JP2003047475A - 新規オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子 - Google Patents
新規オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子Info
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- JP2003047475A JP2003047475A JP2001237183A JP2001237183A JP2003047475A JP 2003047475 A JP2003047475 A JP 2003047475A JP 2001237183 A JP2001237183 A JP 2001237183A JP 2001237183 A JP2001237183 A JP 2001237183A JP 2003047475 A JP2003047475 A JP 2003047475A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 マダコの直腸から単離、精製されるオキシト
シン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペ
プチドを提供し、分子レベルでの構造活性相関の研究を
通じて、医薬および農薬等への新たなアプローチを与え
る。 【解決手段】 ９個のアミノ酸配列からなり、Ｎ末端か
ら５番目のアミノ酸がＳｅｒである、オキシトシン／バ
ソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドで
あり、特に、次の特性：１） アミノ酸残基数が９；
２） Ｎ末端がＣｙｓ；３） Ｃ末端から５つのアミノ
酸が次のアミノ酸配列式（Ｉ）：−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （Ｉ）で表わさ
れ、Ｎ末端のＣｙｓとＮ末端から６番目のＣｙｓとがジ
スルフィド結合している。より具体的には、以下のアミ
ノ酸配列式（２）：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈ
ｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
（２）（Ｃｙｓ残基はジスルフィド結合してい
る）で示されるペプチド。
シン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペ
プチドを提供し、分子レベルでの構造活性相関の研究を
通じて、医薬および農薬等への新たなアプローチを与え
る。 【解決手段】 ９個のアミノ酸配列からなり、Ｎ末端か
ら５番目のアミノ酸がＳｅｒである、オキシトシン／バ
ソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドで
あり、特に、次の特性：１） アミノ酸残基数が９；
２） Ｎ末端がＣｙｓ；３） Ｃ末端から５つのアミノ
酸が次のアミノ酸配列式（Ｉ）：−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （Ｉ）で表わさ
れ、Ｎ末端のＣｙｓとＮ末端から６番目のＣｙｓとがジ
スルフィド結合している。より具体的には、以下のアミ
ノ酸配列式（２）：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈ
ｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
（２）（Ｃｙｓ残基はジスルフィド結合してい
る）で示されるペプチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なペプチドに関
し、さらに詳細には、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓｖｕｌｇ
ａｒｉｓ）の腸管から得られる、マダコの直腸に対する
収縮活性を有する新規オキシトシン／バソプレシンスー
パーファミリーに分類されるペプチドに関する。
し、さらに詳細には、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓｖｕｌｇ
ａｒｉｓ）の腸管から得られる、マダコの直腸に対する
収縮活性を有する新規オキシトシン／バソプレシンスー
パーファミリーに分類されるペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】脳下垂体後葉からは、視床下部の神経分
泌細胞で産生されたペプチドホルモンが血中に放出さ
れ、末梢の標的器官に直接作用する。これらのペプチド
ホルモンにオキシトシンおよびバソプレシンという構造
の類似したペプチドが知られている。オキシトシンは子
宮筋収縮作用と乳汁射出作用を示し、バソプレシンは、
主に昇圧作用および抗利尿作用を示す。脊椎動物では、
各綱の動物に見られるペプチドがよく似たアミノ酸配列
を持つ。例えば哺乳類ではオキシトシンとバソプレシン
が、両生類では、メソトシンとバソトシン、魚類ではイ
ソトシンとバソトシンが、別々のニューロンに存在する
とされている。これらのペプチドは、アミノ酸配列の類
似性に加えて前駆体タンパク質の構造も類似しており、
総称してオキシトシン／バソプレシンスーパーファミリ
ーペプチドと呼ばれている。
泌細胞で産生されたペプチドホルモンが血中に放出さ
れ、末梢の標的器官に直接作用する。これらのペプチド
ホルモンにオキシトシンおよびバソプレシンという構造
の類似したペプチドが知られている。オキシトシンは子
宮筋収縮作用と乳汁射出作用を示し、バソプレシンは、
主に昇圧作用および抗利尿作用を示す。脊椎動物では、
各綱の動物に見られるペプチドがよく似たアミノ酸配列
を持つ。例えば哺乳類ではオキシトシンとバソプレシン
が、両生類では、メソトシンとバソトシン、魚類ではイ
ソトシンとバソトシンが、別々のニューロンに存在する
とされている。これらのペプチドは、アミノ酸配列の類
似性に加えて前駆体タンパク質の構造も類似しており、
総称してオキシトシン／バソプレシンスーパーファミリ
ーペプチドと呼ばれている。
【０００３】なお、本明細書においては使用する「オキ
シトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類され
るペプチド」という用語は、特許請求の範囲を含め、オ
キシトシンファミリーペプチド、バソプレシンファミリ
ーペプチドおよびオキシトシン／バソプレシンスーパー
ファミリーペプチドの３者を含むペプチドを総称する用
語として使用している。
シトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類され
るペプチド」という用語は、特許請求の範囲を含め、オ
キシトシンファミリーペプチド、バソプレシンファミリ
ーペプチドおよびオキシトシン／バソプレシンスーパー
ファミリーペプチドの３者を含むペプチドを総称する用
語として使用している。
【０００４】無脊椎動物では、軟体動物 （Ｌ．Ｊ．Ｃ
ｒｕｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１５８２
１−１５８２４，１９８７：Ｒ．Ｅ．ｖａｎ Ｋｅｓｔ
ｅｒｅｎら、Ｐｒｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８９，４５９３−４５９７，１９９２）および環
形動物（Ｍ．Ｓａｌｚｅｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，２１７，８９７−９０３，１９９３）から単離
されたコノプレシン、節足動物のバッタペプチド（Ｊ．
Ｐ．Ｐｒｏｕｘら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，１８０−１８６，
１９８７）、環形動物のアネトシン（Ｏ．Ｍａｔｓｕｓ
ｈｉｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８，３９３−３９９，１９９
４）、およびマダコの大静脈神経内分泌系から単離され
たセファロトシン（Ｇ．Ｒｅｉｃｈ，Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ．Ｌｅｔｔ．，１３４，１９１−１９４，１９９２）
が知られている。そして無脊椎動物において見出されて
いるこれらペプチドは、オキシトシンとしての作用と、
バソプレシンとしての作用の両方を持つものとされてお
り、無脊椎動物では１種類だったものが分化、進化の過
程でオキシトシンとバソプレシンに分かれていったと考
えられている。
ｒｕｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１５８２
１−１５８２４，１９８７：Ｒ．Ｅ．ｖａｎ Ｋｅｓｔ
ｅｒｅｎら、Ｐｒｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８９，４５９３−４５９７，１９９２）および環
形動物（Ｍ．Ｓａｌｚｅｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，２１７，８９７−９０３，１９９３）から単離
されたコノプレシン、節足動物のバッタペプチド（Ｊ．
Ｐ．Ｐｒｏｕｘら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，１８０−１８６，
１９８７）、環形動物のアネトシン（Ｏ．Ｍａｔｓｕｓ
ｈｉｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８，３９３−３９９，１９９
４）、およびマダコの大静脈神経内分泌系から単離され
たセファロトシン（Ｇ．Ｒｅｉｃｈ，Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ．Ｌｅｔｔ．，１３４，１９１−１９４，１９９２）
が知られている。そして無脊椎動物において見出されて
いるこれらペプチドは、オキシトシンとしての作用と、
バソプレシンとしての作用の両方を持つものとされてお
り、無脊椎動物では１種類だったものが分化、進化の過
程でオキシトシンとバソプレシンに分かれていったと考
えられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、新たなオキシトシン／バソプレシンスーパーファミ
リーに分類されるペプチドを見出し、その構造を明らか
にするとともに、その前駆体ポリペプチドの構造、さら
には当該前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡの構造
を明らかにして、これらオキシトシン／バソプレシンス
ーパーファミリーに分類されるペプチドの構造−活性相
関の研究や、オキシトシン／バソプレシンスーパーファ
ミリーに分類されるペプチドの分化、進化の過程を解明
しようとするものである。また本発明は、オキシトシン
／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチ
ドを見出す方法を提供しようとするものである。さらに
農薬または医薬品開発における基礎化合物としても利用
可能な、新規オキシトシン／バソプレシンスーパーファ
ミリーに分類されるペプチドおよびその前駆体ポリペプ
チドを容易にかつ大量に製造する方法を提供することを
も課題とする。
は、新たなオキシトシン／バソプレシンスーパーファミ
リーに分類されるペプチドを見出し、その構造を明らか
にするとともに、その前駆体ポリペプチドの構造、さら
には当該前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡの構造
を明らかにして、これらオキシトシン／バソプレシンス
ーパーファミリーに分類されるペプチドの構造−活性相
関の研究や、オキシトシン／バソプレシンスーパーファ
ミリーに分類されるペプチドの分化、進化の過程を解明
しようとするものである。また本発明は、オキシトシン
／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチ
ドを見出す方法を提供しようとするものである。さらに
農薬または医薬品開発における基礎化合物としても利用
可能な、新規オキシトシン／バソプレシンスーパーファ
ミリーに分類されるペプチドおよびその前駆体ポリペプ
チドを容易にかつ大量に製造する方法を提供することを
も課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かかる課題を解決するた
めに、今回マダコの腸管から、直腸を収縮させる作用を
持つ、セファロトシンとは異なる新たなペプチドを単離
した。無脊椎動物では、オキシトシン／バソプレシンス
ーパーファミリーに分類されるペプチドは同一の動物か
ら一種のペプチドしか単離されておらず、単一のペプチ
ドがオキシトシン様およびバソプレシン様の両方の作用
を示すとされてきた。しかしながら、マダコから二種の
ペプチドが単離されたことは初めての例である。これは
新たな複数のファミリーペプチドの存在を示唆するもの
である。
めに、今回マダコの腸管から、直腸を収縮させる作用を
持つ、セファロトシンとは異なる新たなペプチドを単離
した。無脊椎動物では、オキシトシン／バソプレシンス
ーパーファミリーに分類されるペプチドは同一の動物か
ら一種のペプチドしか単離されておらず、単一のペプチ
ドがオキシトシン様およびバソプレシン様の両方の作用
を示すとされてきた。しかしながら、マダコから二種の
ペプチドが単離されたことは初めての例である。これは
新たな複数のファミリーペプチドの存在を示唆するもの
である。
【０００７】しかして本発明は、９個のアミノ酸残基の
配列からなり、Ｎ末端から５番目のアミノ酸がＳｅｒで
ある、オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリー
に分類されるペプチドを提供する。
配列からなり、Ｎ末端から５番目のアミノ酸がＳｅｒで
ある、オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリー
に分類されるペプチドを提供する。
【０００８】そのなかでも、本発明は特に、次の特性：
アミノ酸残基数が９であり；
Ｎ末端がＣｙｓであり；
Ｃ末端から５つのアミノ酸が次のアミノ酸配列式
（Ｉ）： −Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （Ｉ） で表わされ、Ｎ末端のＣｙｓとＮ末端から６番目のＣｙ
ｓとがジスルフィド結合している、オキシトシン／バソ
プレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドを提
供する。
（Ｉ）： −Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （Ｉ） で表わされ、Ｎ末端のＣｙｓとＮ末端から６番目のＣｙ
ｓとがジスルフィド結合している、オキシトシン／バソ
プレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドを提
供する。
【０００９】より具体的な本発明は、特に、次のアミノ
酸配列式（１）： Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌ ｙ−ＮＨ２ （１） で表わされ、Ｎ末端のＣｙｓとＮ末端から６番目のＣｙ
ｓとがジスルフィド結合している、オキシトシン／バソ
プレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドを提
供する。
酸配列式（１）： Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌ ｙ−ＮＨ２ （１） で表わされ、Ｎ末端のＣｙｓとＮ末端から６番目のＣｙ
ｓとがジスルフィド結合している、オキシトシン／バソ
プレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドを提
供する。
【００１０】すなわち、本発明者らはマダコ（Ｏｃｔｏ
ｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の直腸から、直腸を収縮さ
せる作用を有するペプチドを得るべく探索を行い、上記
アミノ酸配列式（１）で表されるペプチド（本ペプチド
を、「オクトシン」と命名した。）を分離、精製し、そ
の化学構造を決定すると共に、全合成によりその構造お
よび生理活性を確認した。（なお、本明細書中において
は、アミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める
３文字表記により表記する。）
ｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の直腸から、直腸を収縮さ
