KR20110130285A - 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) SAP26에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 박테리오파지 SAP26을 이용하여 균막 형성능이 있는 황색포도상구균을 효과적으로 사멸시키거나 감소시킬 수 있다. 특히 박테리오파지는 세균을 숙주로 하는 바이러스로 사람과 동물 등에는 전혀 작용하지 않는 것으로 알려져 있기 때문에 의약산업, 식품산업, 생명공학 등에 응용이 가능할 뿐 아니라, 항생제 내성에 대한 문제점 없이 유해 세균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있다.

Description

황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지 {A bacteriophage killing Staphylococcus aureus}

본 발명은 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) SAP26에 관한 것이다.

황색포도상구균은 병원내 감염을 일으키는 대표적인 세균으로 정상인이나 환경에서도 쉽게 발견되는 상재세균이다. 이 세균은 상처나 면역저하환자, 그리고 외과적 치료부위에 오염된 의료기구 등을 통하여 감염하여 항균제로 치료하기 어려운 내성을 가지고 화농성 질환을 일으킨다. 균의 특성상 의료기구나 비생물체의 표면에 고착하여 오랫동안 생존하고 있기 때문에 일반적인 세제나 알코올류로 완전히 제거가 어렵다. 이를 세균의 균막형성이라 하며 균막형성시 치료가 더욱 어렵고 항균제에도 보다 높은 저항성을 나타낸다. 인체 감염시 균막은 인체의 면역체계에 저항하며, 항균물질에 대한 저항성이 부유 상태의 500배에서 1000배 이상 증가하는 것으로 나타나 항균치료만으로는 효과적인 치료를 기대하기 힘들다. 뿐만 아니라 항균제 내성균의 출현 및 확산 문제가 매우 심각해서 현재까지 개발되어 사용되고 있는 거의 모든 종류의 항균치료제에 내성을 나타내는 슈퍼박테리아까지 출현하여, 항균제 이외의 대체치료제의 개발이 시급하고 절실하게 요구되고 있다.

박테리오파지는 세균에 특이적으로 감염하고 용균을 일으키는 바이러스로 1915년 최초발견 이후 지금까지 다양한 세균성 질병의 치료를 위해 연구되어 왔으며, 80년 전 파지 발견자인 Felix d'Herelle는 최초로 파지를 감염질환의 치료 목적으로 사용하였다.

박테리오파지를 이용한 연구는 과거부터 지금까지 그루지아, 폴란드와 구소련에서는 꾸준히 치료 연구가 진행되고 있으며, 실제 병원성 미생물에 대한 치료에도 사용되고 있다. 1994년, 위절제술 후에 재발한 횡경막 종양에 감염된 내성 대장균에 박테리오파지를 처리하여 깨끗하게 치료하였다. 1995년, 급성 만성 비뇨기염증환자 46명에게 박테리오파지를 처리하여 92%명이 임상적으로 회복되었고, 84%가 병원성 미생물을 완벽히 제거하였다. 1999년, 신생아의 수막염을 일으키는 균인 Klebsiella pueumoniae에 항생제 처리가 실패하여 구강주입을 통해 박테리오파지를 처리하여 치료에 성공하였다. 2001년, 20명의 난치 종양환자에게 2~9주 동안 하루에 3번 구강으로 박테리오파지를 주입하여 치료에 성공하였다. 2001년, 54명의 환자들의 화상부위에 파지를 감염균의 수에 1.5~2배 처리하여 Staphylococcus, Streptococcus, Proteus 등에 감염으로부터 보호하였다. 2002년, 박테리오파지와 생물분해성 혼합물을 상처와 종양에 처리하여 환자 96명중 67명이 회복되었다.

최근 종 선택성에 대한 광범위 효과를 발휘하는 박테리오파지에 대한 탐색과 살균효과의 전달에 대한 약물동력학적 연구가 진행됨에 따라 점차 그 활용가능성이 높아지고 있고 외국의 경우 활발한 관련연구가 진행되고 있지만 국내에서는 파지 관련연구가 시작단계에 불과하다.

