KR20140039157A - 항미생물성 융합 화합물 및 그의 용도 - Google Patents

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에이지. 무함마드 사가프 아부 바카르
엥 후안 웅
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발리언트 바이오파마 에스디엔 비에이치디
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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 타입 1 리보좀 불활성화 단백질, 폴리펩타이드 B; 및 바이러스 침입 억제를 할 수 있는 적어도 하나의 폴리펩타이드 A; 및/또는 적어도 하나의 양이온성 항미생물 펩타이드, 폴리펩타이드 C를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

Description

항미생물성 융합 화합물 및 그의 용도{ANTIMICROBIAL FUSION COMPOUNDS AND USES THEREOF}
본 발명은 항미생물성 융합 화합물, 특히 폴리펩타이드, 및 그의 단편, 및 미생물 감염에서 치료제로서의 그의 용도에 관한 것이다.
미생물 감염은 인간 및 동물에게 영향을 미치고, 세계적으로 높은 수준의 사망률을 야기한다. 미생물 감염제는 그에 대해 항미생물제가 종종 이용될 수 있는 원생 기생충, 박테리아 및 진균을 포함한다. 그러나, 일부의 항미생물제는 바람직하지 않은 부작용과 연관되어 있으며, 이러한 약제에 대한 미생물 저항성의 문제는 증가하고 있는 문제이기도 하다.
미생물 감염제는 또한 인간뿐만 아니라 인간의 반려동물, 및 또한 특히 인간의 식량을 위해서 사육되는 동물을 괴롭히는 다수의 광범한 감염성 질병의 원인이 되는 바이러스를 포함한다. 인간의 치료분야에서 사용되는 현재 이용가능한 항바이러스 약물의 대부분은 사실상 단일-작용성이며, 예를 들어, 바이러스의 숙주 세포 내로의 이입, 바이러스 게놈의 숙주 세포 게놈 내로의 융합 또는 통합, 감염된 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 실행할 수 있는 dsDNA 형태로의 바이러스 ssRNA의 해독 또는 역전사와 같은 단지 하나의 특정한 바이러스 경로만을 차단한다. 따라서, 바이러스가 단일-작용성 항바이러스 약물에 대한 저항성을 획득하면, 그 약물은 그의 유효성을 상실한다.
또한, 현재 예를 들어, 흰반점 증후군 바이러스 (White Spot Syndrome Virus; WSSV), 돼지 유행성 설사 바이러스 (Porcine Epidemic Diarrhoea Virus; PEDV), 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스 (Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome Virus; PRRSV) 등을 포함한 다수의 동물 바이러스에 대해서 이용할 수 있는 치료제는 없다. 이들 동물 바이러스는 새우 (prawn) 및 돼지 산업에 특히 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이들 바이러스 각각에 의해서 야기된 연간 손실은 10억 USD를 초과하는 것으로 믿어진다.
이들 바이러스 및 대부분의 다른 바이러스에 대한 효과적인 백신은 그들의 높은 돌연변이율로 인하여 개발하기가 어렵다. 또한, 하나의 지리적 스트레인에 대해서 작용하는 백신은 종종 동일한 바이러스의 다른 지리적 스트레인에 대해서는 잘 작용하지 않는다.
항바이러스 약물의 예로는 HIV-1 융합 억제제인 엔푸비르티드 (Enfuvirtide) (상품명 푸제온 (FUZEON®)으로 Roche에 의해서 판매됨)가 포함된다. 엔푸비르티드는 합성에 의해서 생산되는 변형된 단백질이며, 개인당 연간 약 USD 25,000인 것으로 보고된 고가의 치료 방법인 것으로 알려져 있다. 이것은 1일 2 회 피하 주사에 의해서 체내로 도입되기 때문에 그의 투여 방법은 또한 매우 불편하다.
항바이러스 약물의 다른 예로는 바이러스가 그의 숙주 세포와의 관계를 화학적으로 절단하는 것을 중단시킴으로써 체내의 세포들 사이에서 인플루엔자 (플루) 바이러스의 확산을 늦추는 오셀타미비르 (Oseltamivir) (또한 그의 상품명 타미플루 (TAMIFLU®)로 알려짐)가 포함된다. 타미플루 (TAMIFLU®)는 1999년 이래로 5000만 명이 넘는 사람에게서 인플루엔자 바이러스 A 및 인플루엔자 바이러스 B 감염을 치료 및 예방하기 위해서 사용되어 왔으며, 캅셀제로 또는 현탁제로 경구적으로 섭취된다. 그러나, 현재는 타미플루에 대해 저항성이 있는 다수의 인플루엔자 바이러스 A 및 인플루엔자 바이러스 B의 스트레인이 있다. 자나비르 (Zanamivir) (또한 그의 상품명 렐렌자 (RELENZA®)로도 알려짐)는 인플루엔자 바이러스 A 및 인플루엔자 바이러스 B의 치료 및 예방에 사용되는 뉴라미니다제 억제제로서 작용하는 또 다른 항바이러스 약물이다. 렐렌자 (RELENZA®)는 흡입에 의해서 투여된다. 항바이러스 약물인 타미플루 및 렐렌자는 그의 생산을 위해서 경제적으로 합성될 수 없는 원료물질 시킴산 (shikimic acid)에 따라 좌우된다는 것은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 실제로, ROCHE는 이미 항바이러스 약물 타미플루 및 렐렌자의 생산량이 시킴산의 공급에 의해서 심각하게 제한될 수 있다는 몇 개의 보도자료가 있었다.
발명의 요약
본 발명은 첨부된 특허청구범위의 독립항들에서 정의된다. 본 발명의 일부의 임의적 특징들은 첨부된 종속항들에서 정의된다.
본 발명의 한가지 관점에 따르면, 적어도 하나의 타입 1 리보좀 불활성화 단백질 또는 그의 단편, 폴리펩타이드 B; 및
(i) 바이러스 침입 억제가 가능한 적어도 하나의 폴리펩타이드 A; 및/또는
(ii) 적어도 하나의 양이온성 항미생물 펩타이드, 또는 그의 단편, 폴리펩타이드 C를 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
폴리펩타이드 A는 세타 디펜신, 그의 유사체 또는 단편일 수 있다.
특히, 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질은 경구 투여에 적합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에 따르면, 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질 또는 약제학적 조성물의 유효량을 척추동물, 무척추동물 또는 식물에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 척추동물, 무척추동물 또는 식물에서 미생물 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 특히, 미생물 감염은 바이러스 감염일 수 있다. 척추동물은 포유동물, 어류 또는 조류일 수 있다. 더 더욱 특히, 포유동물은 비-인간 동물일 수 있다.
이하의 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 구체예는 광범위한 치료법에서 최적의 유효성을 갖고/갖거나 여러가지 적용분야 중의 일부로서 단백질의 경구 송달을 허용하는 융합 단백질을 제공한다.
융합 단백질의 바람직한 구체예는 여기서 이하의 첨부된 도면을 참고 하여 예를 들어 기술될 것이다:
도 1은 RetroMAD1의 해독 지도 (translation map)이다 (서열번호 1 및 서열번호 2).
도 2는 이. 콜라이 (E. Coli) BL21(DE3) 세포에서 RetroMAD1 발현의 A) 시간 경로 발현 (Time course expression) 및 B) 용해도를 나타내는 그래프이다. pRMD를 보유하는 세포는 유도 전 (0h)에 수확하였으며, 1h, 2h 및 3h 동안의 유도 후에 펠렛 상을 나타내고, 별표 (*)로 표시한 시간은 상등액 상을 나타낸다. 단백질은 15% SDS-PAGE 상에서 분석하였다. M: 페이지룰러 단백질 래더 퍼멘타스 (PageRulerTM Protein Ladder Fermentas), U: 비유도, IND: 유도, 및 IB: 정제된 봉입체. 화살표는 이. 콜라이 생산된 RetroMAD1 (41.2 kDa)를 나타낸다.
도 3은 RetroMAD1과의 24- 및 48-시간의 인큐베이터간에 걸쳐 각각의 처리에서 감소된 바이러스 카피의 양을 나타내는 그래프이다: (A) MOI = 0.1에서의 HSV-1, (B) MOI = 0.5에서의 HSV-1.
도 4는 RetroMAD1과의 24- 및 48-시간의 인큐베이터간에 걸쳐 각각의 처리에서 감소된 바이러스 카피의 양을 나타내는 그래프이다: (A) MOI = 0.1에서의 HSV-2, (B) MOI = 0.5에서의 HSV-1.
도 5는 RetroMAD1과의 24- 및 48-시간의 인큐베이터간에 걸친 각각의 처리 중에 감소된 바이러스 카피의 양을 나타내는 그래프이다: (a) DENV1, (b) MOI 0.1에서 DENV2 및 MOI 0.5에서 DENV2, (c) DENV3 및 (d) DENV4.
도 6은 RetroMAD1과의 72 시간 인큐베이션 후에 동시에 처리된 표준 PBMC의 세포 수를 나타내는 그래프이다.
도 7은 72-시간 인큐베이션 후에 동시에 처리된 비-호지킨 림프종 PBMC의 세포 수를 나타내는 그래프이다.
도 8은 24 시간, 48 시간 및 96 시간의 종료점에서 측정된 RetroMAD1의 세포독성을 나타낸 그래프이다. 모든 값은 3 회 반복한 실험의 평균 ± 표준편차로 나타낸다. 포유동물 세포주의 최대 비-독성 용량: (A) 베로 (Vero), (B) LLC-MK2 및 (C) BHK-21 세포주는 100 ㎍/㎖였다.
도 9는 24 시간, 48 시간 및 96 시간의 종료점에서 측정된 RetroMAD1의 세포독성을 나타낸 그래프이다. 모든 값은 3 회 반복한 실험의 평균 ± 표준편차로 나타낸다. 인간 세포주의 최대 비-독성 용량: (A) RWPE-1, (B) 창 (Chang)의 간, (C) NL-20, (D) 184B5 및 (E) CCD-1127SK 세포주는 100 ㎍/㎖였다.
도 10(A)는 441 bp의 크기를 갖는 밴드가 HPV에 의해서 감염된 개개의 대조군 새우를 나타내는 겔의 사진을 나타낸다. 22/23은 HPV에 대해서 양성이었다.
도 10B는 처리된 각각의 새우 중의 단지 2/24만이 HPV에 의해서 감염된 것인 겔의 그림을 나타낸다. 개개 새우 중의 22/24는 HPV에 대해서 음성이었다.
도 11은 WSSV에 의해 실험적으로 감염된 새우의 생존의 백분율을 나타내는 그래프이며, 좌측은 대조군인 반면에 우측은 처리군이다.
도 12A 및 B는 포획 (capture) ELISA를 사용하여 고양이 혈청에서 RetroMAD1의 농도를 결정하는 표준 곡선이다.
도 13A는 포획 ELISA로부터 유도된 대조군 및 처리된 마우스의 혈청 내의 RetroMAD1의 농도를 나타내는 그래프이다.
도 13B는 도 14(A)에서 혈청 내의 RetroMAD1 농도를 유도하기 위해서 사용된 결과의 탁월한 유사성을 확인하는 삼중 데이터를 보여주는 그래프이다.
도 14는 RetroMAD1의 열안정성을 보여주는 SDS-페이지 결과이다.
도 15는 HPLC를 사용하여 (A) PBS 대조군, (B) 50 ㎍/㎖, (C) 100 ㎍/㎖, (D) 200 ㎍/㎖, (E) 400 ㎍/㎖ 및 (F) 500 ㎍/㎖의 RetroMAD1에 대한 피크를 나타내는 크로마토그램이다.
도 16은 유도 전 및 후의 AB, BA, BC 및 CB의 발현을 나타내는 겔의 사진이다. 단백질은 15% SDS-PAGE 상에서 분석하였다. M: 염색되지 않은 단백질 마커 (Fermentas).
도 17은 구조 A-B, B-A, B-C 및 C-B를 갖는 펩타이드의 단순 포진 바이러스 (Herpes Simplex Virus)-2 (HSV-2)에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 그래프이다.
도 18은 HSV-2에 대한 플라크 감소시험을 사용하여 아마틸린 (Amatilin) 약물 (실시예 19에 기술된 바와 같음)의 억제활성을 나타내는 사진이다.
도 19는 각각 실시예 17에 기술된 바와 같이 아마틸린, 카타다르신 (Catadarcin), 쿠다판 (Kudapan) 및 RetroGAD1의 처리에 의한 바이러스 DNA 감소의 백분율을 나타내는 4 개의 그래프이다.
정의
편의를 위해서, 명세서, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 특정의 용어들을 여기에 모아놓았다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "보조제 (adjuvant)"는 면역학적 보조제를 나타낸다. 이말은, 보조제는 문제의 성분에 대한 면역계의 반응을 증진시키거나 촉진시킴으로써 대상체에서 면역 반응 또는 일련의 면역 반응을 유도할 수 있는 화합물인 것을 의미한다. 보조제는 데포(dept)를 형성시킴으로써 (성분의 반감기를 연장시킴으로써) 치료학적 조성물의 효과를 촉진시키고, 추가의 T-세포 도움을 제공하고, 사이토킨 생산을 자극한다. 보조제에 의한 항원 생존의 촉진 및 비특이적 자극은 일부의 경우에, 항원 분자가 단지 약하게 항원성이거나 면역계의 화합물, 분자 또는 세포들과 단지 약 내지 중등도의 상호작용만을 나타내는 경우에 필요할 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "유사체 (analogue)"는 하나 이상의 천연적으로-존재 및/또는 비-천연적으로-존재하는 아미노산을 포함하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 변형될 수 있는 펩타이드를 나타내며, 단 펩타이드 유사체는 미생물의 성장을 감소시키거나 방지하거나, 미생물을 사멸시킬 수 있다. 예를 들어, 용어 "유사체"는 하나 이상의 보존적 아미노산 변화를 포함하는 억제성 펩타이드를 포함한다. 용어 "유사체"는 또한 예를 들어, 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는 펩타이드를 포함한다. 이러한 유사체는 예를 들어, 프로테아제 저항성의 특징을 갖는다. 유사체는 또한 하나 이상의 펩타이드 결합이 변형된 펩타이드유사체 (peptidomimetics)를 포함한다. 바람직한 유사체에는 하나 이상의 비-천연적으로-존재하는 아미노산 유사체를 포함하는, 본 발명에서 임의 구체예에 따라 기술된 바와 같은 펩타이드의 유사체가 포함된다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "항미생물 (antimicrobial)"은 본 발명의 펩타이드 또는 그의 유사체 또는 유도체의 생물학적 활성을 나타내며, 본 발명의 단백질이 사멸시키거나, 생식을 붕괴시키거나, 다른 방식으로 미생물 성장을 무능하게 하는 능력을 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 또는 그의 유사체 또는 유도체는 미생물을 사멸시킬 수 있고/있거나 미생물의 성장을 감소시키거나 방지할 수 있으며, 즉 펩타이드는 살미생물 활성 및/또는 미생물성장정지 활성을 갖는다. 펩타이드는 미생물 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 임의 구체예에 따른 융합 단백질을 포함한 약물, 화합물 또는 분자일 수 있다. 펩타이드 또는 그의 유사체 또는 유도체의 항미생물 활성을 측정하는 방법은 당업자에게 자명하며/하거나 본 명세서에 기술될 것이다. 예를 들어, 펩타이드 또는 유사체 또는 유도체는 이전에 미생물이 성장한 기질에 적용되고, 적합한 기간 후에 미생물의 성장 억제 및/또는 세포 사멸의 수준을 측정한다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "포함하는 (comprising)"은 다양한 구성요소, 성분 또는 단계들이 본 발명을 실시하는데 공동으로 사용될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 용어 "포함하는"은 더 제한적인 용어 "~로 본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "~로 구성되는"을 포함한다. 용어 "~로 본질적으로 구성되는"의 경우에, 본 발명의 에피토프/항원은 "실질적으로" "필수" 요소로서 지시된 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 추가의 서열은 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 포함될 수 있다. 따라서, 서열 X로 "본질적으로 구성되는" 폴리펩타이드는 우연하게 서열 X를 포함하는 공지의 폴리펩타이드를 고려하여 신규한 것일 수 있다. 용어 "~로 구성되는"의 경우에, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 항원은 지시된 서열 중의 적어도 하나 (예를 들어, 서열 번호로 지시된 특정의 서열 또는 그의 상동성 서열 또는 단편)에 상응하는 것으로 이해된다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "유도체"는 예를 들어, 언급된 펩타이드의 단편 또는 가공된 형태, 언급된 펩타이드에 비해서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함하는 변이체 또는 돌연변이체, 언급된 펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 또는 언급된 펩타이드에 비해서 하나 이상의 추가의 비-펩타이드 성분, 예를 들어, 화학적 성분, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하는 펩타이드를 포함한다. 용어 "유도체"는 또한 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 예를 들어, 에피토프, 예를 들어, FLAG 에피토프 또는 V5 에피토프 또는 HA 에피토프와 같은 표지를 포함한다. 예를 들어, 에피토프는 FLAG 에피토프이다. 이러한 태그 (tag)는 예를 들어, 폴리펩타이드를 정제하는데 유용하다. 본 발명의 항미생물성 융합 단백질의 바람직한 유도체는 증진된 안정성을 갖는다. 예를 들어, 융합 단백질이 투여되는 대상체에서 활성인 프로테아제의 분해 부위를 돌연변이시키고/시키거나 결실시켜 본 발명의 항미생물성 융합 단백질의 안정한 유도체를 생산한다. 용어 "유도체"는 또한 예를 들어, 아미노산 이외의 다른 하나 이상의 화학적 부분을 함유하도록 변형된 펩타이드와 같은 유도체화된 펩타이드를 포함한다. 화학적 부분은 예를 들어, 아미노 말단 아미노산 잔기, 카복시 말단 아미노산 잔기를 통해서, 또는 내부 아미노산 잔기에서 펩타이드에 공유적으로 결합될 수 있다. 이러한 변형은 펩타이드 내의 반응성 부분에 대한 보호적 또는 캡핑 (capping) 그룹의 첨가, 검출가능한 표지의 첨가, 및 펩타이드 화합물의 활성을 불리하게 파괴시키지 않는 그 밖의 다른 변화를 포함한다.