せる作用を有するペプチドを得るべく探索を行い、上記
アミノ酸配列式（１）で表されるペプチド（本ペプチド
を、「オクトシン」と命名した。）を分離、精製し、そ
の化学構造を決定すると共に、全合成によりその構造お
よび生理活性を確認した。（なお、本明細書中において
は、アミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める
３文字表記により表記する。）
【００１１】さらに本発明者らは、上記のオクトシンの
アミノ酸配列、およびセファロトシンのアミノ酸配列を
もとにプライマーを作成し、マダコの脳から調製したｔ
ｏｔａｌ ＲＮＡに対して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反
応（ＲＴ−ＰＣＲ）法などを用いた遺伝子配列の解析手
段を組み合わせることにより、オキシトシン／バソプレ
シンスーパーファミリーに分類されるオクトシン、およ
びセファロトシンの前駆体であるポリペプチドの全一次
アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および配列番号３
で示されることを明らかにした。また、これらの前駆体
ポリペプチドをコードする遺伝子は、それぞれ配列番号
４および配列番号５に示す塩基配列を有するものである
ことを明らかにした。
アミノ酸配列、およびセファロトシンのアミノ酸配列を
もとにプライマーを作成し、マダコの脳から調製したｔ
ｏｔａｌ ＲＮＡに対して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反
応（ＲＴ−ＰＣＲ）法などを用いた遺伝子配列の解析手
段を組み合わせることにより、オキシトシン／バソプレ
シンスーパーファミリーに分類されるオクトシン、およ
びセファロトシンの前駆体であるポリペプチドの全一次
アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および配列番号３
で示されることを明らかにした。また、これらの前駆体
ポリペプチドをコードする遺伝子は、それぞれ配列番号
４および配列番号５に示す塩基配列を有するものである
ことを明らかにした。
【００１２】したがって、本発明は別の態様として、配
列番号２または３で表わされるアミノ酸配列または、そ
の一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列、あるいは
該アミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換した
アミノ酸配列に１個から複数個のアミノ酸が付加したア
ミノ酸配列を有する、オキシトシン／バソプレシンスー
パーファミリーに分類されるペプチドの前駆体ポリペプ
チドを、また、別の態様としては、かかるオキシトシン
／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチ
ドの前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子を提供す
る。
列番号２または３で表わされるアミノ酸配列または、そ
の一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列、あるいは
該アミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換した
アミノ酸配列に１個から複数個のアミノ酸が付加したア
ミノ酸配列を有する、オキシトシン／バソプレシンスー
パーファミリーに分類されるペプチドの前駆体ポリペプ
チドを、また、別の態様としては、かかるオキシトシン
／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチ
ドの前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子を提供す
る。
【００１３】さらに別の態様として、本発明は、かかる
オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類
されるペプチドの前駆体ポリペプチドをコードする遺伝
子を用いた前駆体ポリペプチド、およびオキシトシン／
バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチド
の製造方法を提供する。
オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類
されるペプチドの前駆体ポリペプチドをコードする遺伝
子を用いた前駆体ポリペプチド、およびオキシトシン／
バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチド
の製造方法を提供する。
【００１４】さらにまた別の態様として、本発明は同様
のアミノ酸配列を有する新規なオキシトシン／バソプレ
シンスーパーファミリーに分類されるペプチドを他の生
物種においてスクリーニングおよびクローニングする方
法を提供する。
のアミノ酸配列を有する新規なオキシトシン／バソプレ
シンスーパーファミリーに分類されるペプチドを他の生
物種においてスクリーニングおよびクローニングする方
法を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明が提供する新規ペプチド
は、無脊椎動物の腸管収縮作用を有するオキシトシン／
バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチド
であり、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）
から、例えば以下の方法により単離、精製することがで
きる。
は、無脊椎動物の腸管収縮作用を有するオキシトシン／
バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチド
であり、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）
から、例えば以下の方法により単離、精製することがで
きる。
【００１６】すなわち、マダコの腸管を粉砕後煮沸し、
その抽出液に酢酸を３％濃度になるように加えホモゲナ
イズし、冷却後遠心分離して粗抽出物を得る。この粗抽
出物をＣ１８カートリッジ（例えばＳｅｐ−Ｐａｋ（登
録商標）Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ：Ｗａｔｅｒｓ社製）に
吸着させた後、０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦ
Ａと略す）を含む６０％メタノールで溶出してペプチド
画分を分取して、この画分をイオン交換クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー等に付して、目的とする
ペプチドを分離、精製することができる。
その抽出液に酢酸を３％濃度になるように加えホモゲナ
イズし、冷却後遠心分離して粗抽出物を得る。この粗抽
出物をＣ１８カートリッジ（例えばＳｅｐ−Ｐａｋ（登
録商標）Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ：Ｗａｔｅｒｓ社製）に
吸着させた後、０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦ
Ａと略す）を含む６０％メタノールで溶出してペプチド
画分を分取して、この画分をイオン交換クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー等に付して、目的とする
ペプチドを分離、精製することができる。
【００１７】また、本発明のペプチドはアミノ酸残基数
９のペプチドであるため、通常のペプチド合成機（例え
ばアプライド バイオシステムズ社製全自動ペプチド合
成機４３３Ａ型）を用いた固相合成法や、通常の有機合
成化学的手法により容易に合成することができる。これ
らの方法で得られた粗ペプチドは、必要であれば逆相高
速液体クロマトグラフィーや結晶化等の通常の精製手法
によって、精製することができる。
９のペプチドであるため、通常のペプチド合成機（例え
ばアプライド バイオシステムズ社製全自動ペプチド合
成機４３３Ａ型）を用いた固相合成法や、通常の有機合
成化学的手法により容易に合成することができる。これ
らの方法で得られた粗ペプチドは、必要であれば逆相高
速液体クロマトグラフィーや結晶化等の通常の精製手法
によって、精製することができる。
【００１８】一方、マダコのオキシトシン／バソプレシ
ンスーパーファミリーに分類されるペプチドの前駆体ポ
リペプチドのアミノ酸配列、および当該ポリペプチドを
コードする遺伝子の塩基配列は、次のようにして決定す
ることができる。
ンスーパーファミリーに分類されるペプチドの前駆体ポ
リペプチドのアミノ酸配列、および当該ポリペプチドを
コードする遺伝子の塩基配列は、次のようにして決定す
ることができる。
【００１９】すなわち、上記により得られたオキシトシ
ン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプ
チドのアミノ酸配列をもとにプライマーを作成し、マダ
コの脳より調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡに対して逆転写
ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、約５０
０塩基対の遺伝子配列を解明し、続いて５’−ＲＡＣＥ
法、３’−ＲＡＣＥ法を用いて５’末端および３’末端
側の遺伝子配列を解明することができる。本発明におい
ては、この方法によりマダコのオキシトシン／バソプレ
シンスーパーファミリーに分類されるペプチドであるオ
クトシンおよびセファロトシンの前駆体ポリペプチド
は、それぞれ配列番号２および配列番号３で示されるア
ミノ酸配列を有するものであること、また、これらの前
駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は、それぞれ配列
番号４および配列番号５に示す塩基配列を有するもので
あることを明らかにした。
ン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプ
チドのアミノ酸配列をもとにプライマーを作成し、マダ
コの脳より調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡに対して逆転写
ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、約５０
０塩基対の遺伝子配列を解明し、続いて５’−ＲＡＣＥ
法、３’−ＲＡＣＥ法を用いて５’末端および３’末端
側の遺伝子配列を解明することができる。本発明におい
ては、この方法によりマダコのオキシトシン／バソプレ
シンスーパーファミリーに分類されるペプチドであるオ
クトシンおよびセファロトシンの前駆体ポリペプチド
は、それぞれ配列番号２および配列番号３で示されるア
ミノ酸配列を有するものであること、また、これらの前
駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は、それぞれ配列
番号４および配列番号５に示す塩基配列を有するもので
あることを明らかにした。
【００２０】したがって、本発明のオキシトシン／バソ
プレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドの前
駆体ポリペプチドおよびオキシトシン／バソプレシンス
ーパーファミリーに分類されるペプチドは、遺伝子組み
換え法によっても製造することができる。すなわち、遺
伝子組み換え法によって製造を行う場合は、例えば、配
列番号４または配列番号５で示される遺伝子を組み込ん
だベクターを作成し、当該ベクターによって宿主の形質
転換を行った後、該宿主を培養または成育させ、該宿主
または該宿主の培養液から目的の前駆体ポリペプチドを
単離、精製すれば良い。そして、前駆体ポリペプチドか
ら目的のオキシトシン／バソプレシンスーパーファミリ
ーに分類されるペプチドを得るには、前駆体ポリペプチ
ドから酵素などを用いて切り出し（プロセッシング）を
行い、アミド化、ジスルフィド結合形成を行った後、必
要に応じて単離、精製すれば良い。
プレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドの前
駆体ポリペプチドおよびオキシトシン／バソプレシンス
ーパーファミリーに分類されるペプチドは、遺伝子組み
換え法によっても製造することができる。すなわち、遺
伝子組み換え法によって製造を行う場合は、例えば、配
列番号４または配列番号５で示される遺伝子を組み込ん
だベクターを作成し、当該ベクターによって宿主の形質
転換を行った後、該宿主を培養または成育させ、該宿主
または該宿主の培養液から目的の前駆体ポリペプチドを
単離、精製すれば良い。そして、前駆体ポリペプチドか
ら目的のオキシトシン／バソプレシンスーパーファミリ
ーに分類されるペプチドを得るには、前駆体ポリペプチ
ドから酵素などを用いて切り出し（プロセッシング）を
行い、アミド化、ジスルフィド結合形成を行った後、必
要に応じて単離、精製すれば良い。
【００２１】
【作用】本発明のペプチドは、オキシトシン様の子宮筋
収縮作用と乳汁射出作用、さらにはバソプレシン様の昇
圧作用および抗利尿作用を示すオキシトシン／バソプレ
シンスーパーファミリーに分類されるペプチドであるた
め、神経伝達系研究用の試薬としてだけでなく、医薬へ
の新たなアプローチを与える有用な化合物として利用す
ることができる。
収縮作用と乳汁射出作用、さらにはバソプレシン様の昇
圧作用および抗利尿作用を示すオキシトシン／バソプレ
シンスーパーファミリーに分類されるペプチドであるた
め、神経伝達系研究用の試薬としてだけでなく、医薬へ
の新たなアプローチを与える有用な化合物として利用す
ることができる。
【００２２】例えば、本発明のペプチドを有効成分とす
る医薬としては、製剤学的に慣用されている賦形剤と共
にカプセル剤、錠剤、注射剤等の適当な剤形で、経口的
または非経口的に投与することができる。具体的には、
本発明のペプチドを、乳糖、デンプンまたはその誘導
体、セルロース誘導体等の賦形剤と混合したのち、ゼラ
チンカプセルに充填することによりカプセル剤を調製す
ることができる。
る医薬としては、製剤学的に慣用されている賦形剤と共
にカプセル剤、錠剤、注射剤等の適当な剤形で、経口的
または非経口的に投与することができる。具体的には、
本発明のペプチドを、乳糖、デンプンまたはその誘導
体、セルロース誘導体等の賦形剤と混合したのち、ゼラ
チンカプセルに充填することによりカプセル剤を調製す
ることができる。
【００２３】また錠剤は、上記の賦形剤の他に、カルボ
キシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸、アラビ
アゴム等の結合剤と水を加えて練合し、必要により顆粒
として造粒したのち、さらにタルク、ステアリン酸マグ
ネシウム等の滑沢剤を添加して、通常の圧縮打錠機を用
いて錠剤に調製することができる。
キシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸、アラビ
アゴム等の結合剤と水を加えて練合し、必要により顆粒
として造粒したのち、さらにタルク、ステアリン酸マグ
ネシウム等の滑沢剤を添加して、通常の圧縮打錠機を用
いて錠剤に調製することができる。
【００２４】さらに、非経口投与に際しては、本発明の
ペプチドを溶解補助剤と共に滅菌蒸留水あるいは滅菌生
理食塩水に溶解し、アンプルに封入して注射用製剤とす
ることができる。この場合、必要により安定化剤、緩衝
物質等を含有させてもよい。また、粉末のままバイアル
充填し、滅菌蒸留水により用時溶解型の製剤とすること
もできる。これらの非経口投与製剤は、静脈内投与、あ
るいは点滴静注により投与することができる。
ペプチドを溶解補助剤と共に滅菌蒸留水あるいは滅菌生
理食塩水に溶解し、アンプルに封入して注射用製剤とす
ることができる。この場合、必要により安定化剤、緩衝
物質等を含有させてもよい。また、粉末のままバイアル
充填し、滅菌蒸留水により用時溶解型の製剤とすること
もできる。これらの非経口投与製剤は、静脈内投与、あ
るいは点滴静注により投与することができる。
【００２５】なお本発明の有効成分であるペプチドの投
与量は、種々の要因、例えば治療すべき病態、患者の症
状、重篤度、患者の年齢、さらには投与経路等を考慮し
て、適宜設定すればよい。一般的に経口投与の場合に
は、有効成分として通常０．１〜１０００ｍｇ／日／ヒ
ト、好ましくは１〜５００ｍｇ／日／ヒトの範囲内で、
また非経口投与の場合には、経口投与の場合における投