세계적인 학술지인 Nature review와 Nature biotechnology에서는 박테리오파지를 이용한 치료에 대하여 소개하면서 치료용 박테리오파지의 선별 방법과 치료방법들에 대하여 자세하게 보고 하였으며, 게놈 유전자의 산물을 이용하여 감염세균의 성장을 억제하는 방법을 소개하였다.

2007년, 미국 식품의약품안전청(FDA)이 당뇨성 발 괴사의 세균감염 치료를 위한 파지 사용 1단계 임상실험을 승인하여 파지를 이용한 동물의 감염질환 치료 뿐 아니라 사람에게도 치료목적으로 사용할 수 있는 길이 열렸다. 2008년, FDA는 살모넬라 특이적 박테리오파지를 이용하여 닭고기 처리과정 중에 살모넬라 오염을 저감하는 방법을 승인하였다. 감염질환의 치료를 위하여 파지 자체를 개발하는 것 뿐 아니라 파지가 가지고 있는 살균 인자(bactericidal factor)를 탐색하여 응용하는 것이 필요하다. 감염질환의 경제적 효과와 보건의료기술 향상에 큰 영향을 줄 것으로 기대되어 국가적 연구지원을 통한 관련기술 및 연구기반 향상이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 다약제 내성 황색포도상구균의 임상분리주로부터 분리된 박테리오파지 SAP26이 황색포도상구균에 대하여 특이적 사멸능을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 황색포도상구균에 대한 탁월한 사멸능을 갖는 박테리오파지(Bacteriophage) SAP26을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지 SAP26을 유효성분으로 함유하는 황색포도상구균 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지 SAP26을 포함하는 항생제 및 소독제를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) SAP26을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 박테리오파지 SAP26은 본 발명에서 처음으로 분리 동정된 것으로서, 그 유전체의 서열 또한 본 발명자에 의해 처음으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 분리된 박테리오파지 SAP26의 전장 유전체를 분리하고 이를 시퀀싱함으로써 파지의 유전체가 약 41 kbp 크기인 이중 가닥 DNA이며 63개의 단백질 암호와 부위(open reading frame, ORF)를 가짐을 확인하였다 (표 2 참조). 또한 본 발명에서 분리된 박테리오파지 SAP26는 메티실린 내성 황색포도상구균과 메티실린 감수성 황색포도상구균 모두에 탁월한 사멸능을 가짐을 확인하였다 (표 1 및 도 4).

본 발명에 있어서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCTC 11665BP인 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 다약제 내성 황색포도상구균의 임상분리주로부터 황색포도상구균에 대하여 사멸능을 가지고 있는 신규한 박테리오파지를 선별하였고, 분리된 박테리오파지를 한국 생명공학연구원의 유전자은행에 2010년 3월 22일자로 기탁하였다.

본 발명에 있어서, 상기 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균 또는 메티실린 감수성 황색포도상구균인 것을 특징으로 한다. 특히 균막이 형성된 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 높은 사멸능을 보였다 (도 4의 b). 또한 낮은 농도의 항균제와 복합적 사용에서는 탁월한 항균능을 보였다 (도 4의 d). 즉 균막이 형성된 황색포도상구균에 항균제를 단독으로 처리하는 경우(도 4의 c)에는 황색포도상구균의 사멸능이 낮았지만 발명의 박테리오파지와 함께 처리하는 경우(도 4의 d)에는 균막이 형성된 황색포도상구균에 본 발명의 박테리오파지가 직접 작용하여 시너지 효과를 얻을 수 있었다. 따라서 본 발명의 박테리오파지 SAP26을 의학 산업, 식품 산업, 생명공학 산업 등에 응용하여 항균제 내성에 대한 문제점 없이 유해 황색포도상구균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 SAP26을 유효성분으로 포함하는 균막 형성능을 가진 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지는 일반 항균제보다 내성세균 출현의 문제가 적고, 세균에만 용균작용을 나타낼 뿐 진핵세포에는 작용하지 않는 선택적 독성이 우수하므로 인체와 동물에 무해하기 때문에 감염병 치료에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 ‘치료’라는 용어는 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 예방; 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 황색포도상구균에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지는 상술한 바와 같이 황색포도상구균을 사멸시키고 그것에 의해 형성된 균막을 효과적으로 제거할 수 있으므로, 황색포도상구균에 의해 유발되고 균막 형성으로 인해 만성화된 다양한 질환, 예컨대 유방염, 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염, 및 장염 등에 대한 치료에 효과를 나타낸다. 이러한 목적의 조성물에는 추가적 치료의 효과를 얻기 위하여 이미 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 성분이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명에 적용될 수 있는 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 성분으로는 메티실린, 옥사실린, 반코마이신 등이 있는데 이에 국한되지 않고 다양한 항생제가 적용될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법으로 이용할 수 있으며, 그 밖에 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수도 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 1×10³ 내지 1×10¹⁰ pfu/㎖의 박테리오파지를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 SAP26을 유효성분으로 포함하는 화장품용 항균제 및 의약용 항생제를 제공한다.

