대체항균제로 이용될 가치가 높다.
도 1은 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 균주인 황색포도상구균 배지에서 발생한 파지 플라크(phage plaque)를 나타낸다.
도 2는 박테리오파지 SAP26을 직접점적법을 통하여 MRSA 균주인 황색포도상구균을 용혈한 사진이다.
도 3은 박테리오파지 SAP26의 전자현미경 사진이다.
도 4는 MRSA인 황색포도상구균 균막에 대하여 박테리오파지 SAP26, 피팜피신, 및 이들의 조합의 처치에 따른 황색포도상구균 균막의 제거효과를 비교한 결과이다. a: 처치하지 않은 대조군(control biofilm), b: 박테리오파지 SAP26을 처지한 균막, c: 리팜피신을 처치한 균막, d: 박테리오파지 SAP26와 리팜피신을 동시에 처치한 균막.
도 2는 박테리오파지 SAP26을 직접점적법을 통하여 MRSA 균주인 황색포도상구균을 용혈한 사진이다.
도 3은 박테리오파지 SAP26의 전자현미경 사진이다.
도 4는 MRSA인 황색포도상구균 균막에 대하여 박테리오파지 SAP26, 피팜피신, 및 이들의 조합의 처치에 따른 황색포도상구균 균막의 제거효과를 비교한 결과이다. a: 처치하지 않은 대조군(control biofilm), b: 박테리오파지 SAP26을 처지한 균막, c: 리팜피신을 처치한 균막, d: 박테리오파지 SAP26와 리팜피신을 동시에 처치한 균막.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. SAP26 파지의 생산 및 분리
국내 임상분리주들인 메티실린 내성 황색포도상구균 (methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)을 LB (Luria Bertani) 액체 배지에 접종하여 지수기의 생장조건에서 미토마이신 C (mitomycin C)를 1 μg/ml 농도로 처리하고 37℃에서 하룻밤 정치배양하였다. 세균은 4000 g로 10분간 원심분리하여 제거하고 0.45 μm 크기의 필터를 사용하여 여과하였다. 50 μl 정도의 클로로포름을 첨가하여 4℃에 보관하였다. 이 용액을 사용하여 LB 고체배지에 황색포도상구균이 퍼져서 말린 박테리아론(bacterial lawn)에 직접 한 방울씩 떨어뜨려 하룻밤 동안 37℃에 배양한 후, 다음날 세균용혈을 확인(직접점적법)하였다. 박테리오파지는 상기 임상분리주들의 염색체에 존재하였던 것으로 인위적으로 미토마이신을 처리하여 분리하였다. 박테리오파지의 순수분리를 위하여 플라크 (plaque) 형성 시험을 하고 단일 플라크를 분리하여 다시 황색포도상구균과 혼합배양하여 박테리오파지를 증폭하는 과정을 연속 세 번 반복하여 순수분리하였다 (도 1 참조). 이렇게 순수분리된 박테리오파지를 본 발명자들은 한국 생명공학연구원의 유전자은행(KCTC)에 기탁하고 (KCTC 11665BP) ‘박테리오파지 SAP26’이라고 명명하였다. 대량의 박테리오파지를 수확하기 위하여 순수 분리된 파지를 지수기의 숙주세균과 혼합하고 최종 0.7%의 한천이 되도록 녹인 한천과 혼합한 후, LB 고체배지에 붓고 말린 후, 37℃에 하룻밤 배양하였다. 그린 다음, 위의 원심분리와 여과과정을 수행하였다. 원하는 PFU(plaque forming unit)를 얻을 때까지 이를 반복하였다.
실시예 2. SAP26의 황색포도상구균에 대한 숙주특이성 및 사멸능
실시예 1에서 얻은 순수 분리된 파지용액을 이용하여 아토피 피부염 환자들과 창상 환자에서 분리된 MSSA(methicillin susceptible Staphylococcus aures) 61주와 MRSA(methicillin resistant Staphylococcus aures) 110주를 포함한 총 171주의 황색포도상구균(표 1)을 대상으로 직접점적법을 수행하였다 (도 2). 이 결과, 하기 표 1과 같이, SAP26 파지는 93.4%의 MSSA와 99.1%의 MRSA를 사멸시키는 것으로 나타났다.
[표 1]
실시예 3. 전자현미경을 이용한 SAP26의 형태관찰
파지의 모양을 관찰하기 위하여 주사전자현미경을 사용하였다. 약 1012 pfu의 순수분리된 파지를 탄소로 코팅된 구리판에 바른 후, 2%의 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하고 주사전자현미경 (Philips EM 300)을 사용하여 관찰하였다.
관찰결과 도 3에서, 각이 진 머리(icosahedral head)와 긴 하나의 꼬리가 관찰되어 형태적 분류를 통해 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 것으로 판단하였다. 머리크기는 약 50 nm이었으며 꼬리길이는 120-200 nm이었다.
실시예 4. SAP26의 유전학적 특성
파지의 유전체는 Lambda midikit (Qiagen)를 사용하여 순수분리하였다. 분리된 파지 유전체는 전체유전자 염기서열 결정을 위하여 (주)제노텍에 맡겼다. 전체 염기서열 결정은 shotgun 방법과 포스미드 라이브러리 제작, 그리고 자동화 염기서열기기 (ABI PRISM 377)에 의하여 수행되었다. 염기서열 분석결과에서 단백질 암호화 부위 (open reading frame, ORF)들은 Sequin 소프트웨어 버전 9.5를 사용하여 분석하였다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
실험결과, 파지의 유전체는 이중가닥 DNA로 크기가 약 41 kbp이고 (서열번호 1), 63개의 ORF로 구성되어 있었다. 전체 염기서열을 미국 NCBI의 BLAST 검색을 한 결과, SAP26 파지의 게놈은 기존에 보고된 황색포도상구균의 파지인 phiNM1와 phiETA2에 각각 75%의 Query Coverage를 보여 SAP26와 가장 가까운 파지로 나타났다. 이러한 결과는 SAP26이 새로운 파지임을 나타낸다.
[표 2-1]
[표 2-2]
실시예 5. SAP26 단독처치 또는 SAP26와 항균제 동시 처치에 의한 황색포도상구균 사멸효과 및 균막 제거효과 시험
SAP26의 황색포도상구균 사멸능을 시험하고자 MRSA 균주인 S. aureus D43-a 균주를 사용하였다. D43-a 균주를 BHI 액상배지를 사용하여 37℃에서 흔들어 하룻밤 배양하고 OD600 = 1을 맞춘 배양액을 100배 BHI로 희석하여 96웰 플레이트에 100 μl씩 분주하였다. 이 때의 균은 약 5×106 cfu/웰이다. 그리고 37℃에서 하룻밤 정치배양하여 24시간 세균막 형성을 하도록 하였다. 24시간 후에 배양액과 부유세균을 제거하고 5×108 pfu/웰이 되도록 각 웰에 SAP26 파지를 100 μl 가하였다. 항균제만을 위한 세균막 처치를 위해서는 리팜피신(rifampicin)을 사용하여 D43-a 균주의 MIC 농도보다 10배 높은 0.6 μg/ml의 농도가 되도록 제조한 후 100 μl씩 각 세균막 형성된 웰에 가하였다. 또 리팜피신과 파지의 동시 처치를 위해서 SAP26 파지 5×108 pfu/웰과 리팜피신 0.6 μg/ml의 농도가 되도록 하여 총 100 μl의 부피가 되록 하여 세균막 형성된 웰에 가하였다. 이렇게 파지와 항균제, 파지-항균제 처치를 가한 것을 추가로 24시간 동안 37℃에서 정치배양을 하고 주사전자현미경(scanning electron microscopy)을 이용하여 세균의 상태를 관찰하였다.
도 4를 보면 아무것도 처치하지 않은 균막(도 4의 a)과 비교하였을 때, SAP26 파지 처치된 균막(도 4의 b)은 리팜피신 처치한 것(도 4의 c)보다 더 균막을 상당량 제거하였으며 남아있는 세균의 형태도 건강하지 않은 모습을 보여주고 있다. 반면에 SAP26 파지와 리팜피신 동시 처치된 균막(도 4의 d)을 보면 항균제나 파지의 단독 처치보다 더 좋은 균막 제거효과를 보여주었다. 이 결과를 근거로 SAP26 파지는 항균제를 동시 처치하면 MRSA 황색포도상구균의 사멸과 함께 균막까지도 효과적으로 제거할 수 있음을 알 수 있다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> A bacteriophage killing Staphylococcus aureus
<160> 1
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 41207
<212> DNA
<213> Bacteriophage SAP26
<400> 1
tattcacttc acacggtgtt tatagatatc ttaccaatag aacaaatgga ttgaagctca 60
caccacgtga aaacagtttt gaatctcact catttgaacg catgcctatt acagaattta 120
gcaataacga aagaagaaaa ggggattacg agaaagtaat cactttaatt gatttgtatg 180
ataatgctga atcagataca gctaactata tgagtgattt aaatgacgct atgttactta 240
ttaaaggtaa tttaaattta gatcctgtag aagttagaaa acaaaaggaa gctaacgtgt 300
tgtttttaga accgactgtt tatgctgata gcgaaggtag agaaacagaa ggttcagttg 360
acggtggtta tatttataag caatacgatg tacaaggtac cgaagcttat aaagaccgtt 420
tgaacagtga tatacacatg tttaccaaca cgcctaacat gaaagatgat aactttagtg 480
gcactcaatc gggcgaggca atgaaatata aattgttcgg attagaacaa cgtactaaaa 540
ctaaagaagg attgttcact aaagggttaa gacgtcgtgc taagttgtta gagacaatac 600
ttaaaaatac acggtcgatt gacgctaaca aagatttcaa tactgttaga tacgtataca 660
acagaaactt acctaaatca ttgattgaag aattaaaagc ttatattgat tctggcggga 720
agattagcca aacaacttta atgtctctat tctcgttctt ccaagaccct gaattagaag 780
ttaagaaaat cgaagaagat gagaaagaat ctattaaaaa agctcaaaaa ggtatttata 840
aagaccctag agacatcaat gatgacgaac aagatgatga tacaaaagat actgttgata 900
aaaaggaatg attgtaattg cctaacaaaa acactcaaga atattgggaa gaacgcggac 960
gcaaagcaat cgagaatgag ttgaagcgtg ataaaactaa agctgaagaa atagaacgta 1020
tattgaatat gatgattaag cgcattgaaa aagagatcaa tgcgtttatt gttaagtacg 1080
gagattttgc aggcgttaca ttacaagaag cacaaaagat tattgatgag ttcgatgtaa 1140
aagcgtttca agaagaagca aaaagattgg tcgaaaacaa ggactttagc gatagagcaa 1200
atgaagaatt aaagaagtat aacactaaga tgtatgtatc tagagaacag atgttaaaga 1260
ttcaaataga attcttaatt gcttatgcaa cagctcaaac agaattatcg atgagggaat 1320
atttcgaatc aacagcttat cgtgtgttca gtgatcaagc gggtatttta ggtgaaggtg 1380
tacaagtagc taaagaagtt atagatacaa tcgttgatac acaatttcat ggtgtcgttt 1440
ggtcagagcg attatggact aataccgaag caatgaaaca agaagtagaa gaaataattg 1500
ctaatgtagt tattagaggt cgacatccta atgaatatgt taaagatatg cgcaagcact 1560
taaataaatt cgaaggcaca gcacgacaaa agaccgcagc aattaaatca ttgctttata 1620
cggaatcggc acgtgttcac gcacaatcaa gcattgacag catgaaagaa atttcaccgg 1680
aaggatatta tatgtatatt gcaaaaatcg ataatagaac aactaaagta tgcaaagggc 1740
ttaatggaga aatattcaaa gttaaagacg ctaaaattgg tgttaatttc tatcctatgc 1800
atatcaattg tcgttcagat tgcgctttac tacctaaatc tatgtggccg aaaaaaccaa 1860
gcaagaaacg aaaaacaaaa tacttcggag ggaaagtgaa aagcggtgat tgatttaaaa 1920
gtaaagtttt ttaaaggcaa gttagttttg tatgacagta aattaaatgt ttggaggata 1980
ctaatatgag taatactgac aaatacctta gagacatagc aagagaatta aaaggtatac 2040
gtaaagagtt acaaaagcga aacgaaacag ttattattga tgcaaactta gatagtgtaa 2100
ggtcggcagt attagccgat aaagaaaaat cgaaatataa tgaacctctc ttttaatagc 2160
tagcacttaa ttgtgttggc tattttttat gtccaaacca tgcttatgac aataaaagat 2220
gcaagtgtaa cagcccgaac catgtatggc ttaaaactaa tcaagagtaa ataaatgagg 2280
tgtaaaaact atggatatcc aagagaagtt aaaactcaaa ttacagtttt ttgctgaaga 2340
atcagatgga gataatggaa aatcaaaaga taacaacgat gatgaaggca aagacaaaca 2400
agacaaaaag actaattcag aagaagaaat cgaaaaaaga ctacaagaag aatataacaa 2460
gcgtcttaaa gaagaattaa gtcgtcgtat gaagcagaaa gaaaaagaga aacaagaagc 2520
tgttgatgaa gctaaacgat tagcaaaaat gaacaaagat caaatcgctg aatatgaacg 2580
cgaacaaatg gaaaaagagc tggaacaatt acgttcagaa aaacaattaa acgaaatgcg 2640
ttcagaagca cgaaaaatgt tgagtgaagc ggaagttgat tcatcagatg aggttgtcaa 2700
tttggttgta actgacactg ctgaacaaac taaattgaat gttgaagctt tttctaatgc 2760