与量の約１／１００〜１／２程度の範囲内で適宜選択し
投与することができる。
与量は、種々の要因、例えば治療すべき病態、患者の症
状、重篤度、患者の年齢、さらには投与経路等を考慮し
て、適宜設定すればよい。一般的に経口投与の場合に
は、有効成分として通常０．１〜１０００ｍｇ／日／ヒ
ト、好ましくは１〜５００ｍｇ／日／ヒトの範囲内で、
また非経口投与の場合には、経口投与の場合における投
与量の約１／１００〜１／２程度の範囲内で適宜選択し
投与することができる。
【００２６】
【実施例】次に実施例によって本発明をさらに説明する
が、本発明の範囲はこれのみに限定されるものではな
い。
が、本発明の範囲はこれのみに限定されるものではな
い。
【００２７】実施例１：マダコの腸管からのペプチド類
の分離 （ａ）：粗抽出 マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）から腸管
を摘出し、液体窒素にて凍結し、粉砕した。組織（５８
ｇ）を沸騰した蒸留水６００ｍｌ中に入れ、１０分間煮
沸した。放冷後、酢酸を３％濃度になるように加え、ホ
モゲナイズした後、４℃にて３０分間１２，０００×ｇ
で遠心分離して、上清を得た。沈殿物には２００ｍｌの
３％酢酸を加えて再度ホモゲナイズし、同様に遠心分離
をして上清を得た。両方の上清を合わせて抽出物とし
た。
の分離 （ａ）：粗抽出 マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）から腸管
を摘出し、液体窒素にて凍結し、粉砕した。組織（５８
ｇ）を沸騰した蒸留水６００ｍｌ中に入れ、１０分間煮
沸した。放冷後、酢酸を３％濃度になるように加え、ホ
モゲナイズした後、４℃にて３０分間１２，０００×ｇ
で遠心分離して、上清を得た。沈殿物には２００ｍｌの
３％酢酸を加えて再度ホモゲナイズし、同様に遠心分離
をして上清を得た。両方の上清を合わせて抽出物とし
た。
【００２８】（ｂ）：Ｃ１８カートリッジへの吸着
（ａ）で得られた抽出物をＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）
Ｖａｃ Ｃ１８カートリッジ（１０ｇ、３５ｍｌ、Ｗａ
ｔｅｒｓ社製）に通した。カートリッジを０．１％トリ
フロロ酢酸（以下、ＴＦＡと略す）２００ｍｌで洗浄し
た後、保持物質を６０％メタノール／０．１％ＴＦＡ１
００ｍｌで溶出し、溶出液を減圧濃縮後、凍結乾燥させ
た。
Ｖａｃ Ｃ１８カートリッジ（１０ｇ、３５ｍｌ、Ｗａ
ｔｅｒｓ社製）に通した。カートリッジを０．１％トリ
フロロ酢酸（以下、ＴＦＡと略す）２００ｍｌで洗浄し
た後、保持物質を６０％メタノール／０．１％ＴＦＡ１
００ｍｌで溶出し、溶出液を減圧濃縮後、凍結乾燥させ
た。
【００２９】（ｃ）：逆相高速液体カラムクロマトグラ
フィー （ｂ）で得られた残査を０．１％ＴＦＡに溶かし、Ｃａ
ｐｃｅｌｌ ｐａｋＣ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ１０
×２５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相高速液体カラム
クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付し、流速１．
５ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、
６０分間で０％から６０％のアセトニトリルの直線濃度
勾配で溶出した。２１５ｎｍの紫外吸収のモニターによ
り、３ｍｌずつに分画した。各フラクションを後記する
実施例４に示す方法に従って生物検定に付したところ、
アセトニトリル濃度３８〜４０％に溶出される画分に、
マダコの直腸に対する自動収縮増強活性がみられた。
フィー （ｂ）で得られた残査を０．１％ＴＦＡに溶かし、Ｃａ
ｐｃｅｌｌ ｐａｋＣ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ１０
×２５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相高速液体カラム
クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付し、流速１．
５ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、
６０分間で０％から６０％のアセトニトリルの直線濃度
勾配で溶出した。２１５ｎｍの紫外吸収のモニターによ
り、３ｍｌずつに分画した。各フラクションを後記する
実施例４に示す方法に従って生物検定に付したところ、
アセトニトリル濃度３８〜４０％に溶出される画分に、
マダコの直腸に対する自動収縮増強活性がみられた。
【００３０】（ｄ）：陽イオン交換カラムクロマトグラ
フィー （ｃ）で得られた活性画分を濃縮し、１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶かしてＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５
ＰＷ（１０μｍ、Φ７．５×７５ｍｍ、東ソー製）を用
いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（陽イオン
交換ＨＰＬＣ）に添加した。流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ
で、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、６０分間
で０Ｍから０．６ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出し
た。２ｍｌずつの画分を生物検定したところ、０Ｍ Ｎ
ａＣｌに溶出する画分に活性が見られた。
フィー （ｃ）で得られた活性画分を濃縮し、１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶かしてＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５
ＰＷ（１０μｍ、Φ７．５×７５ｍｍ、東ソー製）を用
いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（陽イオン
交換ＨＰＬＣ）に添加した。流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ
で、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、６０分間
で０Ｍから０．６ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出し
た。２ｍｌずつの画分を生物検定したところ、０Ｍ Ｎ
ａＣｌに溶出する画分に活性が見られた。
【００３１】（ｅ）：逆相ＨＰＬＣ
（ｄ）で得られた活性画分を、Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ
Ｃ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、
資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍ
ｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、４０
分間で、２４〜４４％のアセトニトリル濃度直線勾配で
溶出した。アセトニトリル濃度約２４％に溶出する画分
に活性を認めた。この画分は左右対称のピークを示すこ
とから単一に純化されたと判断して化合物（１）とし
た。この逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを図１に示し
た。
Ｃ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、
資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍ
ｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、４０
分間で、２４〜４４％のアセトニトリル濃度直線勾配で
溶出した。アセトニトリル濃度約２４％に溶出する画分
に活性を認めた。この画分は左右対称のピークを示すこ
とから単一に純化されたと判断して化合物（１）とし
た。この逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを図１に示し
た。
【００３２】実施例２：ペプチドの同定
実施例１で純化した化合物（１）の構造を、Ｓｈｉｍａ
ｄｚｕ ＰＳＱ−１型気相シークエンサー（島津製作所
製）によってアミノ酸配列分析をした。Ｎ−末端１番目
と６番目のアミノ酸残基が不明であったが、他の７残基
についてはアミノ酸配列の情報を得た。この結果を下記
表１に示した。
ｄｚｕ ＰＳＱ−１型気相シークエンサー（島津製作所
製）によってアミノ酸配列分析をした。Ｎ−末端１番目
と６番目のアミノ酸残基が不明であったが、他の７残基
についてはアミノ酸配列の情報を得た。この結果を下記
表１に示した。
【００３３】
【表１】ペプチドのアミノ酸配列（単位：ｐｍｏｌ）
【００３４】化合物（１）の分子量は、ｎａｎｏ ＥＳ
Ｉ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｑ−ＴＯＦ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ
ＵＫ社製）によって確認した。その測定値を下記表２に
示した。
Ｉ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｑ−ＴＯＦ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ
ＵＫ社製）によって確認した。その測定値を下記表２に
示した。
【００３５】
【表２】化合物（１）のＭＳデータ
【００３６】上記したアミノ酸配列と分子量測定によ
り、化合物（１）はＮ末端から１番目と６番目がＣｙｓ
であり、この２つのＣｙｓはジスルフィド結合している
ことがわかった。
り、化合物（１）はＮ末端から１番目と６番目がＣｙｓ
であり、この２つのＣｙｓはジスルフィド結合している
ことがわかった。
【００３７】以上の機器分析データにより、今回単離、
精製されたマダコの神経ペプチド類である化合物（１）
は、次のアミノ酸配列式（１） Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌ ｙ−ＮＨ２ （１） で表されることが明らかになった（ただし、２つのＣｙ
ｓはジスルフィド結合している）。
精製されたマダコの神経ペプチド類である化合物（１）
は、次のアミノ酸配列式（１） Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌ ｙ−ＮＨ２ （１） で表されることが明らかになった（ただし、２つのＣｙ
ｓはジスルフィド結合している）。
【００３８】実施例３：固相法による化合物（１）の合
成 化合物（１）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型を用い、Ｆａｓ
ｔＭｏｃ（登録商標）法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ社）により合成した。Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡ
Ｌ−Ａレジン（渡辺化学工業社製）を担体とし、Ｆｍｏ
ｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍ
ｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ
−ＩｌｅおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｙを用いた。（ただし、
Ｆｍｏｃは９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａ
ｒｂｏｎｙｌを、Ｔｒｔはｔｒｉｔｙｌを、Ｂｏｃはｔ
−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、ｔＢｕはｔ−ｂｕ
ｔｙｌを示す。）
成 化合物（１）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型を用い、Ｆａｓ
ｔＭｏｃ（登録商標）法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ社）により合成した。Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡ
Ｌ−Ａレジン（渡辺化学工業社製）を担体とし、Ｆｍｏ
ｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−
Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍ
ｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ
−ＩｌｅおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｙを用いた。（ただし、
Ｆｍｏｃは９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａ
ｒｂｏｎｙｌを、Ｔｒｔはｔｒｉｔｙｌを、Ｂｏｃはｔ
−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、ｔＢｕはｔ−ｂｕ
ｔｙｌを示す。）
【００３９】反応終了後のペプチド樹脂からの粗ペプチ
ドの切り離しと脱保護には、１００ｍｇの２−メチルイ
ンドールを溶かした１，２−エタンジチオール２．５％
／水２．５％／ＴＦＡ９５％混液を用いた。反応混合物
を濾過し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈殿さ
せ、沈殿をエーテルで３回洗浄し、粗ペプチド３００ｍ
ｇを得た。このうち、約１００ｍｇの粗ペプチドを南竹
の方法（南竹義春、京都大学薬学博士論文、１９９１）
により、フェリシアン化カリウムを用いて酸化させ、ジ
スルフィド結合させた。結合後の粗ペプチドを逆相ＨＰ
ＬＣにより精製し、約２０ｍｇの精製ペプチドを得た。
ドの切り離しと脱保護には、１００ｍｇの２−メチルイ
ンドールを溶かした１，２−エタンジチオール２．５％
／水２．５％／ＴＦＡ９５％混液を用いた。反応混合物
を濾過し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈殿さ
せ、沈殿をエーテルで３回洗浄し、粗ペプチド３００ｍ
ｇを得た。このうち、約１００ｍｇの粗ペプチドを南竹
の方法（南竹義春、京都大学薬学博士論文、１９９１）
により、フェリシアン化カリウムを用いて酸化させ、ジ
スルフィド結合させた。結合後の粗ペプチドを逆相ＨＰ
ＬＣにより精製し、約２０ｍｇの精製ペプチドを得た。
【００４０】精製ペプチドは、Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｃ
Ｃ１８を用いた逆相ＨＰＬＣにおいて、保持時間が化
合物（１）と全く一致した。また、マダコの直腸におい
ても、合成物は天然物と同様の活性を示した。
Ｃ１８を用いた逆相ＨＰＬＣにおいて、保持時間が化
合物（１）と全く一致した。また、マダコの直腸におい
ても、合成物は天然物と同様の活性を示した。
【００４１】実施例４：マダコ直腸の自動収縮増強活性
の測定 マダコ直腸の自動収縮増強活性は、次のとおり実施し
た。すなわち、マダコの直腸を摘出し、両端を木綿糸で
縛り、一端をチャンバー（２ｍｌ）に固定し、他端を張
力トランスデューサーにつないだ。チャンバーを人工海
水２ｍｌで満たし、エアーレーションを行った。自動収
縮が安定した後、化合物（１）を人工海水に溶解して添
加した。発生した張力を変換アンプで増幅し、ペンレコ
ーダーで記録した。化合物（１）は図２に示すように、
マダコ直腸の自動収縮増強活性を示した。
の測定 マダコ直腸の自動収縮増強活性は、次のとおり実施し
た。すなわち、マダコの直腸を摘出し、両端を木綿糸で
縛り、一端をチャンバー（２ｍｌ）に固定し、他端を張
力トランスデューサーにつないだ。チャンバーを人工海
水２ｍｌで満たし、エアーレーションを行った。自動収
縮が安定した後、化合物（１）を人工海水に溶解して添
加した。発生した張力を変換アンプで増幅し、ペンレコ
ーダーで記録した。化合物（１）は図２に示すように、
マダコ直腸の自動収縮増強活性を示した。
【００４２】実施例５：マダコ体心臓の拍動増強活性の
測定 マダコの心臓の拍動活性は、森下ら（Ｆ．Ｍｏｒｉｓｈ
ｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．，２４０，３５４−３５８，１９９７）
の方法に準拠して実施した。すなわち、マダコの心臓を
摘出し、両心房を切断して、それぞれの房室から心室に
カニューレを差し込み、チャンバー（容量８０ｍｌ）に
木綿の糸で縛って固定した。また、心室内の溶液が流れ
出すのを妨げないように大動脈をはさみ、張力トランス
デューサーにつないで検定の標本とした。カニューレか
らは人工海水（０．１％グルコースを含む）が１〜２ｍ
ｌ／分で流れるようセットした。検定すべき検体は、同
様の人工海水１ｍｌに溶解して、カニューレから心臓内
部に到達するよう添加し、心臓の拍動の変化を記録し
た。その結果、化合物（１）は図３に示すように、マダ
コ心臓の心拍頻度を増強させ、また、振幅も増大させ
た。
測定 マダコの心臓の拍動活性は、森下ら（Ｆ．Ｍｏｒｉｓｈ
ｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．，２４０，３５４−３５８，１９９７）
の方法に準拠して実施した。すなわち、マダコの心臓を
摘出し、両心房を切断して、それぞれの房室から心室に
カニューレを差し込み、チャンバー（容量８０ｍｌ）に
木綿の糸で縛って固定した。また、心室内の溶液が流れ
出すのを妨げないように大動脈をはさみ、張力トランス
デューサーにつないで検定の標本とした。カニューレか
らは人工海水（０．１％グルコースを含む）が１〜２ｍ
ｌ／分で流れるようセットした。検定すべき検体は、同
様の人工海水１ｍｌに溶解して、カニューレから心臓内
部に到達するよう添加し、心臓の拍動の変化を記録し
た。その結果、化合物（１）は図３に示すように、マダ
コ心臓の心拍頻度を増強させ、また、振幅も増大させ
た。
【００４３】実施例６：マダコ卵管の自動収縮増強活性
の測定 マダコ卵管の自動収縮増強活性は、実施例４と同様に行
った。その結果、化合物（１）は図４に示すように、マ
ダコ卵管の自動収縮増強活性を示した。
の測定 マダコ卵管の自動収縮増強活性は、実施例４と同様に行
った。その結果、化合物（１）は図４に示すように、マ
ダコ卵管の自動収縮増強活性を示した。
【００４４】実施例７：化合物（１）前駆体タンパク質
をコードする遺伝子のクローニング （１）マダコ脳のｔｏｔａｌＲＮＡの調製 マダコの脳約１ｇを液体窒素中で粉砕し、１０ｍｌのセ
パゾールＲＮＡ−Ｉ（ナカライテスク社製）に溶解した
後ホモジナイズした。室温で５分間静置した後エッペン
ドルフチューブに１ｍｌずつ分注し、２００μｌずつク
ロロホルムを加えて撹拌後、冷却遠心機（佐久間製作所
製）で遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４
℃）した。上層の水層をエッペンドルフチューブに分取
して０．５ｍｌずつイソプロパノールを加え、室温で１
０分静置した。冷却遠心機で遠心分離（１５，０００ｒ
ｐｍ、１０分間、４℃）した後、上清を除いて１ｍｌの
７５％エタノールを加えて再度遠心分離（１０，０００
ｒｐｍ、５分間、４℃）した。上清を除いて約１０分間
風乾し、１０μｌのＤＥＰＣ−処理水を加え、６０℃で
１０分間インキュベートしてＲＮＡを溶解した。以上の
方法で約２５０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
をコードする遺伝子のクローニング （１）マダコ脳のｔｏｔａｌＲＮＡの調製 マダコの脳約１ｇを液体窒素中で粉砕し、１０ｍｌのセ
パゾールＲＮＡ−Ｉ（ナカライテスク社製）に溶解した
後ホモジナイズした。室温で５分間静置した後エッペン
ドルフチューブに１ｍｌずつ分注し、２００μｌずつク
ロロホルムを加えて撹拌後、冷却遠心機（佐久間製作所
製）で遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４
℃）した。上層の水層をエッペンドルフチューブに分取
して０．５ｍｌずつイソプロパノールを加え、室温で１
０分静置した。冷却遠心機で遠心分離（１５，０００ｒ
ｐｍ、１０分間、４℃）した後、上清を除いて１ｍｌの
７５％エタノールを加えて再度遠心分離（１０，０００
ｒｐｍ、５分間、４℃）した。上清を除いて約１０分間
風乾し、１０μｌのＤＥＰＣ−処理水を加え、６０℃で
１０分間インキュベートしてＲＮＡを溶解した。以上の
方法で約２５０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡが得られた。
【００４５】（２）ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ３’−ＲＡ
ＣＥ 化合物（１）の配列を基に、次の縮重プライマーを設計
し、サワディーカスタムサービス（サワディー・テクノ
ロジー社）で受託合成した。合成したプライマーの配列
を以下に示す。
ＣＥ 化合物（１）の配列を基に、次の縮重プライマーを設計
し、サワディーカスタムサービス（サワディー・テクノ
ロジー社）で受託合成した。合成したプライマーの配列
を以下に示す。
【００４６】
Oct-oxt-1： 5'-TG(C/T)TT(C/T)TGGACI(A/T)(C/G)ITG(C/T)CC -3'
Oct-oxt-2： 5'-TGGACI(A/T)(C/G)ITG(C/T)CCIAT(A/C/T)GG -3'
（各式中の英文字は「ヌクレオチド略語表」による（細
胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」：秀潤
社；以下の各式において同じ。）
胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」：秀潤
社；以下の各式において同じ。）
【００４７】次に、５’／３’−ＲＡＣＥ ｋｉｔ（Ｒ
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて以下
の手順でｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ３’−ＲＡＣＥを行っ
た。すなわち、２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡ、４μｌの
ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、２μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄＴ−ａｎ
ｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
１μｌのＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−処理水
を混合して全量２０μｌとし、５５℃で６０分間インキ
ュベートした後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓ
ｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて以下
の手順でｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ３’−ＲＡＣＥを行っ
た。すなわち、２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡ、４μｌの
ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、２μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄＴ−ａｎ
ｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
１μｌのＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−処理水
を混合して全量２０μｌとし、５５℃で６０分間インキ
ュベートした後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓ
ｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。
【００４８】次に、以下の条件で１ｓｔ−３’−ＲＡＣ
Ｅを行った。すなわち、３μｌの１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８
μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌのＯｃｔ−ｏｘｔ−１
（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＰＣＲ ａｎｃｈ
ｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、０．
５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）(宝
酒造社製)、水を混合して全量５０μｌとし、９４℃５
分間の後、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２
分間で３５サイクル、その後７２℃で７分間反応させ
た。このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、Ｇｅｎ
ｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００ｔｈｅｒｍ
ａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ社製）を用いた。
Ｅを行った。すなわち、３μｌの１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８
μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌのＯｃｔ−ｏｘｔ−１
（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＰＣＲ ａｎｃｈ
ｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、０．
５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）(宝
酒造社製)、水を混合して全量５０μｌとし、９４℃５
分間の後、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２
分間で３５サイクル、その後７２℃で７分間反応させ
た。このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、Ｇｅｎ
ｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００ｔｈｅｒｍ
ａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ社製）を用いた。
【００４９】続いて、１ｓｔ−ＰＣＲ産物をスピンカラ
ム（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（登録商標））Ｓ−４００（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で精製し、
以下の条件で２ｎｄ−３’−ＲＡＣＥを行った。すなわ
ち、２μｌの１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣ
Ｒ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌ
のＯｃｔ−ｏｘｔ−２（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、１μ
ｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐ
ｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａＥｘ Ｔａ
ｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量
５０μｌにし、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５
０℃３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７
２℃で７分間反応させた。反応液５μｌを１．５％アガ
ロースゲルで電気泳動した結果、約５００ｂｐおよび約
４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅がみられた。
ム（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（登録商標））Ｓ−４００（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で精製し、
以下の条件で２ｎｄ−３’−ＲＡＣＥを行った。すなわ
ち、２μｌの１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣ
Ｒ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌ
のＯｃｔ−ｏｘｔ−２（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、１μ
ｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐ
ｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａＥｘ Ｔａ
ｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量
５０μｌにし、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５
０℃３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７
２℃で７分間反応させた。反応液５μｌを１．５％アガ
ロースゲルで電気泳動した結果、約５００ｂｐおよび約
４００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅がみられた。
【００５０】（３）ＰＣＲ産物の連結反応（ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ） ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製し、精製物５μｌと２
μｌのＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ社製）、７μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈ
ｉｇｈ（東洋紡社製）を混合して１６℃で１時間、連結
反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。
ｉｏｎ） ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製し、精製物５μｌと２
μｌのＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ社製）、７μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈ
ｉｇｈ（東洋紡社製）を混合して１６℃で１時間、連結
反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。
【００５１】（４）大腸菌の形質転換
上記（３）で得た１４μｌの連結反応溶液を、コンピテ
ントセルＣｏｍｐｅｐｔｅｎｔ ｈｉｇｈ Ｅ． ｃｏ
ｌｉ ＤＨ５a（東洋紡社製）と混合し、氷中に３０分
間静置した後、４２℃で５０秒間ヒートショックを行
い、形質転換させた。氷中で２分間冷却した後１ｍｌの
ＳＯＣ培地を加え、３７℃で３０分間インキュベートし
た。続いて、ＬＢ／Ａｍｐ．（５０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬＢ）寒天培地上に３５μｌのＸ−ｇａｌを
塗布した後、１００μｌの形質転換体を蒔いた。残りの
形質転換体も１０，０００ｒｐｍで１分間遠沈し、上清
を捨てて容量を約１００μｌに減らし、ＬＢ／Ａｍｐ．
寒天培地上に蒔いた。培地は３７℃で一晩培養した。
ントセルＣｏｍｐｅｐｔｅｎｔ ｈｉｇｈ Ｅ． ｃｏ
ｌｉ ＤＨ５a（東洋紡社製）と混合し、氷中に３０分
間静置した後、４２℃で５０秒間ヒートショックを行
い、形質転換させた。氷中で２分間冷却した後１ｍｌの