황색포도상구균은 고초균(Bacillus subtilis), 대장균 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 등과 함께 화장품에서 자주 발견되는 유해균이기도 하다. 화장품은 기름이나 물을 주성분으로 하며, 미생물의 탄소원이 되는 글리세린이나 솔비톨 등과 질소원이 되는 아미노산 유도체, 단백질 등이 배합된 것이 많으므로 세균 등의 미생물 침투가 용이하다. 또한, 식품에 비하여 사용기간이 매우 길기 때문에 미생물에 의한 오염 위험이 훨씬 크다고 할 수 있다. 사용함에 따른 미생물 오염으로 나타나는 변색이나 변취 등으로부터 화장품을 장기간 보호하기 위하여 항균제의 첨가가 필수적이다.

최근 화장품에 가장 널리 사용되고 있는 파라벤류와 같은 합성방부제는 그 위험성이 부각되고 있고, 합성 방부제 함유 화장품이 예상 외로 위험할 수도 있다고 인식되고 있다. 또한, 미국 피부과학회는 합성 방부제를 피부 알레르기 유발 원인물질 2위에 올려놓은 바도 있다. 이와 함께 최근에는 어린이용 제품에 대한 인공 합성 방부제의 사용은 어린 시절부터 방부제 함유제품을 사용하게 함으로써 방부제의 사용기간과 양을 성인에 비해 늘릴 수 있기 때문에 더욱 위험할 수 있다는 우려가 있어 새로운 천연유래의 방부제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 비하여 탁월한 황색포도상구균의 사멸능을 갖고 황색포도상구균에 의해 형성된 균막의 제거능력이 있는 장점을 갖고 있다. 본 발명의 박테리오파지를 항생제로 이용하게 되면 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 황색포도상구균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 중요한 장점을 갖기 때문에 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 제공될 수 있다. 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항생제 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그 만큼 항생제로서의 제품수명이 길어질 것으로 기대된다.

따라서 황색포도상구균을 사멸시키는 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 ‘항생제’라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.

상기 황색포도상구균에 대해 효과적인 사멸능을 갖는 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제는 병원감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고 또한, 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 축산산업의 축사 소독제로서 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 소독제에 사용되는 박테리오파지는 자연 분해되므로 친환경적이고 액상으로 준비 가능하기 때문에 일반 환경 또는 의료 기구에 존재하는 황색포도상구균을 제가하기 위한 소독제의 용도로서 매우 유용하다. 박테리오파지를 생산하는 비용 또한 항균제 개발과 생산보다 훨씬 경제적이기 때문에 보건산업에서의 박테리오파지의 효용성은 매우 크다고 할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 황색포도상구균을 효과적으로 사멸시키는 것은 질병치료 및 예방 차원에서 매우 중요하다. 이러한 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환을 치료하거나 원인세균을 사멸시키기 위하여 인체 또는 가축 등에 항균제를 투여하고 식자재나 환경에는 물리화학적 요법으로 원인세균을 저감하기도 한다. 그러나 현재 항균제 남용으로 인한 내성 세균의 유행이 국민보건에 크게 위해요소가 되고 있으며 물리화학적 요법은 환경오염과 경제적 비용이 많이 든다는 단점이 있다. 본 발명의 박테리오파지 SAP26은 균막형성능을 가진 황색포도상구균에 대하여 탁월한 사멸능을 나타낸다. 따라서 다양한 질병의 원인이 되는 황색포도상구균을 사멸하는 SAP26은 보건산업 뿐 아니라 식품, 친환경 대체항균제로 이용될 가치가 높다.

