CN113234128B - 一种抗肿瘤活性多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤活性多肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。本发明中的抗肿瘤活性多肽及其经修饰的变体均具有很强的肿瘤细胞抑制能力，且对正常细胞的杀伤作用很低。

Description

一种抗肿瘤活性多肽及其应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种抗肿瘤活性多肽及其应用。

背景技术

根据美国癌症协会的数据，癌症占全世界死亡人数的八分之一。这意味着死亡率要高于因艾滋病，结核病和疟疾造成的死亡总数(http：//www.cancer.org)。癌症是由一种或多种累积的环境或遗传变化引起的，这些变化促使正常细胞不受控制地生长和发育，最终导致了实体瘤的发展。该肿瘤将首先扩散到周围组织中，如果不加以治疗，最终将通过淋巴系统和血液扩散到人体的其他部位。

癌细胞与正常细胞之间的主要区别在于，前者会丢失所谓的自毁信号，以无序的方式无限地生长和增殖。癌细胞不知道何时必须触发凋亡，这主要是因为它们对周围细胞的化学信号无反应。

基因突变最终导致癌症的发生发展。在癌症期间可能受到影响或突变的基因包括(i)致癌基因，负责促进细胞的生长和分裂；(ii)抑癌基因，其负责阻止细胞分裂；以及(iii)固定DNA的修复基因受损基因的突变。特定基因参与某种癌症类型的发展，例如DNA修复基因，这些基因通常在肠癌中受损。根据GLOBOCAN项目(http：//globocan.iarc.fr/Default.aspx)，全球范围内最常见的癌症(按死亡率降低的顺序排列)是肺癌，肝癌，胃癌，肠癌，乳腺癌，食道癌，胰腺癌，前列腺癌，宫颈癌和白血病，而预防似乎是降低癌症死亡率的最有效手段。

抗肿瘤多肽(Anticancer Peptides，ACPs)是一类由几十个氨基酸残基组成，具有两亲性(亲水性与疏水性)并带正电荷的短肽，具有杀伤肿瘤细胞的活性。因其具有毒副作用小、不易产生耐药和免疫反应低等显著优点，已成为抗肿瘤药物研究的热点之一。抗肿瘤多肽数据库CancerPPD(http：//crdd.osdd.net/raghava/cancerppd/)上收集的具有抗肿瘤活性的多肽已有3491种，涉及21种组织和249种肿瘤细胞系，部分ACPs已经进入临床试验。

几乎任何蛋白质或蛋白质的任何来源都可以用于分离或生成潜在的抗肿瘤肽。例如，加密为大食品蛋白质的生物活性肽通常通过消化酶的作用释放到宿主中，包括植物或动物来源的蛋白质，例如牛奶，大豆，鸡蛋，奶酪等。如今，这些食物源性生物活性肽的探索表示兴趣发现新的抗癌多肽的研究人员几乎无限来源。在基于蔬菜的食品中存在的化合物中，某些肽已显示出在癌症框架内发挥有益的健康作用，例如大豆衍生的肽卢娜菌素。海洋环境尤其令人感兴趣，其中一些动物是抗肿瘤肽和大肽肽的来源。众所周知，几种海洋蛋白水解物含有2-20个氨基酸范围内的具有抗肿瘤活性的肽。有趣的是，它们是加密的肽，只有当它们从完整蛋白中释放出来时，它们的生物活性才显示出来。否则不会产生任何影响。迄今为止，已经描述了各种各样的小而线性的或环状的肽，以及来自多种海洋动物的具有多种抗肿瘤活性的十肽和N-末端或C-末端修饰的肽。抗肿瘤肽的其他来源是人类蛋白，动物/真菌的结构蛋白，工业副产品甚至蛇毒。如果保留了生物活性，则使用肽而不是整个蛋白质是一种改善肽向生物体内传递的方法，因为肽尺寸较小，显示出更好的扩散速率，并且可以与其他分子(如保护剂)相连。