따라서, 허용되는 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기준으로 한다. 전술한 특징 중의 몇 가지를 고려한 예시적인 치환은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다. 본 발명의 분리된 펩타이드는 폴리펩타이드의 서열을 제조하는 전형적인 화학적 합성방법을 포함하는 본 기술분야에서 공지된 다수의 적합한 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "단편(fragment)"은 서열에 단백질의 특징 및 기능을 부여하는 활성 부위(들)를 포함하는, 본 발명의 모든 관점에 따른 융합 단백질의 전체 서열의 불완전하거나 분리된 부분을 나타낸다. 특히, 이것은 적어도 하나의 아미노산만큼 더 짧을 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 융합 단백질의 단편은 단백질이 미생물을 인식할 수 있도록 하는 활성 부위(들)를 포함한다. 단편은 길이가 적어도 10 아미노산일 수 있다. 예를 들어, RIP의 비-제한적 단편은 적어도, 크기가 대략 5 kDa일 수 있는 RIP의 코어 또는 생물활성 부위를 포함할 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "융합 단백질(들)"은 원래는 별개의 단백질에 대해서 암호화한 2 개 또는 그 이상의 유전자의 접합을 통해서 생성된 단백질을 나타낸다. 이 융합 유전자의 해독은 원래의 단백질 각각으로부터 유도된 기능적 특성을 갖는 단일 폴리펩타이드를 제공한다. 재조합 융합 단백질은 생물학적 연구 또는 치료법에서 사용하기 위한 재조합 DNA 기술에 의해서 인공적으로 생성된다. 예를 들어, 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질은 타입 1 RIP, 폴리펩타이드 B; 및 바이러스 침입 억제가 가능한 폴리펩타이드 A 및/또는 CAP, 폴리펩타이드 C를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 구조는 A-B-C, A-C-B, C-A-B, C-B-A, B-A-C, B-C-A, A-B-C-C, A-B, B-C, B-C-C 또는 C-C-B-C-C일 수 있다. 특히, 융합 단백질은 다이머 (dimers) 및/또는 탄뎀 (tandem) 반복체를 포함할 수 있다. 더욱 특히, 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질의 구조는 상기 언급된 구조의 반복체일 수 있다. 예를 들어, 구조는 A-A-B-C-C, C-C-B-C-C, A-A-B-A-A 등일 수 있다. 각각의 융합 단백질에서 폴리펩타이드 A, B 또는 C는 동일한 단백질일 수 있거나, 반복된 경우에 상이한 단백질일 수 있다. 폴리펩타이드 A는 세타 디펜신, 그의 유사체 또는 단편일 수 있다. 본 발명에 따른 융합 단백질은 서열번호 1의 서열, 그의 변이체, 유도체 또는 단편을 포함할 수 있다. 용어 "RetroMAD1"은 본 발명에서 구조 A-B-C를 갖고 아미노산 서열 서열번호 1을 갖는 융합 단백질을 나타내기 위해서 사용된다. 특히, RetroMAD1에서 폴리펩타이드 A는 레트로사이클린 (Retrocyclin) 101일 수 있고, 폴리펩타이드 B는 MAP30일 수 있으며, 폴리펩타이드 C는 더마셉틴 (Dermaseptin) 1일 수 있다. 이들 펩타이드는 서로에 대해 직접적으로 융합될 수 있거나, 링커 펩타이드에 의해서 서로에 대해 연결될 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "링커 펩타이드"는 본 명세서에서 용어 "링커"와 상호교환하여 사용된다. 링커 펩타이드는 2 개 또는 그 이상의 분자 또는 펩타이드를 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결시킴으로써 링커 펩타이드를 포함하는 모든 분자 또는 펩타이드로 구성된 더 큰 복합체를 생성시키는 펩타이드이다. 링커 펩타이드의 비-제한적 예는 서열번호 11일 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "미생물 감염 (microbial infection)"은 다른 유기체 내에서 또는 유기체 상에서의 미생물의 침입, 성장 및/또는 증식을 나타낸다. 미생물 감염은 유기체의 특정한 부분에 국소화되거나 전신적일 수 있다. 본 발명의 융합 펩타이드, 유사체 및/또는 유도체가 그의 치료에 유용한 감염에는 모든 미생물, 예를 들어, 박테리아, 진균, 효모, 원생동물 및 바이러스 (단, 이들로 제한되지 않는다)에 의해서 야기되는 포유동물, 무척추동물, 척추동물 및/또는 식물에 영향을 미치는 모든 감염이 포함된다. 당업자는 무엇이 미생물 감염으로 고려되는지를 이해할 것이다. 특히, 본 발명의 융합 단백질 또는 유사체 또는 유도체 또는 제제는 바이러스에 의한 감염을 치료하는데 유용하다. 바이러스의 예로는 홍역 바이러스, 단순 포진 바이러스 (HSV-1 및 -2), 헤르페스 과의 구성원 (HIV, C형 간염, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 비스나 (visna) 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 등이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "미생물"은 모든 현미경적 유기체 또는 미생물을 포함한다. 예를 들어, 제한적인 것은 아니지만 미생물에는 박테리아, 고세균 (archaebacterium), 바이러스, 효모, 진균 또는 원생생물이 포함된다. 특히, 미생물은 바이러스이다. 바이러스에는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 폐렴, 장염 및 망막염; 엡스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스 (EBV) 림프증식성 질환; 수두/대상포진 (바리셀라 주스터 (varicella zoster) 바이러스 (VZV)에 의해서 야기됨); HSV-1 및 -2 점막염; HSV-6 뇌염, BK-바이러스 출혈성 방광염; 바이러스성 인플루엔자; 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)로 인한 폐렴; AIDS (HIV에 의해서 야기됨); 및 A, B 또는 C형 간염이 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 바이러스의 추가의 예로는 레트로비리다에 (Retroviridae); 피코르나비리다에 (Picornaviridae) (예를 들어, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕사키 (coxsackie) 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시비리다에 (Calciviridae) (예를 들어, 위장염을 야기하는 스트레인); 토가비리다에 (Togaviridae) (예를 들어, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스); 플라비리다에 (Flaviridae) (예를 들어, 뎅기열 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열병 바이러스); 코로나비리다에 (Coronaviridae) (예를 들어, 코로나바이러스); 라브도비리다에 (Rhabdoviridae) (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로비리다에 (Filoviridae) (예를 들어, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae) (예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스); 오르토믹소비리다에 (Orthomyxoviridae) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스); 분가비리다에 (Bungaviridae) (예를 들어, 한탄 (Hantaan) 바이러스, 분가 바이러스, 플레보바이러스 (phleboviruses) 및 나이로 (Nairo) 바이러스); 아레나비리다에 (Arenaviridae) (출혈열 바이러스); 레오비리다에 (Reoviridae) (예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스 (orbiviurses) 및 로타바이러스 (rotaviruses)); 비르나비리다에 (Birnaviridae); 헤파드나비리다에 (Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스); 파르보비리다에 (Parvoviridae) (파르보바이러스); 파포바비리다에 (Papovaviridae) (유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리다에 (Adenoviridae) (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리다에 (Herpesviridae) (단순 포진 바이러스 (HSV) 1 및 HSV-2, 바리셀라 주스터 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 헤르페스 바이러스); 폭스비리다에 (Poxviridae) (바리올라 바이러스, 백시니아 바이러스, 수두 바이러스); 및 이리도비리다에 (Iridoviridae) (예를 들어, 아프리카 돼지열병 바이러스); 및 미분류된 바이러스 (예를 들어, 해면형 뇌병의 병인제, 델타 간염의 작용제 (B형 간염 바이러스의 결함성 위성 (defective satellite)인 것으로 생각됨), 비-A형, 비-B형 간염의 작용제 (클래스 l = 내부적으로 전파됨; 클래스 2 = 비경구적으로 전파됨 (즉, C형 간염); 노르워크 (Norwalk) 및 관련된 바이러스, 및 아스트로 바이러스)가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
예를 들어, 바이러스는 WSSV, HPV, MBV, IHHNV, YHV, TSV, GAV, LSNV, IMNV, MoV, KHV1, KHV2, KHV3, VNN과 같은 크루스타시안 (Crustacean) 바이러스와 같이 (단, 이들로 제한되지 않는다) 수경재배에 대해서 특이적일 수 있다. 수경재배에 대해서 특이적인 바이러스에는 비르나비리다에, 헤르페스비리다에, 이리도비리다에, 레트로비리다에 또는 라브도비리다에의 과 중의 어느 하나로부터의 어류 바이러스가 포함될 수 있다. 특히, 어류 바이러스는 비르나비리다에 과로부터의 췌장 괴사 바이러스 (IPNV), 헤르페스비리다에 과로부터의 채널 캣피쉬 바이러스 (channel catfish virus; CCV), 이리도비리다에 과로부터의 어류 림포시스티스병 (fish lymphocystis disease) 바이러스 (FLDV), 조혈성 괴사 바이러스 (IHNV) 및 라브도비리다에 과에 속하는 바이러스성 출혈 패혈증 바이러스 (VHSV) 등일 수 있다. 아발론 (Abalone) 바이러스는 AVG, AMAV 등을 포함한다.
예를 들어, 바이러스는 조류 수두, 뉴캐슬병 (Newcastle disease), 전염성 기관지염, 메추라기 기관지염, 마릭병 (Marek's Disease) (내장 백혈병 (Visceral Leucosis)), 림프구성 백혈병, 전염성 F낭병 (Infectious Bursal Disease), 조류 인플루엔자, 유행성 진전증 등을 야기하는 바이러스와 같이 (단, 이들로 제한되지 않는다) 가금류에 대해서 특이적일 수 있다.
예를 들어, 바이러스는 돼지 간염 E 바이러스, 시르코바이러스 (Circoviruses), 헤르페스바이러스 등과 같이 (단, 이들로 제한되지 않는다) 돼지에 대해서 특이적일 수 있다. 특히, 바이러스는 돼지 사이토메갈로바이러스, 위광견병 바이러스일 수 있다.
고양이에게서 중요한 바이러스에는 고양이 범백혈구감소증 바이러스 (Feline Panleukopenia virus; FPV), 고양이 헤르페스바이러스, 고양이 칼시바이러스, 고양이 백혈병 바이러스 (FeLV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV) 등이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 바이러스는 개에 대해서 특이적일 수 있으며, 이들에는 광견병 바이러스, 개 파르보바이러스, 개 코로나바이러스, 개 홍역 바이러스, 개 인플루엔자, 개 간염 바이러스, 개 헤르페스바이러스, 위광견병을 야기하는 바이러스, 개 미뉴트 바이러스 (canine minute virus) 등이 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 길고 연속적이며 비분지된 펩타이드를 나타낼 수 있으며, 사이클릭 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 단백질은 생물학적으로 활성인 방식으로 배열된 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성되며, 종종 보조인자 또는 다른 단백질에 결합될 수 있다. 특히, 본 발명의 임의 관점에 따른 단백질은 천연적으로 존재하고, 새로운 것이며/거나 합성적일 수 있다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "대상체"는 미생물에 의해서 감염될 수 있는 인간, 비-인간 동물, 식물 또는 곤충을 포함한 모든 동물을 나타낸다. 특히, 대상체는 본 발명의 융합 단백질 또는 유사체 또는 유도체가 활성을 나타내는 미생물에 의해서 감염될 수 있는 인간, 식물 또는 곤충을 포함한 모든 동물이다.
본 발명과 관련하여 사용된 것으로서 용어 "치료"는 예방적, 개선적, 치료학적 또는 치유적 치료를 나타낸다.
본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "변이체"는 이것이 유도되는 모 폴리펩타이드에 대한 특정한 정도의 서열 동일성에 의해서 대안적으로 또는 추가로 특정화될 수 있다. 더욱 정확하게, 본 발명과 관련한 변이체는 적어도 30% 서열 동일성, 특히 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 나타낸다. 더욱 특히, 본 발명과 관련한 변이체는 그의 모 폴리펩타이드에 대해서 적어도 95% 서열 동일성을 나타낸다. 본 발명의 변이체는 지시된 서열 동일성을 나타내며, 바람직하게는 서열 동일성은 100, 150, 200, 300, 315, 320, 330, 340, 344 또는 그 이상의 아미노산의 연속 스트레치 (continuous stretch)에 걸친 것이다. 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열의 유사성, 즉 서열 동일성의 백분율은 서열 정렬을 통해서 결정될 수 있다. 이러한 정렬은 몇 가지의 본 기술분야에서 알려진 알고리즘에 의해서, 바람직하게는 칼린 (Karlin)과 알츠슐 (Altschul)의 수학적 알고리즘 [Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877]에 의해서, hmmalign (HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/)에 의해서, 또는 예를 들어, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ 상에서 이용할 수 있는 CLUSTAL에 의해서 수행될 수 있다. 사용된 바람직한 매개변수는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html 상에서 설정된 디폴트 (default) 매개변수이다. 서열 동일성 (서열 매칭 (matching))의 등급은 예를 들어, BLAST, BLAT 또는 BlastZ (또는 BlastX)를 사용하여 계산될 수 있다. 바람직하게는, 서열 매칭 분석은 셔플-라간 (Shuffle-LAGAN) [Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1 :154-162] 또는 마르코브 랜덤 필드 (Markov random fields)와 같은 정립된 상동성 매핑 (mapping) 기술에 의해서 보충될 수 있다. 서열 동일성의 백분율이 본 출원에서 언급되는 경우에, 이들 백분율은 구체적으로 다른 식으로 지시되지 않는 한, 더 긴 서열의 전체 길이에 관하여 계산된다.
본 기술분야에서 숙련된 기술자는 본 발명이 본 명세서에 제시된 방법에 따라 과도한 실험이 없이 실시될 수 있음을 인식할 것이다. 본 방법, 기술 및 화학물질은 제시된 문헌에 기술된 바와 같거나, 표준 생명공학 및 분자 생물학 교과서에 있는 프로토콜로부터 유래한다.
본 발명의 한가지 관점에서는 타입 1 RIP 또는 그의 단편, 폴리펩타이드 B; 및
(i) 바이러스 침입 억제가 가능한 적어도 하나의 폴리펩타이드 A; 및/또는
(ii) 적어도 하나의 CAP 또는 그의 단편, 폴리펩타이드 C를 포함하는 적어도 하나의 융합 단백질이 제공된다.
첫 번째 관점에 따른 융합 단백질은 또한, 변이체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 용어 "변이체" 및 "유도체"는 상기에서 정의된다. 폴리펩타이드 A는 세타 디펜신, 그의 유사체 또는 단편일 수 있다.
양이온성 항미생물 펩타이드 (CAP)는 바이러스 융합 억제, 바이러스 유전자 억제, 바이러스 막 붕괴 및/또는 바이러스 침입 억제에서 역할을 할 수 있는 항-바이러스 CAP일 수 있다. CAP는 길이가 최대 100 아미노산일 수 있다. CAP는 대부분 동물 기원일 수 있다. 그러나, 또한 식물로부터 유래하며, 사이클로타이드를 포함하는 (단, 이들로 제한되지 않는다) CAP가 있을 수도 있다. 예를 들어, 융합 억제제로 작용할 수 있는 박테리아 CAP에는 시아마이신 (Siamycin), NP-06 및 그라미시딘 (Gramicidin) A가 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 융합 억제제로 작용할 수 있는 식물 CAP에는 서큘린 (Circulin) A, B, 칼라타 (Kalata) B1 및 B8이 포함될 수 있고; 이입 억제제로 작용할 수 있는 식물 CAP에는 칼라타 B8이 포함될 수 있으며; 바이러스 유전자 억제제로 작용할 수 있는 식물 CAP에는 징크빌로빈 (Ginkbilobin), 알파-바스루빈 (Alpha-Basrubin), 루나투신 (Lunatusin) 및 세스퀸 (Sesquin)이 포함될 수 있다. 바이러스 막 붕괴제 (disruptor)로 작용할 수 있는 식물 CAP에는 서큘린 A, C 및 D, 트리사이클론 (Tricyclon) A 및 사이클로비올라신 (Cycloviolacin) H4가 포함될 수 있다. 융합 억제제로 작용할 수 있는 동물 CAP에는 폴리페뮤신 (Polyphemusin) I 및 II, hfl-B5, 프로테그린 (Protegrin) (돼지 카텔리시딘), 랫트 디펜신 NP1, NP2, NP3 및 NP4, 인간 β-디펜신 I 및 II, 템포린 (Temporin) A, 템포린-LTc, 템포린-Pta, 카에린 (Caerin) 1.1, 라나투에린 (Ranatuerin) 6 및 9, 파충류 디펜신 및 피스시딘 (Piscidin) 1 및 2가 포함될 수 있고; 이입 억제제로 작용할 수 있는 동물 CAP에는 락토페리신 (Lactoferricin) B, 토끼 호중구-1 코르티코스타틴 III a, 토끼 호중구-3A, 토끼 α-디펜신, 레트로사이클린 (Retrocyclin)-1, 레트로사이클린-2, 레트로사이클린-3, 인간 α-디펜신 HNP-1, 2, 3,4, 5 및 6, 인간 β-디펜신 III (HBD3), 레수스 (Rhesus) 미니디펜신 (RTD-1,θ-디펜신), RTD-2 레수스 θ-디펜신, RTD-3 레수스 θ-디펜신, 인간 호중구 펩타이드-2, 인간 호중구 펩타이드-3 및 인간 호중구 펩타이드-4가 포함되며; 바이러스 유전자 억제제로 작용할 수 있는 동물 CAP는 세크로핀 (Cecropin) A, 멜리틴 (Melittin), EP5-1, 마가이닌 (Magainin) 2, 헵시딘 (hepcidin) TH1-5, 및 에피네시딘 (Epinecidin)-1이고; 바이러스 막 붕괴제로 작용할 수 있는 동물 CAP에는 인돌리시딘 (Indolicidin), 카텔리시딘 (Cathelicidin)-4, 인간 호중구 펩타이드-1, LL-37 카텔리시딘, 더마셉틴 (Dermaseptin)-S1, S4 및 S9, 맥시민 (Maximin) 1, 3, 4 및 5, 브레비닌 (Brevinin) 1, 라나투에린 (Ranatuerin) 2P, 6 및 9, 에스큘렌틴 (Esculentin) 2P, 에스큘렌틴-1 Arb, 카에린 1.1, 1.9 및 4.1, 브레비닌-2-관련, 마스큘라틴 (Maculatin) 1.3, 맥시민 H5 및 피스시딘 (Piscidin) 1 및 2가 포함될 수 있다. 그 밖의 다른 CAP에는 문드티신 (Mundticin) KS 엔테로신 (Enterocin) CRL-35, 루나투신 (Lunatusin), FK-13 (GI-20은 유도체임), 타키플레신 (Tachyplesin) I, 알파-MSH, 항바이러스 단백질 Y3, 피스시딘 3, 팔루스트린 (Palustrin)-3AR, 포네리신 (Ponericin) L2, 스피니게린 (Spinigerin), 멜렉틴 (Melectin), 클라바닌 (Clavanin) B, 소 텔리시딘 BMAP-27, BMAP-28, 기니아피그 카텔리시딘 CAP11, 사카신 (Sakacin) 5X, 플렉타신 (Plectasin), 진균 디펜신, GLK-19, 락토페린 (lactoferrin) (Lf) 펩타이드 2, 칼라타 B8, 트리사이클론 A, 알로페론 (Alloferon) 1, 우페린 (Uperin) 3.6, 달레인 (Dahlein) 5.6, 아스카핀 (Ascaphin)-8, 인간 히스타틴 (Histatin) 5, 기니아피그 호중구 CAP2 및 CAP1, 마이틸린 (Mytilin) B 및 C, EP5-1, 및 헥사펩타이드 (합성) 코르티코스타틴 IV 토끼 호중구 2가 포함될 수 있다.
타입 1 RIP는
(i) 진핵성 리보좀 내의 28S-rRNA의 보편적으로 보존된 사르신/리신 영역 (S/R 영역)의 위치 4324에서 아데노신의 N-C 글리코시드 결합을 가수분해시키는 RNA N-글리코시다제로 작용하며, 이것이 단백질 합성을 수행할 수 없게 만듦으로써 기능적으로 해독을 차단할 수 있고,
(ii) 그들의 폴리뉴클레오타이드, 즉 아데노신 글리코시다제 활성에 의해서 바이러스 입자 또는 바이러스 핵산에 직접 작용할 수 있고/있거나,
(iii) HIV-1 슈퍼코일드 (supercoiled) DNA를 비가역적으로 이완시킬 수 있고, 이중-스트랜드 파괴를 촉진시켜 불활성 생성물을 형성시킬 수 있는 DNA 글리코실라제/아퓨린 (AP) 리아제로 작용할 수 있다.
특히, 타입 1 RIP는 α-에불리틴 (Ebulitin), β-에불리틴, γ-에불리틴, 니그리틴 (Nigritin) f1, 니그리틴 f2, 아마란딘 (Amarandin)-S, 아마란투스 (Amaranthus) 항바이러스제/RIP, 아마란딘-1, 아마란딘-2, 아마란틴 (Amaranthin), 아트리플렉스 파텐스 (Atriplex patens) RIP, 베타 불가리스 (Beta vulgaris) RIP, β-불긴 (vulgin), 셀로시아 크리스타타 (Celosia cristata) RIP, 케노포듐 알붐 (Chenopodium album) RIP, CAP30B, 스피나세아 올레라세아 (Spinacea oleracea) RIP, 퀸퀘긴신 (Quinqueginsin), 아스파린 (Asparin) 1, 아스파린 2, 아그로스틴 (Agrostin), 디안틴 (Dianthin) 29, DAP-30, DAP-32, 디안틴 30, 디안투스 키넨시스 (Dianthus chinensis) RIP1, 디안투스 키넨시스 RIP2, 디안투스 키넨시스 RIP3, 라이크닌 (Lychnin), 페트로글라우신 (Petroglaucin), 페트로그란딘 (Petrograndin), 사포나리아 오시모이데스 (Saponaria ocymoides) RIP, 바큐올라스 사포린 (Vacuolas saporin), 사포린-1, 사포린-2, 사포린-3, 사포린-5, 사포린-6, 사포린-7, 사포린-9, 바카리아 히스파니카 (Vaccaria hispanica) RIP, 베닌카신 (Benincasin), α-베닌카신, β-베닌카신, 히스핀 (Hispin), 바이로딘 (Byrodin) I, 바이로딘 II, 콜로신 (Colocin) I, 콜로신 2, 쿠쿠미스 피가레이 (Cucumis figarei) RIP, 멜로닌 (Melonin), 시. 모스카타 (C. moschata) RIP, 쿠쿠르모신 (Cucurmosin), 모스카틴 (Moschatin), 모스카틴 I, 모스카틴 II, 모스카틴 III, 모스카틴 IV, 모스카틴 V, 페포신 (Pepocin), 지노스테민 (Gynostemmin) I, 지노스테민 II, 지노스테민 III, 지노스테민 IV, 지노스테민 V, 지노스테마 펜타필룸 (Gynostemma pentaphyllum) RIP, 집소필린 (Gypsophilin), 라게닌 (Lagenin), 루파쿨린 (Luffaculin), 루판굴린 (Luffangulin), 루핀 (Luffin)-알파, 루핀-B, MOR-I, MOR-II, 모모르딘 (Momordin) II, 알파-모모르카린 (momorcharin), β-모모르카린, γδ-모모르카린, γ-모모르카린, 모모르코킨 (Momorcochin), 모모르코킨-S, 세키우민 (Sechiumin), 모모르그로스빈 (Momorgrosvin), 트리코안구인 (Trichoanguin), α-키릴로윈 (kirilowin), β-키릴로윈, α-트리코산틴, TAP-29, 트리코키린 (Trichokirin), 트리코미슬린 (Trichomislin), 트리코산틴, 카라수린 (Karasurin)-A, 카라수린-B, 트리코마글린 (Trichomaglin), 트리코바킨 (Trichobakin), 크로틴 (Crotin) 2, 크로틴 3, 유세라틴 (Euserratin) 1, 유세라틴 2, 항바이러스성 단백질 GAP-31, 겔로닌 (Gelonin), 휴라 크레피탄스 (Hura crepitans) RIP, 쿠르신 (Curcin), 자트로파 쿠르카스 (Jathropa curcas) RIP, 마팔민 (Mapalmin), 마누틴 (Manutin) 1, 마누틴 2, α-피사빈 (pisavin), 카리브딘 (Charibdin), 히아신투스 오리엔탈리스 (Hyacinthus orientalis) RIP, 무사르민 (Musarmin) 1, 무사르민 2, 무사르민 3, 무사르민 4, 이리스 홀란디카 (Iris hollandica) RIP, 클레로엔드럼 아큘레아툼 (Cleroendrum aculeatum) RIP, CIP-29, CIP-34, 크립 (Crip)-31, 보우가닌 (Bouganin), 보우가인빌라 스펙트빌리스 (Bougainvilla spectbilis) RIP, 보우가인빌레아 x 부티아나 (Bougainvillea x buttiana) 항바이러스성 단백질 1 (BBAP1), 말릭 효소 1 (ME1), ME2, MAP-S, 포크위드 (pokeweed) 항바이러스성 단백질 (PAPa-1), PAPa-2, PAP-alpha, PAP-I, PAP-II, PAP-S, PD-SI, DP-S2, 도데칸드린 (Dodecandrin), 항바이러스성 단백질 PAP, PIP, PIP2, 파이토라카 옥탄드라 (Phytolacca octandra) 항바이러스성 단백질, 파이토라카 옥탄드라 항바이러스성 단백질 II, 호르데움 불가레 (Hordeum vulgare) RIP-I, 호르데움 불가레 RIP-II, 호르데움 불가레 아종 불가레 해독 억제제 II, 세케일 세레알레 (Secale cereale) RIP, 트리틴 (Tritin), 제아 디플로페레미스 (Zea diploperemis) RIP-I, 제아 디플로페레미스 RIP-II, 마루스 x 도메스티카 (Malus x domestica) RIP, 모모르디카 (Momordica) 항-HIV 단백질 (MAP30), 젤로늄 멀티플로룸 (Gelonium multiflorum) (GAP31), 포크위드 항바이러스성 단백질 (PAP), 미라빌리스 엑스판사 (Mirabilis expansa) 1 (ME1), 말릭 효소 2 (ME2), 보우가인빌레아 x 부티아나 (Bougainvillea x buttiana) 항바이러스성 단백질 1 (BBAP1), 파지 MU1, 베타불긴 (betavulgin) (Bvg), 쿠르신 2, 사포린 6, 옥수수 RIP (B-32), 담배 RIP (TRIP), 비틴 (beetin) (BE), BE27, 미라빌리스 (Mirabilis) 항바이러스성 단백질 (MAP), 트리코산틴 (TCS), α-루핀, α-모모르카린 (α-MMC), β-MMC 루핀, 오시모이딘 (Ocymoidin), 브리오딘 (Bryodin), 페폽신 (Pepopsin), β-트리코산틴, 캄포린 (Camphorin), YLP, 인슐라린 (Insularin), 보리 RIP, 트리틴스 (Tritins), 람자린 (Lamjarin), 및 볼바리엘라 볼바세아 (Volvariella volvacea) RIP로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 임의 관점에 따르 융합 단백질은 적용의 광범위 스펙트럼을 가질 수 있고, 본 기술분야에서 공지된 특정의 항미생물성 화합물과는 달리 원료물질 공급에 어떠한 제한도 없이 경제적으로 생산될 수 있는 항미생물성 화합물일 수 있다. 따라서, 본 발명의 모든 관점에 따른 융합 단백질은 원료물질 공급의 어떤 제한도 없이 대규모로 경제적으로 생산될 수 있다.
