CN112724202A

CN112724202A - 一种抗菌肽及其应用

Info

Publication number: CN112724202A
Application number: CN202110170640.7A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏飞; 谭蓉; 熊久强; 汝少国
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2041-02-08
Also published as: CN112724202B

Abstract

本方法公开了一种抗菌肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，同时，本发明还提供了具有特异靶向性的抗菌肽，并进行了相关功能验证。本发明进一步提供了抗菌肽在制备用于防治细菌感染的药物或饲料添加剂中的应用。本发明提供的抗菌肽能够通过引起细胞膜破坏等机制杀死革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，但却对哺乳动物细胞没有毒性。

Description

一种抗菌肽及其应用

技术领域

本发明属于水产养殖防疫技术领域，涉及一种用于水产养殖的抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，水产养殖业发展迅速，由细菌性疾病引发的水产动物病害问题愈发严重，抗生素类药物被广泛应用于细菌性疾病的治疗，抗生素的滥用不仅提高饲养成本，也导致病原微生物的耐药性和致病力明显增强，严重破坏了动物消化道的微生态平衡，长期使用后在动物体内残留并富集，动物机体因药物毒副作用而削弱健康水平，免疫抗病力显著下降。如此恶性循环，导致水体环境和动物肠道微生物群系的结构破坏，进而导致水产动物养殖中各种烈性传染疾病频繁发生，难于控制和治疗。而另一方面，药物残留及日益严重的畜禽产品食品安全问题，不仅直接威胁着人类自身的健康，也阻碍了养殖业的发展由耐药细菌导致的感染性疾病已成为危害全人类健康的严重灾难,当前由耐药菌引起的死亡人数相当于HIV、乳腺癌和前列腺癌致死人数的总和。因此寻找有效控制耐药细菌的新策略，开发安全可靠、无毒无害的药物来预防和治疗水产养殖动物疾病，是当今世界各国紧迫的研究目标。

在众多抗生素替代物中，抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)因其抗菌活性强、作用机制新而受到广泛关注。抗菌肽的抗菌机理与抗生素完全不同，在报道的抗菌肽的作用机理中，有些抗菌肽通过破坏细菌细胞膜结构，使细菌内容物外渗而死亡；还有些抗菌肽能够抑制细菌特异性酶或者DNA转录和蛋白质翻译，影响胞内蛋白质相互作用及酶促级联和胞质溶胶信号传导途径，这些作用机制都不容易引起细菌的耐药性，因此，抗菌肽有望替代抗生素解决病菌耐药性问题，以及由抗生素滥用导致的一系列问题。然而，天然抗菌肽存在生产成本高、抗菌活性普遍不强等问题，且部分抗菌肽所带的正电荷使其仍然具有一定的细胞毒性。

发明内容

本发明针对上述天然抗菌肽的缺陷以及水产养殖中对抗菌药物的需求，通过生物信息学技术和计算机辅助药物设计技术设计和改造抗菌肽分子，并进一步通过连接靶向片段构建特异性靶向抗菌肽，验证了其抗耐药性水产动物致病菌活性、相关的作用机制、细胞毒性以及对动物肠道菌群的影响，同时筛选出高效稳定无毒性的特异性靶向抗菌肽，为新型水产用抗生素替代品的创制及关联新药的开发提供检验指标和方案，为在水产养殖过程中控制抗生素滥用引起的细菌耐药和耐药基因的大规模扩散提供解决方案，保证水产养殖业全面协调可持续的发展，实现“绿色、健康、安全”的水产养殖业发展模式。

本发明所述的技术问题可通过以下技术方案得以解决：

一种抗菌肽，包含抗菌功能区段，所述抗菌功能区段的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

在根据本发明的一个实施方案中，还包含连接在所述抗菌功能区段C端或N端的靶向肽段。

在根据本发明的一个实施方案中，所述靶向肽段氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

在根据本发明的一个实施方案中，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明还提供了上述的抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

在根据本发明的一个实施方案中，所述抗菌药物为用于治疗对抗生素具有耐药性的细菌感染的药物。

在根据本发明的一个实施方案中，所述具有耐药性的细菌为对多种抗生素具有耐药性的细菌。

本发明进一步提供了一种用于治疗细菌感染的药物组合物，包含上述的抗菌肽，以及药学上可接受的辅料。

本发明进一步提供了上述的抗菌肽在制备用于防治养殖动物的细菌感染的饲料添加剂中的应用；优选地，所述养殖动物为水生动物，更优选地，所述水生动物选自鱼、虾或蟹中的一种或多种。