agtaaaaaaa gcggttaatg aagcggttaa gattaacgct agacaatcgc cattgactgg 2820
tggagattca tttaatcact cgactaaaaa taaaccgcaa aacttagctg aaatagctag 2880
acaaaaaaga attattaaaa attaacggag gcatttaaat ggaacaaaca caaaaattaa 2940
aattaaattt gcaacatttt gcaagtaaca atgttaaacc acaagtattt aaccctgata 3000
atgtaatgat gcacgaaaag aaagatggca cgttgatgaa tgaattcaca acgcccatct 3060
tacaagaggt tatggaaaac tctaaaatta tgcaattagg taagtacgaa ccaatggaag 3120
gtactgagaa gaagtttact ttttgggctg ataaaccagg tgcttactgg gtaggtgaag 3180
gtcaaaaaat cgaaacatct aaagctacat gggttaatgc tactatgaga gcgtttaaat 3240
taggggttat cttacctgta acaaaagagt ttttgaatta cacttattca caattctttg 3300
aagaaatgaa gcctatgatt gctgaagcat tctataaaaa gtttgatgaa gcgggtattt 3360
tgaatcaagg taacaatcca ttcggtaaat caattgcaca atcaattgaa aaaactaata 3420
aggttattaa aggtgacttc acacaagata acattattga tttagaggca ttacttgaag 3480
atgacgaatt agaagcaaat gcgtttatct caaaaacaca aaacagaagc ttgttacgta 3540
aaattgtaga tcctgaaacg aaagaacgta tttatgaccg taacagtgat acgttagatg 3600
gtctacctgt ggttaacctt aaatcaagca acttaaaacg tggtgagtta atcactggtg 3660
atttcgataa gttgatttac ggtatccctc aattaattga atacaaaatc gatgaaactg 3720
cacaattatc tacagtcaaa aatgaagatg gaacacctgt aaacttgttt gaacaagaca 3780
tggtggcatt acgtgcaact atgcatgtag cattgcatat cgctgatgat aaagcgtttg 3840
ctaagttagt tcctgctgat gcaaaaccat cttcaaatcc aggagaagtt taataaataa 3900
ttaggagtgg taacatgccc gaaatcattg gaattgttaa agtagatttt acagatttag 3960
aagataacag acatgtctat atgaaagggc atgtctaccc tcgcaaaggt tatgatccta 4020
cagatgaacg tatcaaagct ttagctagtg ttgaaaataa acgcaacgaa caaatgattt 4080
acattgtaaa tgacaaatta accaaaaaag aacttgtcga aatagcaagt gttgctggct 4140
tacaagttga tgaaaaacaa acaaaagctg aaattatcaa tgcttttgag tcactagagt 4200
aggtggttat atgactacgc tagctgatgt aaaaaaacgt attggtctta aagatgaaaa 4260
gcaagatgaa caattagagg aaattataaa aagttgtgaa agccagttgt tatcaatgtt 4320
acctattgaa gttgaacaaa taccggaaag gtttagttac atgattaaag aagttgcagt 4380
taaacgctac aacaggattg gtgctgaagg tatgacatca gaagcggttg acggacgtag 4440
caatgcgtat gaattgaacg atttcaagga gtatgaagct attattgata attactttaa 4500
tgctagaacg agaactaaaa aaggaaaggc tgtgttcttt tgagatatga agatagagct 4560
gtctttcaat cagaacaagc agcaacttac aatcctaaaa ctagcaaaaa agaaaacact 4620
ctaatcactt atgatgcgat accatgcaat attaatccta tttctagagc aagaaagcaa 4680
cttgaattcg gcgatgtaaa aaacgatgta agtgtcctga ggataaaaga atcaatatct 4740
taccctgtta gccacgtgtt ggttaatggc attcgctaca agatagttga tacaaggata 4800
tacagacacg aaacgtcata ttatatcgaa gaggtcaatt gatgaatata gatggattag 4860
acgcactgtt aaatcaattt cacgatatga aaaccaacat cgatgatgat gtagatgata 4920
ctttacaaga aaaagccaaa gaatatgtag tacgagctaa attgaaagct agagaagtaa 4980
tgaataaggg ttattggact ggtaatttat cacgcaatat cagatataaa aaaactggcg 5040
atttgcaata cactatcaca tcgcatgcag cttatagtgg tttcttagag tttggcactc 5100
gatacatgga ggcagaacct tttatgtggc cagtatatga ggtaataaga aaatcaactg 5160
tagaagaatt gaaagcgttg tttgaatagg agataaaagc atgacaccga acttacaact 5220
ttataataaa gcttatgaaa cgctacaagg atatggattc cctgttattt ctcgtaaaga 5280
gatgcaacaa gagattccgt atcctttttt tgtaataaaa atgccggagt caaacagaag 5340
taaatacacg tttgatagtt attctggtga cacgaattta gttattgata tttggagtgt 5400
aagtgatgat ttaggacatc atgacggact tgttaaaaga tgtattgatg atttaacacc 5460
tagcgttaaa acaaacgatt atgactttga agaagatgat actaacatca cacagttagt 5520
tgatgatact accaatcaag aattgctaca cacatcagta acgatatctt acaaaacatt 5580
ttaaaaaacg gaggaatatt gaatggcaaa tatgaaaaat agtaatgatc gtattatttt 5640
atttagaaaa gctggcgaaa aagtagatgc tactaaaatg ctttttttaa ctgaatacgg 5700
cttatcacat gaagctgata cagatacaga ggatacgatg gatgggtctt ataacactgg 5760
tggttcagtt gaatcaacaa tgtctggtac tgctaaaatg ttttatggtg acgattttgc 5820
agatgaaatt gaagatgcag ttgtagatcg cgtattgtat gaggcttggg aagttgaaag 5880
tagaatacca ggcaaaaatg gagatgctac taaatttaaa gcgaaatatt tccaaggttt 5940
ccacaataaa tttgaattaa aagcagaagc taacggtatt gatgaatatg aatatgaata 6000
tggagtgaat ggtcgtttcc aacgtggatt tgcaacacta cctgaggctg taacaaagaa 6060
acttaaggcg actggataca gattccatga cactacaaaa gcagatgcgt taactggcga 6120
agatttaaca gcaattccac aacctaaggt agattcatca acggttacac caggagaggt 6180
ataaaaatag ggcgttaagc cctatttatt ttgtttaaat taatcatgaa tggagatttt 6240
aagttatgaa tgtagaaatt aacggaaagt cattagaatt aagttttggt tttaaatttt 6300
taagagaaat cgataaccga ttaggtttaa aagttgagca agcttctatc ggtcaaggtg 6360
tatcaatgtt gcctgtaggt ttagagagtg gaaatcctgt tgtgattggc gaagttttaa 6420
ttgcagctac atctcacttg aaaaaacaag caattactat taataacatt gatgaagcac 6480
tagatgaaat cgcagaaaat attggactag aagaatttgg ttcggatatt ttaacggagt 6540
tgggaaagcg acctatgacc cgaaacctag tcgaagtagt ggaaacggaa gagaaaccag 6600
cgggagccta ataacttacg acagaatcgt tataacttgt atgtcaacac ttggtattac 6660
agatttgaac gttattgagc aaatgacatt aacagaatat aactatcgaa tgtatgcgaa 6720
agagtatgaa atgctaaccc aagaattcga acgttacaaa cttgcgtttg ctattcgtga 6780
tgctgcagct actaaaaatg ttgggacaga aaataaacct aaagaggaat atgtttttaa 6840
caacgcaaac gacgtattgc cttatgaaga aaatatccaa cggcttaacg aaggtaaaga 6900
tataagattt agtagcgaac gtgatgaata cgaaccacaa aataatgaat tctttaaagt 6960
tatagcagaa tttaataagc aatagaaaga gaggtgttaa tgtgacggaa tataaaatta 7020
aagcgactat tgaagctagt gtagccaaat tcaaaaggca aattgatagt gcggttaagg 7080
cagtgcaaaa atacaagcgt acagctgata agactaaaga tgttgaatta agtgctaatg 7140
ataaaaaatt acaaaaaact atcaaggttg ctaagaagac tttagattcg ttcggtaatg 7200
aaaaagcaaa agctaaatta gatgctaaaa tagaagatct gaaacaaaaa gtattagaag 7260
caagttttga attaaatcaa ttagattcaa aagaagttac accagaagtt aagttagaaa 7320
aacaaaagtt aattaaagat atcattgaaa cagaagctaa gttatccgaa ctggaaaaga 7380
aacgtgtcaa tattgacgtc aatgctgata acagtaaatt taatcgagtg ttaaaagtat 7440
ctaaagctag tcttgaagcg ttaaataggt ctaaagcaaa agctgttata gacgtggaca 7500
atagtgttgc taactctaaa atcaaacgta ctaaagaaga gcttaagagt attccgaaca 7560
aaactagatc tcgacttaat gtagatacag ggctttctat accaacaatc tatgcattta 7620
aaaaatcctt agacgcatta ccaaacaaaa aaacaacgaa ggtagatgtc gatactaatg 7680
gtttaaagaa agcttatacc tacataataa aagcaaacga caatttccaa agacagatgg 7740
ggaatttagc taatatgttc cgtgtgttcg gcactgtagg ttctaatatg gttggtggat 7800
tattaacttc atcttttagt atcttaatac ctgtaatagc gagcgtagta cctgtagtgt 7860
tcgcgctatt aaacgctatc aaagtattaa ctggtggcgt acttgcttta ggtggtgctg 7920
tagcaatagc gggagctgga tttgtagcgt ttggcgcaat ggctatcagc gctataaaaa 7980
tgcttaacga cggaacttta caagctagtt cggcaacaaa cgaatacaaa aaagctttag 8040
atggtgtaaa gtcagcttgg actgacatta taaaacaaaa tcaatcagct atattcacat 8100
ctttagcaaa tggtttaaac accgttaaaa cagcaatgca gagcttacaa ccgtttttca 8160
gcggtatttc aagaggaatg gaagaggcgt ctcaaagcgt gcttaaatgg gctcaaaaca 8220
gcggtgtagc atcaaggttc ttcaacatga tgaatacaac tggtgtttcg gtatttaaca 8280
aactattaag tgctgcaggc ggtttcggtg acggattagt caatgtattc acacaattag 8340
caccactgtt tcaatggtcg gctgattggt tggatagatt aggtcaatct ttctctaact 8400
gggctaatag tgcagctgga gaaaattcga taactcgatt tattgaatac acaaaaacaa 8460
acttacctgt cattggtaat atttttaaaa atgtgttcgt tggaattaat aatctaatga 8520
atgcattcag cggatcatca actggaattt ttcaatctct tgaacaaatg acggctaagt 8580
ttagagaatg gtctgaacaa gttggccaat ctcaaggctt caaagacttt gtcagttatg 8640
tacaaacaaa tggtccacta ataatgcaat taattggaaa catcgcaaga ggattagttg 8700
cattcgcaac agcaatggct cctatagcta gtgcagtatt acgcgttgca gtagcaataa 8760
ctggttggat agctaactta tttgaggcgc atccagctac agcacaatta gtcggtgtca 8820
tcatcacttt agttggtgca tttaggtttt taataccgat tattcttgct gtatctaact 8880
ttatgggtgg cggattaata ggtaggatca ttgcattagt aagtaaattc ggtttattaa 8940
gagcgggatt aacaatttta aaaggtgcgt tcatgttatt gaaaggacca ttaaaaatta 9000
tatcagttat tttccaattg ttattcggta agattggatt gattagaaat gctatcacag 9060
