KR102293673B1 - 세룰로플라스민 유래 펩타이드 및 이를 포함하는 부화 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세룰로플라스민 유래 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 펩타이드의 부화 촉진 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세룰로플라스민 유래 펩타이드는 발생독성이 없을 뿐만 아니라 동물의 부화율을 촉진하는 효과가 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 세룰로플라스민 유래 펩타이드는 난생 동물의 사육·번식 관련 산업 및 연구 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

세룰로플라스민 유래 펩타이드 및 이를 포함하는 부화 촉진용 조성물{Ceruloplasmin-derived peptide and composition for promoting hatching comprising the same}

본 발명은 세룰로플라스민 유래 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 펩타이드의 부화 촉진 용도에 관한 것이다.

세룰로플라스민(ceruloplasmin)은 혈액에서 구리를 운반하는 주요 단백질로, 철 대사에 중요한 역할을 한다. 상기 세룰로플라스민은 단백질 구조에 6개의 구리 원자를 포함하며, 간에서 합성된다고 알려져 있다.

한편, 구리는 많은 효소에서 필수적인 촉매 및 구조 보조인자이며, 주요 생물학적 과정에 관여한다. 필수 미량 영양소인 구리는 내재화 및 배설의 항상성에 의해 체내에서 균형을 이룬다. 어류에서 체내에 구리가 과량 존재할 경우 아가미, 간, 내장 및 신경계가 손상된다. 인간에서 과량의 구리는 종양 촉진제로, 암세포의 증식을 자극하고, 행동학적 변화도 유도한다. 뿐만 아니라, 인간에서 과량의 구리는 알츠하이머병의 원인으로도 알려져 있으며, 윌슨병, 자폐 스펙트럼 및 급성 백혈병과도 관련성이 있다고 알려져 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 체내에 과량 존재하는 구리는 독성을 나타내나, 이와 관련된 분자 매커니즘은 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 낙지의 다중구리산화효소 유래 펩타이드 CP001 및 CP002를 제작하고, 이의 부화 촉진 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드 및 이를 포함하는 부화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 펩타이드를 난태생 또는 난생 동물의 수정란에 처리하는 단계를 포함하는 부화 촉진 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 부화 촉진용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 난태생 또는 난생 동물의 수정란에 처리하는 단계를 포함하는 부화 촉진 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 세룰로플라스민 유래 펩타이드는 발생독성이 없을 뿐만 아니라 난생 동물의 부화율을 촉진하는 효과가 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 세룰로플라스민 유래 펩타이드는 동물의 사육·번식 관련 산업 및 연구 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 확보된 낙지 유래 세룰로플라스민의 cDNA를 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 혈구염색법 및 이를 통해 낙지 유래 세룰로플라스민 유전자의 과발현 표현형을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 세룰로플라스민의 활성 도메인 검색 결과 및 다른 생물과의 상동성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4A는 낙지 세룰로플라스민 유래 펩타이드 CP001 및 CP002 처리 시 생존한 개체수를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4B는 상기 도 4A의 생존 개체수 확인 결과에 기초하여 생존율을 계산한 결과를 나타낸 도이다.
도 5A는 생존 개체수 확인을 통해 낙지 세룰로플라스민 유래 펩타이드 CP001 및 CP002가 독성을 나타내지 않는 농도 범위를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5B는 상기 도 5A의 생존 개체수 확인 결과에 기초하여 생존율을 계산한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 낙지 세룰로플라스민 유래 펩타이드 CP001 처리 및 구리 노출 여부에 따른 부화율을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 낙지 세룰로플라스민 유래 펩타이드 CP002 처리 및 구리 노출 여부에 따른 부화율을 분석한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성방법에 따라 제조될 수 있으며, 바람직하게는 고체상 합성기술에 따라 제조될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 범위에는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 기능적 동등물이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 3 또는 4의 아미노산으로 표시되는 펩타이드와 적어도 80％ 이상의, 바람직하게는 90％, 더욱 바람직하게는 95％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 서열번호 3 또는 4로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다.

또한 상기 서열 동질성은 두개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두개의 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(indentical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.