本发明的再一方面，提供了一种用于防治动物细菌感染的饲料添加剂，包含如权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽；优选地，所述抗菌肽包覆于囊膜之中，所述囊膜能够防止所述抗菌肽被消化液消化降解并实现给药。

本发明的有益效果在于：

本发明设计得到两条能够有效实现抗菌、抑菌效果的抗菌肽，并进行了相关功能验证。本发明提供的抗菌肽1-4和L-4，能够通过引起细胞膜破坏等机制杀死革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，但却对哺乳动物细胞没有毒性。为抗生素替代品的创制及关联新药的开发提供检验指标和方案。

附图说明

图1为L-4构象的三维结构示意图，其中，浅色部分是添加的靶向片段，深色部分是AMP1-4部分；

图2a为1-4螺旋轮结构示意图，其中，在螺旋轮投影中，亲水残基以圆圈形式出现，疏水残基以菱形形式出现，可能带负电的残基以三角形形式出现，可能带正电的残基以正方形形式出现；

图2b为L-4螺旋轮结构示意图，其中，在螺旋轮投影中，亲水残基以圆圈形式出现，疏水残基以菱形形式出现，可能带负电的残基以三角形形式出现，可能带正电的残基以正方形形式出现；

图3为本发明实施例1提供的抗菌肽1-4、L-4对鳗弧菌和藤黄微球菌的杀菌作用(百分比表示杀菌率)；

图4为本发明实施例1提供的抗菌肽1-4和L-4，以及现有技术公开的抗菌肽mBjAMP1的杀菌曲线图；其中，a)-j)分别为本发明实施例1的抗菌肽1-4或L-4对五种细菌的时间-杀菌曲线(阳性对照：ANB：氨苄青霉素钠KNA：硫酸卡那霉素)；k)和l)为mBjAMP1对两种细菌的时间-杀菌曲线；

图5为本发明实施例1提供的抗菌肽1-4和L-4分别对小鼠巨噬细胞RAW264.7存活率影响的检测结果示意图；

图6为将几种典型细菌经本发明的抗菌肽处理后，利用透射电子显微镜观察到的各细菌的形态照片；其中，a)、b)和c)是未经处理的细菌形态显微照片；a1)、b1)和c1)为抗菌肽1-4处理后的细菌形态显微照片；a2)、b2)和c2)为抗菌肽L-4处理后的细菌形态显微照片；

图7为抗菌肽1-4、L-4对鳗弧菌的膜通透性影响图谱，其中，百分比代表死细胞比例；

图8为抗菌肽1-4、L-4对藤黄微球菌的膜通透性影响图谱，其中，百分比代表死细胞比例；

图9为抗菌肽1-4、L-4对李斯特菌的膜通透性影响图谱，其中，百分比代表死细胞比例；

图10抗菌肽1-4、L-4对假单胞菌的膜通透性影响图谱，其中，百分比代表死细胞比例；

图11抗菌肽1-4、L-4对副溶血弧菌的膜通透性影响图谱，其中，百分比代表死细胞比例。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。

实施例1抗菌肽AMP1-4(1-4)和李斯特菌靶向AMP1-4(L-4)

本实施例提供了示例性的两条抗菌肽。抗菌肽AMP1-4(1-4)由21个氨基酸残基组成，氨基酸序列为SEQ ID NO:1WKKWSKRWRHWIPQCKKFGRR，图1螺旋轮表明该抗菌肽1-4具有两亲性结构。在本发明中，通过连接李斯特菌信息素ASSLLLVG(SEQ ID NO:3)靶向片段嵌合成特异性靶向抗菌肽得到李斯特菌靶向AMP1-4(L-4，SEQ ID NO:2)，用分析信息学技术和计算机辅助药物分子设计软件分析其理化性质，如表1所示，通过网站(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/)对抗菌肽(L-4)进行三维结构建模分析，如图1所示，表明了抗菌肽(L-4)具有α螺旋结构。图2a和图2b分别是抗菌肽AMP1-4和抗菌肽L-4的螺旋轮结构，表明两条抗菌肽均是两亲性的。由于抗菌肽均序列较短，合成技术成熟且成本低廉，本实施例中的抗菌肽均由GL生化(上海)有限公司合成，所有抗菌肽都经过了末端酰胺化修饰，纯度大于95％。其理化性质稳定，具有广谱抑菌作用且无细胞毒性，是理想的分子设计和改造模板，其抗菌活性相比天然抗菌肽增强(图3，表3)，且溶血活性减弱。