gactagtaac tgtttttggt attctaggtg gcccaataac aatagtaatt ggtgtaatcg 9120
ctgcattaat agctatattt gttttattgt ggaacaaaaa cgaaggcttc agaaacttta 9180
ttataaatgc ttggaatgcg ataaaaacgt ttatggttaa tgtttggaat gtattaaaag 9240
ctgtagcttc ggttgtatgg aatgctattt taaaagctat cactacagca gtaactaatg 9300
tatacacttt tataatgatt gtttggaatc aaattgtcgc atatttacaa ggactctgga 9360
acggtattat cgctattgca acaacagtat ggaacctttt agttacaatc atcacaactg 9420
ttttcacgac gataatgaca atagttatga cgatatggac agctatttgg acattcttaa 9480
gtacaatctg gaacacgata attacaatcg ctactacgat ttggaatttg ttagtcactg 9540
taataactac tgtgtttaca acaatcatga ctatcgcaat gacaatttgg aatgctattt 9600
ggacgttctt acaaacgttg tggaacacta tagttactgt ggcaactaag gtttggaacg 9660
ctatcactac agctatatct gctgcgttac aagcggcatg gagttttatt tctaatatat 9720
ggaatacgat ttggagtttc ttatctggta tattaacgac gatttggaat aaagttgtaa 9780
gtatattcac acaagttgta tcaactatat cggacaaaat gtctcaagct tggaacttca 9840
tcgtgactaa aggtatgcaa tgggtatcta ctataacaag tacgctaatt aactttgtta 9900
atagagttat tcaaggattc gttaatgttg taaacaaagt tagtcaaggt atgacaaatg 9960
cagtaaataa aataaaaagc tttataggag attttgtgtc tgcaggtgct gatatgatcc 10020
gtggtttaat tagaggtatt ggacaaatgg ctggtcaatt agtagatgca gctaaaaatg 10080
ttgctaagaa agctttagat gcagctaaaa gtgctttggg tattcactca ccttcacgtg 10140
aattcatgga tgttggtatg tattcaatgc taggtttcgt taaaggtata gataatcatt 10200
caagtaaagt tatccgtaat gtttctaatg ttgcagataa agtagttgat gcatttcaac 10260
ctacattaaa cgcacctgac atttctagta ttacaggaaa cttaagtaat ttaggtggaa 10320
atataaatgc gcaagtacaa cacacacatt ctattgaaac atcaccgaac atgaaaactg 10380
ttaaagttga attcgatgtc aataacgatg cgcttactag tattgttaac ggcagaaatg 10440
ctaaacgcaa ttctgagtat tacttataaa ggaggttaca aatggacata gaattaacaa 10500
aaaaagatgg tactgtaatc aaattaagtg aatacgggtt tatcgttaac gatatagtaa 10560
ttgatagcat gcaaatcaac acaaagtatc aagacaaaga aaatatgaac ggtcgcatat 10620
taatggggag caattatatc agtagagata tagttgttcc ttgtttttgt aaagtaaaaa 10680
atcgttcaga cattgcttat atgcgagata tgttgtattc gttaactact gatatagaac 10740
caatgtattt acgagaaatc agaagaaaag aagagttgaa ttacaggttt actcaaccaa 10800
cttctgatga ttacgtgaaa ttagataaaa acaacttccc ggattatgaa tattcaagac 10860
acgatcaaca aatttatgta aacggtaaac agtataaagt tatttttaac ggagttataa 10920
accctaagca aaaaggtaat aaagtttctt ttgaactaaa attcgaaact acagaattgc 10980
catacggtga aagtattgga acaagcctag agttagaaga aaacaaaaag gttggattgt 11040
ggtcgtttga ttttaatatc gattggcatg caggcgggga taagcgccag tatacatttg 11100
aaaatgttag caaagataca gtttactatc atggtagcgc tcctaacgac caattcaaca 11160
tgtataaaaa gataacaatt attttgggcg aagatacaga atcgtttgta tggaatttaa 11220
cgcatgctga aataatgaaa atcgaaggga tcaaactaaa agctggagac agaattgttt 11280
atgatagctt ccgagtttat aaaaacggtg ttgaaataag taccgaaacg aatatagccc 11340
aaccaaaatt taaatacgga gctaataaat ttgagtttaa tcaaacggta caaaaagttc 11400
agtttgattt gaaattttat tataagtagg tgtcagaatg acaataacta ttaaaccacc 11460
taaaggtaat ggcgcacctg taccagtaga aacaacttta gtaaaaaaag ttaatgctga 11520
cggtgtatta acttttgata ttcttgaaga taaatacaca tacgaagtta ttaacgcaat 11580
tggtaaaaga tggattgtta gtcatgtcga aggtgaaaac gacaagaaag aatatgtaat 11640
aactgtcatt gataggaaat cagaaggcga cagacaactg gttgaatgta ctgctagaga 11700
aattcctata gacaagttaa tgattgatag gatttatgtt aatgtaacag gatcttttac 11760
agtagaaaga tattttaaca ttgtgtttca aggtactgga atgctttttg aagtcgaagg 11820
taaggttaag tcttcgaagt ttgaaaatgg tggtgaaggc gatacaaggt tggaaatgtt 11880
taaaaaggga ttagaacatt tcggtttaga atataaaata acgtatgaca aaaagaaaag 11940
cagatataag tttgtattga cgccttttgc aaatcaaaaa gcgtcttact ttatttctga 12000
cgaagtcaac gccaacgcta taaaacttga agaagacgca agtaacttcg ccaccttcat 12060
tagaggatac gggagttatt ctggagaaga aacatatgaa cacgctggac ttgttatgga 12120
ggctagaagc gcattagctg aaatatacgg tgatatacac gcagaacctt ttaaagatgg 12180
caaagtgact gatcaagaaa caatggataa agaattacaa tctagattaa aaaaatcttt 12240
aaaacagtca ctatctttag attttttagt tttaagagaa gcctaccccg aagcagaccc 12300
gcaacctggt gacatagttc aaataaagtc tactattttg ggacttaacg acttagtacg 12360
tatagtagaa attaaaacga ttagagatat aaataatgta attgtaaagc aagatgtaac 12420
gcttggtgaa tttaatcgag aacaacgata tatgaagaaa gtaaatactg ctgctaacta 12480
tgtttctgga ttaaatgacg ttaacctttc caaccctagt aaagcggcag aaaacttaaa 12540
atctaaagtt gcatcaatag ctaaatcaac actcgattta atgagtagaa ctgatttgat 12600
tgaagataaa caacagaagg taagctctaa aactgtaact acatctgacg gcactatcgt 12660
tcatgatttt gtagataaat caaacattaa agatgtaaaa acaattggaa caattggcga 12720
ttctgtagct agaggatcac atgcgaaagt gaattttact gaaatgttag gaaataagtt 12780
gaacgccaaa ataactaatc ttgctaaagg tggcgccacg atggcgactg tgcctattgg 12840
taaggatgca gtagagaata gtatatatcg ccaagcagaa caaataagag gcgacctaat 12900
catattacaa ggtacagatg atgactggtt acacggttat tgggcaggcg taccgatagg 12960
cactgataaa acggacacta aaacgtttta cggtgccttt tgttctgcaa ttgaagttat 13020
caggaaaaat aatccagctt caaaaatact tgtaatgaca gctactaggc aatgccctat 13080
gagtggtaca acgatacgcc gtaaagatac ggacaaaaac aaactagggt taactttaga 13140
ggattatgtc aatgctcaga tattggcttg tagtgaattg gatgtaccag tatatgatgc 13200
ttatcacaca gattatttca aaccatataa tccagcattt agaaaatcta gcatgcctga 13260
tggattacat cctaatgaaa gaggtcatga agttattatg tatgagctta ttaaaaatta 13320
ttatcagttt tatggatagt aaaggaggaa aacatgagta ataaactaat tacagattta 13380
agtagagtct ttgactacag atatgtagat gaaaatgagt ataactttaa acttatttca 13440
gacatgctga cggattttaa tttctctctt gaataccaca gaaataaaga ggtattcgca 13500
catgatggag aacaaataaa gtatgaacat ttaaatgtta caagtaacgt ctctgacttt 13560
ttaacatatt taaacggtcg atttagcaac atggtactag gtcataacgg cgacggtatc 13620
aacgaagtaa aagacgcgcg cgttgataat acaggttatg gtcataagac attgcaagat 13680
cgtttgtatc atgattattc aacactagat gttttcacta aaaaggttga gaaagctgta 13740
gatgaacact ataaagaata tcgagcgaca gaataccgat tcgaaccaaa agagcaagaa 13800
ccggaattta tcactgattt atcgccatat acaaatgcag taatgcaatc attttgggta 13860
gaccctagaa cgaaaattat ttatatgacg caagctcgtc caggtaatca ttacatgtta 13920
tctagattga agcccaacgg acaatttatt gatagattgc ttgttaaaaa cggcggtcac 13980
ggtacacaca atgcgtatag atacattgat ggagaattat ggatttattc agctgtatta 14040
gacagtaaca aaaacaacaa gtttgtacgt ttccaatata gaactggaga aataacttat 14100
ggtaatgaaa tgcaagatgt catgccgaat atatttaacg acagatatac gtcagcgatt 14160
tataatccgg tagaaaattt aatgattttt agacgtgaat ataaacccac tgaaagacaa 14220
cttaagaatt cgttgaactt tgttgaggtt agaagtgctg acgatattga taaaggtata 14280
gacaaagtat tgtatcaaat ggatatacct atggaataca cttcagatac acaacctatg 14340
caaggtatca cttatgatgc aggtatctta tattggtata caggtgattc gaatacagcc 14400
aaccctaact acttacaagg cttcgatatc aaaacgaaag aattgttatt taaacgtcgt 14460
atcgatatag gcggtgtgaa taacaacttt aaaggagatt tccaagaggc tgagggtcta 14520
gatatgtatt acgatctaga aacaggacgt aaagcacttc taatcggggt aactattgga 14580
cctggtaaca acagacatca ttcaatttat tctatcggtc aaagaggtgt aaaccaattc 14640
ttgaaaaaca tcgcacctca agtatcaatg actgattcag gcggacgtgt taaaccgtta 14700
ccaatacaga acccagcata tctaagtgat attacggaag ttggtcatta ctatatctat 14760
acgcaagaca cacaaaatgc attagatttc ccgttaccga aagcgtttag agatgcaggg 14820
tggttcttgg atgtactgcc tggacactat aatggtgctc taagacaagt acttaccaga 14880
aacagcacag gtagaaatat gcttaaattc gaacgtgtca ttgacatttt caataagaaa 14940
aacaacggag catggaattt ctgcccgcaa aacgccggtt attgggaaca tatccctaag 15000
agtattacaa aattatcaga tttaaaaatc gttggtttag atttctatat cactactgaa 15060
gaatcaaacc gatttactga ttttcctaaa gactttaaag gtattgcagg ttggatatta 15120
gaagtaaaat cgaatacacc aggtaataca acacaagtat taagacgtaa taacttcccg 15180
tctgcacatc aatttttagt tagaaacttt ggtactggtg gcgttggtaa atggagttta 15240
ttcgaaggaa aggtggttga ataatggtag tagataattt ttcgaaagat gataacttaa 15300