ＳＯＣ培地を加え、３７℃で３０分間インキュベートし
た。続いて、ＬＢ／Ａｍｐ．（５０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬＢ）寒天培地上に３５μｌのＸ−ｇａｌを
塗布した後、１００μｌの形質転換体を蒔いた。残りの
形質転換体も１０，０００ｒｐｍで１分間遠沈し、上清
を捨てて容量を約１００μｌに減らし、ＬＢ／Ａｍｐ．
寒天培地上に蒔いた。培地は３７℃で一晩培養した。
【００５２】（５）コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲ
得られたコロニーを鋳型にして、以下の条件でコロニー
（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲを行った。すなわち、５μｌの
１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、５μｌの２ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、０．５μｌのＭ１３ＦＷ ｐｒｉｍｅｒ（１００
ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＭ１３ＲＶ ｐｒｉ
ｍｅｒ（１００ ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのｒＴ
ａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）およ
び水を混合して全量５０μｌとした反応液にコロニーを
混和し、９０℃１０分間の後、９４℃３０秒間、５５℃
３０秒間、７２℃１分間で３０サイクル反応させた。反
応液５μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動した。
なお、この反応に使用したＭ１３ＦＷ ｐｒｉｍｅｒお
よび Ｍ１３ＲＶ ｐｒｉｍｅｒはサワディーカスタム
サービスで受託合成した。その配列を以下に示す。
（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲを行った。すなわち、５μｌの
１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、５μｌの２ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、０．５μｌのＭ１３ＦＷ ｐｒｉｍｅｒ（１００
ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＭ１３ＲＶ ｐｒｉ
ｍｅｒ（１００ ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのｒＴ
ａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）およ
び水を混合して全量５０μｌとした反応液にコロニーを
混和し、９０℃１０分間の後、９４℃３０秒間、５５℃
３０秒間、７２℃１分間で３０サイクル反応させた。反
応液５μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動した。
なお、この反応に使用したＭ１３ＦＷ ｐｒｉｍｅｒお
よび Ｍ１３ＲＶ ｐｒｉｍｅｒはサワディーカスタム
サービスで受託合成した。その配列を以下に示す。
【００５３】
M13FW： 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
M13RV： 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'
【００５４】（６）ＤＮＡシークエンス
【００５５】目的のサイズ（約７００ ｂｐ）のコロニ
ー（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製し
て、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエ
ンスを行った。シークエンスには、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ
３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。得ら
れた配列を、遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ
（ソフトウエア開発株式会社製）を用いて解析した結
果、約５００ｂｐの部分ｃＤＮＡ配列が解明できた。 （７）５’−ＲＡＣＥ 部分ｃＤＮＡの塩基配列から、以下のプライマーを合成
した。 Oct-oxt-1R： 5'-TCGGCAACACATCGTCCTTG−3' Oct-oxt-2R： 5'-TGATGCAACCGTCTTTGTGG−3' Oct-oxt-3R： 5'-TCCGCAAGACATACACTGTC−3'
ー（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製し
て、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエ
ンスを行った。シークエンスには、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ
３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。得ら
れた配列を、遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ
（ソフトウエア開発株式会社製）を用いて解析した結
果、約５００ｂｐの部分ｃＤＮＡ配列が解明できた。 （７）５’−ＲＡＣＥ 部分ｃＤＮＡの塩基配列から、以下のプライマーを合成
した。 Oct-oxt-1R： 5'-TCGGCAACACATCGTCCTTG−3' Oct-oxt-2R： 5'-TGATGCAACCGTCTTTGTGG−3' Oct-oxt-3R： 5'-TCCGCAAGACATACACTGTC−3'
【００５６】次に、５’／３’−ＲＡＣＥ ｋｉｔ（Ｒ
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて以下
の手順で５’−ＲＡＣＥを行った。まず、２μｇのｔｏ
ｔａｌ ＲＮＡ、４μｌのｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｂｕｆｆｅｒ、２μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌ
のＯｃｔ−ｏｘｔ−１Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
１μｌのＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、およびＤＥＰＣ−
処理水を混合して全量２０μｌとし、５５℃で６０分間
インキュベートの後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ
−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを合成した。次いで、１ｓｔ−
ｓｔｒａｎｄ ｃDＮＡをスピンカラムで精製した後、
２．５μｌのｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、２．５
μｌの２ｍＭ ｄＡＴＰを加えて９４ ℃で３分処理
し、さらに１μｌのｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ（１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加えて３７℃で２
０分インキュベート後、７０℃で１０分間処理してｄＡ
−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡを合成した。
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて以下
の手順で５’−ＲＡＣＥを行った。まず、２μｇのｔｏ
ｔａｌ ＲＮＡ、４μｌのｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｂｕｆｆｅｒ、２μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌ
のＯｃｔ−ｏｘｔ−１Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
１μｌのＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、およびＤＥＰＣ−
処理水を混合して全量２０μｌとし、５５℃で６０分間
インキュベートの後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ
−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを合成した。次いで、１ｓｔ−
ｓｔｒａｎｄ ｃDＮＡをスピンカラムで精製した後、
２．５μｌのｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、２．５
μｌの２ｍＭ ｄＡＴＰを加えて９４ ℃で３分処理
し、さらに１μｌのｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ（１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加えて３７℃で２
０分インキュベート後、７０℃で１０分間処理してｄＡ
−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡを合成した。
【００５７】次いで、１ｓｔ−ＰＣＲおよび２ｎｄ−Ｐ
ＣＲを、以下の条件で行った。 １ｓｔ−ＰＣＲ：３μｌのｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃ
ＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＯｃｔ−ｏｘｔ−２Ｒ
（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄ
Ｔ−ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ ｐｍｏｌ
／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ
（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量５
０μｌとし、９４℃で５分間の後、９４℃３０秒間、５
５℃３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７
２℃で７分間反応させた。
ＣＲを、以下の条件で行った。 １ｓｔ−ＰＣＲ：３μｌのｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃ
ＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＯｃｔ−ｏｘｔ−２Ｒ
（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄ
Ｔ−ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ ｐｍｏｌ
／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ
（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量５
０μｌとし、９４℃で５分間の後、９４℃３０秒間、５
５℃３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７
２℃で７分間反応させた。
【００５８】 ２ｎｄ−ＰＣＲ：５μｌのスピンカラ
ム精製した１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＯ
ｃｔ−ｏｘｔ−３Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μ
ｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５
ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ
Ｔａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して
全量５０μｌとし、１ｓｔ−ＰＣＲと同じサイクルで反
応させた。以上の方法で得られた２ｎｄ−ＰＣＲ産物を
１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約５０
０ｂｐのバンドが確認できた。
ム精製した１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＯ
ｃｔ−ｏｘｔ−３Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μ
ｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５
ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ
Ｔａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して
全量５０μｌとし、１ｓｔ−ＰＣＲと同じサイクルで反
応させた。以上の方法で得られた２ｎｄ−ＰＣＲ産物を
１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約５０
０ｂｐのバンドが確認できた。
【００５９】この２ｎｄ−ＰＣＲ産物を上記の方法
（３）、（４）、（５）および（６）に記載した方法に
したがってシークエンスを行った。その結果、化合物
（１）の前駆体をコードするｃＤＮＡのサイズ（約９３
０ｂｐ）と配列、その推定アミノ酸の数（１４５アミノ
酸残基）と配列を明らかにすることができた。
（３）、（４）、（５）および（６）に記載した方法に
したがってシークエンスを行った。その結果、化合物
（１）の前駆体をコードするｃＤＮＡのサイズ（約９３
０ｂｐ）と配列、その推定アミノ酸の数（１４５アミノ
酸残基）と配列を明らかにすることができた。
【００６０】実施例８：セファロトシン前駆体タンパク
質をコードする遺伝子のクローニング （１）マダコ脳 ｔｏｔａｌＲＮＡの調製 実施例７の（１）と同様にしてマダコ脳よりｔｏｔａｌ
ＲＮＡを得た。
質をコードする遺伝子のクローニング （１）マダコ脳 ｔｏｔａｌＲＮＡの調製 実施例７の（１）と同様にしてマダコ脳よりｔｏｔａｌ
ＲＮＡを得た。
【００６１】（２）ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ３’−ＲＡ
ＣＥ セファロトシンのアミノ酸配列を基に、次の縮重プライ
マーを設計し、サワディーカスタムサービス（サワディ
ー・テクノロジー社）で受託合成した。合成したプライ
マーの配列を以下に示す。
ＣＥ セファロトシンのアミノ酸配列を基に、次の縮重プライ
マーを設計し、サワディーカスタムサービス（サワディ
ー・テクノロジー社）で受託合成した。合成したプライ
マーの配列を以下に示す。
【００６２】
Oct-cepha-1： 5'-TG(C/T)TA(C/T)TT(C/T)(A/C)GIAA(C/T)TG(C/T)CC-3'
Oct-cepha-2： 5'-TT(C/T)(A/C)GIAA(C/T)TG(C/T)CCIAT(A/C/T)GG-3'
【００６３】次に、５’／３’−RＡＣＥ ｋｉｔ（Ｒ
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて以下
の手順でｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ３’−ＲＡＣＥを行っ
た。すなわち、２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡ、４μｌの
ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、２μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄＴ−ａｎ
ｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
１μｌのＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−処理水