도 1은 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 균주인 황색포도상구균 배지에서 발생한 파지 플라크(phage plaque)를 나타낸다.
도 2는 박테리오파지 SAP26을 직접점적법을 통하여 MRSA 균주인 황색포도상구균을 용혈한 사진이다.
도 3은 박테리오파지 SAP26의 전자현미경 사진이다.
도 4는 MRSA인 황색포도상구균 균막에 대하여 박테리오파지 SAP26, 피팜피신, 및 이들의 조합의 처치에 따른 황색포도상구균 균막의 제거효과를 비교한 결과이다. a: 처치하지 않은 대조군(control biofilm), b: 박테리오파지 SAP26을 처지한 균막, c: 리팜피신을 처치한 균막, d: 박테리오파지 SAP26와 리팜피신을 동시에 처치한 균막.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. SAP26 파지의 생산 및 분리

국내 임상분리주들인 메티실린 내성 황색포도상구균 (methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)을 LB (Luria Bertani) 액체 배지에 접종하여 지수기의 생장조건에서 미토마이신 C (mitomycin C)를 1 μg/ml 농도로 처리하고 37℃에서 하룻밤 정치배양하였다. 세균은 4000 g로 10분간 원심분리하여 제거하고 0.45 μm 크기의 필터를 사용하여 여과하였다. 50 μl 정도의 클로로포름을 첨가하여 4℃에 보관하였다. 이 용액을 사용하여 LB 고체배지에 황색포도상구균이 퍼져서 말린 박테리아론(bacterial lawn)에 직접 한 방울씩 떨어뜨려 하룻밤 동안 37℃에 배양한 후, 다음날 세균용혈을 확인(직접점적법)하였다. 박테리오파지는 상기 임상분리주들의 염색체에 존재하였던 것으로 인위적으로 미토마이신을 처리하여 분리하였다. 박테리오파지의 순수분리를 위하여 플라크 (plaque) 형성 시험을 하고 단일 플라크를 분리하여 다시 황색포도상구균과 혼합배양하여 박테리오파지를 증폭하는 과정을 연속 세 번 반복하여 순수분리하였다 (도 1 참조). 이렇게 순수분리된 박테리오파지를 본 발명자들은 한국 생명공학연구원의 유전자은행(KCTC)에 기탁하고 (KCTC 11665BP) ‘박테리오파지 SAP26’이라고 명명하였다. 대량의 박테리오파지를 수확하기 위하여 순수 분리된 파지를 지수기의 숙주세균과 혼합하고 최종 0.7%의 한천이 되도록 녹인 한천과 혼합한 후, LB 고체배지에 붓고 말린 후, 37℃에 하룻밤 배양하였다. 그린 다음, 위의 원심분리와 여과과정을 수행하였다. 원하는 PFU(plaque forming unit)를 얻을 때까지 이를 반복하였다.

실시예 2. SAP26의 황색포도상구균에 대한 숙주특이성 및 사멸능

실시예 1에서 얻은 순수 분리된 파지용액을 이용하여 아토피 피부염 환자들과 창상 환자에서 분리된 MSSA(methicillin susceptible Staphylococcus aures) 61주와 MRSA(methicillin resistant Staphylococcus aures) 110주를 포함한 총 171주의 황색포도상구균(표 1)을 대상으로 직접점적법을 수행하였다 (도 2). 이 결과, 하기 표 1과 같이, SAP26 파지는 93.4%의 MSSA와 99.1%의 MRSA를 사멸시키는 것으로 나타났다.