tcgagttaca aacaacatca caatataatc cggttattga cacaaacatc agtttctatg 15360
aatcagatag aggaactggt gttttaaatt ttgcagtaac taagaataac agacccttat 15420
ctataagttc tgaacatgtt aaaacatcta tcgtgttaaa aaccgatgat tataacgtag 15480
atagaggcgc ttatatttca gacgaattaa cgatagtaga cgcaattaat gggcgtttgc 15540
agtatgtgat accgaatgaa tttttaaaac attcaggcaa ggtgcatgct caggcattct 15600
ttacacaaaa cgggagtaat aatgttgttg ttgaacgtca atttagcttc aatattgaaa 15660
atgatttagt tagtgggttt gatggtataa caaagcttgt ttatatcaaa tctattcaag 15720
atactatcga agctgtcggt aaagacttta accaattaaa gcaaaatatg gctgatacac 15780
aaacgttaat agcaaaagtg aatgatagtg cgacaaaagg cattcaacaa atcgaaatca 15840
agcaaaacga agctatacaa gctattactg cgacgcaaac tagtgcaaca caagctgtta 15900
cagctgaatt cgataaaata gttgaaaaag agcaagcgat ttttgaacgt gttaacgaag 15960
ttgaacaaca aatcaatggc gctgaccttg ttaaaggtaa ttcaacaaca aattggcaaa 16020
agtctaaact tacagatgat tacggtaaag caattgaatc gtatgagcag tccatagata 16080
gcgttttaag cgcagttaac acatctagga ttattcatat tactaatgca acagatgcgc 16140
cagaaaagac ggatataggc acgttagaga agcctggaca agatggtgtt gatgacggtt 16200
cttcgttcga tgaatcaact tatacatcaa gcaaatctgg tgtgttagtt gtttatgttg 16260
ttgataataa tactgctcgt gcaacatggt atccagatga ttcaaacgac gaatatacaa 16320
aatataaaat tagtggcaca tggtacccgt tttataaaaa aaatgacggc gatttaacta 16380
agcaattcgt cgaagaaaca tcaaacaacg ctttaaatca agccaagcag tatgtagata 16440
ataaattcgg aacaacgagt tggcaacaac ataagttaac tgagcctaac ggccaatcaa 16500
tacaagttaa cttgaataat gcacaaggcg atttgggtta tctaactgca ggtaattact 16560
atgcaacaag agtgccggat ttaccaggta gcgttgaaag ttatgagggt tatttatcgg 16620
tattcgttaa agatgataca aacaagctat ttaacttcac gccttataac tctaaaaaga 16680
tttacacacg atcaatcaca aacggcagac ttgagcaaca gtggacagtt cctaatgaac 16740
ataaatcaac ggtattgttc gacggtggcg caaatggtgt aggtacaaca atcaatctaa 16800
ctgaaccgta cacaaactat tctattttgt tggtaagtgg aacttatcca ggtggcgtta 16860
ttgagggatt cggactaacc gcattaccta atgcaattca attaagcaaa gcgaatgtag 16920
ttgactcaga cggtaacggt ggcggtattt atgagtgttt actatcaaaa acaagtagta 16980
ccactttaag aatagacaac gatgtgtatt tcgatttagg caaaacatca ggttctggaa 17040
cgaatgccaa caaagttact ataactaaaa ttatggggtg gaaataatga aaataacagt 17100
aaacgataaa aacgaagtta tcggatacgt taatactggc ggtttacgca atagtttaga 17160
tgtagatgat aacaatgtgc ctatcaaatt caaagaagag tttgaaccta gaaagtttgt 17220
tttcacaaac ggcgaaatta aatataacag caattttgaa aaagaagacg taccgaatgc 17280
atcaagccaa caaagtgaat cagatttgag tgatgaagaa cttcgcggaa tggttgcgag 17340
tatgcaaatg caggtggcac aagtaaacgt attaacaatg gaattagctc aacaaaacgc 17400
tatgttaaca caacagttga ctgaactgaa aactaacaaa acaagtactg agggggacgt 17460
ttaatgatga agatgattta tccgactttt aaagacatca aaacttttta tgtttggggt 17520
tactataaaa acgagcaaat taagtggtac gtagacaagg gtttaatcga taaagaagaa 17580
tacgctttaa tcactggaga aaaatatcca gaaacaaaag atgaaaagtc acaggtgtaa 17640
tgcttgtggc tttttaattt aacaaaaagt aggtggcgta atgtttggtt ttaccaaacg 17700
acatgaacaa gattggcgtt taacgcgatt agaagaaaat gataagacta tgtttgaaaa 17760
attcgacaga atagaagata gtcttagagc gcaagaaaag atttatgaca aattagatag 17820
aaattttgaa gaattaaagc gcgacaaggt agaagatgaa aagaataaag aaaagaatgc 17880
caagaatatt agagacataa aaatgtggat tctcggtttg atagggacta tcttcagtac 17940
gattgtcata gctttactaa gaactatttt tggcatttaa aggaggtgat taccatgctt 18000
aaagggattt taggatatag cttctgggcg tgcttctggt ttggtaaatg taaataacag 18060
ttaagagtca gtgcttcggc actggctttt tattttgatt gaaatgaggt gcatacatgg 18120
gattacctaa tccaaagact cgaaaaccta cagctagtga agtagtagag tgggcgttgt 18180
atattgctaa aaagaaaata gctattgatg tacccggttc tggaatgggg gcgcaatgtt 18240
gggacttgcc taattacttg cttgataaat attgggggtt tagaacatgg ggaaatgctg 18300
atgctatggc tcagaaatct aattatagag gtagagattt caagataatt agaaatacaa 18360
aagattttgt accacaacca ggcgactggg gtgtttggac tggtggttgg gcaggacatg 18420
taaacattgt agtgggacca tgcacaaaag actattggta tggcgtagat caaaactggt 18480
atacaaataa cgcaacagga agtccgccat ataaaattaa gcactcttat catgatggac 18540
caggtggagg agttaaatat tttgttagac caccatatca tccggagaaa tctacgccgg 18600
cacctaaacc cgaagatgat agtgatgata acgaaaaaaa taataaaaaa gttccaattt 18660
ggaaagatgt aacaactata aagtacacaa tttctagcca agaagttaat tatccagaat 18720
atatttatca ctttatagta gagggtaatc gacgactcga aaaacctaaa gggataatga 18780
ttagaaacgc tcaaacaatg agctcggtag aaagtttata taacagtaga aagaaatata 18840
agcaagatgt agaatatcca cacttttatg ttgatagaca taatatttgg gctcctagaa 18900
gagccgtatt tgaagttcct aatgaagctg attatatagt tatagacgta tgtgaagatt 18960
atagtgcgag taaaaacgaa tttattttta acgagattca cgcaatggtt gtagctgtag 19020
atatgatgat caaatatgag atacctctaa gtattgagaa tttaaaagta gacgatagta 19080
tttggcgttc aatgttggaa catgttaatt ggaatatgat tgacaacggt gttcccccta 19140
aagataaata cgaagcatta gaaaaggcat tacttaatat atttaaaaac agagaaaaat 19200
tattaaattc tataactaaa ccaacagtaa caaaatctag aataaaagtt atggtagata 19260
ataaaaacgc tgatatagcg aatgtaagag actcatcacc aacagctaat aatggctcgg 19320
catctaaaca accgcagatc ataacagaaa cgagtcctta tacattcaaa caagcactgg 19380
ataaacaaat ggcaagaggt aacccgaaaa aatctaatgc ttggggttgg gctaacgcta 19440
cacgagcaca aacgagctcg gcaatgaatg ttaaacgaat atgggaaagt aacacacagt 19500
gctaccaaat gcttaattta ggcaagtatc aaggtgtttc agttagcgca cttaataaga 19560
tacttaaagg taagggaaca ttgaataatc aaggtaaagc gttcgcagaa gcttgtaaaa 19620
aacacaacat taatgaaatt tatttaatcg cgcatgcttt cttagaaagt ggatatggaa 19680
caagtaactt cgctaacgga aaagatggag tatacaacta cttcggcatt ggcgcttacg 19740
acaacaatcc taactacgca atgacgtttg caaggaataa aggttggaca tctccagcaa 19800
aagcaatcat gggcggtgct agcttcgtaa gaaaggatta catcaataaa ggtcaaaaca 19860
cattgtaccg aattagatgg aatcctaaga atccagctac ccaccaatac gctactgcta 19920
tagagtggtg ccaacatcaa gcaagtacaa tcgctaagtt atataaacaa atcggcttaa 19980
aaggtatcta cttcacaagg gataaatata aataaagagg tgtgtaaatg tacaaaataa 20040
aagatgttga aacgagaata aaaaatgatg gtgttgactt aggtgacatt ggctgtcgat 20100
tttacactga agatgaaaat acagcatcta taagaatagg tatcaatgac aaacaaggtc 20160
gtatcgatct aaaagcacat ggcttaacac ctagattaca tttgtttatg gaagatggct 20220
ctatattcaa aaatgagccc cttattatcg acgatgttgt aaaagggttc cttacctaca 20280
agatacctaa aaaggttatc aaacacgctg gttatgttcg ctgtaagctg tttttagaga 20340
aagaagaaga aaaaatacat gtcgcaaact tttctttcaa tatcgttgat agtggtattg 20400
aatctgctgt agcaaaagaa atcgatgtta aattggtaga tgatgctatt acgagaattt 20460
taaaagataa cgcgacagat ttattgagca aagactttaa agagaaaata gataaagatg 20520
tcatttctta catcgaaaag aatgaaagta gatttaaagg tgcgaaaggt gataaaggcg 20580
aaccgggaca acctggtgcg aaaggtgata caggtaaaaa gggagaacaa ggcacacccg 20640
gtaaaaacgg tactgtagta tcaatcaatc ctgacactaa aatgtggcaa attgatggta 20700
aagatacaga tatcaaagca gaacctgagt tattggacaa aatcaatatc gcaaatgttg 20760
aagggttaga aaataaattg caagaagttg aaaaaatcaa agatacaact ctcaacgact 20820
ctaaaacgta tacggattca aaaattgctg aactagttga tagcgcgcct gaatctatga 20880
atacattaag agaattagca gaagcaatac aaaataactc tatttcagaa agtgtattgc 20940
aacagattgg ctcaaaagtt agtacagaag attttgagag attcaagcaa tcattaaaca 21000
gtttgtatgc agataaaaat catagtcata caatcaaaca gattgaagga ttagaaaatg 21060
ctttatcaaa aaaatcagac ataaatcaca gtcatgatga acgttatctt ttatcatcaa 21120
atgcttttac aaaagaggaa gcagataaac tttatcaacc tatcggttct tcgcagccgt 21180
cactgaatat ttggacaggc agtgaaacag aatataatta tttgtatcaa aaagacccta 21240
atacacttta cttaattaag gggtgatttt atggaaggta attttaaaaa tgtaaagaag 21300
cttatttacg aaggcgaaga atatacaaaa gtatatgctg gaaatatcca agtatggaaa 21360
aagccttcat cttttgtaat aaaaccctta cctaaaaata aatatccgga tagcatagaa 21420
gaatcaacag caaaatggac aataaacgga gttgaaccta ataaaagtta tcaggtgaca 21480
