CN108409833B - 一种新型杀念珠菌多肽fcp1及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种杀念珠菌多肽序列和制备方法。该杀念珠菌多肽的氨基酸序列为：NH2‑RILSILRHQ‑COOH。本发明的制备方法是采用固相多肽合成方法。本发明克服了常见抗菌肽生物安全性差、易溶血的缺点，是一种对念珠菌具有特异杀菌作用、不具有溶血性的新型抗真菌多肽。该多肽为临床抗真菌药物研究提供了一种新型先导物。

Description

一种新型杀念珠菌多肽FCP1及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制剂，具体涉及一种新型杀念珠菌多肽及其制备方法。
背景技术
在世界范围内，随着免疫缺陷病人的增多，真菌感染的发病率增加，其中假丝酵母属(Candida spp)引起的许多临床疾病，与医疗机构的重大死亡率和发病率相关。研究表明，在侵染性真菌感染中，以念珠菌感染为主。由于抗生素的滥用，耐药性病原念珠菌越来越多。因此，尽快研究和开发新型、高效、低毒、病原真菌不易对其产生耐药性的抗真菌药物具有重要意义。
已有的研究表明，抗菌肽(AMP)被认为是新型抗菌药物开发中的先导化合物(LvY,et al.PLoS ONE,2014,9:e86364)。AMP生物体产生的先天免疫系统的重要组成部分，最显着的特征是广谱抗菌活性，包括对多重耐微生物的抗性。此外，大多数AMP与抑制特定生物合成途径(包括细胞壁或蛋白质合成)的传统抗生素不同，通过多靶点的作用机制抑制或杀死病原菌。抗菌肽独特的作用机制，致使微生物不易产生耐药性(Forde E,etal.Molecules,2015,20(1):1210-1227；王欢，等.细胞与分子免疫学杂志，2015，31(1):137-139)。因此，抗菌肽用来治疗人和动物的疾病在临床上有着极大的潜力，可能是解决真菌耐药性、药物毒副作用问题的最佳选择。
从总体上看，在发现的抗菌肽中，具有抗细菌活性的抗菌肽较多，而具有抗真菌活性的抗菌肽较少。在前期研究中，我们确定了一种新型抗真菌肽CGA-N46(李瑞芳，等.中山大学学报(自然科学版)，2006，45(2)：64-67)。CGA-N46对应于人嗜铬粒蛋白(CGA)N末端Pro31-Gln76序列，对白色念珠菌具有抗菌活性。
利用基因工程技术表达多肽，表达产物不稳定，易被降解，纯化困难。化学合成30个氨基酸以上多肽，产物产量低、纯度低。对CGA-N46进行生物信息学分析。根据抗菌肽结构特征和生物信息学特性，化学合成CGA-N46的衍生片段，并进行比较，以期获得活性高、生物特性好、便于人工合成对应于CGA N端Arg47-Glu55的抗真菌多肽FCP1，且其具有杀念珠菌作用。
发明内容
采用固相化学合成技术获得多肽FCP1，进行了抗真菌活性研究，发现其具有杀念珠菌活性。
对FCP1生物学特性进行研究，发现FCP1具有以下优点：(1)对念珠菌类病原真菌有特异的抑制作用，其中对热带念珠菌和新型隐球菌的增殖抑制作用最强，MIC100为3.9μg/mL(4μmol/L)；(2)杀菌实验结果表明，经FCP1处理的念珠菌不能再在马铃薯培养基上生长，FCP1能够杀死念珠菌；(3)FCP1安全，在16倍MIC100浓度条件下，对红细胞溶血率仅为1.32％。对FCP1进行生物信息学分析，发现FCP1呈α-螺旋构型。
常见α-螺旋形抗菌肽抗菌机制是通过板筒式模型或毯式模型使细菌细胞膜通透性增加，内容物外溢，达到抗菌目的。具有这种抗菌机制的抗菌肽多数具有溶血活性和哺乳动物细胞毒性。但FCP1在高出MIC100浓度情况下，并不引起溶血(见表1)。因此，FCP1是一种安全的新型杀念珠菌多肽。
表1 FCP1杀念珠菌活性和细胞毒性
Figure GDA0002944249220000021
本发明克服了现有抗菌肽的不足，是一种安全的杀念珠菌多肽。本发明的第二个目的是提供了多肽FCP1的制备方法。
实验表明本发明是一种安全、特异的杀念珠菌多肽，其制备未见报道。
附图说明
附图1为杀念珠菌多肽FCP1二级结构。
具体实施方式
实施例1FCP1的制备
采用固相Fmoc法合成目的肽段，由C端至N端合成。将该多肽C端第一个Fmoc-Gln(Trt)-OH的羧基活化后与树脂结合，脱去Fmoc-保护基，与第二个羧基活化的Fmoc-His(Trt)-OH结合，再脱去Fmoc-保护基，循环重复，直至添加所有氨基酸。用切割液切割树脂上的肽，收集切割液，于离心管中吹干，冰乙醚洗沉淀2～3次，离心去上清，吹干沉淀。将得到的粗品，HPLC纯化。
实施例2MTT法测FCP1抗菌谱
1)称量和溶解蛋白质。配制FCP1磷酸溶液，设第一列初始浓度250μg/mL，终浓度为0.488μg/mL。则需配制1mg/mL的FCP1母液。取适量(10μl)DMSO溶解1mg FCP1，然后补充20mmol/LpH6.0的磷酸钠缓冲液溶解至1ml，溶液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。
2)使用移液枪，在96孔板的各孔中分别加入100μL的20mmol/LpH6.0的磷酸钠缓冲液，用于稀释FCP1。
3)用移液枪吸取100μL 1mg/mL FCP1母液至96孔板第一排的每个孔中。
4)反复吹吸板中第一排的溶液6～8次，混匀，不要溅起。
5)从第一排吸取100μL加入到第二排，反复吹吸混合6～8次，然后再吸取100μL至第三排。重复此步骤至第十排。
6)第十排吸取出的100μL丢弃，不要加入第11排，第11排为阴性对照孔。