[표 1]

실시예 3. 전자현미경을 이용한 SAP26의 형태관찰

파지의 모양을 관찰하기 위하여 주사전자현미경을 사용하였다. 약 10¹² pfu의 순수분리된 파지를 탄소로 코팅된 구리판에 바른 후, 2%의 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하고 주사전자현미경 (Philips EM 300)을 사용하여 관찰하였다.

관찰결과 도 3에서, 각이 진 머리(icosahedral head)와 긴 하나의 꼬리가 관찰되어 형태적 분류를 통해 시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 것으로 판단하였다. 머리크기는 약 50 nm이었으며 꼬리길이는 120-200 nm이었다.

실시예 4. SAP26의 유전학적 특성

파지의 유전체는 Lambda midikit (Qiagen)를 사용하여 순수분리하였다. 분리된 파지 유전체는 전체유전자 염기서열 결정을 위하여 (주)제노텍에 맡겼다. 전체 염기서열 결정은 shotgun 방법과 포스미드 라이브러리 제작, 그리고 자동화 염기서열기기 (ABI PRISM 377)에 의하여 수행되었다. 염기서열 분석결과에서 단백질 암호화 부위 (open reading frame, ORF)들은 Sequin 소프트웨어 버전 9.5를 사용하여 분석하였다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

실험결과, 파지의 유전체는 이중가닥 DNA로 크기가 약 41 kbp이고 (서열번호 1), 63개의 ORF로 구성되어 있었다. 전체 염기서열을 미국 NCBI의 BLAST 검색을 한 결과, SAP26 파지의 게놈은 기존에 보고된 황색포도상구균의 파지인 phiNM1와 phiETA2에 각각 75%의 Query Coverage를 보여 SAP26와 가장 가까운 파지로 나타났다. 이러한 결과는 SAP26이 새로운 파지임을 나타낸다.

[표 2-1]

[표 2-2]

실시예 5. SAP26 단독처치 또는 SAP26와 항균제 동시 처치에 의한 황색포도상구균 사멸효과 및 균막 제거효과 시험

SAP26의 황색포도상구균 사멸능을 시험하고자 MRSA 균주인 S. aureus D43-a 균주를 사용하였다. D43-a 균주를 BHI 액상배지를 사용하여 37℃에서 흔들어 하룻밤 배양하고 OD₆₀₀ = 1을 맞춘 배양액을 100배 BHI로 희석하여 96웰 플레이트에 100 μl씩 분주하였다. 이 때의 균은 약 5×10⁶ cfu/웰이다. 그리고 37℃에서 하룻밤 정치배양하여 24시간 세균막 형성을 하도록 하였다. 24시간 후에 배양액과 부유세균을 제거하고 5×10⁸ pfu/웰이 되도록 각 웰에 SAP26 파지를 100 μl 가하였다. 항균제만을 위한 세균막 처치를 위해서는 리팜피신(rifampicin)을 사용하여 D43-a 균주의 MIC 농도보다 10배 높은 0.6 μg/ml의 농도가 되도록 제조한 후 100 μl씩 각 세균막 형성된 웰에 가하였다. 또 리팜피신과 파지의 동시 처치를 위해서 SAP26 파지 5×10⁸ pfu/웰과 리팜피신 0.6 μg/ml의 농도가 되도록 하여 총 100 μl의 부피가 되록 하여 세균막 형성된 웰에 가하였다. 이렇게 파지와 항균제, 파지-항균제 처치를 가한 것을 추가로 24시간 동안 37℃에서 정치배양을 하고 주사전자현미경(scanning electron microscopy)을 이용하여 세균의 상태를 관찰하였다.