atagaaaatg tacgtagcgg tataatgagg gtttcgcaaa ctaatttagg ttcaagtgat 21540
ttaggaatat caggagtcaa tagcggagtt gcaagtaaaa atatcaactt tagtaatcct 21600
tcagggatgt tgtatgtaac tataagtgat gtttattcag gatctccaac attgaccatt 21660
gaataatttt aaacgactaa ttttttagtc gttttttatt ttggataaaa ggagataaga 21720
atatgattaa ttggaaaatt agaatgaaac aaaaatcatt ttgggtagcg atattgtcag 21780
ctatcttttt atttgctcaa aacatcgcaa aagctattgg gtatgatatc caagtttata 21840
cagagcaatt aacagacggt ttaaacgcta tattaggatt tttagtatta actggtgtga 21900
ttcaagaccc gactactaaa ggtataggtg atagccacca agctttagaa tatgaagaac 21960
caagaagaaa atactaggag gtaaaataat gaaaacatac agtgaagcaa gagcaaggtt 22020
acgttggtat caaggtagat atattgattt tgacggttgg tatggttacc aatgtgcaga 22080
tttagcagtt gattacattt attggttgtt agaaattaga atgtggggaa atgcaaaaga 22140
tgcaatcaat aacgatttta aaaacatggc aacagtatat gaaaacacac catcgtttgt 22200
tccacaaata ggtgatgtgg ctgtatttac caaaggaata tataaacaat acggtcatat 22260
tggtttagtg tttaatggtg gtaatacaaa ccaattttta attttggaac agaactatga 22320
cggtaacgca aatacgcctg caaagttacg ttgggataat tattacggct gtactcactt 22380
tattagacct aagtataaaa gtgagggctt aatgaataag atcacaaata aagttaaacc 22440
acctgctcaa aaagcagtcg gtaaatctgc aagtaaaata acagttggaa gtaaagcgcc 22500
ttataacctt aaatggtcaa aaggtgctta ttttaatgcg aaaatcgacg gcttaggtgc 22560
tacttcagcc actagatacg gtgataatcg tactaactat agattcgatg ttggacaggc 22620
tgtatacgcg cctggaacat taatatatgt gtttgaaatt atagatggtt ggtgtcgcat 22680
ttattggaac aatcataatg agtggatatg gcatgagaga ttgattgtga aagaagtgtt 22740
ttaatataat gtttgcttaa atgttgtatt gtgatataat aacattattc tttagataac 22800
attactctca agatttaaat gtgcataaca ggcaggtact tcggtacttg cctatttttt 22860
ttatgttata attacatgcg tatatagtag gagtgaacta tatagcccgg cagaggtcat 22920
atatctggct gttggtctca caggagacat cttccttgtc atcactcgat acatatatct 22980
tgataacata gagttgttac agtcgctaca ccacccatac tagttgctgg gtggttgttt 23040
tttattttaa tgattgacat attaatagtg gttggattac tatttaaata taaacgacaa 23100
cgcccccacc cctttttagg cagacaagtt ctgacgtggg ggtatttttt gtgttcgttt 23160
atatgttcgg tctacctctt tttgtgtaag ttgtgtatta tatatgtaat tgtgctaatt 23220
aatcggagga tagatatggt gaaaatatta acagagatta cgagtagagt cggtaatggt 23280
gtaacaacac cgtattatgc aatgatagac tctttggctg tagtagttaa atcgattaac 23340
aataacgaag ggttttatgc tttattcaat gaagcagtag gttattgtat tgcagagagg 23400
ttagactttt cacatcctga ttttggattt gcacagtata aatctgattt aacgataaat 23460
cgcataccaa atgattcgag tttcaatgac aaggaaatat ttacatatac tgttttagaa 23520
aattcagtta tacacataga aggaccaggt atgattaata caattgataa taaagatatt 23580
attgaattga taatatttga ttcattcata tctaatacag acagaaataa aggtaacata 23640
ttaattaaaa tgcctaaaaa aggacaaaaa gccaagttat tccctttgga ttatacacat 23700
atttttccag gtgaatgcat ttggtttgat gttttaaaaa gagggaaccc atcgatagaa 23760
aaaatggtag aagatgtttt tcaaactgga aactatcaat tgttattaga aaataaaagt 23820
tttgacccta tagagatacg aaaaatcagc tatgaaatta agaaaaaatt agtgaatatt 23880
gacatggatg atataatcag ttctatgcct aatgaaatta gtcttggtca ttcaaaacaa 23940
gatatttact tgttgaaaaa gtttatcgaa agaaatatta gtgaatttga tgatataata 24000
gaagaaataa cgaaacattt agtgaggtga tgaaaagtgt ataaagtaaa gtattcaagt 24060
tttaactact atccagatat tctattgatt tctaatattg ctgtaggtgt tatttttcaa 24120
atagaaggta ataatggtta ttatgcaaat gaattcaatc taatgcaaag aaaaaacaaa 24180
ctttttagtt ttgacgaaga gcttgacaaa gattttacaa aaatgttttt aaaatcgata 24240
agggaaaact ttcttaattt taaaggtgaa ataaaagaat tcactagatt ctatgtaaat 24300
aattttaaat ttactaatat acaaattaga aactttgata gtctagatga agctaaagca 24360
tttatagaag atactacgaa atacattttg catcctactc aagaagctgg aaataaaatg 24420
actgaagcag aaaagaggga atatataaat aactatttac ttaagacttt tagcactgtg 24480
caaaaatctt atgtattcaa aggtgccaaa aaacgagata aaataactgt tgattttatg 24540
gttgaagacc atacaggaaa aaaaataggt tataaagtta taaataattc tcctcaagcg 24600
ctatttaaca ttagatctta tgtagctcat gcatggttta ataaagaaaa tctcacattt 24660
attatggatg atgatatgga aagcgagcaa agatacgtga atagtttaac tagagaattc 24720
aacaatgaag cagagataaa cgctatatta aaaaaagatt tagttacaca ataaaacgtt 24780
tgtaaattga tacgagtata aaaaataaac cacaccacct attaatttag gagtgtggtt 24840
attttaatat gcgaagctaa aataactaca aatgatacca tttttgatac caaaaaataa 24900
taacctcaaa atttcgagag aaaaaacttc attttaaatc gcattaaatc aacgtttcta 24960
taaaaataag accttaaaaa ttagtttttt caatcgaaat ggaaggtagt attggatagc 25020
tttaaaccgc gttgttaagc cattcttaac ttccggaaat ggctattgat accattttga 25080
taccatttac ttgtcaaaaa tggctattgc atcgtgtttt ttctgagtat ataaatggct 25140
gtaagtgccc atcgtttcag tgatttgagc atgtctcatg agtgactgta aaacgaaaat 25200
atctacacca ttatttgcaa gataagatgc ataagaatgt cttaacgcgt gaatgttata 25260
atgggggaaa gctttttgga atttcttttg aacatgacta taatgtttgg gagccattcc 25320
tccgaaaata aaataactac gttcatcaaa atatttgttt aactcttttt cacgttggtg 25380
tcgttcagtt aacattgtat tgatgaattt aggtaaagga acaatatcct ctgaactatc 25440
tgtttttggt cttggatata tagttctatt agagatgtcc attgttttat ttatggatat 25500
ctcttttttg tatttattgt agtctgtcca aacaagcgcc atagcttcgc caatcctcaa 25560
acctgtataa aacattaatg taaataactc tctgtaatct tgctcttcaa tatctttgat 25620
tctttcttca aattcttcac gcatcataaa cttaggtttt ggctttacac gcggaatagg 25680
tttaattgat attgttggat ctgtacgtaa tccaaagtat tttttagcat aattaattac 25740
aactttaaaa cctgaccaaa ttgtacgagc agaatttgtt gacgctacat tctctattag 25800
atatttacga aactcttggc attgattttg tgttatctta ttcattttta tgtgcccaaa 25860
cttagcttta aagtgtttat gatattcatt ttgcttgcgt cgttttgttt taggtctcaa 25920
atcgctattt tctaaatagt gatgaaaaac ataatcaaaa gtttttgaat cgctatatcc 25980
ttcgtttacg tcattcaaaa aaatagcctc tgctctctta gcttcacgct tagttgaaaa 26040
accgcgttgc atcttacgtt tgttattacc gtatacatct ttatatctaa tagaaaaata 26100
ccatttacct gtattatcat ccttatatac tggcattttg cttctccctc ctcaaaattg 26160
gcaaaaaaat aataagggta ggcgggctac ccgaaatttt attgttgaat cacttcgcta 26220
ttttgacgtt tgaaattgtc gaaatcattt tgtgctttct tccatgaatt atagtcttgt 26280
ccgtcttgta ctgcccatga accacctata ccggcagtat ggccaccatt ctgacgtttg 26340
ttttcttctg ttgctctttt agcttcttga taagcgttat aagatgtgtc acttgaaaac 26400
tcatctttca ctggtgcatt gttgttttta ttagaagtgg gattattttg tgtttgattt 26460
tgtttaggtg cgttattagt ttgttgatga tcattaacat ttgtgttgtt atcgttgttt 26520
acttgattat tgttatcgtt ttgattagca ttttcttttt tcacttctgc tttgtcttta 26580
gtttctttct ttttgtcttt gttctctttc tttgtttccg ctttcttgct ttcctctttc 26640
ttatcgccgt cgttgctacc acatgcacct aatactaacg cgctagctaa aattaaatat 26700
aataatcttt tcatgtttta cactccttta tttgctattt gttttaataa atctatgact 26760
tcgttgtttt gctcgataat tctattattt tgctttatta gttcgtctcg ttgagctata 26820
gagacaaagt tttgttttaa ttgcgtatcg tagaatacga atttagcttg tttatctacg 26880
tttgttgtga atgtacctaa accgttgtag actttcaata gtgtagggtt aatattttgc 26940
ttttgatatg cgtaagtcgt aacgtcggta gcttctttaa taccttgtcc gtttaaactt 27000
ttagctgatt ttgattcgta ttcttcgtta gtgtttttaa aattttcaga tttataaagt 27060
tggatatcaa gttcttttcc ttctttaaaa tcatttaata tctttctttt ttcatctgtt 27120
gtcatttttt tatacatgtc aatctttcta ttgcttaact tactaaacat ttttgtttct 27180
gttagaattt ctttaaaagt taatttatct cctgccattt tcaatttctc cttcatttgg 27240
tttatattaa agcgccacat agacgctatt aatcaaaaat tcgatagtta taaataactt 27300
tgcctatcac ttcgatttca tcaatagaat ctaaatcgta agaattagtt ttaaattcat 27360
ctgaatagct tactgggtct aaatgtagtt ttgtttcagt acgtctcaca cgtttaactg 27420
tatattcacc acctagacgc aatacaagga tgtcgttgct gttaagttta tgatcacaag 27480
actttctata atcatggaca attatataag aaccgttagc gagtatttta ttcatgctat 27540
ctccgtttat ttttagtgct atacattcgc taggtttacg accgttaaaa gcaaatggtg 27600
gaacttttaa tttttcattt tcaattgcaa cttcttcgaa atttccagca gaaactttac 27660