상기 실질적으로 동질의 생리활성은 본 발명의 펩타이드의 활성, 즉, 부화를 촉진하는 활성을 의미한다. 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드의 기본골격과 부화를 촉진하는 활성을 유지하면서 펩타이드의 일부 화학 구조가 변형된 유도체가 포함된다. 예를 들어 펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 발명의 구체예에서, 상기 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 세룰로플라스민 유래인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 낙지(Octopus minor)의 세룰로플라스민 유래이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 낙지의 다중구리산화효소인 세룰로플라스민에서 유래된 것으로, 발생독성이 없을 뿐만 아니라 난태생 또는 난생 동물의 부화를 촉진하는 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 상기 펩타이드는 동물의 사육·번식 관련 산업 및 연구 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 부화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 부화(hatching)는 난막에서 발생하던 동물배가 난막을 파열하고 외계로 나와 자유생활을 하는 현상을 의미한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 부화 촉진은 구리 노출 환경에서 부화를 촉진하는 것일 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 부화는 난태생 또는 난생 동물의 부화인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 난태생 또는 난생 동물은 어류, 양서류, 파충류, 조류, 곤충류 및 연체동물류로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 난태생은 수정된 알이 밖으로 배출되지 않고, 어미의 뱃속에서 부화하여 새끼가 되어 나오는 생식 방식을 의미한다. 즉, 난태생은 탯줄을 통해 어미로부터 영양분을 공급받지 않으며, 알 속에 있는 영양분을 이용하여 발육 및 부화가 이루어지는 생식 방식이다. 난태생은 일부 어류, 파충류 및 무척추 동물에서 보이는 생식 방식으로, 그 예로는 살모사, 우렁이, 바닷 망상어 등이 있다.

본 발명에 있어서, 난생은 알이 어미의 몸 밖으로 배출되어 발육 및 부화하는 형태의 생식 방식을 의미한다. 즉, 난생은 어미로부터 영양분을 공급받지 않으며, 알 속의 영양분만으로 개체가 되는 것을 의미한다. 대부분의 어류, 양서류, 파충류, 조류, 곤충류 및 연체동물류는 난생 동물이다.

본 발명의 구체예에서, 상기 펩타이드는 농도가 0.01 내지 20 μM인 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물에 포함된 펩타이드의 농도가 0.01 μM인 경우 부화 촉진 효과가 미미하여 바람직하지 않으며, 20 μM를 초과하는 경우 발생독성을 나타내어 바람직하지 않다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 조성물에 포함된 펩타이드가 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 경우, 상기 펩타이드의 농도는 0.1 내지 5 μM인 것이 바람직하다. 또한 상기 조성물에 포함된 펩타이드가 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 경우, 상기 펩타이드의 농도는 0.1 내지 10 μM인 것이 바람직하다.

본 발명의 부화 촉진용 조성물은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드와 함께, 부화 촉진 활성을 갖는 공지의 유효성분을 1 종 이상 더 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 부화 촉진용 조성물은 생물학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 생물학적으로 허용되는 담체란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 생물학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 조성물로 투여하거나 다른 조성물과 병용하여 투여될 수 있고 종래의 조성물과는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 난태생 또는 난생 동물의 수정란에 처리하는 단계를 포함하는 부화 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 펩타이드의 처리 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 주입될 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 펩타이드의 처리 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 주입하거나 또는 용량을 분할하여 수회 주입할 수 있다.

본 발명에 따른 부화 촉진 방법은 부화 촉진용 조성물의 설명을 동일하게 적용할 수 있음은 당업자에게 자명하며, 발명의 복잡성을 고려하여 생략하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 낙지 유래 세룰로플라스민 분리

1-1. 낙지 유래 세룰로플라스민의 cDNA 확보

낙지로부터 다중구리산화효소(multicopper oxidase 1, MCO1)를 암호화하는 세룰로플라스민(ceruloplasmin) 유전자를 분리하기 위하여, 성체 낙지의 부위별 시료 및 낙지의 발생 단계별 시료를 준비하였다. 준비된 시료로부터 total RNA를 추출하였다. 추출된 total RNA를 정량한 후 oligo dT 프라이머 및 역전사 효소(superscript IV first-strand synthesis system, invitrogen)를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 상기 cDNA 라이브러리는 유전자 분리를 위한 주형으로 사용하였다.

상기 cDNA 라이브러리로부터 세룰로플라스민 증폭을 위한 프라이머를 제작하였고, 구체적인 서열은 표 1에 나타내었다.