7)分别将100μL菌悬液(1×106CFU/mL)按顺序加入96孔板的第1列至11排，并反复吹吸6～8次，混匀。注意不要将菌悬液添加到第12排。第12排为空白对照孔。
8)在35℃下静置孵育96孔板48h
9)每孔加入20μL 5mg/mLMTT溶液，继续培养4h。吸弃上清，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，37℃置20min，并不时摇动，待晶体溶解完全后，用酶标仪于570nm处测OD值。
抑菌率(％)＝[(OD570(样品)–OD570(空白)]/[OD570(阴性)–OD570(空白)]×100。
MIC100定义为：使抑菌率达到100％时的FCP1最低浓度。
⑩每个实验重复三次。
结果见表2。由结果可知，FCP1特异性抑制念珠菌，对热带念珠菌和新型隐球菌活性最强，100％抑制的浓度为3.9μg/mL(4μmol/L)。
表2FCP1抗菌谱
Figure GDA0002944249220000041
实施例3FCP1杀热带念珠菌作用
1)称量和溶解蛋白质。配制1mg/mL的FCP1母液。取适量(10μl)DMSO溶解1mg FCP1，然后补充20mmol/L pH6.0的磷酸钠缓冲液溶解至1ml，溶液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。
2)使用移液枪，在96孔板的各孔中分别加入100μL的20mmol/LpH6.0的磷酸钠缓冲液，用于稀释FCP1。
3)用移液枪吸取100μL 1mg/mL FCP1母液至96孔板第一排的每个孔中。
4)反复吹吸板中第一排的溶液6～8次，混匀，不要溅起。
5)从第一排吸取100μL加入到第二排，反复吹吸混合6～8次，然后再吸取100μL至第三排。重复此步骤至第八排。
6)第八排吸取出的100μL丢弃，不要加入第九排，第九排设为阴性对照孔。
7)分别将100μL菌悬液(1×106CFU/mL)按顺序加入96孔板的第一排至九排，并反复吹吸6～8次，混匀。
8)设3个重复。
9)在35℃下静置孵育96孔板48h。
10)吸取各孔液体100μL，涂布SD平板，35℃培养48h。
11)观察平板菌落生长情况。
结果如表3所示。由结果可知，FCP1在大于MIC100浓度下，完全杀死了热带念珠菌。
表3 FCP1杀热带念珠菌活性
Figure GDA0002944249220000061
实施例4溶血性测定
取无菌96孔板，吸取100μl 2％的人红细胞混悬液加入到96孔板中。在各个孔中分别加入100μl FCP1溶液，使FCP1终浓度分别为250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，15.625μg/mL，7.8125μg/mL和3.90625μg/mL，混合均匀，每个浓度重复三次。37℃孵育30min后，将各孔中的上清液取出转入到新的96孔微量滴定板中，使用微孔板酶标仪在570nm处测量样品的吸光度A。设未加FCP1的人红细胞混悬液为阴性对照(0％溶血)，加入1％Triton X-100的人红细胞悬液为阳性对照(100％溶血)。计算溶血率。
溶血率计算公式：
溶血百分率(％)＝[(样品A570–阴性对照A570)/(阳性对照A570–阴性对照A570)]×100％
结果(表4)表明：FCP1浓度为62.5μg/ml时，溶血率为1.32％，远远高于敏感菌的MIC100。可见，FCP1用于抗热带念珠菌感染和新型隐球菌感染时，生物安全性高。
表4 FCP1溶血性实验结果
Figure GDA0002944249220000071
序列表
<120> 一种新型杀念珠菌多肽CFP1及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Ile Leu Ser Ile Leu Arg His Gln
1 5

Claims (3)

1.一种新型杀念珠菌多肽，其特征在于：该杀念珠菌多肽氨基酸序列为NH2-RILSILRHQ-COOH。
2.权利要求1中所述多肽制备方法，其特征在于：是采用常规固相多肽合成技术制备。
3.权利要求2中的多肽制备方法，其特征在于：在Fmoc保护系统的固相合成中，首先将Rink Amide-AM Resin装在反应器中，20%哌啶溶液去保护；将C端第一个氨基酸Fmoc-Gln(Trt)-OH与反应器中的去保护Rink Amide-AM Resin混合，在HOBt/DIC催化下，结合到固相载体上；按照给定的氨基酸序列，将Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH依次偶联，由C端逐个向N端延伸，最后用87.5% 三氟乙酸，2.5% 1,3-间苯二甲醚，2.5%三异丙基硅烷，2.5% H2O和5%茴香硫醚组成的切割液将多肽从固相载体上切下来。
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Structure-Activity Relationships of Chromogranin A in Cell Adhesion;Sara Ratti等;《The Journal of Biological Chemistry》;20000922;第275卷(第38期);全文 *
固相合成抗菌肽CGA-N46及其衍生物生物信息学分析和生物活性研究;陆志方;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20161015(第10期);全文 *

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