cgaaatatgg aacctcgatt tcgctatcaa attcgggtaa aacaatttct tcaatttctc 27720
ctaagagata acctttagaa acattgaaca aacttgaaat tttttcgacc atacccattc 27780
taggttcagt tcttccgctt tcccacattc ttatagtacc ttcggaaaca tctaattttc 27840
tagccatctc aactttagac aatctattgt tcaatctgat ttcttttatg gaatttttga 27900
aagccatttt gttttccttc cttatatata atgtttttta cacttttatt atactatgaa 27960
aaatcgtaat tgcaaccctt aaaatacgat ttacgaaaat aaaaatacgt aaaattctaa 28020
aataattacg aaaaacactt gaaatcgtat ttaaattacg atatacttta gtcagaactt 28080
aacaaggagg ttaaaaaatg aactacatca aacaaagtct gaaattagat gaatggcgaa 28140
aacgaaaagg ttatacccag tcgtcttttg ctgaaaaact tggcatttca ccatctactt 28200
ataacatttg ggaaaataac ccagaaatga ttaaacctag agatgctttt agaattgcca 28260
aaacattaaa tatctctatt gatgagatta tttttttaaa agatgaatcg tattttaaat 28320
acgttttagt cgaagggaaa caaatgtctt aaaaagagga atgaacgatg caagcattac 28380
aaacatttaa ttttaaagag ctaccagtaa gaacagtgga aattgaaaac gaaccttatt 28440
ttgtaggaaa agatattgct gagattttag ggtatgcaag gacagacaat gccatcagaa 28500
atcatgttga tagcgaggac aagctgacgc accaatttag tgcatcaggt caaaacagaa 28560
atatgatcat tatcaacgaa tcaggattat acagtttaat cttcgatgct tctaaacaaa 28620
gtaaaaacga aaacattaga gaaaccgctc ggaaattcaa acgatgggta acatcagatg 28680
tcctaccagc tattcgaaaa cacggtatat acgcaacaga caatgtaatt gaacaaacat 28740
taaaagatcc agactacatc attacagtgt tgactgagta taagaaagaa aaagagcaaa 28800
acttactttt acaacaagaa atcggagaac taaaacccaa agcagactat gtagatgaaa 28860
tcttaaagtc aactggcaca ttagccacaa ctcaaatcgc ggcagactac ggtatatcag 28920
cacaaaagtt aaacaaacta ctacacgaag ctagactaca acgaaaagta aataaacagt 28980
gggtgcttta ctcagaacac atgggcaaga gttacacaga ttcagacact ataacaattg 29040
tgcgttctga tggcagagaa gacacagttt tacaaactag atggacacaa aaaggcagat 29100
tgaaaataca tgaaatcatg actgaattcg gttatgaagc taatttaggg ggagcgtaaa 29160
tgacaccaga acaaaaagaa aagctaaaca atatagtatt aacactttat gcagttaaag 29220
aaaacaaaag tcaaacatac acacacaaag atactcttac tgtgacatat gcaggcgaga 29280
ttgagcacac ttacgaagtc gacagagaga aacaccttga atcaatgatt gagtgggcaa 29340
ttgaccaaat cgaacagcac tttgatttag acgaagaaga ataacacaca attgaacaaa 29400
caacttaata ggaggaatta caaatgaacg cactatacaa aacaaccctc ctcaccacaa 29460
tggcagttgt gacgtggaag gtttggaaga ttgaacgaaa tacgagaaag cctgtaatca 29520
atcggaatga ttttagtaaa gagtctacag cagaaacgat tgagcgacac agtgatcctg 29580
attcaggaat aaaactactt aaggcatttt ccgacttcac taaacaagct gaaaagcaaa 29640
aacctacact aggagaagtt tatagacgga acaaacctga attaccaacc gttactttag 29700
acgaaaacgg actgtttata aatgatttta gggtgcctta tgtacttgag gaaggggtta 29760
acgtaaagaa atctatgaac aacctatata aggtcagttt ggactttttc gctaaaagta 29820
ttattgcaga taattacgaa gcagataacc cagagaatca acagttattt taaaggagga 29880
aaagatatga tgaaaaatag tttgcaagct aaagaacttg cggtaatttt atctgtttca 29940
aaatccaaag caggacaaat aataagagaa ctgaataaag agcttgaaga cgaagggtac 30000
attgcgatac gaggcagaat accagtccaa ttagctagga aaaaattccc ttatcacgac 30060
ttatcagacg agagaataat ggaggagttg aaaaaagaaa atgagtaaca tttataaaag 30120
ctatctatta gcagtattat gcttcacagt cttagcaatt gtactcatgc cgtttctata 30180
cttcactaca gcgtggtcaa ttgcaggatt cgcaagtata gggacattca tattttataa 30240
agaatacttt tatggggtgg atgattaaat gacttggttt gaagaatacg ttaaacctag 30300
tgtggaatgg gaaagaaagg cagaacaagc tgttttaagt gatgatgaag ttaaaacgat 30360
cactgaatat agaaagaagt acaacaaccc gcatatttac atgtcggctc agaacagaaa 30420
ttatcttgtt gaatatttag atagacatac tggagacata gtattacaca atttaaaact 30480
taagaaatca tccagaagaa gagtgcatca atatttaatg gtcggccaaa tagtagtgcc 30540
gggcgaacca aaaggcacaa tttatgaagc atctctgata ataagataaa aaaactgcta 30600
cttgcgccaa caagtaacag agacaaacga ttagcaaaat taattcacgt tcaatataaa 30660
acgaaaaacg gaggaagtca agatgtatta cgaaataggc gatgtatgtc agaaggtaat 30720
taatgtagac ggatttgatt ttaaattagc agttaagaag aaggaccaca gcattctggt 30780
gaatatctta gatttagaag ataagtttat cgacggcata aacataacta atgagaacga 30840
tctatacaca gcattagaca tattaaatca atctatttac gaatggattg aagaaaacgc 30900
agatgattat gacagactaa ttaacttagt catgaaatgg taggaggttg ctatgaagca 30960
gactgtaact tatatcattc gtcataggga tatgccaatt tatataacta acaaaccaac 31020
tgataacaat tcagatatta gttactccac aaatagaaat agagctaggg agtttaacgg 31080
tatggaagaa gcgagtatca atatggatta tcacaaagca atcaagaaaa cagtgacaga 31140
aacaattgag tacgaggagg tagaacatga ctgaacaaac taatcaagat gtcgatattt 31200
taacgcaact agatgtaaaa gacatcagca aacaaaatgc aaacaagttt tataaatttg 31260
cgatatacgg caagttcggg actggtaaaa ctacgttttt aacaaaagat aacaatgcct 31320
tagtactaga tataaatgag gacggaacaa cggtaacaga agatggggca gttgtgcaga 31380
ttaagaatta taagcatttt agtgcagtgg ttaaaatgtt gcctaaaatt attgaacaac 31440
taagagaaaa cggaaaacaa attgatgttt tagtgattga aacaatccaa aagttacgtg 31500
atatcactat ggacgacatc atggatggta aatcaaagaa accgacattt aatgattggg 31560
gcgagtgtgc tacacgcatt gtaagtattt atcgttatat ttctaaatta caagaacatt 31620
atcaatttca tcttgctata agcggacacg agggcattaa caaagacaaa gatgatgagg 31680
gaagtactat caatccaaca atcacgatag aggcacaaga ccaaataaaa aaagcagtca 31740
tcagtcaatc tgacgtgtta gcaagaatga caatagaaga acatgagcaa gacggcgaaa 31800
aaacttatca atatgtactt aacgctgaac catcaaattt attcgagaca aagataagac 31860
actcaagcaa catcaaaatt aacaacaaac gtttcattaa tccaagtatt aacgatgttg 31920
tacaagcaat tagaaatggt aattaaaaat taattaaaag gacggtataa aaattatgaa 31980
aatcactggt agaacacaat acattcaaga aactaatcaa gaggcattca tgaaaggtgg 32040
ggacttttta ggagctggag aatttacagt aaaagttgca aatgtcgagt ttaacgacag 32100
agaaaacaga tacttcacga ttgtttttga aaacaacgaa ggtaaacaat acaaacacaa 32160
ccaattcgtc ccaccattcc aacaagatta tcaagaaaaa caatatatcg agttacttag 32220
tagattagga attaaattga acttaccaga tttaactttt gacacagatc aattaattaa 32280
caaaatcgga actattgtac ttaaaaataa atttaacgag gaacaaggca agtattttgt 32340
aagactctca tatgtaaaag tttggaataa agacgatgaa gtagttaata aaccagaacc 32400
taaaactgat gagatgaaac aaaaagaaca gcaagcaaat gggaaacaga cgccaatgag 32460
tcaacaatca aacccattcg ctaatgctaa tggtccaata gaaatcaatg atgatgattt 32520
accgttctag gacgtggttt aaatgcaata cattacaaga taccagaaag acaatgacgg 32580
cacttattcc gtcgttgcta ctggtgttga acttgaacaa agtcacattg atttactaga 32640
aaacggatac tcgctaaaag cagaagtaga ggttccggac aataaaaagt tgtctatcga 32700
acaacgcaaa aaaatattcg caatgtgtag agatatagaa cttcactggg gagaaccggt 32760
ggaatcaact agaaaattat tacaaacaga attggaaatt atgaaaggtt atgaagaaat 32820
cagtctgcgc gactgttcta tgaaagttgc aagggagtta atagaactga ttatagcgtt 32880
tatgtttcat catcaaatac ctatgagtgt agaaacgagt aagttgttaa gcgaagataa 32940
agcgttatta tattgggcta caatcaaccg caactgtgta atttgtggaa agcctcatgc 33000
tgacctagca cattatgaag cagtcggtag aggcatgaac agaaacaaga tgaatcacta 33060
tgacaaacat gtattagcgt tatgtcgcga acatcacaac gagcaacatg cgattggcgt 33120
taagtcgttt gatgataaat atcacttgca tgactcatgg ctaaaagttg atgagaggct 33180
caataaaatg ctgaaaggag agaaagagaa atgaacaaaa tattaatacg ctttgctatt 33240
aactatataa aatatcaaca aaaacaattg cgtgaaaaag aagcccgaat taaatatcta 33300
gagggcttct taaaaggaaa gggttattga ctgtttttgt tttgcaattc catcaatctt 33360
tcaaattgat ccggatactg aacggcaagt tccatcattc ttaccataga atcagcggga 33420
atatcagggt cttgtttggt cactgaaggt agaaactctt ttaattcgga taaatcgctt 33480
tttatatcta acaaatgtct atttaaaaca ccgtattcat tatcgatatt attatactta 33540
ttgactggat tttcaaaatt gaaatcatta tctgtaaatg ttttgatagt ttctttaagt 33600
tggtctttgg catttactac atccgcgtat aattcgctgt agtaaattgt acggtaagcg 33660
ctaacatcaa aagggatatt ctcatctttg ttaatcatag taattgttgg tctctctaga 33720
gcgtgtctgt aacctaattc ataaaatacg ttcgggttat gcgtactcaa atctacaata 33780
actaattcag aattcgttaa tccaccaatt atttcatcag tgattttatt ggtcgatgat 33840
ataaggtcag atcgttggat ttcaaaatct gattctaaag caggttttat gatggattgt 33900