유전자	정방향 프라이머(5` to 3`)	역방향 프라이머(5` to 3`)	증폭산물의 크기(bp)
세룰로플라스민	AATCGATATGTCTCACACTTTGTGGACG(서열번호 5)	CCTCGAGAGGGTTTCTTACAATCAAGTC(서열번호 6)	3178

세룰로플라스민 유전자를 분리하기 위하여, AccuPower PCR Premix & Master Mix kit(bioneer)로 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 표 1의 정방향 및 역방향 프라이머 각 3 μl 및 cDNA 라이브러리 1 μl를 준비하였고, 멸균 3차 증류수로 최종 부피를 30 μl로 조절하였다. PCR은 표 2의 조건으로 수행하였다.

반복수	조건	온도(도)	시간(분)
1	Pre-denaturation	95	5
33	Denaturation	95	0.5
	Annealing	56	0.5
	Extension	72	1.5
1	Post-extension	72	7

PCR을 통해 얻은 증폭 산물을 아가로스 젤을 이용한 전기영동을 통해 확인하였다. 전기영동 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 증폭 산물은 예상된 위치(즉, 3178 bp)에서 밴드를 확인하였다.

이후 실험을 위하여, 소독한 칼로 아가로스 젤의 밴드 부위를 분리하였고, gel extraction kit(Qiagen)을 이용하여 DNA를 정제하였다.

1-2. 낙지 유래 세룰로플라스민의 염기서열 및 아미노산 서열 분석

정제된 DNA의 염기서열을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, pGEM T-easy vector(Promega)를 이용하여 4℃에서 12시간 동안 라이게이션(ligation)시켰다. 형질전환(transformation) 방법으로 Competent cell(DH5α, RBC)에 라이게이션된 DNA를 삽입하였고, white colony 및 colony PCR 방법으로 목적하는 DNA가 삽입된 클론을 선별하였다. 선별된 클론을 LB 액체배지로 배양하였다. 배양액 8 ml을 취한 후 Plasmid DNA miniprep kit(Qiagen)을 이용하여 클로닝 벡터에 삽입된 DNA를 확보하였다. 확보된 DNA의 서열의 분석은 마크로젠 사(한국)에 의뢰하여 분석하였다.

서열 분석 결과, 확보된 DNA(즉, 세룰로플라스민 유전자)의 염기서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 확인하였다.

또한 NCBI blastx, blastp로 reference 및 model organisms 데이터베이스로 정렬(alignment)하여, 위에서 확인된 세룰로플라스민 유전자(서열번호 1)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 번역되는 것을 확인하였다.

실시예 2. 혈구염색법을 통한 조직 내 비정상적인 혈액 침착 확인

모델 동물인 제브라피쉬에서 낙지 유래 세룰로플라스민 유전자의 과발현(overepxression) 표현형을 관찰하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 확보된 낙지 유래 세룰로플라스민 유전자(서열번호 1)를 제한 효소 Cla 1 및 Xho 1을 처리하였고, pCS2+ 발현 벡터에 삽입하였다. 세룰로플라스민 유전자가 삽입된 pCS2+ 발현 벡터에 제한 효소 Sac II를 처리하여, 선형 DNA를 제작하였다. in vitro transcription(Sp6, Invitrogen) 방법으로 상기 선형 DNA를 주형으로 하는 mRNA를 합성하였다. 합성된 세룰로플라스민 mRNA를 phenol/chloroform 정제방법으로 분리한 후 -70℃에서 보관하였다.