광범위-스펙트럼 활성을 달성하기 위해서, 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 펩타이드는 다수의 상이한 경로로, 즉 바이러스 침입 억제, 바이러스 융합 억제, 바이러스 인테그라제 억제 및 바이러스 해독 억제로 바이러스 감염 및 번식 과정을 저해할 수 있다. 따라서, 융합 펩타이드는 다기능성 능력을 가질 수 있다. 따라서, 항바이러스성 약물의 전체적인 새로운 클래스가 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질로부터 생산될 수 있다. 융합 항바이러스성 단백질로서 발현된 포스포릴화 A, B 및 C로부터 수득될 수 있는 조합 및 순열의 수는 잠재적으로 수만에 달한다.
특히, 융합 단백질은 화학식 I-XIII로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화학식을 포함할 수 있다:
[화학식 I]
A-B-C
[화학식 II]
A-B-C-C
[화학식 III]
A-B
[화학식 IV]
A-C-B
[화학식 V]
C-A-B
[화학식 VI]
C-B-A
[화학식 VII]
C-B
[화학식 VIII]
B-A-C
[화학식 IX]
B-A-C-C
[화학식 X]
B-C-A
[화학식 XI]
B-A-C
[화학식 XII]
B-C
[화학식 XIII]
B-A
[화학식 XIV]
C-C-B-C-C
[화학식 XV]
C-B-C
여기에서 폴리펩타이드 A는 세타 디펜신, 그의 유사체 또는 단편일 수 있으며, 폴리펩타이드 B는 타입 1 RIP, 또는 그의 단편일 수 있고, 폴리펩타이드 C는 CAP, 또는 그의 단편일 수 있으며; -는 직접 결합 또는 링커 펩타이드일 수 있다.
특히, 링커 펩타이드는 폴리펩타이드 서열 [VPXVG]n (서열번호 11)을 포함할 수 있고, 여기에서 X는 미지의 또는 그 밖의 다른 아미노산이고, n은 각각의 링커 펩타이드 내의 서열번호 11의 반복의 수이다. 예를 들어, n은 1, 2, 3, 4 또는 5일 수 있다. 더욱 특히, 서열번호 11 내의 X는 G이고, n은 2이다.
특히, 융합 단백질은 화학식 I, 즉 A-B-C-를 포함할 수 있고, 여기에서 폴리펩타이드 A는 세타 디펜신, 그의 유사체 또는 단편이며, 폴리펩타이드 B는 타입 1 RIP, 또는 그의 단편이고, 폴리펩타이드 C는 CAP, 또는 그의 단편이며, -는 직접 결합 또는 링커 펩타이드일 수 있다.
더욱 특히, 폴리펩타이드 A는 서열번호 11의 적어도 하나의 제1 링커 펩타이드를 통해서 폴리펩타이드 B에 융합될 수 있다. 더 더욱 특히, 폴리펩타이드 A는 서열번호 11 (여기에서 X는 G이고, n은 2임)의 펩타이드를 통해서 폴리펩타이드 B에 융합될 수 있다. 폴리펩타이드 B는 중간에 링커 펩타이드가 없이 직접적으로 폴리펩타이드 C에 결합될 수 있다. 화학식 I에서 폴리펩타이드 C는 B에 결합되지 않은 자유 말단 상에 제2 링커 펩타이드를 포함할 수 있다. 제2 링커 펩타이드는 서열번호 11의 화학식을 포함할 수 있다. 더 더욱 특히, 제2 링커 펩타이드에서 X는 G이고, n은 2이다.
폴리펩타이드 A는 척추동물 또는 무척추동물 기원의 세타 디펜신일 수 있다. 특히, 세타 디펜신은 박테리아, 진균, 포유동물, 양서류 또는 파충류로부터 유래할 수 있다. 포유동물은 비-인간 영장류일 수 있고/있거나, 무척추동물은 투구게 (horseshoe crab) 및/또는 곤충일 수 있다. 세타 디펜신은 각각 서열 번호 15-20의 마카카 물라타 (Macaca mulatta)로부터 유래하는 레수스 미니디펜신 (RTD-1), RTD-2, RTD-3, 레트로사이클린-1, 레트로사이클린-2, 레트로사이클린-3 등으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다 [Tang YQ, 1999; Leonava L, 2001; Wang W, 2004].
세타 디펜신은 합성물일 수 있으며, 각각 서열번호 21-33의 레트로사이클린 동족체 (congener) RC100-RC108 및 RC110-RC114의 그룹으로부터 선택될 수 있다 [Cole et. al. 2002: PNAS, V99(4):1813-1818; Wang et. al. 2003: J.Immunol. 170:4708-4716]. 레트로사이클린 (RC) 100-108 및 RC110-RC114의 서열은 이하의 표 1a에 나타낸다.
Figure pct00001
[표 1a] 천연적으로-존재 및 합성 세타 디펜신 단백질의 폴리펩타이드 서열
폴리펩타이드 B는 에불리틴, 니그리틴, 아마란딘, 아마란투스 항바이러스제/RIP, 아마란틴, 아트리플렉스 파텐스 RIP, 베타 불가리스 RIP, β-불긴, 셀로시아 크리스타타 RIP, 케노포듐 알붐 RIP, CAP30B, 스피나세아 올레라세아 RIP, 퀸퀘긴신, 아스파린, 아그로스틴, 디안틴, DAPs, 디안투스 키넨시스, 라이크닌, 페트로글라우신, 페트로그란딘, 사포나리아 오시모이데스 RIP, 바큐올라스 사포린, 사포린, 바카리아 히스파니카 RIP, 베닌카신, 히스핀, 바이로딘, 콜로신, 쿠쿠미스 피가레이 RIP, 멜로닌, 시. 모스카타 RIP, 쿠쿠르모신, 모스카틴, 페포신, 지노스테민, 지노스테마 펜타필룸 RIP, 집소필린, 라게닌, 루파쿨린, 루판굴린, 루핀, MORs, 모모르딘 II, 모모르카린, 모모르코킨, 모모르코킨-S, 세키우민, 모모르그로스빈, 트리코안구인, 키릴로윈, α-트리코산틴, TAP-29, 트리코키린, 트리코미슬린, 트리코산틴, 카라수린, 트리코마글린, 트리코바킨, 크로틴, 유세라틴 항바이러스성 단백질 GAP-31, 겔로닌, 휴라 크레피탄스 RIP, 쿠르신, 자트로파 쿠르카스 RIP, 마팔민, 마누틴, α-피사빈, 카리브딘, 히아신투스 오리엔탈리스 RIP, 무사르민, 이리스 홀란디카 RIP, 클레로엔드럼 아큘레아툼 RIP, CIPs, 크립-31, 보우가닌, 보우가인빌라 스펙트빌리스 RIP, 보우가인빌레아 x 부티아나 항바이러스성 단백질 1 (BBAP1), 말릭 효소, MAP-S, 포크위드 항바이러스성 단백질 (PAP), PD-SI, DP-S2, 도데칸드린, PIP, PIP2, 파이토라카 옥탄드라 항바이러스성 단백질, 호르데움 불가레 RIPs, 호르데움 불가레 아종 불가레 해독 억제제 II, 세케일 세레알레 RIP, 트리틴, 제아 디플로페레미스 RIPs, 마루스 x 도메스티카 RIP, 모모르디카 항-HIV 단백질, 젤로늄 멀티플로룸, 미라빌리스 엑스판사 1, 파지 MU1, 베타불긴 (Bvg), 쿠르신 2, 사포린 6, 옥수수 RIP (B-32), 담배 RIP (TRIP), 비틴, 미라빌리스 항바이러스성 단백질 (MAP), 트리코산틴 (TCS), 루핀, 모모르카린, 오시모이딘, 브리오딘, 페폽신, β-트리코산틴, 캄포린, YLP, 인슐라린, 보리 RIP, 트리틴스, 람자린, 및 볼바리엘라 볼바세아 RIP로 구성된 그룹으로부터 선택된 타입 1 리보좀 불활성화 단백질일 수 있다.
폴리펩타이드 C는 사이클로타이드, 시아마이신, NP-06, 그라미시딘 A, 서큘린, 칼라타, 징크빌로빈, 알파-바스루빈, 루나투신, 세스퀸, 트리사이클론 A, 사이클로비올라신, 폴리페뮤신, hfl-B5, 프로테그린 (돼지 카텔리시딘), 랫트 디펜신, 인간 β-디펜신, 템포린, 카에린, 라나투에린, 파충류 디펜신, 피스시딘, 락토페리신 B, 토끼 호중구, 토끼 α-디펜신, 레트로사이클린, 인간 α-디펜신, 인간 β-디펜신 III (HBD3), 레수스 미니디펜신 (RTD-1,θ-디펜신), 레수스 θ-디펜신, 인간 호중구 펩타이드, 세크로핀 As, 멜리틴, EP5-1, 마가이닌 2s, 하이브리드 (CE-MA), 헵시딘 TH1-5, 에피네시딘-1, 인돌리시딘, 카텔리시딘-4, LL-37 카텔리시딘, 더마셉틴, 맥시민, 브레비닌, 라나투에린, 에스큘렌틴, 마스큘라틴 1.3, 맥시민 H5 및 피스시딘, 문드티신 KS 엔테로신 CRL-35, 루나투신, FK-13 (GI-20은 유도체임), 타키플레신, 알파-MSH, 항바이러스 단백질 Y3, 팔루스트린-3AR, 포네리신 L2, 스피니게린, 멜렉틴, 클라바닌 B, 소 카텔리시딘, 기니아피그 카텔리시딘 CAP11, 사카신 5X, 플렉타신, 진균 디펜신, GLK-19, 락토페린 (Lf) 펩타이드 2, 알로페론 1, 우페린 3.6, 달레인 5.6, 아스카핀-8, 인간 히스타틴 5, 기니아피그 호중구, 마이틸린, EP5-1, 헥사펩타이드 (합성) 코르티코스타틴 IV 토끼 호중구 2, 아우레인 (Aureins), 라타르신 (Latarcin), 플렉타신, 사이클로비올린 (Cycloviolins), 바브 (Varv) 펩타이드 E, 팔리코우레인 (Palicourein), VHL-1로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
인용된 모든 문헌들은 본 발명에 참고로 포함된다.
특히, 폴리펩타이드 A는 레트로사이클린일 수 있고, 폴리펩타이드 B는 MAP30일 수 있으며, 폴리펩타이드 C는 더마셉틴일 수 있다. 더욱 특히, 폴리펩타이드 A는 레트로사이클린 101 (RC101)일 수 있고, 폴리펩타이드 C는 더마셉틴 1일 수 있다. 폴리펩타이드 A, B 및 C로서 각각 RC101, MAP30 및 더마셉틴 1을 포함하는 폴리펩타이드는 본 발명에서 RetroMAD1으로 불린다. RetroMAD1은 RT-PCR에 의해서 확인되는 바와 같이 전-처리, 동시 및 후-처리에서 HSV1, HSV2, DEN1, DEN2, DEN3 및 DEN4 바이러스에 대한 세포 공격시험에서 상당한 바이러스 카피 감소를 나타낼 수 있다.
특히, 폴리펩타이드 A는 서열번호 12를 갖는 아미노산 서열, 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있고, 폴리펩타이드 B는 서열번호 13을 갖는 아미노산 서열, 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있으며, 폴리펩타이드 C는 서열번호 14를 갖는 아미노산 서열, 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
더욱 특히, 본 발명의 모든 관점에 따른 융합 단백질은 아미노산 서열 서열번호 1을 포함할 수 있다. 융합 단백질 또는 융합 단백질의 염기성 유니트는 약 10-50 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 특히, 융합 단백질의 분자량은 36.5, 37, 37.5, 37.8, 38, 39, 40, 41, 41.2, 43 또는 48 kDa일 수 있다. 융합 단백질은 염기성 유니트의 반복부를 포함할 수 있다. 당업자는 융합 단백질의 중량이 단백질 내에 존재하는 염기성 유니트의 배수에 따라 좌우될 수 있음을 이해할 것이다. 서열은 이하의 표 1b에 제시된다.
본 발명의 또 다른 관점에서는 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질을 발현할 수 있는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자가 제공된다.
본 발명의 핵산 분자는 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 이중-스트랜드 또는 단일-스트랜드, 센스 및/또는 안티센스 스트랜드일 수 있다. 이들 분자의 분절은 또한, 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려되며, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해서 생산될 수 있거나, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 처리함으로써 생성될 수 있다. 리보핵산 (RNA) 분자는 시험관내 전사에 의해서 생산될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 천연적으로 존재하는 서열, 또는 천연적으로 존재하는 것과는 상이한 서열을 함유할 수 있지만, 유전자 코드의 퇴화 (degeneracy)에 기인하여 동일한 펩타이드 (예를 들어, 서열 번호 1, 12, 13 및 14를 갖는 펩타이드)를 암호화할 수 있다. 이들 핵산 분자는 암호화 서열로 제한되지 않으며, 암호화 서열로부터 상류 또는 하류에 존재하는 비-암호화 서열 중의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
본 발명의 임의 관점에 따른 핵산 분자는 시험관내에서 합성 (예를 들어, 포스포르아미다이트-기본 합성에 의해서)될 수 있거나, 박테리아 또는 포유동물의 세포와 같은 세포로부터 수득될 수 있다. 핵산은 척추동물, 무척추동물, 또는 더 고등 또는 하등 식물의 핵산일 수 있다. 특히, 척추동물은 포유동물, 양서류, 파충류, 조류 또는 어류일 수 있고, 더 하등 식물은 진균일 수 있다. 포유동물은 인간 또는 비-인간일 수 있다. 특히, 비-인간은 이들이 상술한 범주를 충족시키는 한은 비-인간 영장류, 마우스, 랫트, 기니아피그, 소, 양, 말, 돼지, 토끼, 개 또는 고양이일 수 있다. 핵산의 이들 타입 내에서의 뉴클레오타이드의 조합 또는 변형이 또한 포함된다.
특히, 본 발명에 따른 핵산은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 그의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 특히, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2와 적어도 50%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95%, 또는 98% 동일할 수 있다. 더욱 특히, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
서열은 이하의 표 1b에 제시된다.
Figure pct00002
[표 1b] 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 서열.
변형 및 변화는 본 발명의 펩타이드, 및 이들을 암호화하고, 여전히 바람직한 특징을 갖는 단백질 또는 펩타이드를 암호화한 기능적 분자를 수득하는 DNA 분절의 구조 내에서 만들어질 수 있다. 아미노산 변화는 DNA 서열의 코돈을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 특정의 아미노산이 예를 들어, 융합 단백질의 미생물-결합 부분과 같은 구조에 의한 상호작용성 결합능의 감지할 수 있는 손실이 없이, 단백질 구조 내의 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있다. 이것은 단백질의 생물학적 기능적 활성을 규정하는 단백질의 상호작용성 능력 및 성질이기 때문에, 특정의 아미노산 서열 치환은 단백질 서열, 및 물론 그의 기본적 DNA 암호화 서열에서 이루어질 수 있고, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 다양한 변화가 그들의 생물학적 유용성 또는 활성의 감지할 수 있는 상실이 없이, 개시된 조성물의 펩타이드 서열, 또는 상기 단백질을 암호화한 상응하는 DNA 서열 내에서 만들어질 수 있다. 본 발명에 따른 융합 단백질의 아미노산 치환은, 치환이 원래의 서열에서의 특성과 충분히 유사한 특성을 갖는 아미노산을 제공한다면, 본 발명의 분리된 펩타이드의 항미생물 효과에 영향을 미치지 않고 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 천연 상태에서는 그 자체로 발견되지 않는 분절을 포함한다. 따라서, 본 발명은 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터) 내로, 또는 이종 세포의 게놈 (또는 천연 염색체 위치가 아닌 위치에서 상동성 세포의 게놈) 내로 통합된 재조합 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점에서는, 본 발명의 임의 관점에 따른 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 플라스미드 또는 벡터가 제공된다.
본 발명의 한가지 관점에서는, 본 발명의 임의 관점에 따른 핵산 분자 및/또는 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 적어도 하나의 숙주 세포가 제공된다.
DNA (또는 레트로바이러스 벡터의 경우에는 RNA)는 적합한 숙주 내에서 발현되어 본 발명의 모든 관점에 따른 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 펩타이드를 구성하는 폴리펩타이드를 암호화한 DNA를 공지된 기술에 따라 사용하여 발현 벡터를 제작할 수 있으며, 다음에 이것을 사용하여 본 발명에 따른 융합 단백질의 발현 및 생산을 위해 적절한 숙주 세포를 형질전환시킨다.
본 발명의 융합 단백질을 구성하는 폴리펩타이드를 암호화한 DNA (또는 레트로바이러스 벡터의 경우에는 RNA)는 적절한 숙주 내로의 도입을 위해 광범한 종류의 다른 DNA 서열에 결합될 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 성질, 숙주 내로의 DNA의 도입의 방식, 및 에피좀성 유지 또는 통합이 바람직한지 여부에 따라 달라질 것이다.
일반적으로, DNA는 발현을 위한 적절한 배향 및 정확한 판독 프레임으로 플라스미드와 같은 발현 벡터 내로 삽입된다. 필요에 따라, DNA는 바람직한 숙주에 의해서 인식되는 적절한 전사 및 해독 조절성 제어 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있지만, 이러한 제어는 일반적으로 발현 벡터에서 이용할 수 있다. 그 후에, 벡터는 표준 기술에 의해서 숙주 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포는 원핵성 또는 진핵성일 수 있다. 특히, 박테리아 세포는 일부의 환경에서 바람직한 원핵성 숙주 세포일 수 있으며, 전형적으로는 예를 들어, Bethesda Research Laboratories Inc. (Bethesda, MD, USA)로부터 입수할 수 있는 이. 콜라이 스트레인 DH5 및 American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA)으로부터 입수할 수 있는 RRl (No ATCC 31343)와 같은 이. 콜라이의 스트레인이다. 바람직한 진핵성 숙주 세포에는 효모, 곤충 및 포유동물 세포, 특히 마우스, 랫트, 원숭이 또는 인간 섬유아세포 및 신장 세포주로부터 유래하는 것과 같은 척추동물 세포가 포함된다. 효모 숙주 세포에는 Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA)로부터 일반적으로 입수할 수 있는 YPH499, YPH500 및 YPH501이 포함된다. 바람직한 포유동물 숙주 세포에는 ATCC로부터 CCL61로 입수할 수 있는 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary; CHO) 세포, ATCC로부터 CRL 1658로 입수할 수 있는 NIH 스위스 마우스 배아 세포 NIH/3T3, ATCC로부터 CRL 1650으로 입수할 수 있는 원숭이 신장-유래 COS-I 세포, 및 인간 배아 신장 세포인 293 세포가 포함된다. 바람직한 곤충 세포는 바큘로바이러스 발현 벡터에 의해서 형질감염될 수 있는 Sf9 세포이다.
본 발명의 DNA 구조물, 핵산 분자 및/또는 플라스미드 또는 벡터에 의한 적절한 숙주 세포의 형질전환은 전형적으로 사용된 벡터의 타입에 따라 좌우되는 잘 알려진 방법에 의해서 성취된다. 전기천공, 바이오리스틱 (Biolistic) 형질전환, 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개 및 레트로바이러스-매개된 형질전환은 또한 세포를 형질전환 및/또는 형질감염시키는데 유용하며, 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포 및 척추동물 세포를 형질전환시키기 위해 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.
통상적으로, 숙주 세포의 전부가 벡터에 의해서 형질전환될 수 있는 것은 아니다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포를 위해서 선택하는 것이 필요할 수 있다. 한가지 선택 기술은 항생제 저항성과 같은 형질전환된 세포 내에서 선택가능한 형질을 암호화한 DNA 서열을 모든 필요한 제어 요소와 함께 발현 벡터 내에 통합시키는 것을 포함한다. 대안적으로, 이러한 선택가능한 형질에 대한 유전자는 원하는 숙주 세포를 공동-형질전환시키기 위해서 사용되는 또 다른 벡터 상에 있을 수 있다.