aaaagaaaat cagagtttct tcttacttta gaatcatcag tacctatagg gcaagcaatg 33960
aaacattttt tcaagttatt cactcctaat catattttta ttaattataa cagaaaggag 34020
ataaaaaaat ggcaacattt agaacgataa aagaaagtgg cgattttgta actgtgcata 34080
aatcttttgt gttcgatagt aatttaagtg ctaaagctaa agggatatta ttgtatttcc 34140
tgagtcgtcc tgacaattgg caaatataca cgtcagaagt agttaaacat atgaatgatg 34200
gacaaaaatc aatcaatagt ggcgttcaag aacttatgga taataaatat gttcacagaa 34260
tacaaaaaag agctgaaaac ggtgtgttta aaggttttga atacttagtt tacgaaaaac 34320
caaccgaaat gccattttcg gaaaacggat tatcggcaaa cgggttttcg gaaaacggaa 34380
aaacggaaaa ccgaaaaggg cgtactacta ataataatag tactaataat gatttaacta 34440
ataataacaa tactaataat gaaggaagta tattgtcggg caacccgacg gtgtcttcca 34500
ttccctataa agaaattatc gaatacttaa ataaaaaagc aggaaagcat tttaaacata 34560
atacagctaa aacaaaagat tttattaaag caagatggaa tcaagatttt aggttggagg 34620
attttaaaaa ggtgattgat atcaaaacag ctgaatggtt aaacacggat agcgataaat 34680
accttagacc agaaacactt tttggcaata aatttgaggg gtacctcaat caaaaaatac 34740
aaccaactgg cacggatcaa ttagaacgta tgaagtacga cgaaagttat tgggactagg 34800
aggaagttat gaaaccatta tttgacgaaa aaataaacaa aagtttaaaa aaatatcaac 34860
caatcgaagt aatactaaga cagaattgcg ataaatgcgg gcatcaatat gacttatata 34920
agtttgaaaa tggatatgaa tacaaagacg gttgcgaatg tgaaattcaa agattggctt 34980
atgaagaata caaaaggaat aaacaaaaga aacttgatta tattttcaat caatcaaatg 35040
ttaatccgtc tctaagagat gcaacagtta acaactataa gccacaaaat gaaaaacaag 35100
tacaagctaa acaaacagca atagagtacg ttcaaggctt ctctacaaaa gagccaaaat 35160
cattaatatt gcaaggttca tacggaactg gtaaaagcca cctagcatac gctatcgcaa 35220
aagcagttaa agctaaaggg catacggttg cttttatgca cataccaatg ttgatggatc 35280
gtatcaaagc gacatacaac aaaaatgcag tagagactac agacgagcta gtcagattgc 35340
taagtgatat tgatttactt gtactagatg atatgggtgt agagaacaca gaacatactt 35400
taaacaaact tttcagcatt gttgataaca gagtaggtaa aaacaacatc tttacaacta 35460
actttagtga taaagaacta aatcaaaata tgaactggca acgtatcaat tcaagaatga 35520
aacacaatgc aagaaaagta agagtaatcg gagacgattt cagggagcga gacgcatggt 35580
aaccaaagaa tttttgaaaa ttaaacttga gtgttcagat atgtacgctc agaaactcat 35640
agacgaggca cagggcgacg aaaataagtt atatgaccta tttatccaaa aacttgcaga 35700
acgtcacaca cgccctgcta tcgtcgaata ttaaggagtg ttaaaaaatg ccgaaagaaa 35760
aatattactt ataccgagaa gatggcacag aagatattaa ggtcatcaag tataaagaca 35820
acgtaaatga agtttattcg ctctcaggag cccatttcag cgacgaaaag aaaattatga 35880
ctgatagtga cctaaaacgc ttcaaaggtg ctcacgggct tctatatgag caagagctag 35940
gattacaagc aacgatattt gatatttaga ggtggcacag tgagtaaata caacgctaag 36000
aaagttgagt acaaaggaat tgtatttgat agcaaagtag agtgcgaata ttaccaatat 36060
ttagaaagta atatgaatgg cactaactat gatcgtatcg aaatacaacc gaaatttgaa 36120
ttacaaccta aattcgggaa acaaagaccg attacgtata tagccgattt ctctttgtgg 36180
aaggaaggga aactggttga agttatagac gttaaaggta aggcgactga agttgccaac 36240
atcaaagcga agatattcag atatcagtat agagatgtga atttaacgtg gatatgtaaa 36300
gcgcctaaat acacaggtca agaatggatg gtatatgagg acttagtgaa agtcagacgt 36360
aaaagaaaaa gagaaatgaa gtgatctaat gcaacaacaa gcatatataa acgcaacgat 36420
tgatataagg atacctacag aagttaaata tcagcatttt gatgatgtgg atgatgaaaa 36480
agaaacgctg gcagattact tatataagaa tccagacaaa ttactagagt atgacaattt 36540
aaaaattaga aatgtaaatg tagaggtgga ataaatggcg aaaacagcaa gaattgtaag 36600
gatacacgat aaaccttata ggttcagtaa atttgaaatg gaattaattg aaagtcacgg 36660
tataacaccc ggaatggttt ctaaaagagt aaaagacggt tgggaactac atgaagcaat 36720
ggacgcacca gaaggtacgc gtttaagcga gtacagagaa aagaaaacaa tagaaagact 36780
ggaacaagct agactcgaac gcaaattgga aagaaagcga aagaaagagg ctgagctaag 36840
aagaaagaag ccacatttgt ttaatgtacc acagaaacat ccaagaggac gttatgcgtg 36900
ctacctgatg gaaaacgaca tattcgtgaa agttaagaag tagatcatga cagataacgc 36960
acgcaaagaa tacctaaatc aattctttgg atctaagaga tatctgtatc aggataacga 37020
acgagtggca catattcatg tagtaaacgg cacttattac tttcatgggc atatcgtacc 37080
aggttggcaa ggcgtgaaaa agacatttga tacagcagaa gagctcgaaa catatataaa 37140
gcaacatggt ttggaatacg aggagcagaa gcaactaact ttattttaga ggagatggaa 37200
atgatgaata accgcgaaca aattgaacaa tcaattatca gtgctagtgc ctataacggt 37260
aatgacacag agggattact aaaagaggtt gaagacgtgt ataagaaagc gcaagcgttt 37320
gatgaaatac ttgatggaat gacaaatgct attcaacatt cagttaaaga aggtgttgaa 37380
cttgatgaag cagtagggat tatggcaggt caagttgtct ataaatatga ggaggaacag 37440
gaaaatgagt attagtgtag gagataaagt atataaccat gaaacaaacg aaagtctaga 37500
gattgtgcaa ttggtcggag atattagaga tacacattat aaactgtccg atgattcagt 37560
tattagcatt atagatttta ttactaaacc aatttatcta attaaggggg acgagtgagt 37620
ggaatggaaa cgattaaaaa atgtggtgcc gcacccagtt atcaaaaata aaaacttaaa 37680
gtcggtatac gtaacaaaag ataatgtgaa agaggttcaa aaagaattag gtttctttga 37740
aatttttaat gaagaagtgt tattaactgg atttttatca tttcaaagga tacctattta 37800
cattatttgg attaatccta aatctcataa gacgcctaga tattactttg ctaacgagca 37860
tgagattgaa agatattttg aatttttgga ggacgagtaa atgcttgaaa tcatcgacca 37920
acgtgatgca ttgctagaag aaaagtattt aaacgacgac tggtggtacg agttagatta 37980
ttggttgaat aaacgcaagt cagaaagtga acagattgat attgatagag tgcttaaatt 38040
tattgaggaa ttaaaacgat aggagataac gaataaatga ataatttaac agtagatcaa 38100
ttaaaagaac ttttacaaat acaaaaggag ttcgacgata gaataccgac gctgaactta 38160
cgagatagca aaatagcata tgtagttgaa ttctttgaat ggtttaatac attggaaacg 38220
tttaagaact ggaagaagaa accaggtaag ccgttagacg tacaacttga tgaattagct 38280
gacatgttgg cgtttggatt gagtattgcg aatcaagtag gagtgtcatc agaagagata 38340
aaagaagcga ttgaatcaag ttttaaaaat acagaatttc acaaaatgtt taattttaaa 38400
gataaagaat ttgctcaaga cgcagttgtt agtataccac agataatatt caaagaattt 38460
tatcccgacc aattggcaat tgtaatagtg atagacatag cttacaactt atattctatc 38520
gaccaactca ttgacgcata caaaaagaaa atgaaaagga accacgaaag acaagatgga 38580
acagcagacg caggaaaagg atacgtgtaa agacatctta gatcgagtca aggaggtttt 38640
ggggaagtga cacaatactt agtcacaaca ttcaaagatt caacaggacg caagcataca 38700
cacataacta aagctaatag caatcaaagg tttacagttg ttgaggcaga gagtaaagaa 38760
gaagcgaaag agaagtacga gaaacaagtt aaaagggatg caattattaa agtgagtcag 38820
ttatttgaaa atataaggaa gtgtgggaaa tgattaagca aatactaaga ttattattct 38880
tactagcaat gtacgagtta ggtaagtatg taactgagca agtatatatt atgatgacgg 38940
ctaatgatga tgtagaggcg ccgagtgact tcgcaaagtt gagcgatcag tctgatttga 39000
tgagggcgga ggtgtcagag tagatggact ggatattttt ttatactaac attgttatat 39060
tcattgcatg tgtatataca atgtatagac gaattgaagt gagtaagaaa attggtgaat 39120
taagacgtga tataaaagag aacgaaaaag cattggataa ttataaaaaa gaaaacagac 39180
caatcgaata tatcgtcgag ttaaatgacg gtgtgtactt tcgaaaaaaa catacagatg 39240
cgtttgcgca aaggaccaca tatattataa ctaataatat tttcgaagct aaatcatatg 39300
acaatttatt atcagctaaa atagatgccg aaattctaaa tggccgtgta ttaaaatata 39360
aaccaaattt agaggaggtt gggtagatga tgtggttcat catagcaatt atattattag 39420
tcatcttatt gtttggtgtg atgttgcaag ctgaacagtt aaaaggtgaa gtgaaagtta 39480
aagagcgaga gatagagata ttaagaagta gattgagaca ttttgaagat taacgggggt 39540
taaacaaatg agtttgagaa aatcaacgca aagatacttg gaaagcgaat taagtaatta 39600
caattacttc gataaagata tagcgcgtgt aagagatgaa gttttaaacc cgtggagtca 39660
acaagatact aatatcggtg gagatagggt tcaaagtaat gtaagtgtaa ccgaaataaa 39720
agctattagg gtcgttaacg atagaagatt atcacaatta gctagaatga agtcggctat 39780
agaggttgtg tataatcaca gcactgtaga gactcaaaaa cttatggaac tttattattt 39840
caaaaaacct agaacattaa atctaactgg tgtagctcaa gaaataaatg taagtaaatc 39900
taccgcttat gatatgagga aagatatatt agttaggtta gctgatgaat taggtataat 39960
acattaagtt tggaaaaagt ctggaaaaat aacgtcactt tcggtgttaa tatgatagcg 40020
taagatattg actatcttac tgcgtttccc ttatcgcaat taggaataaa ggatctatgt 40080