科学文献中发现的许多抗肿瘤肽的作用机理和分子信号传导。与靶细胞结合后，该肽可能引发不同的机制，从触发凋亡途径到抑制正在发展的肿瘤中的血管生成。

抗肿瘤多肽作用于细胞的最主要方式是裂解细胞膜。天然抗肿瘤肽Polybia-MPI、铃蟾肽、合成肽BTM-P1等都是以膜裂解的方式作用于多种肿瘤细胞。以膜裂解的方式杀死细胞作用时间短，且多肽不需要进入到细胞内，不易产生耐药。另一种作用方式是破坏线粒体膜从而引发线粒体途径诱导的细胞凋亡。Eliassen等人发现牛乳铁蛋白肽LFcinB通过破坏线粒体膜诱导神经胶质瘤细胞凋亡，并在异体移植的小鼠体内得到验证。豹毒素则通过作用于线粒体，激活caspase3而诱导鳞状细胞癌细胞凋亡。还有一种有趣的作用方式是激活细胞的免疫反应，多肽LTX-315能使细胞发生免疫原性死亡，并能产生一种持续的长久效应可防止再次发生同一种肿瘤的恶化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肿瘤活性多肽。

本发明的另一目的在于提供上述抗肿瘤活性多肽应用。

本发明的再一目的在于提供一种抗肿瘤药物组合物。

本发明的技术方案如下：

一种抗肿瘤活性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。

在本发明的一个优选实施方案中，其第11位Y及第16位S的氨基酸残基磷酸化。

在本发明的一个优选实施方案中，其第3位R、第7位K及第10位K的氨基酸残基甲基化。

在本发明的一个优选实施方案中，其C末端酰胺化。

在本发明的一个优选实施方案中，其N末端乙酰化。

在本发明的一个优选实施方案中，其C末端连接2×至8×的PEG。

进一步优选的，其C末端连接2×、4×、6×或8×的PEG。

本发明的另一技术方案如下：

上述抗肿瘤活性多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述抗肿瘤药物的剂型包括糖浆剂、酏剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、锭剂、水溶液、霜剂、膏剂、洗液剂、凝胶剂、乳剂或气雾剂。

本发明的再一技术方案如下：

一种抗肿瘤药物组合物，包括上述抗肿瘤活性多肽以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋型剂。

在本发明的一个优选实施方案中，其剂型包括糖浆剂、酏剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、锭剂、水溶液、霜剂、膏剂、洗液剂、凝胶剂、乳剂或气雾剂。

本发明的有益效果是：本发明中的抗肿瘤活性多肽及其经修饰的变体均具有很强的肿瘤细胞抑制能力，且对正常细胞的杀伤作用很低。

附图说明

图1为本发明实施例1的实验结果图。

图2为本发明实施例2的实验结果图。

图3为本发明实施例3的实验结果图。

图4为本发明实施例4的实验结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

下述实施例中所涉及的序列如下表1所示：

具体合成方法为：委托南京金斯瑞生物科技有限公司应用其自主研发的PepPower^TM多肽合成平台，其融合了全自动多肽合成方式，先进的微波技术和肽链延长技术，选择固相合成方式(Solid Phase Peptide Synthesis，SPPS)进行合成，即将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。合成多肽以冻干粉末形式交付，交付多肽每管质量5mg，纯度为95％。

实施例1

五种肿瘤细胞HepG2、HeLa、MCF-7、THP-1和BGC-823及人正常乳腺细胞MCF-10A各100μL细胞悬液(5×10³个/mL)，加至96孔板中，于37℃恒温CO₂培养箱中培养24h后待细胞贴壁后，吸出旧培养液，加入终体积为100μL的含20μM的All-1多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37℃恒温CO₂培养箱中培养48h后吸出药液，用PBS洗板2次，每孔加入10μL的CCK-8溶液和新鲜基础培养基90μL；于37℃恒温CO2培养箱中继续培养2h后，450nm波长处测定光密度值并计算抑制率，结果见图1。