도 4를 보면 아무것도 처치하지 않은 균막(도 4의 a)과 비교하였을 때, SAP26 파지 처치된 균막(도 4의 b)은 리팜피신 처치한 것(도 4의 c)보다 더 균막을 상당량 제거하였으며 남아있는 세균의 형태도 건강하지 않은 모습을 보여주고 있다. 반면에 SAP26 파지와 리팜피신 동시 처치된 균막(도 4의 d)을 보면 항균제나 파지의 단독 처치보다 더 좋은 균막 제거효과를 보여주었다. 이 결과를 근거로 SAP26 파지는 항균제를 동시 처치하면 MRSA 황색포도상구균의 사멸과 함께 균막까지도 효과적으로 제거할 수 있음을 알 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC11665BP 20100311

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A bacteriophage killing Staphylococcus aureus <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 41207 <212> DNA <213> Bacteriophage SAP26 <400> 1 tattcacttc acacggtgtt tatagatatc ttaccaatag aacaaatgga ttgaagctca 60 caccacgtga aaacagtttt gaatctcact catttgaacg catgcctatt acagaattta 120 gcaataacga aagaagaaaa ggggattacg agaaagtaat cactttaatt gatttgtatg 180 ataatgctga atcagataca gctaactata tgagtgattt aaatgacgct atgttactta 240 ttaaaggtaa tttaaattta gatcctgtag aagttagaaa acaaaaggaa gctaacgtgt 300 tgtttttaga accgactgtt tatgctgata gcgaaggtag agaaacagaa ggttcagttg 360 acggtggtta tatttataag caatacgatg tacaaggtac cgaagcttat aaagaccgtt 420 tgaacagtga tatacacatg tttaccaaca cgcctaacat gaaagatgat aactttagtg 480 gcactcaatc gggcgaggca atgaaatata aattgttcgg attagaacaa cgtactaaaa 540 ctaaagaagg attgttcact aaagggttaa gacgtcgtgc taagttgtta gagacaatac 600 ttaaaaatac acggtcgatt gacgctaaca aagatttcaa tactgttaga tacgtataca 660 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tatcaaagct ttagctagtg ttgaaaataa acgcaacgaa caaatgattt 4080 acattgtaaa tgacaaatta accaaaaaag aacttgtcga aatagcaagt gttgctggct 4140 tacaagttga tgaaaaacaa acaaaagctg aaattatcaa tgcttttgag tcactagagt 4200 aggtggttat atgactacgc tagctgatgt aaaaaaacgt attggtctta aagatgaaaa 4260 gcaagatgaa caattagagg aaattataaa aagttgtgaa agccagttgt tatcaatgtt 4320 acctattgaa gttgaacaaa taccggaaag gtttagttac atgattaaag aagttgcagt 4380 taaacgctac aacaggattg gtgctgaagg tatgacatca gaagcggttg acggacgtag 4440 caatgcgtat gaattgaacg atttcaagga gtatgaagct attattgata attactttaa 4500 tgctagaacg agaactaaaa aaggaaaggc tgtgttcttt tgagatatga agatagagct 4560 gtctttcaat cagaacaagc agcaacttac aatcctaaaa ctagcaaaaa agaaaacact 4620 ctaatcactt atgatgcgat accatgcaat attaatccta tttctagagc aagaaagcaa 4680 cttgaattcg gcgatgtaaa aaacgatgta agtgtcctga ggataaaaga atcaatatct 4740 taccctgtta gccacgtgtt ggttaatggc attcgctaca agatagttga tacaaggata 4800 tacagacacg aaacgtcata ttatatcgaa gaggtcaatt gatgaatata gatggattag 4860 acgcactgtt 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Claims (6)

1. 황색포도상구균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 전장 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지(Bacteriophage) SAP26.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 기탁번호 KCTC 11665BP의 박테리오파지인 것을 특징으로 하는 박테리오파지 SAP26.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 황색포도상구균은 메티실린 내성 황색포도상구균 또는 메티실린 감수성 황색포도상구균인 것을 특징으로 하는 박테리오파지 SAP26.
   
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 박테리오파지 SAP26을 유효성분으로 포함하는, 균막 형성능을 가진 황색포도상구균에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 박테리오파지 SAP26을 포함하는 항생제.
   
6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 박테리오파지 SAP26을 포함하는 소독제.

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