gggttggctg attatagcca atcccttttt taattttaaa aagcgtatag cgcgagagtt 40140
ggtggtaaat gaaatgaacg aaaaacaaaa gagattcgca gatgaatata taatgaatgg 40200
atgtaatggt aaaaaagcag caattacagc aggttatagt aagaaaacag cagagtcttt 40260
agcaagtcga ttgttaagaa atgttaatgt ttcggaatat attaaagaac gattagaaca 40320
gatacaagaa gagcgtttaa tgagtattac agaagcttta gcgttatctg cttctattgc 40380
tagaggagaa cctcaagagg cttacagtaa gaaatatgac catttaaacg acgaagtgga 40440
aaaagaggtt acttacacaa tcacgccaac atttgaagag cgtcagagat ctattgacca 40500
tatactaaaa gttcacggtg cgtatatcga taaaaaagaa attactcaga agaatattga 40560
aattaatatt ggtgagtacg atgacgaagg ttaaattaaa ttttaagaaa ccgtctaatg 40620
ttttcaatag aaacatattc gaaatactaa ccaattacga taatttcact gaagttcatt 40680
atggtggcgg ttcaagtggt aagtctcacg gcgttataca aaaagttgta cttaaagcat 40740
tgcaagactg gaaatatcct aggcgtatac tatggcttag aaaagtccaa tcaacaatta 40800
aagatagttt attcgaagat gtcaaagatt gtttgataaa cttcggtatt tgggacatgt 40860
gcctttggaa taagactgat aacaaagttg aattgccaaa cggcgcagtt tttttgttta 40920
aaggattaga taacccagag aaaataaagt cgataaaagg catatcagac atagtcatgg 40980
aagaagcgtc tgaattcaca ctaaatgatt acacgcaatt aacgttgcgt ttgagggagc 41040
gtaaacacgt gaataagcaa atatttttga tgtttaaccc agtatctaaa ctgaattggg 41100
tttataagta tttctttgaa catggtgaac caatggaaaa tgtcatgatt agacaatcta 41160
gttatcgaga taataagttt cttgatgaaa tgacacgaca aaactta 41207
Claims (6)
- 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) SAP26.
- 제 1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCTC 11665BP의 박테리오파지인 것을 특징으로 하는 박테리오파지 SAP26.
- 제 1항에 있어서, 상기 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균 또는 메티실린 감수성 황색포도상구균인 것을 특징으로 하는 박테리오파지 SAP26.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 박테리오파지 SAP26을 유효성분으로 포함하는, 균막 형성능을 가진 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 박테리오파지 SAP26을 포함하는 항생제.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 박테리오파지 SAP26을 포함하는 소독제.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020100049853A KR101174809B1 (ko) | 2010-05-27 | 2010-05-27 | 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020100049853A KR101174809B1 (ko) | 2010-05-27 | 2010-05-27 | 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20110130285A true KR20110130285A (ko) | 2011-12-05 |
KR101174809B1 KR101174809B1 (ko) | 2012-08-20 |
Family
ID=45499145
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020100049853A KR101174809B1 (ko) | 2010-05-27 | 2010-05-27 | 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101174809B1 (ko) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101643235B1 (ko) * | 2015-06-03 | 2016-07-27 | 서울대학교산학협력단 | 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 sap4 및 이를 함유하는 조성물 |
KR20200029763A (ko) * | 2018-09-11 | 2020-03-19 | 경북대학교 산학협력단 | 병원성 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 효소 LysSAP26의 용도 |
KR20210143685A (ko) * | 2020-05-20 | 2021-11-29 | 서울대학교산학협력단 | 황색포도상구균 유래 점보박테리오파지 PALS2의 엔도라이신 LysPALS22 |
CN115125216A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-09-30 | 广东省人民医院 | 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用 |
WO2023113396A1 (ko) * | 2021-12-14 | 2023-06-22 | 경북대학교 산학협력단 | 클로스트리듐 디피실 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 단백질의 용도 |
WO2023140723A1 (ko) * | 2022-01-21 | 2023-07-27 | 서울여자대학교 산학협력단 | 스타필로코커스균 특이 박테리오파지 kmsp1 및 이를 포함하는 항균 조성물 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101596665B1 (ko) * | 2013-05-29 | 2016-02-23 | 서울대학교산학협력단 | 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 sa12 및 이를 함유하는 조성물 |
KR102097127B1 (ko) | 2019-04-02 | 2020-04-07 | 서울대학교산학협력단 | 황색포도상구균 유래 바이오필름 제거에 효과적인 박테리오파지 CSA13 및 그 유래의 엔도라이신 LysCSA13 |
-
2010
- 2010-05-27 KR KR1020100049853A patent/KR101174809B1/ko active IP Right Grant
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101643235B1 (ko) * | 2015-06-03 | 2016-07-27 | 서울대학교산학협력단 | 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 sap4 및 이를 함유하는 조성물 |
KR20200029763A (ko) * | 2018-09-11 | 2020-03-19 | 경북대학교 산학협력단 | 병원성 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 효소 LysSAP26의 용도 |
WO2020055011A1 (ko) * | 2018-09-11 | 2020-03-19 | 경북대학교 산학협력단 | 병원성 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 효소 LysSAP26의 용도 |
US20220175894A1 (en) * | 2018-09-11 | 2022-06-09 | Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation | Use of recombinant antibacterial enzyme lyssap26 effectively killing pathogenic bacteria |
KR20210143685A (ko) * | 2020-05-20 | 2021-11-29 | 서울대학교산학협력단 | 황색포도상구균 유래 점보박테리오파지 PALS2의 엔도라이신 LysPALS22 |
KR20210143684A (ko) * | 2020-05-20 | 2021-11-29 | 서울대학교산학협력단 | 황색포도상구균 유래 점보박테리오파지 PALS2의 엔도라이신 LysPALS21 |
KR20210143974A (ko) * | 2020-05-20 | 2021-11-30 | 서울대학교산학협력단 | 황색포도상구균 유래 점보박테리오파지 PALS2 및 그 유래의 엔도라이신 LysPALS21과 LysPALS22 |
WO2023113396A1 (ko) * | 2021-12-14 | 2023-06-22 | 경북대학교 산학협력단 | 클로스트리듐 디피실 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 단백질의 용도 |
WO2023140723A1 (ko) * | 2022-01-21 | 2023-07-27 | 서울여자대학교 산학협력단 | 스타필로코커스균 특이 박테리오파지 kmsp1 및 이를 포함하는 항균 조성물 |
CN115125216A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-09-30 | 广东省人民医院 | 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用 |
CN115125216B (zh) * | 2022-06-27 | 2024-03-05 | 广东省人民医院 | 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101174809B1 (ko) | 2012-08-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20110130285A (ko) | 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 | |
CN107250352B (zh) | 新型肠致病性大肠杆菌噬菌体Esc-CHP-2及其用于抑制肠致病性大肠杆菌增殖的用途 | |
KR100781669B1 (ko) | 황색포도상구균 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지 | |
KR102003770B1 (ko) | 신규한 포도상구균 특이 박테리오파지 sa3 및 이를 포함하는 항균 조성물 | |
KR101261873B1 (ko) | 식중독을 유발하는 살모넬라에 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지 | |
CN109082414B (zh) | 一种金黄色葡萄球菌噬菌体及应用 | |
KR20150118835A (ko) | 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 | |
CN113430174A (zh) | 一株高裂解性沙门氏菌噬菌体rdp-sa-19009及其应用 | |
KR101237233B1 (ko) | 녹농균 및 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 | |
KR102073086B1 (ko) | 신규한 스트렙토코커스 수이스 박테리오파지 Str-SUP-1 및 이의 스트렙토코커스 수이스 균 증식 억제 용도 | |
KR102073088B1 (ko) | 신규한 스트렙토코커스 수이스 박테리오파지 Str-SUP-2 및 이의 스트렙토코커스 수이스 균 증식 억제 용도 | |
CN114231500A (zh) | 一株突变的金黄色葡萄球菌噬菌体及其应用 | |
CN108431213B (zh) | 新的海豚链球菌噬菌体Str-INP-1及其海豚链球菌增殖抑制用途 | |
KR101587113B1 (ko) | 치주염 유발 장알균(Enterococcus faecalis)을 특이적으로 사멸시키는 신규한 박테리오파지 | |
US20130273635A1 (en) | Bacteriophage killing pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus | |
KR101591783B1 (ko) | 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 | |
KR20200075472A (ko) | 항생제 내성을 갖는 아시네토박터 속의 균을 용균하는 신규한 박테리오파지 | |
KR20180073489A (ko) | 신규한 녹농균 특이 박테리오파지 pa4 및 이를 포함하는 항균 조성물 | |
KR102193495B1 (ko) | 신규한 아시네토박터 바우마니 균 특이 박테리오파지 ab63 및 이를 포함하는 항균 조성물 | |
KR102003795B1 (ko) | 신규한 시가톡신 생성 대장균 특이 박테리오파지 ecoh1 및 이를 포함하는 항균 조성물 | |
KR102275107B1 (ko) | 항생제 내성을 갖는 아시네토박터 속의 균을 용균하는 신규한 박테리오파지 | |
KR102003786B1 (ko) | 신규한 시가톡신 생성 대장균 특이 박테리오파지 ecoh7 및 이를 포함하는 항균 조성물 | |
KR20230127664A (ko) | 살모넬라 사멸능을 갖는 박테리오파지 및 이의 용도 | |
KR101992013B1 (ko) | 병원성 장내세균에 대해 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 및 이의 용도 | |
KR102224896B1 (ko) | 신규한 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 엔테로코커스 속 세균에 대한 항생제 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150723 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170725 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180724 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190725 Year of fee payment: 8 |