상기한 바와 같은 박테리아 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 및 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)), 효모 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)), 사상 진균 (예를 들어, 아스퍼질러스 (Aspergillus)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포를 포함한 다수의 발현 시스템이 공지되어 있다.
프로모터는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사가 일어나도록 허용하는 DNA 서열에 의해서 형성된 발현 제어 요소이다. 예시적인 박테리아 숙주와 상화성인 프로모터 서열은 전형적으로, 본 발명의 DNA 분절의 삽입에 편리한 제한 부위를 함유하는 플라스미드 벡터 내에 제공된다. 전형적인 원핵성 벡터 플라스미드는 Biorad Laboratories (Richmond, CA, USA)로부터 입수할 수 있는 pUC18, pUC19, pBR322 및 pBR329, 및 Pharmacia (Piscataway, NJ, USA)로부터 입수할 수 있는 pTrc99A 및 pKK223-3이다.
본 발명의 또 다른 관점에서는 본 발명에 따른 숙주 세포를 융합 단백질이 발현될 수 있도록 하는 조건 하에서 배양함으로써 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질의 생산의 자본 비용은 종종 다수의 기능적 그룹의 화학적 합성과 연관된 매우 큰 자본 투자를 필요로 하는 복잡한 합성적 소분자 약물에 비해서 낮은 것으로 생각될 수 있다. 융합 단백질은 생물제제이기 때문에, 비교적 작은 자본 투자로 대량의 생성물을 잠재적으로 생산할 수 있다.
특히, 본 발명의 재조합 DNA에 의해서 형질전환된 숙주 세포를 그 후에 본 명세서에 기술된 지침을 고려하여, 본 기술분야에서 숙련된 기술자에 공지된 적절한 조건 하에서 충분한 시간 동안 배양하여 본 발명에 따른 융합 펩타이드를 구성하는 폴리펩타이드의 발현을 허용하고, 이것은 그 후에 회수할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에서는 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 보조제, 희석제 및/또는 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 제제는 융합 단백질 이외에도, 가능하게는 항생제와 같은 다른 항체 또는 약물과 같은 하나 이상의 다른 약제와의 혼합물로, 생리적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다. 적합한 담체에는 생리적 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 포스페이트 완충 식염수 글루코즈 및 완충 식염수가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 대안적으로, 융합 단백질은 동결건조되고 (냉동 건조됨), 필요한 때에 상술한 바와 같은 수성 완충 용액을 첨가함으로써 사용을 위해서 재구성될 수 있다. 투여의 경로는 일상적으로 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 주사를 포함하는 비경구, 또는 경구 송달이다. 투여는 전신적이고/이거나 국소적일 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터일 수 있는 리간드, 및 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
약제학적 조성물은 피하, 피내, 복강내, 정맥내, 근육내 또는 경구 투여와 같은 국소 또는 비경구 투여를 위해서 사용될 수 있다. 이를 위해서, 리간드를 약제학적으로 허용되는, 바람직하게는 수성 담체에 용해 또는 현탁시킬 수 있다. 약제학적 조성물은 완충제, 결합제, 블라스팅제 (blasting agents), 희석제, 방향제, 윤활제 등과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 본 조성물은 항미생물제로서 방지, 예방 및/또는 치료를 위해서 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 임의 관점에 따른 약제학적 조성물은 경구 투여에 적합할 수 있다. 약제학적 조성물은 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 계면활성제는 나트륨-우르소데옥시콜레이트, 나트륨 글리실우르소데옥시콜레이트, 칼륨-우르소데옥시콜레이트, 칼륨 글리실우르소데옥시콜레이트, 페로우스-우르소데옥시콜레이트, 페로우스 글리실우르소데옥시콜레이트, 암모늄-우르소데옥시콜레이트, 암모늄 글리실우르소데옥시콜레이트, 나트륨-타우로우르소데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸글리실우르소데옥시콜레이트, 칼륨-타우로우르소데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸글리실우르소데옥시콜레이트, 페로우스-타우로우르소데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸글리실우르소데옥시콜레이트, 암모늄-타우로우르소데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸글리실우르소데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸타우로우르소데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸타우로우르소데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸타우로우르소데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸타우로우르소데옥시콜레이트, 나트륨-콜레이트, 나트륨-데옥시콜레이트, 칼륨-콜레이트, 칼륨-데옥시콜레이트, 페로우스-콜레이트, 페로우스-데옥시콜레이트, 암모늄-콜레이트, 암모늄-데옥시콜레이트, 나트륨-케노데옥시콜레이트, 나트륨-글리실콜레이트, 칼륨-케노데옥시콜레이트, 칼륨-글리실콜레이트, 페로우스-케노데옥시콜레이트, 페로우스-글리실콜레이트, 암모늄-케노데옥시콜레이트, 암모늄-글리실콜레이트, 나트륨-타우로콜레이트, 나트륨-N-메틸글리실콜레이트, 칼륨-타우로콜레이트, 칼륨-N-메틸글리실콜레이트, 페로우스-타우로콜레이트, 페로우스-N-메틸글리실콜레이트, 암모늄-타우로콜레이트, 암모늄-N-메틸글리실콜레이트, 나트륨-N-메틸타우로콜레이트, 나트륨-글리실데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸타우로콜레이트, 칼륨-글리실데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸타우로콜레이트, 페로우스-글리실데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸타우로콜레이트, 암모늄-글리실데옥시콜레이트, 나트륨-타우로데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸글리실데옥시콜레이트, 칼륨-타우로데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸글리실데옥시콜레이트, 페로우스-타우로데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸글리실데옥시콜레이트, 암모늄-타우로데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸글리실데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸타우로데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸글리실케노데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸타우로데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸글리실케노데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸타우로데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸글리실케노데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸타우로데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸글리실케노데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸타우로케노데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸타우로케노데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸타우로케노데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸타우로케노데옥시콜레이트, 우르소데옥시콜레이트의 에틸 에스테르, 우르소데옥시콜레이트의 프로필 에스테르, 나트륨-글리실케노데옥시콜레이트, 칼륨-글리실케노데옥시콜레이트, 페로우스-글리실케노데옥시콜레이트, 암모늄-글리실케노데옥시콜레이트, 나트륨-타우로케노데옥시콜레이트, 칼륨-타우로케노데옥시콜레이트, 페로우스-타우로케노데옥시콜레이트, 암모늄-타우로케노데옥시콜레이트, 나트륨 데옥시콜레이트 등으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 특히, 계면활성제는 경구 투여를 허용하는 나트륨 데옥시콜레이트일 수 있는데, 이는 이것이 소비될 때에 위장관 내에서 융합 단백질이 소화되지 않게 할 수 있기 때문이다. 이것은 투여의 편리한 모드이다.
계면활성제는 0.003-5 중량%의 농도로 존재할 수 있다. 특히, 농도는 0.01-4.5 중량%, 0.05-4 중량%, 0.1-3.5 중량%, 0.5-2 중량%, 1-1.5 중량% 등일 수 있다. 특히, 계면활성제의 농도는 약 0.05 중량%일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터 중의 적어도 하나를 포함할 수 있는 적어도 하나의 리간드를 함유하는 본 발명에 따른 약제학적 제제는 미생물, 특히 바이러스 감염을 앓고 있는 환자에게 투여될 수 있다.
미생물 감염을 앓고 있는 환자에게 투여될 본 발명에 따른 리간드의 투약량은 치료될 상태의 정확한 성질 및 치료의 수용자에 따라 달라질 수 있다. 용량은 일반적으로 성인 환자에 대해서 약 0.005 내지 약 1000 ㎎의 범위일 수 있으며, 통상적으로 1 내지 30일의 기간 동안 매일 투여된다. 바람직한 1일 용량은 0.5 내지 50 ㎎/일이다. 특히, 1일 용량은 약 0.8, 1, 1.2, 1.5, 2, 2.5, 3.2, 4, 4.5 ㎎/일일 수 있다. 투약량은 치료되는 환자에게서 0.001 ㎎/㎏/일 내지 5 ㎎/㎏/일의 상기 리간드의 생체내 농도를 제공하는 농도로 리간드가 약제 내에 존재할 수 있도록 하는 방식으로 적용될 수 있다. 한가지 구체예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 펩타이드 또는 리간드는 최대 농도를 100 ㎍/㎖로 하여 1 ㎍/㎖ 또는 그 이상의 생체내 농도를 달성하는 양으로 존재한다. 본 발명의 약제학적 제제는 리소자임, 락토페린 및/또는 역-전사효소 억제제와 같은 적어도 하나의 숙주 방어 분자를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질 및 약제학적 조성물은 광범한 스펙트럼의 항바이러스 특성을 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질 및 약제학적 조성물은 광범한 스펙트럼의 경구 송달 항바이러스 치료제를 개발하는데 유용할 수 있다. 이것은 특히, 바이러스성 가축유행병의 위협에 시달리는 다수의 축산업에 유익할 수 있다. 이것은 특히 중요한데, 이는 세계적 집단에서 발생하는 경우에 식품 생산이 더 생산적이 되도록 하는 더 큰 압박이 존재하기 때문이다.
본 발명의 한가지 관점에서는 척추동물, 무척추동물 또는 식물에게 본 발명의 모든 관점에 따른 융합 단백질 또는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 척추동물, 무척추동물 또는 식물에게서 미생물 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에서는 의약품으로 사용하기 위한, 본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질 또는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에서는 척추동물, 무척추동물 또는 식물에게서 미생물 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한, 본 발명의 모든 관점에 따른 융합 단백질 또는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가의 관점에서는 척추동물, 무척추동물 또는 식물에게서 미생물 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약품의 제조에 있어서의 본 발명의 모든 관점에 따른 융합 단백질 또는 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
특히, 미생물 감염은 바이러스 감염일 수 있다. 척추동물은 포유동물, 어류 또는 조류일 수 있다. 더 더욱 특히, 포유동물은 비-인간 동물일 수 있다.
본 기술분야에서 숙련된 기술자는 본 명세서에 제시된 방법에 따라 과도한 실험이 없이 본 발명이 실시될 수 있음을 인식할 것이다. 본 방법, 기술 및 화학물질은 제시된 문헌에 기술된 바와 같거나, 표준 생명공학 및 분자 생물학 교과서에 있는 프로토콜로부터 유래한다.
본 발명의 임의 관점에 따른 융합 단백질 및/또는 약제학적 조성물은 대상체에 의해서 섭취하였을 때 독성 부작용을 야기하지 않거나 실질적으로 야기하지 않을 수 있다.
이하 본 발명은 일반적으로 기술되지만, 예시적으로 제공되는 것이지, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아닌 이하 실시예들을 참고하여, 발명을 더 쉽게 이해될 것이다.
실시예
본 기술분야에서 공지되어 있어 구체적으로 기술되지 않은 표준 분자생물학 기술은 일반적으로 문헌 [Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (2001)]에 기술된 바에 따른다.
실시예 1
발현 벡터의 제작 및 디자인
서열번호 1을 갖는 RetroMAD1 A-B-C를 암호화한 유전자를 합성하고, 계약 서비스에 의해 KpnI/SacI 부위에서 벡터 pGA4의 골격 내에 클로닝하였다 (GeneArt AG, Germany). 예상된 생성물 크기는 1140 bp였으며, 이것은 379 아미노산 및 41.2 kDa의 예상된 크기를 암호화하였다. 폴리뉴클레오타이드 서열 및 해독된 폴리펩타이드 서열은 도 1에 나타낸다. 유전자는 NcoI/HindIII 부위에서 pET 발현 벡터 (Novagen), pET-26(b) 내에 서브-클로닝되었다. 카나마이신이 인큐베이션 목적의 선택 및 유지를 위한 마커로 사용되었다. 이 벡터는 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)의 첨가 하에서 유도가능하였다. 그 후에, 플라스미드 pRMD1를 BL21(DE23) 세포 (Novagen) 내로 형질전환시키고, 카나마이신을 함유하는 선택 배지 상에 플레이팅하였다.
이. 콜라이로부터 RetroMAD1 의 발현
한 개의 재조합 클론을 30 ㎍/㎖ 카나마이신이 보충된 10 ㎖의 LB 베르타니 (LB Bertani) (DIFCO) 배지 내에서 37℃로 밤새 성장시켰다. 이 배양물을 사용하여 30 ㎍/㎖ 카나마이신이 보충된 100 ㎖의 LB 베르타니를 접종하고, 광학적 판독치가 600 ㎚에서 0.4-0.6일 될 때까지 37℃에서 성장시켰다. IPTG는 1.0 mM 최종 농도로 첨가되었다. 성장 기간은 3일 동안 계속되었다. 전기영동 부하 완충액 내에서 추출된 세포 내의 RetroMAD1의 분획의 SDS-PAGE 분석은, 단백질이 약 37.5 kDa의 분자 질량을 갖고, 예상된 분자 크기의 RetroMAD1가 단지 유도된 세포 내에서만 생산되었음을 나타내었다 (도 2A). SDS-PAGE에 의한 추가의 용해도 분석은, 단백질이 도 2B에서 나타낸 바와 같이 봉입체로서 발현 및 생산되었음을 시사하는 것으로서 RetroMAD1이 이. 콜라이의 펠렛 분획에서 발견되지만 상등액 분획에서는 발견되지 않았음을 나타내었다.
RetroMAD1 의 분리 및 정제
100 ㎖의 유도된 배양물로부터 세포를 15℃에서 5000 x g으로 10 분 동안 원심분리시킴으로써 수확하였다. 세포를 20 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA 및 1% 트리톤-X 100을 함유하는 용해 완충액 내에 현탁시켰다. 세포를 초음파 처리에 의해서 붕괴시켰다. 불용성 분획을 20 분 동안 8,000 x g에서 원심분리시킴으로써 가용성 분획으로부터 분리시켰다. 상등액을 버리고, 펠렛은 동일한 단계를 반복함으로써 더 세척하였다. 펠렛은 초음파 처리를 통한 재현탁 및 원심분리에 의한 분리에 의해서 RO 물로 2 회 더 세척하였다.
RetroMAD1 의 가용화
불용성 물질을 10 ㎖의 5-8 우레아 또는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 중에서 용해시켜 초음파 처리하고, 2-5%의 나트륨-라우릴 사르코신 및 100 mM β-머캅토에탄올로 보충하였다. 가용화는 밤새 수행하였다. 가용화된 단백질을 20 분 동안 8,000 x g에서 원심분리시킴으로써 박테리아 세포벽으로부터 분리시켰다.
RetroMAD1 의 리폴딩 ( refolding )
단백질의 복원은 투석에 의해서 수행되었다. 단백질 (10 ㎖)을 15 kDa 분자량 컷-오프 투석막 (Spectra/Por Lab) 내에서 투석하였다. 단백질을 NaOH에 의해서 조정된 11.0의 pH를 갖는 5 ℓ의 RO 물 중에서 투석하였다. 배양은 실온에서 15-20 시간 동안 수행하였다. 리폴딩된 단백질을 50 ㎖ 튜브로 옮기고, 8,000 x g으로 원심분리시켜 모든 불용성 물질을 분리시켰다. 복원된 단백질은 더 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 이하의 실시예에서 RetroMAD1의 생물활성은 단백질의 성공적인 리폴딩의 증거이다.
실시예 2
바이러스 스톡 ( stocks )
단순 포진 바이러스 타입-1 (HSV-1) 및 타입-2 (HSV-2)는 University of Malaya의 Faculty of Medicine, Medical Microbiology Department로부터 수득하였다. 바이러스 스톡은 25-㎠ 조직 배양 플라스크 내의 베로 (vero) 세포의 단일층을 2% 태아 소혈청 (FBS) (HyClone)을 함유하는 1 ㎖의 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) (HyClone) 중에서 1:5 내지 1:10으로 희석된 바이러스로 접종함으로써 제조하였다. 플라스크를 37℃의 인큐베이터 내에 위치시켜 바이러스 흡착을 허용하였다. 1 시간 후에, 2% FBS로 보충된 4 ㎖의 DMEM을 첨가하고, 세포는 세포변성 효과 (cytophatic effect; CPE)가 확인될 때까지 6 내지 7일 동안 37℃에서 계속 번식되도록 하였다. 세포 파편은 1,500 x g에서 5 분 동안 원심분리시킴으로써 제거하였다. 바이러스 상등액을 각각 1 ㎖씩의 분취량으로 수집하고, 더 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
플라크 시험에 의한 바이러스 적정
밀리리터당 플라크 형성 유니트 (PFU/㎖)로 표현된, 각각의 HSV 타입의 병독성 (virulence)은 University of Malaya의 Faculty of Medicine, Medical Microbiology Department로부터 수득된 베로 세포를 사용한 플라크 시험에 의해서 적정하였다. 베로 세포는 10% FBS를 함유하는 DMEM의 6-웰 플레이트 (5 x 105 세포/웰) 내에서 37℃로 24 시간 동안 번식시켰다. 24 시간 후에, 성장 배지를 2% FBS를 함유하는 DMEM 중의 바이러스 현탁액의 계열 희석액으로 대체시키고, 세포를 37℃에서 1 시간 동안 더 배양하여 바이러스 흡착이 일어나도록 하였다. 이어서, 한천 오버레이 (overlay)를 첨가하고, 플레이트를 5일 동안 (또는 플라크의 형성 시까지) 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플라크가 형성되면, 한천 오버레이를 제거하고, 플라크를 6% 빙초산 중의 0.1 나프탈렌 블랙 용액으로 염색하였다.
시험관내 바이러스 억제시험
전-처리 시험: 베로 세포를 웰당 1 x 105 세포의 농도로 24-웰 배양 플레이트에 접종하고, 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 바이러스 접종 전에, RetroMAD1의 최대 비독성 용량을 세포에 첨가하고, 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 펩타이드와의 24 시간 인큐베이션 후에, 0.1의 MOI에서 단순 포진 바이러스-2 (HSV-2)를 때때로 흔들어 주면서 1 시간 동안 베로 세포 상에 접종하였다. 바이러스를 제거하고, 세포를 신선한 DMEM으로 대체하였다. 배양액을 5% CO2 대기 하에 37℃에서 24, 48 및 72 시간 동안 인큐베이션시켰다.
동시 처리 시험: 베로 세포를 웰당 1 x 105 세포의 농도로 24-웰 배양 플레이트에 접종하고, 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. RetroMAD1을 바이러스와 혼합시키고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 혼합물을 때때로 흔들어 주면서 1 시간 동안 24-웰 배양 플레이트 내의 베로 세포 상에 접종하였다. 용액을 제거하고, 배지를 DMEM으로 대체하였다. 배양액을 5% CO2 대기 하에 37℃에서 24, 48 및 72 시간 동안 인큐베이션시켰다.
후-처리 시험: 베로 세포를 웰당 1 x 105 세포의 농도로 24-웰 배양 플레이트에 접종하고, 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 0.1의 MOI에서 HSV-2를, 때때로 흔들어 주면서 1 시간 동안 24-웰 배양 플레이트 내의 베로 세포 상에 접종하였다. 배지를 제거하고, RetroMAD1을 함유하는 DMEM으로 대체하였다. 배양액을 5% CO2 대기 하에 37℃에서 24, 48 및 72 시간 동안 인큐베이션시켰다.
모든 항바이러스 시험에서 기간의 종료 시에, 플레이트를 -80℃에서 동결시켰다. 동결 및 해동의 2 사이클 후에, 상등액 및 부착된 세포 둘 다를 수거하였다. 바이러스 DNA를 추출 키트 (Bioneer, South Korea)에 의해서 추출하였다. 그 후, 용출된 DNA를 RT-PCR에 적용하였다.
바이러스 DNA 추출 및 실시간 PCR 을 사용한 분석
200 ㎕의 배양 배지를 제조자의 설명에 따라 아큐프레프 (AccuPrep®) 게놈 DNA 추출 키트 (BioNeer)를 사용한 바이러스 DNA 분리를 위해서 사용하였다. 분리된 총 DNA의 순도는 분광분석에 의해서 측정하였다. 증폭 및 바이러스 부하 검출은 바이오래드 (BioRad) CFX98 (Biorad)을 사용하여 수행하였다. 각각 25 ㎕의 SYBR® 그린 PCR 매스터 믹스 (Green PCR Master Mix)는 1X 최종 농도의 12.5 ㎕의 SYBR® 그린 (Biorad), 0.5 ㎕ (0.2 μM)의 정방향 (HSV-1: 5' TGG GAC ACA TGC CTT CTT GG 3' (서열번호 3), HSV-2: 5' GTA CAG ACC TTC GGA GG 3' (서열번호 4)) 및 역방향 프라이머 (HSV-1: 5' ACC CTT AGT CAG ACT CTG TTA CTT ACC C 3' (서열번호 5), HSV-2: 5' CGC TTC ATC ATG GGC 3' (서열번호 6)) 둘 다 및 5 ㎕의 주형 DNA를 함유한다. 서모사이클러 (thermocyclers)는 95℃에서 15 분 동안의 개시 단계로 시작하고, 이어서 95℃에서 30 초 동안의 변성 단계, 60℃에서 30 초 동안의 어닐링 (annealing) 및 72℃에서 1 분 동안의 연장(extension)의 34 사이클 및 72℃에서 5 분 동안의 최종 연장을 수행하였다. HSV-1 프라이머를 사용한 결과는 표 2 및 도 3에 나타내고, HSV-2를 사용한 결과는 표 3 및 도 4에 나타낸다. RetroMAD1은 도 3 및 4에서 나타낸 바와 같이, 모든 처리 그룹에서 90% 이상의 바이러스 카피 감소를 제공하여 HSV 감염의 진행을 억제하는데 매우 효과적인 것으로 확인되었다. 이 연구에서 나타난 결과는 HSV에 대한 RetroMAD1의 유의적인 억제를 나타내어 항바이러스 화합물의 새로운 부류를 제공하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
[표 2] RetroMAD1과의 24- 및 48-시간 인큐베이션 후에 바이러스 감소의 백분율: (A) MOI = 0.1에서 HSV-1, (B) MOI = 0.5에서 HSV-1.