を混合して全量２０μｌとし、５５℃で６０分間インキ
ュベートした後６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓｔ
ｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて以下
の手順でｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ３’−ＲＡＣＥを行っ
た。すなわち、２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡ、４μｌの
ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、２μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄＴ−ａｎ
ｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
１μｌのＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−処理水
を混合して全量２０μｌとし、５５℃で６０分間インキ
ュベートした後６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓｔ
ｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。
【００６４】次に、以下の条件で１ｓｔ−３’−ＲＡＣ
Ｅを行った。すなわち、３μｌの１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８
μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌのＯｃｔ−ｃｅｐｈａ
−１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＰＣＲ ａｎ
ｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）
（宝酒造社製）、および水を混合して全量５０μｌと
し、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５０℃３０秒
間、７２℃２分間で３５サイクル、その後７２℃で７分
間反応させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、
ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００ ｔｈ
ｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
Ｅを行った。すなわち、３μｌの１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８
μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌのＯｃｔ−ｃｅｐｈａ
−１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＰＣＲ ａｎ
ｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）
（宝酒造社製）、および水を混合して全量５０μｌと
し、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５０℃３０秒
間、７２℃２分間で３５サイクル、その後７２℃で７分
間反応させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、
ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００ ｔｈ
ｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
【００６５】続いて１ｓｔ−ＰＣＲ産物をスピンカラム
精製し、以下の条件で２ｎｄ−３’−ＲＡＣＥを行っ
た。すなわち、５μｌの１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの
１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉ
ｘ、３μｌのＯｃｔ−ｃｅｐｈａ−２（１００ｐｍｏｌ
／μｌ）、１μｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅ
ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａ
Ｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および
水を混合して全量５０μｌとし、９４℃５分間の後、９
４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間で３０サ
イクル、その後７２℃で７分間反応させた。
精製し、以下の条件で２ｎｄ−３’−ＲＡＣＥを行っ
た。すなわち、５μｌの１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの
１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉ
ｘ、３μｌのＯｃｔ−ｃｅｐｈａ−２（１００ｐｍｏｌ
／μｌ）、１μｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅ
ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａ
Ｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および
水を混合して全量５０μｌとし、９４℃５分間の後、９
４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃２分間で３０サ
イクル、その後７２℃で７分間反応させた。
【００６６】反応液５μｌを１．５％アガロースゲルで
電気泳動した結果、約５００ｂｐおよび約４００ｂｐの
ＰＣＲ産物の増幅がみられた。
電気泳動した結果、約５００ｂｐおよび約４００ｂｐの
ＰＣＲ産物の増幅がみられた。
【００６７】（３）ＤＮＡの精製
上記の（２）で得た２ｎｄ−３’−ＲＡＣＥ産物のうち
の２０μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動し、Ｑ
ＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約５００ｂｐの産物を
抽出した。
の２０μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動し、Ｑ
ＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約５００ｂｐの産物を
抽出した。
【００６８】（４）ＰＣＲ産物の連結反応（ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ） 上記の（３）で得た抽出ＤＮＡのうち１５μｌと２μｌ
のＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社製）、１７μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉ
ｇｈ（東洋紡社製）を混合して１６℃で１時間連結反応
（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。
ｉｏｎ） 上記の（３）で得た抽出ＤＮＡのうち１５μｌと２μｌ
のＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社製）、１７μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉ
ｇｈ（東洋紡社製）を混合して１６℃で１時間連結反応
（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。
【００６９】（５）大腸菌の形質転換
上記の（４）で得た３４μｌの連結反応溶液を、コンピ
テントセルＣｏｍｐｅｐｔｅｎｔ ｈｉｇｈ Ｅ． ｃ
ｏｌｉ ＤＨ５a（東洋紡社製）と混合し、氷中に３０
分間静置した後、４２℃で５０秒間ヒートショックを行
い、形質転換させた。氷中で２分間冷却した後１ｍｌの
ＳＯＣ培地を加え、３７℃で３０分間インキュベートし
た。続いて、ＬＢ／Ａｍｐ．（５０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬＢ）寒天培地上に３５μｌのＸ−ｇａｌを
塗布した後、１０μｌの形質転換体を蒔いた。残りの形
質転換体は１０，０００ｒｐｍで１分間遠沈し、上清を
捨てて容量を約１００μｌに減らし、全量をＬＢ／Ａｍ
ｐ．寒天培地上に蒔いた。培地は３７℃で一晩培養し
た。
テントセルＣｏｍｐｅｐｔｅｎｔ ｈｉｇｈ Ｅ． ｃ
ｏｌｉ ＤＨ５a（東洋紡社製）と混合し、氷中に３０
分間静置した後、４２℃で５０秒間ヒートショックを行
い、形質転換させた。氷中で２分間冷却した後１ｍｌの
ＳＯＣ培地を加え、３７℃で３０分間インキュベートし
た。続いて、ＬＢ／Ａｍｐ．（５０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含むＬＢ）寒天培地上に３５μｌのＸ−ｇａｌを
塗布した後、１０μｌの形質転換体を蒔いた。残りの形
質転換体は１０，０００ｒｐｍで１分間遠沈し、上清を
捨てて容量を約１００μｌに減らし、全量をＬＢ／Ａｍ
ｐ．寒天培地上に蒔いた。培地は３７℃で一晩培養し
た。
【００７０】（６）コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲ
得られたコロニーを鋳型にして、以下の条件でコロニー
（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲを行った。すなわち、５μｌの
１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、５μｌの２ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、０．５μｌのＭ１３ＦＷ ｐｒｉｍｅｒ（１００
ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＭ１３ＲＶｐｒｉｍｅ
ｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのｒＴａｑ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）および水
を混合して全量５０μｌとした反応溶液にコロニーを混
和し、９０℃１０分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３
０秒間、７２℃１分間で３０サイクル反応させた。反応
液５μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動した。
（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲを行った。すなわち、５μｌの
１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、５μｌの２ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、０．５μｌのＭ１３ＦＷ ｐｒｉｍｅｒ（１００
ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＭ１３ＲＶｐｒｉｍｅ
ｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのｒＴａｑ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）および水
を混合して全量５０μｌとした反応溶液にコロニーを混
和し、９０℃１０分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３
０秒間、７２℃１分間で３０サイクル反応させた。反応
液５μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動した。
【００７１】なお、この反応に使用したＭ１３ＦＷ ｐ
ｒｉｍｅｒおよびＭ１３ＲＶ ｐｒｉｍｅｒは実施例７
で用いたｐｒｉｍｅｒと同じものである。
ｒｉｍｅｒおよびＭ１３ＲＶ ｐｒｉｍｅｒは実施例７
で用いたｐｒｉｍｅｒと同じものである。
【００７２】（７）ＤＮＡシークエンス
目的のサイズ（約７００ｂｐ）のコロニー（ｃｏｌｏｎ
ｙ）ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製して、ＤＮＡ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエンスを行った。シ
ークエンスには、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
ｙ）ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製して、ＤＮＡ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエンスを行った。シ
ークエンスには、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
【００７３】得られた配列を、遺伝子解析ソフトＧＥＮ
ＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発株式会社製）を用
いて解析した結果、約５００ｂｐの部分ｃＤＮＡ配列が
解明できた。 （８）５’−ＲＡＣＥ 部分ｃＤＮＡの塩基配列から、以下のプライマーを合成
した。 Oct-oxt-1R： 5'-TCGGCAACACATCGTCCTTG-3' Oct-oxt-2R： 5'-TGATGCAACCGTCTTTGTGG-3' cepha-5'-1R： 5'-GATTTGATCCCTGCTCTGAC-3'
ＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発株式会社製）を用
いて解析した結果、約５００ｂｐの部分ｃＤＮＡ配列が
解明できた。 （８）５’−ＲＡＣＥ 部分ｃＤＮＡの塩基配列から、以下のプライマーを合成
した。 Oct-oxt-1R： 5'-TCGGCAACACATCGTCCTTG-3' Oct-oxt-2R： 5'-TGATGCAACCGTCTTTGTGG-3' cepha-5'-1R： 5'-GATTTGATCCCTGCTCTGAC-3'
【００７４】次に、５’／３’−ＲＡＣＥ ｋｉｔ（Ｒ
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて以下
の手順で５’−ＲＡＣＥを行った。まず、２μｇのｔｏ
ｔａｌ ＲＮＡ、４μｌのｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｂｕｆｆｅｒ、２μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌ
のＯｃｔ−ｏｘｔ−１Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
１μｌのＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−処理水
を混合して全量２０μｌとし、５５℃６０分間インキュ
ベートの後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓｔｒ
ａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。次いで、１ｓｔ−ｓｔｒ
ａｎｄ ｃＤＮＡをスピンカラムで精製した後、２．５
μｌのｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、２．５μｌの
２ｍＭｄＡＴＰを加えて９４℃で３分処理し、さらに１
μｌのｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（１
０ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加えて３７℃で２０分インキュ
ベート後、７０℃で１０分間処理してｄＡ−ｔａｉｌｅ
ｄ ｃＤＮＡを合成した。
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて以下