表1抗菌肽序列及理化性质

实施例2抗菌实验：

调整菌浓度到4×10⁴个/ml，用于后续的实验。肽的作用终浓度分别为3μg/ml，6μg/ml，12μg/ml，25μg/ml，50μg/ml。PBS作为空白对照。25℃孵育半小时之后，将每个浓度的蛋白细菌混合液平均分为三份，涂布在三个含有LB固体培养基的玻璃平板上，37℃培养过夜。

通过菌落计数法，根据每个平板上的菌落数量，统计蛋白的杀菌率。

最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)如表2所示：杀死99.9％的细菌所需的最低药物浓度。

分别选用一种革兰氏阴性菌鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和一种革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)研究实施例1提供的抗菌肽的杀菌活性，如图3所示，杀菌实验结果表明，本发明实施例1中的两条抗菌肽均能直接杀死细菌且杀菌率较高，抗菌肽L-4比抗菌肽1-4的杀菌效果更强。

表2抗菌肽的最小杀菌浓度(MBC)

实施例3抑菌实验

调整菌浓度到10⁶个/ml，用于后续的实验。将LB液体培养基、稀释后菌液、不同浓度的抗菌肽稀释液混合后培养8h，期间每1小时取出用酶标仪测定595nm波长的吸光值。根据所得结果绘制细菌生长曲线，能完全抑制细菌生长的最小浓度即为最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)，统计特异性靶向抗菌肽对不同细菌的抑菌活性和最小抑菌浓度(MIC)。

抑菌实验结果表明(图4)，本发明实施例1提供的抗菌肽对鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)、假单胞菌(Pseudomonas adaceae)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)均有明显的抑制作用，而且表3为本发明的两条抗菌肽对五种典型细菌的最小抑菌浓度MIC，添加了李斯特菌靶向片段的抗菌肽L-4对李斯特菌的抑菌效果相比抗菌肽1-4来说更具有靶向性。同时，本发明还提供了现有技术中公开的抗菌肽mBjAMP1的抗菌效果，抗菌肽mBjAMP1的氨基酸序列为SEQ ID NO:4NLCASLRARHTIPQCKKFGRR(“Structuraland Functional Assessment of mBjAMP1,an Antimicrobial Peptide fromBranchiostoma japonicum,Revealed a Novelα-Hairpinin-like Scaffold withMembrane Permeable and DNA Binding Activity”，Liu et al.,2015)，本发明的两条抗菌肽均具有更优的抗菌效果。

表3抗菌肽对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC)

实施例4细胞毒性实验

本实施例通过MTT实验检测细胞的活性，进而检验抗菌肽对哺乳动物细胞是否存在毒性。实验中用到的动物细胞为小鼠巨噬细胞RAW264.7。

实验原理：进入活细胞的MTT，能够被细胞内的酶作用，生产蓝紫色的结晶，沉淀在细胞内。而死细胞无法形成蓝紫色的结晶。有机溶剂DMSO能够溶解形成的蓝紫色沉淀。用分光光度计，检测样品中蓝紫色结晶的吸光值，可以反映细胞的活性。样品中蓝紫色结晶的吸光值与活细胞数呈正相关。

具体步骤如下：

1)细胞复苏，把保存在液氮中的小鼠巨噬细胞RAW264.7复苏，培养在DMEM培养基(含有10％的胎牛血清)中，放置在37℃二氧化碳培养箱中培养，传代2-3次，为后续实验做准备。

2)用PE(含有EDTA的PBS溶液)处理贴壁的细胞，之后把细胞重悬在不含血清的培养基中，调整细胞浓度1×10⁶个/ml。

3)把细胞悬液添加到96孔板的小孔中，每孔加180μl，37℃二氧化碳培养箱中培养2小时，使细胞贴壁生长。

4)之后向每孔中添加不同浓度的抗菌肽1-4和L-4溶液，使得蛋白的终浓度为12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml和100μg/mlPBS(pH7.4)为空白对照。每个样品设置3个平行样，之后把96孔板放在37℃二氧化碳培养箱中培养4小时。