Figure pct00005
Figure pct00006
[표 3] RetroMAD1과의 24- 및 48-시간 인큐베이션 후에 바이러스 감소의 백분율: (A) MOI = 0.1에서 HSV-2, (B) MOI = 0.5에서 HSV-2.
실시예 3
바이러스 스톡
이 연구에서 사용된 뎅기열 바이러스 타입-1 (DENV-1), 타입-2 (DENV2), 타입-3 (DENV-3) 및 타입-4 (DENV-4) 스트레인은 각각 하와이, 뉴기니 C, H87 및 H241 스트레인의 표현형이다 (University of Malaya의 Faculty of Medicine, Medical Microbiology Department의 허락). 바이러스 스톡은 25-㎠ 조직 배양 플라스크 내의 C6/36 세포의 단일층을 2% FBS를 함유하는 1 ㎖의 레이보비츠 (Leibovitz) L-15 중에서 1:5 내지 1:10 희석된 바이러스로 접종함으로써 제조하였다. 플라스크를 28℃의 인큐베이터 내에 위치시켜 바이러스 흡착을 허용하였다. 1 시간 후에, 2% FBS로 보충된 4 ㎖의 레이보비츠 L-15를 첨가하고, 세포는 세포변성 효과 (CPE)가 확인될 때까지 6 내지 7일 동안 28℃에서 계속 번식되도록 하였다. 세포 파편은 1,500 x g에서 5 분 동안 원심분리시킴으로써 제거하였다. 바이러스 상등액을 각각 1 ㎖씩의 분취량으로 수집하고, 더 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
플라크 시험에 의한 바이러스 적정
밀리리터당 플라크 형성 유니트 (PFU/㎖)로 표현된, 각각의 뎅기열 바이러스 타입의 병독성은 University of Malaya의 Faculty of Medicine, Medical Microbiology Department로부터 수득된 HepG2 (인간 간종양 세포주) 세포를 사용한 플라크 시험에 의해서 적정하였다 [Phoolcharoen and Smith, 2004]. HepG2 세포는 10% 태아 소혈청 (FBS)을 함유하는 DMEM의 6-웰 플레이트 (5 x 105 세포/웰) 내에서 37℃로 24 시간 동안 번식시켰다. 24 시간 후에, 성장 배지를 2% FBS를 함유하는 DMEM 중의 바이러스 현탁액의 계열 희석액으로 대체시키고, 세포를 37℃에서 1 시간 동안 더 인큐베이션시켜 바이러스 흡착이 일어나도록 하였다. 이어서, 한천 오버레이를 첨가하고, 플레이트를 5일 동안 (또는 플라크의 형성 시까지) 37℃에서 인큐베이션시켰다. 플라크가 형성되면, 한천 오버레이를 제거하고, 플라크를 6% 빙초산 중의 0.1 나프탈렌 블랙 용액으로 염색하였다.
시험관내 바이러스 억제시험
RetroMAD1의 시험관내 바이러스 억제시험은 100 ㎍/㎖의 화합물의 MNTD 및 0.1 및 0.5의 MOI (viral multiplicity of infectivity)에서 이중으로 수행되었다. C6/36 세포의 전형성된 단일층은 24-웰 플레이트 (5 x 105 세포/웰) 내의 레이보비츠 L-15 (HyClone) 내에 제조하였다. 세포는 3 가지 처리로 적용하였다: 전-감염 처리, 동시 처리 및 후-감염 처리. 세포를 전-감염 처리 및 후-감염 처리 각각을 위한 제제에서 24 시간 동안 RetroMAD1 및 1 시간 동안 희석된 바이러스 스톡과 전-인큐베이션시키는 반면에, 동시 처리를 위해서는 RetroMAD1 및 희석된 바이러스 스톡과 동시에 인큐베이션시켰다. 24 시간 및 48 시간의 인큐베이션 시간 후에, 배양 배지를 수거하고, 표지를 붙인 1.5 ㎖ 마이크로튜브 내에 분취하고, 더 사용할 때까지 -80℃에서 유지시켰다.
바이러스 RNA 추출 및 실시간 PCR 을 사용한 분석
200 ㎕의 배양 배지를 제조자의 설명에 따라 아큐프레프 게놈 DNA 추출 키트 (BioNeer)를 사용한 바이러스 DNA 분리를 위해서 사용하였다. 분리된 총 DNA의 순도는 분광분석에 의해서 측정하였다. 증폭 및 바이러스 부하 검출은 바이오래드 CFX98 (Biorad)을 사용하여 수행하였다. 각각 25 ㎕의 PCR 혼합물은 1X 최종 농도의 12.5 ㎕의 SYBR® 그린 (Biorad), 1 ㎕의 이스크립트 (iScript™) 일-단계 RT-PCR (Biorad), 0.25 ㎕ (10 μM)의 정방향 (5' GGA AGG AGA AGG ACT GCA CA 3') (서열번호 7) 및 역방향 프라이머 (5' ATT CTT GTG TCC CAT CCT GCT 3') (서열번호 8) 둘 다 및 5 ㎕의 주형 DNA를 함유한다. 서모사이클러는 50℃에서 30 분 동안의 개시 단계 및 95℃에서 15 분 동안의 초기 변성 단계로 시작하고, 이어서 95℃에서 30 초 동안의 변성, 60℃에서 40 초 동안의 어닐링 및 72℃에서 5 초 동안의 연장의 40 사이클 및 72℃에서 10 분 동안의 최종 연장을 수행하였다. DENV1, DENV2, DENV3 및 DENV4의 결과는 각각 표 4-7, 및 도 5에 나타낸다.
RetroMAD1은 24 시간 및 48 시간의 인큐베이션 기간에 걸쳐 전-감염 처리조건에서 0.1의 MOI인 4 개의 뎅기열 혈청형 모두에 대해 효과적인 것으로 확인되었다. 혈청형들 중에서, RetroMAD1에 의한 전-감염 처리는 MOI 0.1 및 0.5 둘 다에서 뎅기열 혈청형 2에 대해 최고의 바이러스 억제 효과를 제공하였다. 전-감염 처리 및 동시 감염의 처리 조건 둘 다는 50%-90% 감소의 범위에서 만족스러운 억제 효과를 제공하였다.
Figure pct00007
[표 4] RetroMAD1과의 24- 및 48-시간 인큐베이션 후에 DENV1의 감소 백분율 (MOI = 0.1).
Figure pct00008
Figure pct00009
[표 5] DENV2 (a) MOI = 0.1 및 (b) MOI = 0.5에서 RetroMAD1과의 24- 및 48-시간 인큐베이션 후에 DENV2의 감소 백분율
Figure pct00010
[표 6] RetroMAD1과의 24- 및 48-시간 인큐베이션 후에 DENV3의 감소 백분율
Figure pct00011
[표 7] RetroMAD1과의 24- 및 48-시간 인큐베이션 후에 DENV4의 감소 백분율
개방 병소뿐만 아니라 치은염과 같은 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV)의 전통적인 증상을 갖는 길 잃은 고양이를 증상을 완화시키는데 실패한 통상적인 약물치료 후에 RetroMAD1로 치료하였다. 이 고양이는 이미 ELISA PCR을 사용하여 FIV를 갖는 것으로 나타났다 (결과는 나타내지 않음). 스포로트릭스 (Sporotrix) 감염이 보였기 때문에 면역 억제는 명백하였다. 고양이를 그의 사료에 혼합시킨 0.68 ㎎/㎖의 RetroMAD1의 경구 용량 (계면활성제인 나트륨 데옥시콜레이트로 조합시킬 수 있으며, 여기에서 계면활성제의 농도는 약 0.05 중량%였다)에 의해 0.6 ㎖로 1일 3 회 치료하였다. 세팔렉신 이트라코나졸에 의한 더 초기의 치료는 창상이 50%까지 축소하도록 야기하였지만, 그 후에 이들 아물지 않은 상처는 더 이상 치유되지 않았다. RetroMAD1 치료의 14일 후에, 상처는 치유되기 시작하였으며, 이들은 완전히 사라졌다. 이 시간 중에, 고양이는 식욕이 좋았으며, 그의 체중은 4.5 ㎏에서 7.5 ㎏으로 증가하였다. 고양이는 PCR을 사용하면 FIV 양성인 것으로 유지되지만, 이것은 고양이의 게놈 내로 이미 통합되었지만 바이러스 활성 또는 존재의 징후를 갖지 않는 프로바이러스 DNA에 기인한 것이다. 고양이는 거동의 명백한 변화 및 명백한 부작용이 없이, 다양한 RetroMAD1 처방으로 8 개월의 치료로 누적 치료하였다.
유사하게, 2-4.6 ㎏ 초기 체중 범위의 체중을 갖고 FIV, FeLV, FPV 또는 공동-감염이 있는 총 25 마리의 고양이를 체중 1 ㎏당, 1일에 3 회, 0.1 ㎖로 경구적으로 투여된 0.68 ㎎/㎖의 RetroMAD1 (계면활성제인 나트륨 데옥시콜레이트로 조합시킬 수 있으며, 여기에서 계면활성제의 농도는 약 0.05 중량%였다)에 의해서 치료하였다. 모두는 ELISA를 사용하여 FIV에 대해 양성이었으며, 명백하게 징후를 나타내었다 (결과는 나타내지 않음). 2 증례에서, FIV 및 FeLV 공동-감염은 고양이의 코, 입 및 항문으로부터의 출혈을 야기하였고, 고양이는 스스로 설 수 없었다. 고양이가 사망한 하나의 증례를 제외한 모두에서, 대상 동물은 이들에게 통상적인 약물 치료만을 수행한 경우보다 더 빨리 완전하게 회복하였다. 동물이 사망한 단일 증례에서, 고양이는 소유자가 취소하기를 원했기 때문에 그의 투약 처방을 완수할 수 없었다. 이들 결과는 쿠알라룸푸르의 Puchong Animal Clinic에서 등록된 수의사, 및 말레이시아의 Johor에 있는 다른 2 명에 의해 2010년 7월 22일부터 2011년 12월 12일까지 수득되었다.
개 파르보 바이러스 (CPV2)의 전통적인 증상을 갖는 5 마리의 강아지를 체중 1 ㎏당, 1일에 3 회, 0.1 ㎖로 0.68 ㎎/㎖의 RetroMAD1 (계면활성제인 나트륨 데옥시콜레이트로 조합시킬 수 있으며, 여기에서 계면활성제의 농도는 약 0.05 중량%였다)에 의해서 치료하였다. 한 마리는 10 마리 모두 CPV2를 갖는 10 마리의 한배 새끼 중의 6 주령인 골든 리트리버 (Golden Retriever) 강아지였다. 이 강아지는 RetroMAD1 (계면활성제인 나트륨 데옥시콜레이트로 조합시킬 수 있으며, 여기에서 계면활성제의 농도는 약 0.05 중량%였다)로 치료된 한배 새끼 중의 유일한 하나였다. 나머지 9 마리의 강아지는 모두 CPV2로 사망한 반면에, RetroMAD1 치료된 강아지는 생존하였다. 또 다른 것은 중증의 CPV2를 갖고 수액을 꽂고 있는 토이 푸들 (toy poodle)이었다. RetroMAD1로 7일 치료한 후에, 푸들은 완전히 회복하였다. 3 마리의 반-형제인 독일 셰퍼드 (German Shepherd) 강아지는 중증의 CPV2 증상을 가졌다. 동일한 처방의 RetroMAD1로 7일 치료한 후에, 3 마리의 강아지는 모두 완전히 회복하였다. 추가의 증례의 대부분은 2011년 10월 24일부터 2011년 12월 16일 사이에 말레이시아의 Johor에서 CPV2의 발생 중에 시험하였다.
상기한 것은 일화적 결과이고, 어떤 방식으로든 과학적 실험을 구성하지는 않지만, 이들은 1일에 체중 ㎏당 200 ㎍의 투약량에서 항바이러스 약물로서의 RetroMAD1의 유효성을 나타낸다.
각각 FIV, FeLV, FPV, 고양이 칼시바이러스, CPV, TVT, 개 코로나바이러스, 개 홍역 바이러스에 대해서 양성인 시험한 고양이 및 개는 상당한 회복율을 나타내었다. FIV, FeLV, 및 CPV는 각각 82%, 73% 및 76%의 강제적인 증후적 회복율 (compelling symptomatic recovery rate)을 나타내었다. 병원으로 데려온 아픈 동물은 주로 질병에 대해서 스크리닝한다. 확인되면, 의사는 소유자의 승인을 받은 후에 RetroMAD1 치료 처방을 시작한다. 이들 증례 중의 대부분은 6-12 개월에 걸쳐서 이어졌으며, 그의 이전의 증후적 상태로 복귀되지 않았다. 그러나, RetroMAD1는 FIPV에 대해서는 효능을 나타내지 않았다. 일화적인 실험 결과가 다음과 같은 3 명의 수의사에 의해서 제공되었다:
(i) Dr Tan Thiam Khoon (2010년 7월 22일-2011년 10월 1일까지 실험)
Klinik Haiwan & Surgeri Wawasan
27, Jalan Wawasan 2/22, 47100 Puchong, Malaysia.
Tel: 03-58826422
(ii) Dr B. P. M. Mohanakrishnan (2011년 10월 24일-12월 3일까지 실험)
Hari Pet Clinic & Surgery
No 45, Jalan Chengal, Taman Batu Pahat,
8300 Batu Pahat, Johor, Malaysia
Tel: 07-4349699
(iii) Dr V. C. Vasavan (2011년 8월 5일-12월 16일까지 실험)
8, Jalan Hj. Abdul Aziz Awab,
Kluang Baru,
86000 Kluang, Johor, Malaysia.
Tel: 07-7745000
Figure pct00012
[표 8] 결과 요약
상기에 나타낸 바와 같이, FIV의 11 증례, FeLV의 11 증례, 및 CPV의 34 증례에 대한 말레이시아의 3 명의 등록 수의사에 의한 일화적 증거는 RetroMAD1로 치료하였을 때, 각각 81.8%, 73% 및 76.47%의 증후적 회복율을 제공하였으며, 수의사의 전문적 견해로 이들 획복율은 개업 수의사로서의 그들의 수십 년간의 오랜 경험에 근거하여 비-치료된 사례에 비해서 매우 유의적인 개선이었다.
실시예 5
말초혈액 단핵구 세포 ( PBMC )의 제조
PBMC를 분리하고, 혈액 샘플을 밀도 구배 원심분리 방법에 의해서 10 ㎖ 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)코팅된 튜브 내로 수집하였다. 이것을 RPMI-1640 (HyClone)에 의해서 1:3의 비로 희석하고, 림포프레프 (Lymphoprep) (Axis-Shield) 상에 적층시키고, 2000 rpm에서 30 분 동안 원심분리시켰다. 원심분리 중에, PBMC를 혈장으로부터 이동시키고, 밀도 구배로 현탁시켰다. PBMC를 RPMI-1640으로 2 회 세척하고, 이어서 RPMI-1640 배지로 세척하였다. 세포 생존도는 트립판 블루 배제 방법에 의해서 측정하였다. 이 연구에서 사용된 PBMC 세포 밀도는 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰당 1 x 106 세포였다. 비-호지킨 림프종 환자의 PBMC를 12 가지 상이한 농도의 RetroMAD1과 72 시간의 기간 동안 배양하였다. 세포 생존도는 약물 농도의 범위가 0.05 ㎍/㎖로부터 3.13 ㎍/㎖로 증가함에 따라 감소하는 것으로 확인되었다. 세포는 6.25 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖의 약물 농도 범위에서 가장 잘 생존하는 것으로 확인된다 (표 9).
Figure pct00013
[표 9] RetroMAD1의 12 가지 희석액에 의한 동시 처리 및 그의 각각의 세포 생존도 백분율
시험관내 바이러스 억제시험
RetroMAD1의 시험관내 바이러스 억제시험은 세포를 동시에 처리하여 96 웰 플레이트의 웰에서 삼중으로 수행되었다. RetroMAD1의 12 개의 희석액 (스톡의 농도: 100 ㎍/㎖)을 사용하여 정상 및 감염된 PBMC 둘 다를 동시에 처리하고, 플레이트를 72 시간 동안 인큐베이션시켰다. 72 시간의 인큐베이션 시간 후에, 배양물을 수거하였다. 결과는 도 6 및 7에 나타낸다. RetroMAD1은 동일한 성별 및 유사한 연령 그룹의 정상 공여체로부터 분리된 PBMC의 생존도에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (도 7). 따라서, RetroMAD1는 초미세구조가 바이러스 감염 또는 암 또는 둘 다에 의해서 변화된 세포를 표적화하는 그의 보고된 능력에 기인하여 변칙적인 PBMCs의 감소를 선택적으로 야기할 수 있는 것으로 보인다. 이것은 RetroMAD1의 MAP30 부분이 정상 PBMC에 비해 특정의 백혈병 세포에 대해 10 배 더 선택적인 독성을 나타내었기 때문이다 [Lee-Huang, S. et al.,2000].
실시예 6
세포 배양
베로 (아프리카 그린 원숭이의 신장으로부터 유도됨), LLC-MK2 (레수스 원숭이의 신장으로부터 유도됨) 및 BHK21 (새끼 햄스터의 신장으로부터 유도됨) 세포주를 포함한 포유동물 세포주 (Medical Microbiology Dept., Faculty of Medicine, Universiti Malaya, Kuala Lumpur, Malaysia로부터)를 5% CO2 존재 하의 가습 인큐베이터 (humidified incubator) 내의 37℃에서 2% 태아 소혈청 (FBS) 및 44.04 mmol/ℓ 중탄산나트륨이 보충된 DMEM (HyClone)의 1X 농축된 성장 배지 내에서 유지시켰다. 정상 인간 세포주 (Medical Microbiology Dept., Faculty of Medicine, Universiti Malaya, Kuala Lumpur, Malaysia로부터)로서 창의 간 (Chang's Liver) (인간 간으로부터 유도됨)은 2% FBS 및 44.04 mmol/ℓ 중탄산나트륨이 보충된 DMEM (HyClone)의 1X 농축된 성장 배지 내에 유지되었으며, 그 반면에 NL20 (정산 인간 폐로부터 유도됨) 및 184B5 (인간 유방으로부터 유도됨)는 각각 2% FBS가 보충된 DMEM/F-12 배지 (Gibco) 및 포유동물 상피 성장 배지 (MEGM) 내에 유지되었고, RWPE-1 (인간 전립선으로부터 유도됨)은 2% FBS가 보충된 각질세포 무혈청 배지 (Gibco) 내에 유지되었다. CCD-1127SK (정상 인간 피부로부터 유도됨)는 2% FBS가 보충된 이글 (Eagle) 최소 필수 배지 내에 유지되었다. 이들 세포주는 5% CO2 존재 하의 가습 인큐베이터 내의 37℃에서 유지시켰다. C6/36 세포 (Medical Microbiology Dept., Faculty of Medicine, Universiti Malaya, Kuala Lumpur, Malaysia로부터)는 CO2의 부재 하에 28℃에서 10% FBS가 보충된 레이보비츠 L-15 (HyClone)의 1X 농축된 성장 배지 내에 유지되었다.
RetroMAD1 의 세포독성
RetroMAD1의 세포독성은 세포 형태학, 생존도 및 성장에 대한 화합물의 효과를 평가함으로써 모니터링하였다. 웰당 1 x 105 세포를 96-웰 플레이트 내에서 RetroMAD1의 존재 또는 부재 하에, 최적 조건에서 삼중으로 접종하고, 플레이트는 어떤 변화가 있는지에 대해 매일 관찰하였다.
RetroMAD1 의 최대 비-독성 용량 ( MNTD )
시험관내 세포독성 분석을 RetroMAD1에 대해 수행하여 본 실험에서 사용된 모든 세포주에 대한 최대 비-독성 용량 (MNTD)을 결정하였다. RetroMAD1의 농축된 스톡을 96-웰 플레이트 내의 세포의 전-플레이팅된 단일층에 첨가하기 전에 각각의 배지 (사용된 세포주에 따라 좌우됨)로 6 개의 농도 (200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖ 및 6.25 ㎍/㎖)로 희석하였다. 시험관내 MNTD 결정을 위한 일련의 적합한 대조군이 매 플레이트 내에 포함되었으며, 플레이트는 최적 조건에서 배양한다. 결과는 도 8에 나타낸다.
세포 생존도 평가
세포 배양은 제조자의 프로토콜에 따라 MTS-셀타이터 (CellTiter) 96® AQueous 비-방사성 세포 증식시험 (Promega, USA)에 의해 3 개의 시점, 즉 24 시간, 48 시간 및 96 시간에 분석하였다 [Malich et al., 2004]. 결과는 도 9에 나타낸다.
RetroMAD1은 100 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 다양한 세포주에 대해 억제효과를 갖는 것으로 확인되었다. RetroMAD1의 MNTD는 100 ㎍/㎖인 것으로 측정되었다.
실시예 7
경구 송달의 증거
PCR을 통해서 확인된 것으로서 간췌장 파르보바이러스 (HPV)에 의해 천연적으로 감염된 것으로 확인된 총 47 마리의 새우 (Palaemonetes sp)가 사용되었다. 2 개의 탱크를 바이오시큐어 (bio-secure) 실험실 내에 구성하였으며; 제1 탱크는 대조 목적이었고, 제2 탱크는 RetroMAD1로 처리하기 위한 것이었다. 처리 그룹에게는 4일 동안 매일 3 회씩, 사료의 g당 100 ng의 RetroMAD1 (계면활성제인 나트륨 데옥시콜레이트와 조합되며, 이 경우에 계면활성제의 농도는 약 0.05 중량%였다)를 제공하였다. RetroMAD1은 새우 사료에 의해서 흡수되었으며, 매일 제공되었다.