实施例2

五种肿瘤细胞HepG2、HeLa、MCF-7、THP-1和BGC-823悬液(5×10³个/mL)各100μL，加至96孔板中，于37℃恒温CO₂培养箱中培养，24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为100μL的含0μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM、128μM的All-1多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37℃恒温CO₂培养箱中培养，48h后吸出药液，用PBS洗板2次，每孔加入10μL的CCK-8溶液和新鲜基础培养基90μL；于37℃恒温CO₂培养箱中继续培养2h后，450nm波长处测定光密度值并计算相应的IC₅₀，结果见图2的a-e，a-e分别为用0、1、2、4、8、16、32、64和128μM的All-1处理HepG2、HeLa、MCF-7、THP-1和BGC-823等细胞48h后检测所得半数抑制浓度IC₅₀值。

实施例3

人乳腺癌细胞MCF-7细胞悬液(5×10³个/mL)，加至96孔板中，于37℃恒温CO₂培养箱中培养24h后待细胞贴壁后，吸出旧培养液，加入终体积为100μL的含0μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM、128μM的All-1～All-9多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37℃恒温CO₂培养箱中培养48h后吸出药液，用PBS洗板2次，每孔加入10μL的CCK-8溶液和新鲜基础培养基90μL；于37℃恒温CO₂培养箱中继续培养2h后，450nm波长处测定光密度值并计算相应的IC₅₀，结果见图3的a～i。

实施例4

人乳腺癌细胞MCF-7细胞和MCF-10A细胞悬液(5×10³个/mL)，分别加至96孔板中，于37℃恒温CO₂培养箱中培养24h后待细胞贴壁后，吸出旧培养液，加入终体积为100μL的含20μM的All-1～All-9多肽样品的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，于37℃恒温CO₂培养箱中培养48h后吸出药液，用PBS洗板2次，每孔加入10μL的CCK-8溶液和新鲜基础培养基90μL；于37℃恒温CO₂培养箱中继续培养2h后，450nm波长处测定光密度值并计算抑制率，结果见图4。

综上，本发明的抗肿瘤活性多肽在终浓度为20μM时，与五种肿瘤细胞HepG2、HeLa、MCF-7、THP-1和BGC-823混匀，孵育培养48h后，经CCK-8法检测，对肿瘤细胞抑制率分别达到89.12％、88.61％、75.32％、86.23％和76.69％，更具体的所述抗肿瘤活性多肽对HepG2、HeLa、MCF-7、THP-1和BGC-823的半数抑制浓度IC₅₀值分别为10.82μM、8.345μM、13.98μM、10.25μM和13.61μM。本发明的抗肿瘤活性多肽在终浓度为20μM时，对正常乳腺细胞MCF-10A的抑制率为23.78％，显著低于以上五种肿瘤细胞。表明本发明的抗肿瘤活性多肽对肿瘤细胞的杀伤具有较好的选择性，可为其在生物医药领域的应用提供参考。此外，以All-1多肽为基础，进行结构修饰得到的All-2至All-9多肽均对HeLa细胞具有一定的杀伤活性，当All-2、All-3、All-4、All-5、All-6、All-7、All-8和All-9的浓度为20uM时，对HeLa细胞的抑制率分别为77.25％、80.8％、81.85％、88.86％、85.46％、79.56％、82.63％和79.32％。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 庶安永康（厦门）健康产业有限公司

<120> 一种抗肿瘤活性多肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Leu Arg His Val Val Lys Ile Leu Lys Tyr Leu His Gly Val Ser

1 5 10 15

Gly His Gly Gln His Gly Val His Gly

20 25

Claims (7)

1.一种抗肿瘤活性多肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。

2.如权利要求1所述的一种抗肿瘤活性多肽，其特征在于：其第11位Y及第16位S的氨基酸残基磷酸化。

3.如权利要求1所述的一种抗肿瘤活性多肽，其特征在于：其第3位R、第7位K及第10位K的氨基酸残基甲基化。

4.如权利要求1所述的一种抗肿瘤活性多肽，其特征在于：其C末端酰胺化。

5.如权利要求1所述的一种抗肿瘤活性多肽，其特征在于：其N末端乙酰化。

6.如权利要求1所述的一种抗肿瘤活性多肽，其特征在于：其C末端连接2×至8×的PEG。

7.如权利要求6所述的一种抗肿瘤活性多肽，其特征在于：其C末端连接2×、4×、6×或8×的PEG。

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