の手順で５’−ＲＡＣＥを行った。まず、２μｇのｔｏ
ｔａｌ ＲＮＡ、４μｌのｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｂｕｆｆｅｒ、２μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌ
のＯｃｔ−ｏｘｔ−１Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
１μｌのＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−処理水
を混合して全量２０μｌとし、５５℃６０分間インキュ
ベートの後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓｔｒ
ａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。次いで、１ｓｔ−ｓｔｒ
ａｎｄ ｃＤＮＡをスピンカラムで精製した後、２．５
μｌのｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、２．５μｌの
２ｍＭｄＡＴＰを加えて９４℃で３分処理し、さらに１
μｌのｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（１
０ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加えて３７℃で２０分インキュ
ベート後、７０℃で１０分間処理してｄＡ−ｔａｉｌｅ
ｄ ｃＤＮＡを合成した。
【００７５】次いで、１ｓｔ−ＰＣＲおよび２ｎｄ−Ｐ
ＣＲを、以下の条件で行った。 １ｓｔ−ＰＣＲ：３μｌのｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃ
ＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＯｃｔ−ｏｘｔ−２Ｒ
（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄ
Ｔ−ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／
μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登
録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量５０μ
ｌとし、９４℃で５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃
３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７２℃
で７分間反応させた。
ＣＲを、以下の条件で行った。 １ｓｔ−ＰＣＲ：３μｌのｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃ
ＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＯｃｔ−ｏｘｔ−２Ｒ
（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄ
Ｔ−ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／
μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登
録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量５０μ
ｌとし、９４℃で５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃
３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７２℃
で７分間反応させた。
【００７６】 ２ｎｄ−ＰＣＲ：５μｌのスピンカラ
ム精製した１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのｃ
ｅｐｈａ−５’−１Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１
μｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５
ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ
Ｔａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して
全量５０μｌとし、１ｓｔ−ＰＣＲと同じサイクルで反
応させた。以上の方法で得られた２ｎｄ−ＰＣＲ産物を
１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約４０
０ｂｐのバンドが確認できた。
ム精製した１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのｃ
ｅｐｈａ−５’−１Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１
μｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５
ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ
Ｔａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して
全量５０μｌとし、１ｓｔ−ＰＣＲと同じサイクルで反
応させた。以上の方法で得られた２ｎｄ−ＰＣＲ産物を
１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約４０
０ｂｐのバンドが確認できた。
【００７７】この２ｎｄ−ＰＣＲ産物を上記の方法
（４）、（５）、（６）および（７）に記載した方法に
したがってシークエンスを行った。その結果、セファロ
トシンの前駆体をコードするｃＤＮＡのサイズ（約８０
０ｂｐ）と配列、その推定アミノ酸の数（１５２アミノ
酸残基）と配列を明らかにすることができた。
（４）、（５）、（６）および（７）に記載した方法に
したがってシークエンスを行った。その結果、セファロ
トシンの前駆体をコードするｃＤＮＡのサイズ（約８０
０ｂｐ）と配列、その推定アミノ酸の数（１５２アミノ
酸残基）と配列を明らかにすることができた。
【００７８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> SUNTORY LIMITED
<120> NOVEL PEPTIDES CLASSIFIED AS OXYTOCIN/VASOPRESSIN SUPER
FAMILY, THEIR PRECURSORS AND GENES CONDING THEREOF
<130> SN-263
<160> 5
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> OCTOPUS VULGARIS
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(9)
<223> C TERMINAL IS AMIDATED.
<400> 1
Cys Phe Trp Thr Ser Cys Pro Ile Gly
1 5
<210> 2
<211> 145
<212> PRT
<213> OCTOPUS VULGARIS
<400> 2
Met Ser Ser Ile Lys Ser Ser Val Phe Ala Ile Leu Ile Val Val Val
1 5 10 15
Leu Leu Pro Leu Val Lys Gly Cys Phe Trp Thr Ser Cys Pro Ile Gly
20 25 30
Gly Lys Arg Ser Asn Ile Pro Ala Thr Glu Pro Arg Gln Cys Met Ser
35 40 45
Cys Gly Pro Asn Gly Glu Gly Gln Cys Val Gly Ser Asn Ile Cys Cys
50 55 60
His Lys Asp Gly Cys Ile Ile Gly Thr Leu Ala Lys Glu Cys Asn Glu
65 70 75 80
Glu Asn Glu Ser Thr Thr Ala Cys Ser Val Lys Gly Val Pro Cys Gly
85 90 95
Thr Asp Gly Gln Gly Arg Cys Val Ala Asp Gly Val Cys Cys Asp Glu
100 105 110
Ser Ser Cys Phe Thr Thr Asp Arg Cys Asp Arg Glu Asn His Arg Ser
115 120 125
Met Ala Met Gln Lys Leu Leu Glu Ile Arg Asp Gly Ile Tyr Tyr Lys
130 135 140
Lys
145
<210> 3
<211> 152
<212> PRT
<213> OCTOPUS VULGARIS
<400> 3
Met Ser Gln Asn Cys Phe Ala Ile Val Gln Leu Leu Phe Val Leu Phe
1 5 10 15
Thr Val Cys Ser Leu Phe Ile Ala Thr Thr Asp Gly Cys Tyr Phe Arg
20 25 30
Asn Cys Pro Ile Gly Gly Lys Arg Ala Thr Pro Met Ser Glu Gln Gly
35 40 45
Ser Asn Gln Lys Cys Met Ser Cys Gly Pro Asn Gly Glu Gly Gln Cys
50 55 60
Val Gly Ser Asn Ile Cys Cys His Lys Asp Gly Cys Ile Ile Gly Thr
65 70 75 80
Leu Ala Lys Glu Cys Asn Glu Glu Asn Glu Ser Thr Thr Ala Cys Ser
85 90 95
Val Lys Gly Val Pro Cys Gly Thr Asp Gly Gln Gly Arg Cys Val Ala
100 105 110
Asp Gly Val Cys Cys Asp Glu Ser Ser Cys Phe Thr Thr Asp Arg Cys
115 120 125
Asp Arg Glu Asn His Arg Ser Met Ala Met Gln Lys Leu Leu Glu Ile
130 135 140
Arg Asp Gly Ile Tyr Tyr Lys Lys
145 150
<210> 4
<211> 930
<212> DNA
<213> OCTOPUS VULGARIS
<220>
<221> CDS
<222> (380)..(814)
<400> 4
atatgtgtct ataacgaact ttatcatgta atatctgatt gattttcgtg actatttaat 60
ttctgttaaa aatttcgatt actgatatca acagcgaaag atattgactc aaagtgaagt 120
aataaagaag aaaattctaa gagagagaga gcaaagattt cttcagaaaa accaaaatat 180
tagaacgaag cttaaggaga tatttctaag aattacaaca tttggaacaa aacgagacga 240
atgatattga aattacatta cacgtgtgtg gctgaattct aacacgacct actaatataa 300
atacatacat atacacaaat ttctatatat atatctatat aacttcatcc caaaaagttc 360
acaaatcaac ttagtgaaa atg tcg agt ata aaa agt agt gta ttt gct att 412
Met Ser Ser Ile Lys Ser Ser Val Phe Ala Ile
1 5 10
tta atc gtt gtg gta ctt tta ccc ctt gtg aag ggt tgt ttc tgg aca 460
Leu Ile Val Val Val Leu Leu Pro Leu Val Lys Gly Cys Phe Trp Thr
15 20 25
agc tgc cct att ggt ggt aaa aga agt aat ata cct gca aca gaa cca 508
Ser Cys Pro Ile Gly Gly Lys Arg Ser Asn Ile Pro Ala Thr Glu Pro
30 35 40
aga cag tgt atg tct tgc gga cca aat ggt gaa ggc cag tgt gtt gga 556
Arg Gln Cys Met Ser Cys Gly Pro Asn Gly Glu Gly Gln Cys Val Gly
45 50 55
tcc aac ata tgc tgc cac aaa gac ggt tgc atc ata ggc aca ctc gca 604
Ser Asn Ile Cys Cys His Lys Asp Gly Cys Ile Ile Gly Thr Leu Ala
60 65 70 75
aag gaa tgc aat gag gag aac gag agc acg aca gca tgt tct gtg aaa 652
Lys Glu Cys Asn Glu Glu Asn Glu Ser Thr Thr Ala Cys Ser Val Lys
80 85 90
ggg gtg ccg tgt gga act gac gga caa gga cga tgt gtt gcc gac ggt 700
Gly Val Pro Cys Gly Thr Asp Gly Gln Gly Arg Cys Val Ala Asp Gly
95 100 105
gtt tgc tgc gat gaa tcc tcc tgt ttt aca acc gat aga tgt gac aga 748
Val Cys Cys Asp Glu Ser Ser Cys Phe Thr Thr Asp Arg Cys Asp Arg
110 115 120
gag aat cat cgc agt atg gca atg cag aaa tta ttg gaa ata cgt gat 796
Glu Asn His Arg Ser Met Ala Met Gln Lys Leu Leu Glu Ile Arg Asp
125 130 135
gga att tat tac aag aaa taaatgaaag aatcataaaa ggaccactct 844
Gly Ile Tyr Tyr Lys Lys
140 145
caaaacgaga tttcatatga aattggaaaa acatctacca ctaccccaat caacaaacag 904
caacaaccac aaaaaaaaaa aaaaaa 930
<210> 5
<211> 806
<212> DNA
<213> OCTOPUS VULGARIS
<220>
<221> CDS
<222> (234)..(689)
<400> 5
gttagccttt atattctgcc gtagtcaggc ggaagaagtg gtaaagagaa aaccagcaaa 60
gaaaaaaaat atctagataa tactacaaga gataactata agtacaacca caccacaaga 120
attaaacaag agacctattt atatatttgc atagtataca gcatatatct ttaaaatacc 180
tttattaatt atatatctat atctgaaaaa aattatacag aacaactgtg aaa atg 236
Met
1
tct caa aat tgt ttc gcc atc gtc caa ctt ttg ttc gtg ttg ttc aca 284
Ser Gln Asn Cys Phe Ala Ile Val Gln Leu Leu Phe Val Leu Phe Thr
5 10 15
gta tgc agt ctc ttc att gcc act aca gat ggt tgc tat ttc cga aac 332
Val Cys Ser Leu Phe Ile Ala Thr Thr Asp Gly Cys Tyr Phe Arg Asn
20 25 30
tgt ccc att ggt ggc aaa cga gcg aca ccc atg tca gag cag gga tca 380