DNA 추출은 '염석 (salting-out)' 절차를 사용하여 수행되었다. PCR은 HPV의 검출을 위한 특정의 프라이머를 사용하여 수행되었다. 사용된 프라이머는 fHPV: 5'-ACA-CTC-AGC-CTC-TAC-CTT-GT 3' (서열번호 9) 및 rHPV: 5' -GCA-TTA-CAA-GAG-CCA-AGC-AG-3' (서열번호 10)였다. 양성 검출은 441 bp의 크기를 갖는 PCR 생성물을 생성시킬 것이다.
아가로즈 겔 결과는, 대조 탱크 (도 10A)에서 22/23 새우가 HPV에 의해서 감염된 반면에 처리 탱크 (도 10B)에서는 22/24가 HPV에 대해서 음성이었음을 나타내었다. 이것은 경구적으로 투여된 RetroMAD1이 시험 동물로부터 완전하게 HPV를 제거한 것으로 보이는 것으로 나타났다.
실시예 8
경구 송달의 추가 증거
상업적 부화장으로부터 수득된 SPF (특정한 병원체가 없는) 유생-후 생물로부터 연못에서 기른 8g±0.5g의 평균 체중을 갖는 흰다리 새우 (White Leg Shrimp) 페나우스 바나메이 (Penaeus vannamei)를 사용하였다. 연못으로부터 산소화된 용기에 옮긴 후에, 이들 동물을 우선 14일의 기간 동안 바이오시큐어 (BioSecure) 실험 탱크 내에 순응시켰다. 각각의 탱크는 100 L 탱크 내에서 사육된 20 마리의 새우로 구성되었다. 새우에게는 1일에 체중의 약 3.5%에 해당하는 4 회의 식사를 제공하였다. 마지막으로, 이들은 최근에 흰반점 증후군 바이러스 (White Spot Syndrome Virus (WSSV))-사멸된 연못으로부터 수득한 PCR 양성 새우로부터의 동결된 살을 체중의 약 4%로 공급함으로써 시험접종하여 경구적으로 감염시켰다. 감염의 24 시간 후에, RetroMAD1(계면활성제인 나트륨 데옥시콜레이트와 조합되며, 이 경우에 계면활성제의 농도는 약 0.05 중량%였다)는 공급하기 전에 펠렛에 15 분 동안 흡수하도록 두어 사료의 g당 0.1 ㎎으로 투여하였다.
비처리 대조군에서, 사망은 시험접종-후 3일에 시작하였으며, 8일까지 20 마리의 동물 중의 거의 모두가 사망하였다. 시험접종-후 9일까지, 100% 사망률이 대조군 탱크에서 관찰되었으며, 이것은 사용된 WSSV-감염됨 사체가 경구 감염 후 9일 이내에 아주 100% 사망률을 야기할 수 있었음을 보여준다. 결과는 RetroMAD1이 WSSV에 의한 급성 사망으로부터 시험접종 받은 동물을 보호하는데 성공하였음을 시사한다 (도 11).
실시예 9
ICR ( Imprinting Control Region ) 마우스에서의 급성 독성 시험
성숙한 수컷 및 암컷 ICR 마우스 (6-8 주령)를 쿠알라룸푸르의 University of Malaya, Faculty of Medicine, Animal House로부터 입수하였다 (Ethics No. PM 07/05/2008 MAA (a) (R)). 마우스는 체중이 25-35 g 사이였다. 동물에게는 표준 랫트 펠렛 및 수돗물을 제공하였다. 급성 독성 시험을 사용하여 RetroMAD1에 대한 안전 용량을 결정하였다. 36 마리의 마우스 (수컷 18 마리 및 암컷 18 마리)를 3 개의 그룹으로 나누고, 각각의 그룹에게는 경구적으로 (a) 비히클 단독 (생리식염수, 5 ㎖/㎏); (b) 생리식염수 중에서 제조된 RetroMAD1 0.105 ㎎/㎏ 및 생리식염수 중에서 제조된 RetroMAD1 1.05 ㎎/㎏을 1 회 급여하였다. 동물은 투약하기 전에 밤새 금식시켰다 (사료는 금식이지만 물은 아님). 사료는 투약 후에 추가로 3 내지 4 시간 동안 금지하였다. 동물은 투여 후에 30 분, 및 2, 4, 8, 24 및 48 시간 동안 임상적 또는 독성학적 증상의 발현에 대해서 관찰하였다. 존재한다면, 사망률은 2 주일의 기간에 걸쳐서 관찰하였다. 동물은 14일째에 금식시키고, 15일째에 케타민 마취제를 과잉투여하여 희생시켰다. 조직학적, 혈액학적 및 혈청 생화학적 매개변수는 표준 방법에 따라 측정하였다 [Bergmeyer, 1980; Tietz et al., 1983]. 결과는 표 10에 나타낸다.
상기 연구는 말레이시아의 University of Malaya, Faculty of Medicine의 동물실험에 대한 윤리위원회에 의해서 승인되었다. 모든 동물은 National Academy of Sciences에 의해서 작성되고, National Institute of Health에 의해서 공표된 "Guide for the Care and Use of laboratory Animals"에 개략적으로 기술된 기준에 따라 인간의 관리를 받았다.
Figure pct00014
[표 10] 대조군 및 시험 ICR 마우스로부터 측정된 것에 대해 시험을 수행함으로써 수득된 조직학적, 혈액학적 및 혈청 생화학적 매개변수의 결과
표 9의 결과는 암컷과 수컷 사이 및 처리군 (저 및 고용량)과 대조군 사이에 큰 차이가 없는 것을 보여준다. ICR 마우스에서 간 및 신장의 조직병리학의 결과는 또한, 암컷과 수컷 사이 및 처리군 (저 및 고용량)과 대조군 사이에 큰 차이가 없음을 나타내었다. 이들 결과는 RetroMAD1의 투여가, 3 명의 별도의 수의사에 의해서 상당한 증후적 회복이 관찰된 고양이 및 개를 치료하기 위해서 사용된 용량 (표 B)의 50x 및 500x로 약물이 투여된 IRC 마우스에 대해서 비독성이거나 적어도 최소의 독성인 것으로 생각될 수 있음을 확인한다.
실시예 10
영장류 독물학
체중이 1.5-1.7 ㎏인 마카카 파시큘라리스 (Macaca fascicularis) 교배종인 15 마리의 건강한 수컷 및 암컷 원숭이 (12-18 개월령)를 사용하였다. 원숭이를 그룹당 5 마리씩 분류하였다; 대조군 (RetroMAD1 처리 없음), 저용량 (0.2 ㎎/체중 ㎏) 및 고용량 (2.4 ㎎/체중 ㎏). 본 연구를 위해서 저용량 및 고용량으로 확립된 투약량은 실제로 동등 표면적 투약량 전환인자 (Equivalent Surface Area Dosage Conversion Factors)로부터 계산된 마우스 용량의 4 배 및 48 배이다. 각각의 그룹의 동물에게는 그들의 실제 사료에 혼입된 RetroMAD1의 상응하는 용량 수준로 투여하였으며, 4 주일의 기간 동안 1일 2 회 제공하였다.
모든 동물은 시험기간 전체에 걸쳐서, 및 투약-후 2 개월 후에 활동적인 것으로 관찰되었다. 모든 혈액학적 매개변수는 정상 범위 내에 있었다. 3 개의 그룹 모두에서 헤마토크릿, 평균 혈구 용적 (mean corpuscular volume), 트롬보시트 (thrombocit), 단핵구 및 일부의 호산성 과립구는 정상 범위를 벗어나는 값을 나타내었지만, 차이는 최소이다 (허용할 수 있는 값) (표 11A 및 11B).
반면에, 혈액 화학 시험에서 정상 범위 내에 있지 않은 유일한 매개변수는 글로불린이었지만, 차이는 단지 매우 미미하다 (허용할 수 있는 값). 그러나, 가장 명백한 차이는 클로라이드에 있다. 이것은 이온의 작용성과 관련하여 동물의 지혈상태에서의 출혈의 영향에 기인하는 것으로 예상된다 (표 12).
각각의 그룹으로부터 한 마리의 동물을 안락사시켜 조직병리학적 관찰을 수행하였다. 조직병리학적 결과는 RetroMAD1의 고용량 수준이 아미도 검사한 특정의 기관에 대해 독성 효과를 유발할 수 있음을 강력하게 시사한다. 고용량 그룹에서의 기관 중에서 폐, 간, 장 및 신장이 상당한 병변을 나타내었다. 대조군 (비처리) 및 저용량 그룹에 속하는 대표적인 동물에서 발견된 병변은 다른 원인에 기인할 수 있었다. 투여된 저용량 및 고용량은 각각 정상 용량의 4 배 및 48 배에 해당한다. 따라서, 50x 및 500x 단일 용량은 ICR 마우스에서 어떤 감지할 수 있는 독성을 나타내는 것으로 보이지 않는 반면에, 원숭이에게서 48x 수회 용량은 기관에서 상당한 병변을 나타내어, 인간 치료를 위한 용량은 고양이 및 개에게 사용된 용량의 대략 1-4 배여야 함을 시사한다. 이 연구는 AAALAC에 의해서 인정된 필리핀의 Simian Conservation Breeding & Research Centre Inc. (SICONBREC)에서 수행되었다. 소개된 설명은 University of Philippines Los Bafios의 College of Veterinary Medicine으로부터의 수의학 전문가에 의해서 제공되었다.
Figure pct00015
[표 11A] 평균 혈액학 데이터 - 독성
Figure pct00016
[표 11B] 평균 혈액학 데이터 - 독성
Figure pct00017
[표 12] 평균 혈액 화학 데이터 - 독성
이들 결과는 RetroMAD1이 독성 용량이 매우 큰 안전한 약물임을 입증한다. 실시예 10 및 11에서 사용된 두문자어 및 기준은 이하의 표 13에 제시된다.
Figure pct00018
[표 13] 혈액학 실험에서 사용된 범례
실시예 11
영장류 모델에서 RetroMAD1 을 사용한 치료
시미안 로타 바이러스 (Simian Rota Virus) A에 의해서 감염된 것으로 확인된 체중 1-1.7 ㎏인 10 마리의 병이 있는 시노몰구스 원숭이를 본 실험을 위해서 분리하였다. RNA를 그들의 분변 샘플로부터 추출하여 PCR에 의해 로타 바이러스에 관해 시험하였다. 원숭이는 다음의 그룹당 5 마리씩으로 분류하였다; 대조군 (RetroMAD1 치료 없음) 및 치료군 (0.2 ㎎/체중 ㎏). RetroMAD1은 4 주일의 기간 동안 각각 20 ㎖의 세레락 (Cerelac)을 또한 포함하는 그들의 매일의 사료에 포함시켰다. 대조군은 시험기간의 11일째 및 14일째에 초래된 3 마리의 사망 (60% 사망률)이 있었다. 이 배취의 동물은 열등 내지 무난한 상태를 갖는 것으로 관찰되었다. 치료군은 활동적이었다. 치료된 동물은 모두 생존하였다 (0% 사망률). 본 실험은 필리핀의 SICONBREC 시설에서 수행하였다. 소개된 설명은 University of Philippines Los Bafios의 College of Veterinary Medicine으로부터의 수의학 전문가에 의해서 제공되었다.
영향을 미친 혈액학 매개변수는 HGB, HCT, RDWc, PLT 및 PCT이다. PLT는 가장 필적할만한 데이터를 나타내었다. 비처리 대조군 및 병이 있는 치료군은 둘 다 수득된 값의 정상 범위보다 상당히 더 큰 값을 나타내었다. 정상값의 상한은 586.0 (103/㎕)인 반면에 대조군에서 최종-출혈 양은 596.0 (103/㎕)이고, 치료군에서의 최종-출혈 양은 627.4 (103/㎕)였다. 전문가에 의해서 제공된 이론적 해석은 이들 매개변수의 더 큰 값은 감염을 구제하는데 반응하는 신체의 방어기전에 기인한다는 것이다 (표 14A 및 B).
병이 있는 배취의 원숭이의 혈액 화학은 행해진 치료에 대한 원숭이의 자연적 반응의 좋은 징조인 대조군 및 치료군에서의 다양한 결과를 갖는다. 대조군에서 BUN, CREA 및 TP는 병태생리학과 관련될 수 있는 각각의 매개변수로부터 수득된 값의 범위의 최소값 이하였다. 글로불린에 대한 알부민의 비율은 정상이다. 하나의 단백질이 적어지게 되면 다른 단백질은 혈액의 콜로이드성 삼투압의 균형을 맞추기 위해서 보상하려고 할 것이다. 이것은 대조군 및 치료군 둘 다에서 알부민의 낮은 값과 대조군 및 치료군 둘 다에서 글로불린의 더 높은 값으로 나타난다. 이온 클로라이드, K 및 Na도 마찬가지로 영향을 받는다. 출혈과 함께 설사가 있는 것은 이들 이온에 대한 다양한 결과에서 나타나는 바와 같이 체액-전해질 평형에 크게 영향을 미칠 수 있다 (표 15).
Figure pct00019
[표 14A] 평균 혈액학 - 병이 있음
Figure pct00020
[표 14B] 평균 혈액학 - 병이 있음
Figure pct00021
[표 15] 평균 혈액 화학 - 병이 있음
실시예 12
최기성 ( teratogenicity ) 연구
30 마리의 임신 1일된 성숙한 암컷 스프라그 다우리 (Sprague Dawley) (SD) 랫트를 무작위로 3 그룹으로 분류하고, 각각의 그룹에게는 (a) 멸균 증류수 (1 ㎖/체중 ㎏, 0.2 ㎖/200 g 랫트); (b) 생리식염수 내에서 제조된 RetroMAD1 5 ㎎/㎏ 및 (c) 생리식염수 내에서 제조된 RetrOMAD1 10 ㎎/㎏을 경구적으로 공급하였다. 상기 언급된 처방은 임신 1일부터 20일까지 성숙한 암컷 랫트에 대해 수행하였으며, 분만 후 21일 동안 계속하였다.
1일부터 20일까지 처리된 임신한 랫트의 체중 ㎏당 10 ㎎의 약물에서 모체 독성 또는 배발생성 (embryogenicity)의 징후는 없다. 여기에서는 외부 태아 이상도, 성장 지연도, 태아 사망도 없다. 약물의 저용량 및 고용량을 투약 (임신 1 내지 20일)한 후에 어미 (모체)의 체중 증가는 정상 대조군과 필적하였다. 임신한 랫트 중의 어떤 것도 조산하지 않았다. 임신의 지속기간은 RetroMAD1에 의해서 영향을 받지 않았다.
약물-처리군과 정상 대조군 사이에서 어미-새끼 상호작용에서 관찰된 차이는 없었다. 각각의 어미는 돌볼 수 있었고, 각각의 새끼는 젖을 빨 수 있었다. 언제 새끼가 모발이 성장하거나, 기거나, 앉거나, 젖을 떼기 시작하였는지에 관해서 그룹들 간에 관찰된 차이는 없었다. 수동 및 능동적 수유 및 새끼 털손질의 빈도는 약물-처리군과 정상 대조군에서 동등하게 유지되었기 때문에, 태아기 약물 처리는 새끼에 대한 모체 행동을 크게 변화시키지 않는다. 약물-처리된 어미에게서 어미-관련된 행동 (자체-털손질, 먹기 및 마시기, 및 능동 또는 수동적인 유주성 (wandering))의 빈도는 또한 정상 대조군 어미와 동등하였다. 둥지-틀기 행동의 빈도는 약물-처리된 모체와 정상 대조군 모체에서 유사하였다.
약물로 처리된 어미는 분만 후에 정상적으로 진행하여 21일에 종료되었다. 약물-처리된 어미는 어떤 비정상적인 타입의 행동도 나타내지 않았으며, 이들은 임신 전체에 걸쳐서 정상 대조군 어미와 신체적으로 구별될 수 없었다. 정상 대조군과 약물-처리된 새끼의 전체적인 외관은 건강하였으며, 한배 새끼의 수 및 새끼에서 어떤 차이도 나타나지 않았다. 대조군 및 약물-처리군의 임신 기간에서 차이는 발견되지 않았고, 한배 새끼의 수 또는 사산된 새끼의 수에서도 차이는 관찰되지 않았다.
기형의 외적인 징후는 새끼에게서 검출되지 않았다. 정상 대조군과 비교한 약물 처리군 사이에서 새끼에게서의 사망은 없었다. PND 1부터 PND 21까지에서 약물-처리군과 대조군 사이에서 평균 새끼 체중에서의 차이는 없었다. 한배당 새끼의 수에 있어서도 모체 그룹들 사이에서 차이는 없었다. 그룹들은 사산의 수, 생존도 지수, 및 수유 지수에 있어서 다르지 않았다. 약물-처리군과 정상 대조군 (PND 1 내지 21) 사이에서 새끼의 체중, 길이 또는 성장률의 유의적인 차이는 없었으며, 이것은 태아기 약물 처리에 의해서 영향을 받지 않은 정상적인 태아기 성장을 시사한다.
신체 발육 마커는 약물 처리 효과를 나타내지 않았다. 모든 그룹은 치아 맹출 (생후 9일) 및 눈 오프닝 (openings) (생후 14일)을 나타내었다. 약물-처리군의 새끼는 이개 개전 (pinna detachment)의 시기에 있어서 그들의 정상 대조군 대응자와 상이하지 않았다. PND 4까지, 모든 그룹의 새끼는 모두 이개 개전되었다. 약물-처리된 모체에게서 태어난 새끼는 치아 맹출의 시기 및 눈 오프닝의 시기에 있어서 정상 대조군 새끼와 다르지 않았다. 약물-처리군에서 새끼의 운동성 활동량은 정상 대조군의 경우와 동등하였다.
실시예 13
생체이용률의 증거
RetroMAD1은 약동학 데이터는 6-8 주령의 암컷 ICR 마우스로부터 유도되었다. 마우스 (48)에게는 10일 동안 경구적으로 제공되는 0.2 ㎎/체중 ㎏의 50X 용량인, 마우스당 70 ㎕의 RetroMAD1의 단일 용량을 투여하였다. 매일의 혈액 샘플은 3 마리 마우스 및 한 마리 대조군의 심장으로부터 배출시켰다. 공급 후 제1일 동안에 혈액은 경구 투여 후 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간 및 12 시간 후에 수거하고, 다음날에는 (제10일까지) 혈액을 투여 후 단지 30 분 후에 수거하였다. 매 시점은 약물을 경구적으로 공급한 3 마리의 마우스와 PBS 만을 제공한 한 마리의 대조군으로 구성되었다. RetroMAD1의 혈장 농도는 내부 개발된 ELISA를 사용하여 측정되었다.
마우스 혈청에서 RetroMAD1 을 검출하기 위한 ELISA : 항 인간- IgG - HRP 를 사용하는 내부의 포획 ELISA
포획 항체를 제조하기 위해서 고양이에게 RetroMAD1을 매일 (1X 실시예 4에 나타낸 고양이 용량) 경구적으로 공급하고, 6 개월 후에 혈액을 수확하여 혈청을 추출하였다. 이 혈청을 포획 항체로 사용하였다. 코팅 완충액 (0.2 M 탄산나트륨-중탄산나트륨, pH 9.6) 내에 1:80으로 희석된 이 폴리클로날 고양이 항-RetroMAD1 항체 100 ㎕/웰을 96-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트 상에 흡착시켰다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS 1x 중의 0.05% 트윈-20으로 3 회 세척하였다. PBS 중의 0.05% BSA에 1:2로 희석된 마우스 혈청 100 ㎕/웰을 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 플레이트를 마찬가지로 세척하고, PBS 중의 0.05% BSA에 1:2000으로 희석된 항 RetroMAD1 양성 인간 혈청 100 ㎕를 첨가하였다.이 항체는 말레이시아의 University Malaya의 Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology로부터 수득하였다. 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 플레이트를 세척하고, PBS 중의 0.05% BSA에 1:6000으로 희석된 토끼 항-인간 IgG HRP 컨주게이트 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 37℃에서 1 시간 동안 암소에서 인큐베이션시킨 후에, 플레이트를 세척하고, 100 ㎕/웰의 OPD를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 암소에서 실온으로 30 분 동안 인큐베이션시키고, 반응을 50 ㎕/웰의 4N H2SO4를 사용하여 정지시켰다. 흡광도 (OD)는 배경으로서 490 ㎚ 및 600 ㎚에서 측정하였다. 그 후, 모든 OD 판독치는 로그 (Log) 값으로 전환시켜 ㎍/㎖로 농도를 수득하였으며, 표준 곡선은 도 12에 제공된다. 시험의 결과는 표 16 및 도 13A 및 B에 제공된다. PK/PD 데이터는 RetroMAD1이 약 0.2 ㎍/㎖로 공급한 지 30 분 후만큼 빠르게 혈청 내에서 검출되었고, 이것은 1-2 시간에 1-1.1 ㎍/㎖로 최대에 도달한 후에 4 시간에 약 0.2 ㎍/㎖로 다시 떨어졌음을 나타내었다. 공급 후 12 시간까지, 수준은 비공급 대조군과 거의 유사하였으며, 이것은 단백질이 완전히 대사되었음을 나타낸다. 다음날의 공급 후 30 분의 매일의 샘플링은 약 0.2 ㎍/㎖의 수준을 나타내었다. 이들 데이터는 약물의 생체이용률을 시사한다.