5)4小时之后，向每孔中加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，之后把96孔板放在37℃二氧化碳培养箱中继续培养4小时。

6)4小时之后，用移液枪吸掉每孔中的液体，每孔加入150μl DMSO溶剂，检测样品在492nm波长时的吸光值。

7)计算细胞的存活率，细胞存活率＝(处理组OD值/对照组OD值)×100％，结果用平均值±标准差形式表示。

结果如图5所示，毒性实验表明，实验中设置的不同浓度的抗菌肽对小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活率没有明显影响，实验结果初步说明本发明实施例1提供的抗菌肽对哺乳动物细胞没有毒性。

实施例5透射电子显微镜实验：

1)实验中的样品准备

将藤黄微球菌、鳗弧菌和李斯特菌培养到对数增长期。室温5000×g离心3分钟，去掉上层培养基，用灭过菌的PBS分别洗细菌，重复三次，最后将细菌重悬，调整菌浓度到10⁹个/ml，用于后续的实验。

2)菌液和蛋白溶液混合

将50μl藤黄微球菌菌液，与50μl的抗菌肽结合，设置蛋白的终浓度为25μg/ml。PBS组作为空白对照。蛋白和菌液在25℃孵育半小时。

3)样品固定

把细菌蛋白混合液与等体积的2.5％的戊二醛(用PBS配制)溶液混合，以固定细菌细胞。之后，吸取50μl细菌固定液在平板上，把载网浸入混合液，等待10分钟，让细菌吸附在载网上。随后，把用滤纸吸掉多余的液体，静置。

4)把载网放到透射电镜中观察，拍照。

透射电镜实验结果表明(图6)，经本发明的不同浓度抗菌肽1-4或L-4孵育后，细菌形状均产生明显的改变(如图6中a1)、a2)、b1)、b2)、c1)和c2)所示)，细菌菌体形状变得不规则，细胞内容物流出，还有的细菌细胞表面出现孔洞。

实施例6细胞膜通透性实验

荧光染料碘化丙啶(PI)是一种能与DNA结合的荧光染料，它不能够进入活细胞。但是能进入通透性增加的细胞或者死细胞内，与DNA分子结合，发出红色荧光。因此，可以用PI荧光强度来间接反映细胞中死细胞和活细胞的比例。发出PI荧光的细菌比例明显增加，这就说明，抗菌肽作用后的细菌通透性明显增加(图7-11)。

具体步骤如下：

1)实验中的样品准备

将细菌培养到对数增长期。室温6000×g离心5分钟，去掉上层培养基，用灭过菌的PBS(pH7.4)分别洗细菌，重复三次，最后将细菌重悬，调整菌浓度到1×10⁸个/ml，用于后续的实验。

2)菌液和蛋白溶液混合，抗菌肽的终浓度为12.5μg/ml和25μg/ml(用PBS稀释)，PBS(pH7.4)作为空白对照，ep管终体积为600μL。蛋白和菌液在37℃孵育1小时。