Cys Pro Ile Gly Gly Lys Arg Ala Thr Pro Met Ser Glu Gln Gly Ser
35 40 45
aat caa aag tgt atg tct tgc gga cca aat ggt gaa ggc cag tgt gtt 428
Asn Gln Lys Cys Met Ser Cys Gly Pro Asn Gly Glu Gly Gln Cys Val
50 55 60 65
gga tcc aac ata tgc tgc cac aaa gac ggt tgc atc ata ggc aca ctc 476
Gly Ser Asn Ile Cys Cys His Lys Asp Gly Cys Ile Ile Gly Thr Leu
70 75 80
gca aag gaa tgc aat gag gaa aac gag agc acg aca gca tgt tct gtg 524
Ala Lys Glu Cys Asn Glu Glu Asn Glu Ser Thr Thr Ala Cys Ser Val
85 90 95
aaa ggg gtg ccg tgt gga act gac gga caa gga cga tgt gtt gcc gac 572
Lys Gly Val Pro Cys Gly Thr Asp Gly Gln Gly Arg Cys Val Ala Asp
100 105 110
ggt gtt tgc tgc gat gaa tcc tcc tgt ttt aca acc gat aga tgt gac 620
Gly Val Cys Cys Asp Glu Ser Ser Cys Phe Thr Thr Asp Arg Cys Asp
115 120 125
aga gag aat cat cgc agt atg gca atg cag aaa tta ttg gaa ata cgt 668
Arg Glu Asn His Arg Ser Met Ala Met Gln Lys Leu Leu Glu Ile Arg
130 135 140 145
gat gga att tat tac aag aaa taaatgaaag aatcataaaa ggaccattct 719
Asp Gly Ile Tyr Tyr Lys Lys
150
caaaacgaga tttcatatga aattggaaaa acatctacca ctaccccaat caacaaacag 779
caacaaccac aaaaaaaaaa aaaaaaa 806
【図１】実施例１における本発明のペプチドである化合
物（１）の最終溶出パターンを示す逆相ＨＰＬＣの展開
図である。
物（１）の最終溶出パターンを示す逆相ＨＰＬＣの展開
図である。
【図２】化合物（１）を最終濃度１０−７Ｍになるよう
チャンバーに加えた時の、マダコ直腸の自動収縮の変化
を示す図面である。
チャンバーに加えた時の、マダコ直腸の自動収縮の変化
を示す図面である。
【図３】図３は、化合物（１）を最終濃度１０−７Ｍに
なるようチャンバーに加えた時の、マダコ心臓の自動収
縮の変化を示す図面である。
なるようチャンバーに加えた時の、マダコ心臓の自動収
縮の変化を示す図面である。
【図４】化合物（１）を最終濃度１０−５Ｍになるよう
チャンバーに加えた時の、マダコ卵管の自動収縮の変化
を示す図面である。なお、時間および張力を表わすスケ
ールは、図２，図３とも、図４に示したものと同じであ
る。
チャンバーに加えた時の、マダコ卵管の自動収縮の変化
を示す図面である。なお、時間および張力を表わすスケ
ールは、図２，図３とも、図４に示したものと同じであ
る。
【図５】脊椎動物および無脊椎動物で知られている主な
オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーペプチ
ドと化合物（１）を比較したものである。なお、Ｃｙｓ
残基は、それぞれジスルフィド結合している。
オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーペプチ
ドと化合物（１）を比較したものである。なお、Ｃｙｓ
残基は、それぞれジスルフィド結合している。
【図６】化合物（１）の前駆体遺伝子およびタンパク質
の構造を示す図である。
の構造を示す図である。
【図７】セファロトシンの前駆体遺伝子およびタンパク
質の構造を示す図である。
質の構造を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 15/14 Ｃ０７Ｋ 7/06
Ｃ０７Ｋ 1/113 Ｃ１２Ｎ 1/15
7/06 1/19
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21
1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
5/10 5/00 Ａ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/34
(72)発明者 岩越 栄子
大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号
財団法人サントリー生物有機科学研究所
内
(72)発明者 南方 宏之
大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号
財団法人サントリー生物有機科学研究所
内
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA07 BA80 CA01 GA11
HA20
4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 DA11
4B065 AA90Y AB01 AC14 BA02
CA24 CA44 CA47
4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08
BA17 CA51 CA53 CA59 DB28
DB29 NA14 ZA81 ZA84 ZA85
ZC04
4H045 AA10 BA15 BA32 CA50 EA05
EA20 FA74
Claims (21)
- 【請求項１】 ９個のアミノ酸残基の配列からなり、Ｎ
末端から５番目のアミノ酸がＳｅｒである、オキシトシ
ン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプ
チド。 - 【請求項２】 次の特性： アミノ酸残基数が９であり； Ｎ末端がＣｙｓであり； Ｃ末端から５つのアミノ酸が次のアミノ酸配列式
（Ｉ）： −Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （Ｉ） で表わされ、Ｎ末端のＣｙｓとＮ末端から６番目のＣｙ
ｓとがジスルフィド結合している、請求項１に記載され
るオキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分
類されるペプチド。 - 【請求項３】 次のアミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌ ｙ−ＮＨ２ （１） で表わされ、Ｎ末端のＣｙｓとＮ末端から６番目のＣｙ
ｓとがジスルフィド結合している、請求項１または２に
記載されるオキシトシン／バソプレシンスーパーファミ
リーに分類されるペプチド。 - 【請求項４】 マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖｕｌｇａｒ
ｉｓ）の腸管から得られる請求項１ないし３のいずれか
に記載のペプチド。 - 【請求項５】 配列番号２に示すアミノ酸配列、あるい
は該アミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸
の付加、欠失、および／または他のアミノ酸による置換
により修飾されたアミノ酸配列を有する、オキシトシン
／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチ
ドの前駆体ポリペプチド。 - 【請求項６】 配列番号３に示すアミノ酸配列、あるい
は該アミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸
の付加、欠失、および／または他のアミノ酸による置換
により修飾されたアミノ酸配列を有する、オキシトシン
／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチ
ドの前駆体ポリペプチド。 - 【請求項７】 請求項５に記載のオキシトシン／バソプ
レシンスーパーファミリーに分類されるペプチドの前駆
体ポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項６に記載のオキシトシン／バソプ
レシンスーパーファミリーに分類されるペプチドの前駆
体ポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項９】 配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮ
Ａ。 - 【請求項１０】 配列番号５に示す塩基配列からなるＤ
ＮＡ。 - 【請求項１１】 請求項７ないし１０のいずれか１項に
記載のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ。 - 【請求項１２】 請求項７ないし１１のいずれか１項に
記載のＤＮＡを含んでなるベクター。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載のベクターにより形
質転換された宿主。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載の宿主を培養し、ま
たは生育させ、そして該宿主または該宿主の培養液から
オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類
されるペプチドの前駆体ポリペプチドを採取する、オキ
シトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類され
るペプチドの前駆体ポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法により得られ
る、オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに
分類されるペプチドの前駆体ポリペプチド。 - 【請求項１６】 請求項１４に記載の方法により得られ
るオキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分
類されるペプチドの前駆体ポリペプチドから、オキシト
シン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペ
プチドの前駆体を切り出し、続いてＣ末端の修飾および
ジスルフィド結合を形成することからなるオキシトシン
／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチ
ドの製造方法。 - 【請求項１７】 請求項１６に記載の方法により得られ
るオキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分
類されるペプチド。 - 【請求項１８】 ９個のアミノ酸残基の配列からなり、
Ｎ末端から５番目のアミノ酸がＳｅｒである、請求項１
７に記載のオキシトシン／バソプレシンスーパーファミ
リーに分類されるペプチド。 - 【請求項１９】 次の特性： アミノ酸残基数が９であり； Ｎ末端がＣｙｓであり； Ｃ末端から５つのアミノ酸が次のアミノ酸配列式
（Ｉ）： −Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （Ｉ） で表わされ、Ｎ末端のＣｙｓとＮ末端から６番目のＣｙ
ｓとがジスルフィド結合している、請求項１７に記載さ
れるオキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに
分類されるペプチド。 - 【請求項２０】 次のアミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌ ｙ−ＮＨ２ （１） で表わされ、Ｎ末端のＣｙｓとＮ末端から６番目のＣｙ
ｓとがジスルフィド結合している、請求項１７に記載の
オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類
されるペプチド。 - 【請求項２１】 請求項１ないし４あるいは請求項１７
ないし２０のいずれかに記載のオキシトシン／バソプレ
シンスーパーファミリーに分類されるペプチドを有効成
分とする医薬または農薬。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2001237183A JP2003047475A (ja) | 2001-08-03 | 2001-08-03 | 新規オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001237183A JP2003047475A (ja) | 2001-08-03 | 2001-08-03 | 新規オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003047475A true JP2003047475A (ja) | 2003-02-18 |
Family
ID=19068308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001237183A Pending JP2003047475A (ja) | 2001-08-03 | 2001-08-03 | 新規オキシトシン／バソプレシンスーパーファミリーに分類されるペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003047475A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020085530A1 (ko) * | 2018-10-24 | 2020-04-30 | 국립해양생물자원관 | 낙지 옥토프레신 활성 펩타이드 및 이의 용도 |
| KR20200046488A (ko) * | 2018-10-24 | 2020-05-07 | 국립해양생물자원관 | 낙지 옥토프레신 활성 펩타이드 및 이의 용도 |
| KR102166717B1 (ko) * | 2020-03-03 | 2020-10-16 | 국립해양생물자원관 | 세파로토신을 포함하는 연체동물의 번식 촉진용 조성물 |
| KR102293673B1 (ko) * | 2020-12-11 | 2021-08-24 | 국립해양생물자원관 | 세룰로플라스민 유래 펩타이드 및 이를 포함하는 부화 촉진용 조성물 |
-
2001
- 2001-08-03 JP JP2001237183A patent/JP2003047475A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020085530A1 (ko) * | 2018-10-24 | 2020-04-30 | 국립해양생물자원관 | 낙지 옥토프레신 활성 펩타이드 및 이의 용도 |
| KR20200046488A (ko) * | 2018-10-24 | 2020-05-07 | 국립해양생물자원관 | 낙지 옥토프레신 활성 펩타이드 및 이의 용도 |
| KR102193195B1 (ko) * | 2018-10-24 | 2020-12-28 | 국립해양생물자원관 | 낙지 옥토프레신 활성 펩타이드 및 이의 용도 |
| US11459355B2 (en) | 2018-10-24 | 2022-10-04 | National Marine Biodiversity Institute Of Korea | Peptides having octopus octopressin activity and use thereof |
| KR102166717B1 (ko) * | 2020-03-03 | 2020-10-16 | 국립해양생물자원관 | 세파로토신을 포함하는 연체동물의 번식 촉진용 조성물 |
| KR102293673B1 (ko) * | 2020-12-11 | 2021-08-24 | 국립해양생물자원관 | 세룰로플라스민 유래 펩타이드 및 이를 포함하는 부화 촉진용 조성물 |
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