Figure pct00022
[표 16] 생체이용률 시험의 결과
실시예 14
열안정성 실험
다양한 온도 하에서의 단백질 안정성은 RetroMAD1을 통상적인 냉장고 내의 4℃에서, 좁은 온도 범위를 유지하는 24 시간 에어-컨디셔닝 (air-conditioning)을 갖는 실험실 내의 27℃±1℃에서, 37℃로 설정된 통상적인 인큐베이터 오븐 내에서, 및 50℃로 설정된 실험실 오븐 내에서 다수의 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브 (Eppendorf tubes)에 유지시킴으로써 측정되었다. RetroMAD1은 41.2 kDa의 단백질이기 때문에, 이것을 SDS-PAGE 겔 상에 주행시키고, 4℃에서 저장된 샘플의 겔 밴드를 다른 온도에서 저장된 것과 비교함으로써 그의 안정성이 밝혀질 것이다. 7일까지, 겔의 강도는 50℃까지 온도와는 무관하게 동일하게 유지시켰다. 30일까지, 강도는 4℃, 27±1℃ 및 37℃에서 저장된 샘플의 경우에 유사하였다. 불행하게도, 50℃의 샘플은 30일 동안 유지되지 않았다. 도 14에 나타낸 바와 같은 결과를 기초로 하여, RetroMAD1는 1 주일 동안 50℃까지 및 1 개월 동안 37℃까지에서 안정하다.
실시예 15
HPLC 검출방법
검출방법을 최적화하고, HPLC를 사용함으로써 RetroMAD1에 대한 검출 한계를 결정하기 위함.
1 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖ 범위의 다양한 농도는 3.5 ㎎/㎖의 RetroMAD1 스톡 용액을 밀리큐 (miliQ) 물로 희석함으로써 제조하였다. 10 ㎕의 RetroMAD1를 주입하고, 이동상의 조성이 전체 용출 중에 일정하게 유지되는 등용매 용출로 칼럼으로부터 용출시켰다. RetroMAD1은 280 ㎚에서 UV 흡수에 의해서 검출되었다. 데이터는 크로마토그램으로부터 분석되었다. 최적화는 피크가 분할될 때까지 반복하였다.
크로마토그래피 매개변수의 변화
크로마토그래피 매개변수는 분할된 피크를 얻도록 조정하였다. 조정된 매개변수는 이동상의 농도 및 비, UV 흡수의 범위, 주행 시간 및 온도이다. RetroMAD1의 크로마토그래피 검출은 1.0 ㎖/분의 유속, 280 ㎚에서의 UV 검출 및 15 분의 주행 시간에서 0.01 M 포스페이트 완충 식염수 pH 7.2 및 아세토니트릴 (50:50)을 포함하는 이동상과 함께 정지상으로서 에클립스 (Eclipse) XDB-C8 칼럼 (4.6 x 250 ㎜) 5 ㎛를 사용함으로써 수행되었다.
도 15에서 나타낸 바와 같은 크로마토그램은 HPLC를 사용한 RetroMAD1의 검출의 결과이다. 1.2 분에서의 첫 번째 피크는 비결합 화합물이 첫 번째로 용출되었을 경우이며; 1.4 분에서의 두 번째 피크는 UV에 의해서 야기된 배경이다. 6.8 분에서의 피크는 RetroMAD1이 검출된 경우이다. 현재 최적화된 HPLC 검출 조건은 정지상으로서 에클립스 XDB-C8 칼럼 (4.6 x 250 ㎜) 5 ㎛를 사용함으로써 15 분 이내의 A: 0.01 M 포스페이트 완충 식염수 (50%) 및 B: 아세토니트릴 (50%)에 의한 등용매 용출, 30℃의 칼럼 온도, 유속 1 ㎖/분; UV 검출 280 ㎚이다. 또한, RetroMAD1의 현재의 검출 한계는 50 ㎍/㎖이다.
실시예 16
A-B 및 B-C 조합의 항바이러스 활성
RetroMAD1이 상당한 항바이러스 활성을 나타낸 것을 발견한 후에, A-B; B-A뿐만 아니라 B-C; C-B 배열 내의 성분 폴리펩타이드의 항바이러스 활성을 시험하도록 결정하였다. 폴리펩타이드 A (레트로사이클린 101)를 RetroMAD1에 의해서 이미 수행된 것과 동일한 방식으로 폴리펩타이드 B (모르모디카 항-HIV 단백질 30)와 융합시켰다. 그 후, 폴리펩타이드 B를 폴리펩타이드 C (더마셉틴 1)와 융합시키고, 처리-후 항-HSV2 활성을 RetroMAD1에 의해서 이미 수행된 것과 동일한 방식으로 비교하였다. N 및 C 말단에서의 부착의 효과를 측정하기 위해서, A-B는 또한 B-A로서 발현시키고, B-C는 또한 C-B로 발현시켰다. 봉입체로 발현된 이들 단백질의 증거는 도 16에서 발견된다.
용량-의존적 바이러스 감소는 모든 증례에서 나타났다. 단지 A-B 융합 단백질만이 RetroMAD1 (A-B-C)에 대한 후-처리에서 HSV-2에 대한 초기 시험과 동등한 결과를 제공하였다. 또한, A-B는 B-A보다 탁월하여 N 또는 C 말단 부착이 차이를 만들었음을 밝혀내었다. 결과는 표 17 및 도 17에 나타낸다.
150 ㎍/㎖에서, A-B는 72 시간째에도 감소되지 않는 매우 높은 항바이러스 활성을 지속적으로 제공한 반면에 B-A의 경우에는 항바이러스 활성이 시간의 경과에 따라 선형 방식으로 감소하였음이 분명하였다. 유사한 경향은 또한 B-C의 경우에 나타났지만, C-B의 경우에는 최고 용량의 경우에 72 시간째에 무시할 수 있는 정도의 항바이러스 활성이었다.
단지 폴리펩타이드 A (레트로사이클린 101) 및 B (MAP30)가 HSV2의 항바이러스 시험에 사용된 경우에, 후처리 결과는 B의 N 또는 C 말단에서 A의 위치가 펩타이드의 항바이러스 활성에서 상당한 차이를 만들었음을 나타내었다.
Figure pct00023
[표 17] 봉입체 내의 약물, 후처리 단독
실시예 17
폴리펩타이드 A, B 및 C의 다른 조합에 대한 실험
RetroMAD1 이후에 제2의 잠재적 선도 약물을 어떻게 쉽게 개발하는지를 연구하기 위해서 또 다른 4 개의 융합 단백질 조합을 시험하도록 결정하였다. 이들은 다음과 같았다:
AVBD103 - MAP30 - 마이틸린 (MYTILIN) C10C (아마틸린 (Amatilin))
레트로사이클린 - GAP31 - 더마셉틴1 (RetroGAD1)
HKABF - PAP1 - V1 (쿠다판 (Kudapan))
CAD - TAP29-DAP30 - 라타르신 (LATARCIN) 2A (카타다르신 (Catadarcin))
아마틸린은 폴리펩타이드 A로서 펭귄으로부터의 비-θ-디펜신인 조류 β-디펜신 103 (AVBD103), 폴리펩타이드 B로서 RetroMAD1로서 사용된 MAP30, 및 폴리펩타이드 C로서 홍합으로부터의 양이온성 항미생물 펩타이드인 마이틸린 C10C를 포함한다.
RetroGAD1은 MAP30을 폴리펩타이드 B인 GAP31로 대체시킨 것을 제외하고는 RetroMAD1과 유사하였다.
쿠다판은 폴리펩타이드 A로서 CAP, 히포캄푸스 쿠다 (Hippocampus kuda) 항박테리아 인자 HKABF, 폴리펩타이드 B로서 포크위드 항바이러스 단백질 1, RIP, 및 폴리펩타이드 C로서 단지 V2로서 공지된 새로운 서열 (V2는 'De Novo design of potent antimicrobial peptides' - Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2004)pg 3349-3357에 제시된다)을 포함하였다.
카타다르신은 2 개의 CAP 이종 반복체를 포함하였으며, 여기에서 CAD는 폴리펩타이드 A1 및 A2로서 세크로핀 A 및 세크로핀 D 탄뎀 서열이었다. 폴리펩타이드 B는 전체 DAP30 RIP 서열과 융합된 TAP29 RIP의 활성 코어 단편을 포함하는 반면에 라타르신 2A는 거미 항미생물 펩타이드 라타르신의 상동성 탄뎀 반복체였다.
세포 및 바이러스
베로 세포 (아프리카 그린 원숭이 신장 세포주)는 American Type Culture Collections (Rockville, MD)로부터 입수하였다. 이들을 HSV-2에 대한 숙주 세포로 사용하였다. 세포를 10% 태아 소혈청 (FBS)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)를 사용하여 배양하였다.
단순 포진 2 (HSV-2) 바이러스 스톡은 75 ㎠ 조직 배양 플라스크 내의 베로 세포의 단일층을 2% FBS를 함유하는 유지 배지 내의 바이러스로 접종함으로써 수득하였으며, 세포는 세포변성 효과 (CPE)가 확인될 때까지 4일 동안 37℃에서 번식을 계속하도록 하였다. 그 후, 세포 및 상등액을 온화하게 피펫팅함으로써 수확하였다. 세포 파편을 1500 rpm에서 10 분 동안 원심분리시킴으로써 제거하였다. 바이러스 상등액을 1.5 ㎖ 튜브 내로 분취하고, 더 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
플라크 시험에 의한 바이러스 적정
HSV-2 병독성은 베로 세포를 사용한 플라크 시험에 의해서 적정하였다. 간략하면, 베로 세포를 2% FBS를 함유하는 500 ㎕의 DMEM 내의 24-웰 플레이트 (2x105 세포/웰)에 접종하고, 1% FBS를 함유하는 100 ㎕의 DMEM 내의 바이러스 현탁액의 계열 희석액을 웰에 첨가하였다. 접종된 세포를 더 배양하여 4 시간 동안 세포 번식 및 바이러스 흡착이 일어나도록 하였다. 이어서, 한천 오버레이의 혼합물을 첨가하고, 플레이트를 4일 동안, 또는 플라크가 형성될 때까지 37℃에서 배양하였다. 플라크는 한천 플러그 (plug)를 제거하고 6% 빙초산 중의 0.1% 나프탈렌 블랙 용액으로 염색한 후에 가시화시켰다. 바이러스 역가는 밀리리터당 플라크 형성 유니트 (PFU)로 표현된다.
세포독성 시험
펩타이드를 그들의 항바이러스 특성에 대해서 스크리닝하기 전에, 8 개의 펩타이드 (아마틸린, 카타다르신, 쿠다판 및 RetroGAD1) 모두를 베로 세포에 대해 비독성일 수 있는 최대 농도를 확인하기 위하여 세포독성 시험에 적용하였다. 펩타이드의 세포독성 활성은 신규 테트라졸륨 화합물 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포닐)-2H-테트라졸륨, 내부 염, MTS 및 전자 커플링 시약 (페나진 메토설페이트; PMS) (Promega, Madison, WI)의 용액으로 구성된 MTS-기본 세포 역가 96 비-방사성 세포 증식시험을 사용하여 정량화하였다. MTS 성장시험은 제조자 (Promega)에 의해서 제공된 설명서에 따라 수행되었다. 각각의 실험 전에, 다수의 플라스크로부터의 세포를 포스페이트 완충 식염수 (PBS) (1X)로 철저하게 세척하고, 37℃에서 트립신-EDTA (1X)의 용액으로 처리함으로써 수확하고, 배양 배지 내에 재-현탁시켰다. 그 후, 세포를 계수하고, 96-웰 편평-바닥 플레이트의 웰에 1 x 104 세포/웰의 농도로 접종하였다. 가습 CO2 대기 (5% CO2) 중에서 37℃로 배양한 지 24 시간 후에, 세포를 증가하는 농도의 펩타이드에 노출시켰다. 100 ㎍/㎖로부터의 펩타이드의 계열 희석액을 배양 배지 내에서 제조하고, 배양물에 첨가하였다. 각각의 희석액은 항상 삼중으로 시험하였으며, 각 실험에는 3 개의 대조 웰이 포함되었다. 대조 웰은 추출물이 없이 배양 배지와 함께 세포를 포함하였으며, 음성 대조 웰은 세포의 부재 하에서 다양한 농도의 추출물을 갖는 배양 배지만을 함유하였다 (배양 배지 내의 약물에 기인한 배경을 제거하기 위함). 인큐베이션의 24, 48 및 72 시간 후에, 최대 비-독성 농도 (MNTD)인 것으로 간주되는, 독성 효과를 나타내지 않는 추출물의 최대 농도는 MTS 시험을 사용하여 측정하였다. 각각의 시점의 종료 시에, MTS 용액을 첨가하고, 1 시간 동안 더 인큐베이션시켰다. 흡광도는 96-웰 마이크로플레이트 판독기 (GLOMAX, Promega)를 사용하여 490 ㎚에서 측정하였다. 흡광도는 배양물 내의 생존 세포의 수에 정비례한다. 각각의 샘플에 대한 적어도 3 개의 복제물을 사용하여 항-증식 활성을 측정하였다. 결과는 평균±S.D로 보고하였다.
세포 생존도의 백분율 =
[시험군의 평균 OD - 음성 대조군의 평균]/[대조군의 평균 OD - 음성 대조군의 평균] × 100%
MNTD는 용량-반응 곡선으로부터 계산하였다. 형태학도 세포 생존율도 변화시키지 않는 MNTD를 MNTD로 인정하였다.
항바이러스 생물시험
전-처리 시험: 베로 세포를 웰당 1 x 105 세포의 농도로 24-웰 배양 플레이트에 접종하고, 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 바이러스 접종 전에, 펩타이드의 최대 비독성 용량을 세포에 첨가하고, 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 펩타이드와의 24 시간 인큐베이션 후에, 0.1의 MOI에서 단순 포진 바이러스-2 (HSV-2)를 때때로 흔들어 주면서 1 시간 동안 베로 세포 상에 접종하였다. 바이러스를 제거하고, 세포를 신선한 DMEM으로 대체하였다. 배양액을 5% CO2 대기 하에 37℃에서 24, 48 및 72 시간 동안 인큐베이션시켰다.
동시 처리 시험: 베로 세포를 웰당 1 x 105 세포의 농도로 24-웰 배양 플레이트에 접종하고, 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 펩타이드를 바이러스와 혼합시키고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 혼합물을 때때로 흔들어 주면서 1 시간 동안 24-웰 배양 플레이트 내의 베로 세포 상에 접종하였다. 용액을 제거하고, 배지를 DMEM으로 대체하였다. 배양액을 5% CO2 대기 하에 37℃에서 24, 48 및 72 시간 동안 인큐베이션시켰다.
후-처리 시험: 베로 세포를 웰당 1 x 105 세포의 농도로 24-웰 배양 플레이트에 접종하고, 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 0.1의 MOI에서 HSV-2를, 때때로 흔들어 주면서 1 시간 동안 24-웰 배양 플레이트 내의 베로 세포 상에 접종하였다. 배지를 제거하고, 펩타이드를 함유하는 DMEM으로 대체하였다. 배양액을 5% CO2 대기 하에 37℃에서 24, 48 및 72 시간 동안 인큐베이션시켰다.
모든 항바이러스 시험에서 기간의 종료 시에, 플레이트를 -80℃에서 동결시켰다. 동결 및 해동의 2 사이클 후에, 상등액 및 부착된 세포 둘 다를 수거하였다. 바이러스 DNA를 추출 키트 (Bioneer, South Korea)에 의해서 추출하였다. 그 후, 용출된 DNA를 RT-PCR에 적용하였다.
정량적 실시간 PCR
펩타이드로 처리한 후에 감염된 베로 세포에 바이러스 DNA가 존재 또는 부재하는지를 입증하기 위해서, 실시간 PCR을 수행하였다. RT-PCR은 HSV-2 그룹 특이적 프라이머를 사용하는 iQ SYBR 그린 슈퍼믹스 (Green Supermix) (Bio-Rad, USA)를 사용하여 수행되었다. 각각의 프라이머 쌍의 최적화 후에, 샘플을 2.5 ㎕의 샘플 DNA, 0.125 ㎕의 각각의 프라이머, 5.0 ㎕의 SYBR 그린 믹스 및 2.25 ㎕의 물을 함유하는 10 ㎕ 반응 혼합물에서 시험하였다. PCR 증폭은 다음과 같이 수행되었다: 95℃에서 15 분 동안의 초기 변성 단계에 이어서 교대하는 변성(95℃에서 30 초 동안), 프라이머 어닐링 (60℃에서 30 초 동안) 및 프라이머 연장 (72℃에서 30 초 동안)의 35 사이클. 72℃에서 5 분의 최종 연장 단계가 포함되었다.
베로 세포에 대한 시험한 펩타이드의 세포독성
베로 세포의 성장에 대한 4 가지 펩타이드 모두의 효과는 어떤 직접적인 세포독성도 배제하도록 검사하였다. 베로 세포의 단일층 배양물을 배양의 24, 28 및 72 시간 후에 증가하는 농도의 아마틸린, 카타다르신, 쿠다판 및 RetroGAD1에 노출시키고, 세포 생존도는 MTS 시험을 사용하여 결정하였다. 표 1에 나타낸 바와 같은 결과는, 베로 세포에 대한 4 가지 펩타이드의 허용된 최대 비독성 농도가 30 ㎍/㎖ 미만이었음을 나타내었다. 선택된 MNTD에서, 펩타이드는 비처리 대조군에 비해서 세포 생존도를 손상시키지 않았다.
Figure pct00024
[표 18] 베로 세포에 대한 펩타이드의 최대 비독성 용량
HSV -2에 대한 펩타이드의 항바이러스 활성
4가지 펩타이드 모두의 항바이러스 활성은 전-, 동시- 및 후-처리에 의해서 평가되었다. 이들 3 가지 상이한 처리 모드를 수행하여 펩타이드가 억제활성을 나타내는 단계를 결정하였다. 전- 및 동시-처리 시험은 숙주 세포에 대한 HSV-2의 부착을 방지하는데 있어서의 펩타이드의 능력을 시험하기 위해서 수행되었다. 동시 처리는 또한 펩타이드의 가능한 살바이러스 효과를 검출하기 위해서 사용되었다. 반면에, 후-처리 시험은 펩타이드가 아마도 해독 억제제로서, 숙주 세포 내부에서 HSV-2의 복제를 억제할 수 있는지 여부를 평가하기 위해서 수행되었다 [Barakat et al., 2010; Kwon et al., 2010].
수득된 결과는 4 가지 펩타이드 중에서 아마틸린이 후-처리시에 HSV-2에 대해 가장 강력한 억제활성을 가져서 30 ㎍/㎖의 최대 비독성 용량 (MNTD)에서 24, 48 및 72 시간 후에 각각 94.35%, 92.92% 및 96.33%의 억제를 제공하는 것을 시사한다 (표 19). 이 결과는 후-처리 시에 48 및 72 시간에 각각 90.00% 및 98.57%의 감소를 나타낸 플라크 감소시험에 의해서 확인되었다 (도 18). 그러나, 아마틸린은 동시 처리 시에는 단지 43.47%, 57.14% 및 44.97%의 억제를 나타내었다. 전-처리 시에, 아마틸린은 단지 24 시간째에 억제를 야기하였다. 이들 관찰결과는 아마틸린이 숙주 세포에 대한 바이러스 흡착을 저해하지 않으면서 이입 후에 바이러스 복제에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 동시 처리에서의 경미한 억제효과는 아마틸린이 보통의 직접적인 살바이러스 효과를 가질 수 있음을 나타낸다. 펩타이드인 카타다르신, 쿠다판 및 RetroGAD1는 후-처리에서 24, 48 및 72 시간째에 보통의 억제 활성을 나타내었다.
후-처리 중에 나타난 억제 활성은 바이러스 복제를 억제하는 펩타이드의 가능한 능력을 시사하는 반면에, 동시 처리 중의 억제 활성은 그들의 직접적인 살바이러스 효과를 나타낸다. 펩타이드는 전-처리 시에는 활성을 나타내지 않거나 약한 억제 효과를 나타내었으며, 이것은 세포에 대한 바이러스 흡착을 차단하는 그들의 능력이 없음을 시사한다. 결과의 요약은 도 19에 나타낸다.
다른 서열을 '절단하고 붙임'으로써 RIP-CAP 융합 단백질의 이 부류로부터 더 많은 항바이러스 약물을 비교적 간단하게 만들 수 있는 것으로 보이기 때문에, 4 개 중의 하나의 '적중률 (Hit rate)'은 항바이러스 약물 발견에서의 매우 우수한 성공률인 것으로 생각될 수 있다.
Figure pct00025
[표 19] PCR에 의해서 결정된 것으로서 전-, 동시 및 후-처리 시에 아마틸린, 카타다르신, 쿠다판 및 RetroGAD1에 의해서 야기된 바이러스 감소의 백분율
요약하면, 항-HSV2 시험의 결과는 4 개의 실험 서열 중에서 하나, 즉 아마틸린이 후-처리 시에, RetroMAD1의 경우와 동등한 매우 상당한 바이러스 감소를 제공하였음을 나타내었다. 이것은, 4 중의 1의 '적중률'이 특히 항바이러스제를 위한 약물 발견에 매우 중요한 것으로 생각되기 때문에, 이 제안된 부류의 더 많은 약물을 비교적 간단하게 개발하였음을 의미하였다. 다른 유전자를 포함하는 4 개의 다른 조합을 시험하였을 때, 특히 하나인 아마틸린은 단지 후-처리 시에만 RetroMAD1과 동등한 결과를 제공하였다. 이것은 폴리펩타이드 A로서 조류 β-디펜신, RetroMAD1에서와 동일한 RIP (폴리펩타이드 B), 및 폴리펩타이드 C로서 연체동물 항미생물 펩타이드를 포함하였다. 그 후, 플라크-감소 시험을 아마틸린에 대해 수행하여 동시 및 후-처리 효능에 대해 수득된 RT-PCR 결과를 시각적 방식으로 재대조하였으며, 이들 데이터는 RT-PCR 데이터를 강력하게 지지하였다.