3)在孵育之后，向上述的蛋白细菌混合液中加入碘化丙啶(PI)荧光染料，使染料终浓度为12.5μg/ml(黑暗避光情况下)，之后把样品放在4℃孵育15分钟。

4)等染料充分进入细胞之后，用流式细胞仪检测PI的荧光值。每个样品检测10000个细胞。

5)用流式细胞仪结果分析软件对所得的数据进行分析。

本发明分别以鳗弧菌、藤黄微球菌、李斯特菌、假单胞菌、副溶血弧菌作为典型致病菌作为抗菌效果的检测，结果分别如图7-图11所示，

图7为抗菌肽1-4、L-4对鳗弧菌的膜通透性影响图谱，其中，百分比代表死细胞比例；具体地，a)为PBS对照组，鳗弧菌死细胞比例为3.45％，

b)为12.5μg/ml 1-4与鳗弧菌作用后，死细胞比例为24.97％，

c)为25μg/ml 1-4与鳗弧菌作用后，死细胞比例为50.01％，

d)为12.5μg/ml L-4与鳗弧菌作用后，死细胞比例为41.14％，

e)为25μg/ml L-4与鳗弧菌作用后，死细胞比例为87.83％。

图8为抗菌肽1-4、L-4对藤黄微球菌的膜通透性影响图谱，其中，百分比代表死细胞比例；具体地，a)为PBS对照组，藤黄微球菌死细胞比例为4.49％，

b)为12.5μg/ml 1-4与藤黄微球菌作用后，死细胞比例为73.56％，

c)为25μg/ml 1-4与藤黄微球菌作用后，死细胞比例为64.06％，

d)为12.5μg/ml L-4与藤黄微球菌作用后，死细胞比例为56.52％，

e)为25μg/ml L-4与藤黄微球菌作用后，死细胞比例为95.13％。

图9为抗菌肽1-4、L-4对李斯特菌的膜通透性影响图谱，其中，百分比代表死细胞比例；具体地，a)为PBS对照组，李斯特菌死细胞比例为2.33％，

b)为12.5μg/ml 1-4与李斯特菌作用后，死细胞比例为41.39％，

c)为25μg/ml 1-4与李斯特菌作用后，死细胞比例为66.35％，

d)为12.5μg/ml L-4与李斯特菌作用后，死细胞比例为62.60％，

e)为25μg/ml L-4与李斯特菌作用后，死细胞比例为87.51％。

图10抗菌肽1-4、L-4对假单胞菌的膜通透性影响图谱，其中，百分比代表死细胞比例；具体地，a)为PBS对照组，假单胞菌死细胞比例为12.08％，

b)为12.5μg/ml 1-4与假单胞菌作用后，死细胞比例为48.96％，

c)为25μg/ml 1-4与假单胞菌作用后，死细胞比例为67.27％，

d)为12.5μg/ml L-4与假单胞菌作用后，死细胞比例为82.49％，

e)为25μg/ml L-4与假单胞菌作用后，死细胞比例为86.56％。

图11抗菌肽1-4、L-4对副溶血弧菌的膜通透性影响图谱，其中，百分比代表死细胞比例；具体地，a)为PBS对照组，副溶血弧菌死细胞比例为10.48％，

b)为12.5μg/ml 1-4与副溶血弧菌作用后，死细胞比例为60.30％，

c)为25μg/ml 1-4与副溶血弧菌作用后，死细胞比例为77.31％，

d)为12.5μg/ml L-4与副溶血弧菌作用后，死细胞比例为59.34％，

e)为25μg/ml L-4与副溶血弧菌作用后，死细胞比例为52.96％。

如图7-11所示，与对照组a)相比，图7-11各自的b)、c)、d)和e)中发出PI荧光的细菌比例明显增加，这就说明，抗菌肽1-4和L-4作用后的细菌通透性明显增加。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种抗菌肽及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Trp Lys Lys Trp Ser Lys Arg Trp Arg His Trp Ile Pro Gln Cys Lys

1 5 10 15

Lys Phe Gly Arg Arg

20

<210> 2

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Ser Ser Leu Leu Leu Val Gly Trp Lys Lys Trp Ser Lys Arg Trp

1 5 10 15

Arg His Trp Ile Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg

20 25

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 李斯特菌(Listeria monocytogenes)

<400> 3

Ala Ser Ser Leu Leu Leu Val Gly

1 5

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 文昌鱼(Branchiostoma lanceolatum)

<400> 4

Asn Leu Cys Ala Ser Leu Arg Ala Arg His Thr Ile Pro Gln Cys Lys

1 5 10 15

Lys Phe Gly Arg Arg

20

Claims

1.一种抗菌肽，其特征在于，包含抗菌功能区段，所述抗菌功能区段的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述抗菌肽，其特征在于，还包含连接在所述抗菌功能区段C端或N端的靶向肽段。

3.如权利要求2所述抗菌肽，其特征在于，所述靶向肽段氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

4.如权利要求2所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

5.如权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗菌药物为用于治疗对抗生素具有耐药性的细菌感染的药物。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述具有耐药性的细菌为对多种抗生素具有耐药性的细菌。

8.一种用于治疗细菌感染的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽，以及药学上可接受的辅料。

9.如权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽在制备用于防治养殖动物的细菌感染的饲料添加剂中的应用；优选地，所述养殖动物为水生动物，更优选地，所述水生动物选自鱼、虾或蟹中的一种或多种。

10.一种用于防治动物细菌感染的饲料添加剂，其特征在于，包含如权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽；优选地，所述抗菌肽包覆于囊膜之中，所述囊膜能够防止所述抗菌肽被消化液消化降解并实现给药。