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<110> VALIANT BIOPHARM SDN BHD <120> ANTIMICROBIAL FUSION COMPOUNDS AND USES THEREOF <130> IPA130738 <150> PI 2011000092 <151> 2011-01-07 <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 379 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Peptide <220> <221> misc_feature <223> Amino acid sequence of fusion protein <400> 1 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Gly Arg Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly 20 25 30 Arg Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro 35 40 45 Gly Val Gly Gly Ala Thr Gly Ser Asp Val Asn Phe Asp Leu Ser Thr 50 55 60 Ala Thr Ala Lys Thr Tyr Thr Lys Phe Ile Glu Asp Phe Arg Ala Thr 65 70 75 80 Leu Pro Phe Ser His Lys Val Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Tyr Ser Thr 85 90 95 Ile Ser Asp Ser Arg Arg Phe Ile Leu Leu Asp Leu Thr Ser Tyr Ala 100 105 110 Tyr Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Val Val 115 120 125 Ala Tyr Arg Thr Arg Asp Val Ser Tyr Phe Phe Lys Glu Ser Pro Pro 130 135 140 Glu Ala Tyr Asn Ile Leu Phe Lys Gly Thr Arg Lys Ile Thr Leu Pro 145 150 155 160 Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Asn Leu Gln Thr Ala Ala His Lys Ile Arg 165 170 175 Glu Asn Ile Asp Leu Gly Leu Pro Ala Leu Ser Ser Ala Ile Thr Thr 180 185 190 Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Gln Ser Ala Pro Ser Ala Leu Leu Val Leu 195 200 205 Ile Gln Thr Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Arg His 210 215 220 Val Ala Lys Tyr Val Ala Thr Asn Phe Lys Pro Asn Leu Ala Ile Ile 225 230 235 240 Ser Leu Glu Asn Gln Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Phe Leu Ala 245 250 255 Gln Asn Gln Gly Gly Lys Phe Arg Asn Pro Val Asp Leu Ile Lys Pro 260 265 270 Thr Gly Glu Arg Phe Gln Val Thr Asn Val Asp Ser Asp Val Val Lys 275 280 285 Gly Asn Ile Lys Leu Leu Leu Asn Ser Arg Ala Ser Thr Ala Asp Glu 290 295 300 Asn Phe Ile Thr Thr Met Thr Leu Leu Gly Glu Ser Val Val Glu Phe 305 310 315 320 Pro Trp Ala Leu Trp Lys Thr Met Leu Lys Glu Leu Gly Thr Met Ala 325 330 335 Leu His Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala Asp Thr Ile Ser 340 345 350 Gln Gly Thr Gln Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Lys Leu 355 360 365 Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 370 375 <210> 2 <211> 1140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion peptide <220> <221> misc_feature <223> Polynucleotide sequence encoding fusion protein of SEQ ID No:1 <400> 2 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60 atggccatgg ggcgtatttg ccgttgcatt tgcggccgtg gcatttgccg ctgcatctgt 120 ggcgtgccgg gtgttggtgt tccgggtgtg ggtggtgcga ccggatccga tgtgaacttt 180 gatctgagca ccgcgaccgc gaaaacctat accaaattca tcgaagattt tcgtgcgacc 240 ctgccgttta gccataaagt gtatgatatc ccgctgctgt atagcaccat tagcgatagc 300 cgtcgtttta ttctgctgga tctgaccagc tatgcgtatg aaaccattag cgtggcgatt 360 gatgtgacca acgtgtatgt ggtggcgtat cgtacccgtg atgtgagcta ctttttcaaa 420 gaaagcccgc cggaagcgta caacattctg tttaaaggca cccgtaaaat taccctgccg 480 tataccggca actatgaaaa cctgcagacc gcggcgcata aaattcgtga aaacatcgat 540 ctgggcctgc cggccctgag cagcgcgatt accaccctgt tttattataa cgcgcagagc 600 gcgccgagcg cgctgctggt gctgattcag accaccgcgg aagcggcgcg ttttaaatat 660 attgaacgcc acgtggcgaa atatgtggcg accaacttta aaccgaacct ggccattatt 720 agcctggaaa accagtggag cgccctgagc aaacaaattt ttctggccca gaaccagggc 780 ggcaaatttc gtaatccggt ggatctgatt aaaccgaccg gcgaacgttt tcaggtgacc 840 aatgtggata gcgatgtggt gaaaggcaac attaaactgc tgctgaacag ccgtgcgagc 900 accgcggatg aaaactttat taccaccatg accctgctgg gcgaaagcgt ggtggaattc 960 ccgtgggcgc tgtggaaaac catgctgaaa gaactgggca cgatggcgct gcatgcgggt 1020 aaagcggcgc tgggtgcggc agcggatacc attagccagg gcacccaggt tccgggcgtg 1080 ggcgttccgg gcgttggtaa gcttgcggcc gcactcgagc accaccacca ccaccactga 1140 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <220> <221> misc_feature <223> Forward primer for HSV-1 <400> 3 Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys Cys Thr Thr Cys 1 5 10 15 Thr Thr Gly Gly 20 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <220> <221> misc_feature <223> Forward primer for HSV-2 <400> 4 gtacagacct tcggagg 17 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <220> <221> misc_feature <223> Reverse primer of HSV-2 <220> <221> misc_feature <223> Reverse primer of HSV-1 <220> <221> misc_feature <223> Reverse primer for HSV-2 <400> 5 acccttagtc agactctgtt acttaccc 28 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <220> <221> misc_feature <223> Reverse primer for HSV-2 <400> 6 cgcttcatca tgggc 15 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <220> <221> misc_feature <223> Forward primer for DENV1, DENV2, DENV3 and DENV4 <400> 7 ggaaggagaa ggactgcaca 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <220> <221> misc_feature <223> Reverse primer for DENV1, DENV2, DENV3 and DENV4 <400> 8 attcttgtgt cccatcctgc t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <220> <221> misc_feature <223> Forward primer for HPV <400> 9 acactcagcc tctaccttgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sequence <220> <221> misc_feature <223> Reverse primer for HPV <400> 10 gcattacaag agccaagcag 20 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker peptide <220> <221> misc_feature <223> N is 0, 1, 2, 3, 4 or 5 <220> <221> misc_feature <223> Linker Peptide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 11 Val Pro Xaa Val Gly 1 5 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide A <220> <221> misc_feature <223> Amino acid Sequence of Polypeptide A <400> 12 Gly Arg Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Arg Gly Ile Cys Arg Cys Ile 1 5 10 15 Cys Gly <210> 13 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide B <220> <221> misc_feature <223> Amino acid Sequence of Polypeptide B <400> 13 Gly Ser Asp Val Asn Phe Asp Leu Ser Thr Ala Thr Ala Lys Thr Tyr 1 5 10 15 Thr Lys Phe Ile Glu Asp Phe Arg Ala Thr Leu Pro Phe Ser His Lys 20 25 30 Val Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Tyr Ser Thr Ile Ser Asp Ser Arg Arg 35 40 45 Phe Ile Leu Leu Asp Leu Thr Ser Tyr Ala Tyr Glu Thr Ile Ser Val 50 55 60 Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Val Val Ala Tyr Arg Thr Arg Asp 65 70 75 80 Val Ser Tyr Phe Phe Lys Glu Ser Pro Pro Glu Ala Tyr Asn Ile Leu 85 90 95 Phe Lys Gly Thr Arg Lys Ile Thr Leu Pro Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu 100 105 110 Asn Leu Gln Thr Ala Ala His Lys Ile Arg Glu Asn Ile Asp Leu Gly 115 120 125 Leu Pro Ala Leu Ser Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala 130 135 140 Gln Ser Ala Pro Ser Ala Leu Leu Val Leu Ile Gln Thr Thr Ala Glu 145 150 155 160 Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Arg His Val Ala Lys Tyr Val Ala 165 170 175 Thr Asn Phe Lys Pro Asn Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Gln Trp 180 185 190 Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Phe Leu Ala Gln Asn Gln Gly Gly Lys 195 200 205 Phe Arg Asn Pro Val Asp Leu Ile Lys Pro Thr Gly Glu Arg Phe Gln 210 215 220 Val Thr Asn Val Asp Ser Asp Val Val Lys Gly Asn Ile Lys Leu Leu 225 230 235 240 Leu Asn Ser Arg Ala Ser Thr Ala Asp Glu Asn Phe Ile Thr Thr Met 245 250 255 Thr Leu Leu Gly Glu Ser Val Val Glu Phe Pro Trp 260 265 <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide C <220> <221> misc_feature <223> Amino acid Sequence of Polypeptide C <400> 14 Ala Leu Trp Lys Thr Met Leu Lys Glu Leu Gly Thr Met Ala Leu His 1 5 10 15 Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala Asp Thr Ile Ser Gln Gly 20 25 30 Thr Gln <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> Rhesus minidefensin (RTD-1) <400> 15 Gly Phe Cys Arg Cys Leu Cys Arg Arg Gly Val Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Thr Arg <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RTD-2 <400> 16 Arg Cys Leu Cys Arg Arg Gly Val Cys Arg Cys Leu Cys Arg Arg Gly 1 5 10 15 Val Cys <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RTD-3 <400> 17 Arg Cys Ile Cys Thr Arg Gly Phe Cys Arg Cys Ile Cys Thr Arg Gly 1 5 10 15 Phe Cys <210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> Retrocyclin-1 <400> 18 Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Arg Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> Retrocyclin-2 <400> 19 Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Arg Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> Retrocyclin-3 <400> 20 Arg Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Arg Arg Ile Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC100 <400> 21 Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Arg Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC101 <400> 22 Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Lys Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC102 <400> 23 Gly Ile Cys Arg Cys Tyr Cys Gly Arg Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC103 <400> 24 Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Arg Gly Ile Cys Arg Cys Tyr Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC104 <400> 25 Gly Tyr Cys Arg Cys Ile Cys Gly Arg Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC105 <400> 26 Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Arg Gly Tyr Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC106 <400> 27 Gly Ile Cys Tyr Cys Ile Cys Gly Arg Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC107 <400> 28 Gly Ile Cys Ile Cys Ile Cys Gly Tyr Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC108 <400> 29 Gly Ile Cys Ile Cys Ile Cys Gly Arg Gly Ile Cys Tyr Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC110 <400> 30 Gly Ile Cys Ile Cys Ile Cys Gly Arg Gly Ile Cys Tyr Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 31 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC111 <400> 31 Arg Gly Cys Ile Cys Arg Cys Ile Gly Arg Gly Cys Ile Cys Arg Cys 1 5 10 15 Ile Gly <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC112 <400> 32 Arg Gly Cys Ile Cys Arg Cys Ile Gly Arg Gly Cys Ile Cys Arg Cys 1 5 10 15 Ile Gly <210> 33 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC113 <400> 33 Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Arg Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Gly Arg <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic theta Defensin <220> <221> misc_feature <223> RC114 <400> 34 Gly Ile Cys Arg Cys Ile Cys Gly Lys Gly Ile Cys Arg Cys Tyr Cys 1 5 10 15 Gly Arg

Claims (31)

  1. 적어도 하나의 타입 1 리보좀 불활성화 단백질 (RIP) 또는 그의 단편, 폴리펩타이드 B; 및
    (i) 바이러스 침입을 억제할 수 있는 적어도 하나의 폴리펩타이드 A; 및/또는
    (ii) 적어도 하나의 양이온성 항미생물 펩타이드 (CAP) 또는 그의 단편, 폴리펩타이드 C를 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드 A가 세타 디펜신, 그의 유사체 또는 단편인 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 구조 A-B-C, A-C-B, C-A-B, C-B-A, B-A-C, B-C-A, A-B-C-C, A-B, B-A, B-C, C-B,C-B-C, 또는 C-C-B-C-C를 포함하는 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 A, B 및 C를 포함하는 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 A, B 및 C가 서로에 대해 직접적으로 연결된 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 각각의 폴리펩타이드 A, B 및 C 사이에 적어도 하나의 링커 펩타이드를 추가로 포함하는 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 링커가 서열번호 11을 갖는 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드 A가 레수스 미니디펜신 (RTD-1), RTD-2, RTD-3, 레트로사이클린-1, 레트로사이클린-2, 레트로사이클린-3, 합성 레트로사이클린 동족체 RC100, RC101, RC102, RC103, RC104, RC105, RC106, RC107, RC108, RC110, RC111, RC112, RC113 및 RC114로 구성된 그룹으로부터 선택되는 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 타입 1 RIP (폴리펩타이드 B)가 에불리틴, 니그리틴, 아마란딘, 아마란투스 항바이러스제/RIP, 아마란틴, 아트리플렉스 파텐스 RIP, 베타 불가리스 RIP, β-불긴, 셀로시아 크리스타타 RIP, 케노포듐 알붐 RIP, CAP30B, 스피나세아 올레라세아 RIP, 퀸퀘긴신, 아스파린, 아그로스틴, 디안틴, DAPs, 디안투스 키넨시스, 라이크닌, 페트로글라우신, 페트로그란딘, 사포나리아 오시모이데스 RIP, 바큐올라스 사포린, 사포린, 바카리아 히스파니카 RIP, 베닌카신, 히스핀, 바이로딘, 콜로신, 쿠쿠미스 피가레이 RIP, 멜로닌, 시. 모스카타 RIP, 쿠쿠르모신, 모스카틴, 페포신, 지노스테민, 지노스테마 펜타필룸 RIP, 집소필린, 라게닌, 루파쿨린, 루판굴린, 루핀, MORs, 모모르딘 II, 모모르카린, 모모르코킨, 모모르코킨-S, 세키우민, 모모르그로스빈, 트리코안구인, 키릴로윈, α-트리코산틴, TAP-29, 트리코키린, 트리코미슬린, 트리코산틴, 카라수린, 트리코마글린, 트리코바킨, 크로틴, 유세라틴 항바이러스성 단백질 GAP-31, 겔로닌, 휴라 크레피탄스 RIP, 쿠르신, 자트로파 쿠르카스 RIP, 마팔민, 마누틴, α-피사빈, 카리브딘, 히아신투스 오리엔탈리스 RIP, 무사르민, 이리스 홀란디카 RIP, 클레로엔드럼 아큘레아툼 RIP, CIPs, 크립-31, 보우가닌, 보우가인빌라 스펙트빌리스 RIP, 보우가인빌레아 x 부티아나 항바이러스성 단백질 1 (BBAP1), 말릭 효소, MAP-S, 포크위드 항바이러스성 단백질 (PAP), PD-SI, DP-S2, 도데칸드린, PIP, PIP2, 파이토라카 옥탄드라 항바이러스성 단백질, 호르데움 불가레 RIPs, 호르데움 불가레 아종 불가레 해독 억제제 II, 세케일 세레알레 RIP, 트리틴, 제아 디플로페레미스 RIPs, 마루스 x 도메스티카 RIP, 모모르디카 항-HIV 단백질, 젤로늄 멀티플로룸, 미라빌리스 엑스판사 1, 파지 MU1, 베타불긴 (Bvg), 쿠르신 2, 사포린 6, 옥수수 RIP (B-32), 담배 RIP (TRIP), 비틴, 미라빌리스 항바이러스성 단백질 (MAP), 트리코산틴 (TCS), 루핀, 모모르카린, 오시모이딘, 브리오딘, 페폽신, β-트리코산틴, 캄포린, YLP, 인슐라린, 보리 RIP, 트리틴스, 람자린, 및 볼바리엘라 볼바세아 RIP로 구성된 그룹으로부터 선택되는 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, CAP (폴리펩타이드 C)가 사이클로타이드, 시아마이신, NP-06, 그라미시딘 A, 서큘린, 칼라타, 징크빌로빈, 알파-바스루빈, 루나투신, 세스퀸, 트리사이클론 A, 사이클로비올라신, 폴리페뮤신, hfl-B5, 프로테그린 (돼지 카텔리시딘), 랫트 디펜신, 인간 β-디펜신, 템포린, 카에린, 라나투에린, 파충류 디펜신, 피스시딘, 락토페리신 B, 토끼 호중구, 토끼 α-디펜신, 레트로사이클린, 인간 α-디펜신, 인간 β-디펜신 III (HBD3), 레수스 미니디펜신 (RTD-1,θ-디펜신), 레수스 θ-디펜신, 인간 호중구 펩타이드, 세크로핀 As, 멜리틴, EP5-1, 마가이닌 2s, 하이브리드 (CE-MA), 헵시딘 TH1-5, 에피네시딘-1, 인돌리시딘, 카텔리시딘-4, LL-37 카텔리시딘, 더마셉틴, 맥시민, 브레비닌, 라나투에린, 에스큘렌틴, 마스큘라틴 1.3, 맥시민 H5 및 피스시딘, 문드티신 KS 엔테로신 CRL-35, 루나투신, FK-13 (GI-20은 유도체임), 타키플레신, 알파-MSH, 항바이러스 단백질 Y3, 팔루스트린-3AR, 포네리신 L2, 스피니게린, 멜렉틴, 클라바닌 B, 소 카텔리시딘, 기니아피그 카텔리시딘 CAP11, 사카신 5X, 플렉타신, 진균 디펜신, GLK-19, 락토페린 (Lf) 펩타이드 2, 알로페론 1, 우페린 3.6, 달레인 5.6, 아스카핀-8, 인간 히스타틴 5, 기니아피그 호중구, 마이틸린, EP5-1, 헥사펩타이드 (합성) 코르티코스타틴 IV 토끼 호중구 2, 아우레인, 라타르신, 플렉타신, 사이클로비올린, 바브 펩타이드 E, 팔리코우레인, VHL-1 및 부포린으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 타입 1 RIP가 MAP30이고, CAP가 더마셉틴이며, 폴리펩타이드 A가 레트로사이클린인 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 더마셉틴이 더마셉틴 1이고, 레트로사이클린이 레트로사이클린 101인 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호 1을 포함하는 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 경구 투여에 적합한 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 발현할 수 있는 분리된 핵산 분자.
  16. 제15항에 따른 핵산 분자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터.
  17. 제15항에 따른 핵산 분자 및/또는 제16항에 따른 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  18. 제17항에 따른 숙주 세포를 융합 단백질이 발현되도록 하는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 생산하는 방법.
  19. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 경구 투여에 적합한 약제학적 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 및/또는 계면활성제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 계면활성제가 나트륨-우르소데옥시콜레이트, 나트륨 글리실우르소데옥시콜레이트, 칼륨-우르소데옥시콜레이트, 칼륨 글리실우르소데옥시콜레이트, 페로우스-우르소데옥시콜레이트, 페로우스 글리실우르소데옥시콜레이트, 암모늄-우르소데옥시콜레이트, 암모늄 글리실우르소데옥시콜레이트, 나트륨-타우로우르소데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸글리실우르소데옥시콜레이트, 칼륨-타우로우르소데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸글리실우르소데옥시콜레이트, 페로우스-타우로우르소데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸글리실우르소데옥시콜레이트, 암모늄-타우로우르소데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸글리실우르소데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸타우로우르소데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸타우로우르소데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸타우로우르소데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸타우로우르소데옥시콜레이트, 나트륨-콜레이트, 나트륨-데옥시콜레이트, 칼륨-콜레이트, 칼륨-데옥시콜레이트, 페로우스-콜레이트, 페로우스-데옥시콜레이트, 암모늄-콜레이트, 암모늄-데옥시콜레이트, 나트륨-케노데옥시콜레이트, 나트륨-글리실콜레이트, 칼륨-케노데옥시콜레이트, 칼륨-글리실콜레이트, 페로우스-케노데옥시콜레이트, 페로우스-글리실콜레이트, 암모늄-케노데옥시콜레이트, 암모늄-글리실콜레이트, 나트륨-타우로콜레이트, 나트륨-N-메틸글리실콜레이트, 칼륨-타우로콜레이트, 칼륨-N-메틸글리실콜레이트, 페로우스-타우로콜레이트, 페로우스-N-메틸글리실콜레이트, 암모늄-타우로콜레이트, 암모늄-N-메틸글리실콜레이트, 나트륨-N-메틸타우로콜레이트, 나트륨-글리실데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸타우로콜레이트, 칼륨-글리실데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸타우로콜레이트, 페로우스-글리실데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸타우로콜레이트, 암모늄-글리실데옥시콜레이트, 나트륨-타우로데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸글리실데옥시콜레이트, 칼륨-타우로데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸글리실데옥시콜레이트, 페로우스-타우로데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸글리실데옥시콜레이트, 암모늄-타우로데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸글리실데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸타우로데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸글리실케노데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸타우로데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸글리실케노데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸타우로데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸글리실케노데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸타우로데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸글리실케노데옥시콜레이트, 나트륨-N-메틸타우로케노데옥시콜레이트, 칼륨-N-메틸타우로케노데옥시콜레이트, 페로우스-N-메틸타우로케노데옥시콜레이트, 암모늄-N-메틸타우로케노데옥시콜레이트, 우르소데옥시콜레이트의 에틸 에스테르, 우르소데옥시콜레이트의 프로필 에스테르, 나트륨-글리실케노데옥시콜레이트, 칼륨-글리실케노데옥시콜레이트, 페로우스-글리실케노데옥시콜레이트, 암모늄-글리실케노데옥시콜레이트, 나트륨-타우로케노데옥시콜레이트, 칼륨-타우로케노데옥시콜레이트, 페로우스-타우로케노데옥시콜레이트, 암모늄-타우로케노데옥시콜레이트, 및 나트륨 데옥시콜레이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 계면활성제가 나트륨 데옥시콜레이트인 약제학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 제19항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 유효량을 척추동물 또는 무척추동물에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 척추동물 또는 무척추동물에게서 미생물 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 미생물 감염이 바이러스 감염인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 척추동물이 포유동물, 어류 또는 조류인 방법.
  27. 의약품으로 사용하기 위한 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 제19항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물.
  28. 척추동물, 무척추동물 또는 식물에서 미생물 감염을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 제19항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 미생물 감염이 바이러스 감염인 융합 단백질 및/또는 약제학적 조성물.
  30. 척추동물 또는 무척추동물에서 미생물 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약품의 제조에 있어서, 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 제19항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  31. 제30항에 있어서, 미생물 감염이 바이러스 감염인 용도.
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