야생형 제브라피쉬를 교미하여 수정란을 확보한 후, 1-4 세포 단계의 배아를 인젝션 플레이트에 정렬하였다. 미세유리관에 합성한 세룰로플라스민 mRNA를 마이크로로더 팁(microloder tip)으로 로딩한 후 미세주입장치, 피코펌프 및 현미경을 이용하여 배아에 일정 농도(180 pg 또는 350 pg)로 주입하였다. 세룰로플라스민 mRNA를 주입한 개체를 인큐베이터에서 배양하였으며, 주입 48시간 후 혈구염색시약(o-dianisidine(0.6mg/ml), 0.01M Sodium acetate(pH 4.5), 0.65% H₂O₂, 40% ethanol)으로 30분 동안 암처리한 후 수세하였다. 수세 후 세룰로플라스민 mRNA를 주입한 개체에 고정액(4% paraformaldehyde)을 처리하여 1시간 이상 반응시켰다. 고정된 세룰로플라스민 mRNA를 주입한 개체를 80% 글리세롤/20% PBS에 넣었고, 실체 현미경 하에서 사진을 촬영하였다. 현미경 관찰 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 세룰로플라스민 mRNA를 주입한 개체는 정상군에 비해 세룰로플라스민 단백질이 생체 내에 다량 존재하는 것을 확인하였고, 이로 인해 조직 내 비정상적인 혈액 침착 현상이 관찰되었다.혈구세포가 침착된 것을 확인하였다.

실시예 3. 낙지 유래 세룰로플라스민의 활성 도메인 검색

상기 실시예 1에서 확인한 낙지 유래 세룰로플라스민의 아미노산 서열(서열번호 2)에 기초하여, 세룰로플라스민의 활성 도메인을 검색하였다. 상기 활성 도메인 검색은 ExPASy prosite(https://prosite.expasy.org/) 및 MOTIF Search(https://www.genome.jp/tools/motif/)을 활용하였다.

검색된 세룰로플라스민의 활성 도메인 정보에 기초하여, 낙지 유래 세룰로플라스민의 활성 도메인과 인간, 생쥐, 물고기 유래 활성 도메인의 상동성을 분석하였다. 상기 상동성 분석은 ClustalW 프로그램(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)을 활용하였다.

검색된 세룰로플라스민의 활성 도메인 및 다른 생물과의 상동성 분석 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 검색된 세룰로플라스민의 활성 도메인은 세룰로플라스민의 324 내지 344번째 아미노산; 및 1019 내지 1039번째 아미노산;인 것을 확인하였다. 상기 두 활성 도메인은 각각 CP001(324-344번, 서열번호 3) 및 CP002(1019-1039번, 서열번호 4)로 명명하였다. 상기 CP001 및 CP002 부위는 다른 생물(인간, 생쥐 및 물고기)과 상동성이 있으나, 일부 아미노산이 상이한 것을 확인하였다.

실시예 4. 낙지 세룰로플라스민 유래 펩타이드의 발생 독성 분석

낙지 세룰로플라스민 유래 펩타이드인 CP001(서열번호 3) 및 CP002(서열번호 4)의 발생 독성을 분석하였다. 구체적으로, 야생형 제브라피쉬를 교미하여 수정란을 확보하였다. 확보된 수정란을 배양기에서 24시간 동안 유지한 후 24웰 플레이트의 각 웰에 7 개체씩 분주하였다. 분주된 개체에 CP001 및 CP002를 다양한 농도(10, 50, 100 μM)로 처리하였다. 상기 CP001 및 CP002를 처리한 후 2, 6, 22 및 36시간째의 생존 개체수를 현미경을 이용하여 확인하고, 그 결과에 기초하여 생존률을 계산하였다. 본 실험의 대조군은 0.1% DMSO를 처리하였다. 생존 개체수 확인 결과는 도 4A에 나타내었고 생존율 계산 결과는 도 4B에 나타내었다.

도 4A 및 4B에 나타낸 바와 같이, CP001을 10 내지 100 μM 농도로 처리한 군은 발생 독성이 확인되었다. 또한 CP002을 10 μM 농도로 처리한 군은 발생 독성이 나타나지 않았으나, 50 내지 100 μM 농도로 처리한 군은 발생 독성이 확인되었다.

이에, CP001 및 CP002가 발생 독성을 나타내지 않는 농도 범위를 추가 조사하였다. 실험은 위와 동일한 방법으로 수행하였으며, CP001 및 CP002의 처리 농도는 다음과 같다.

- CP001 : 1 μM, 4 μM

- CP002 : 5 μM, 10 μM

CP001 및 CP002의 발생 독성을 추가 조사한 결과는 도 5에 나타내었다(A : 시간별 생존개체 수, B : 생존율).

도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, CP001을 1 또는 4 μM 농도로 처리한 군; 및 CP002를 5 또는 10 μM 농도로 처리한 군;은 생존개체 수 및 생존율이 높은 것(즉, 발생 독성이 없는 것)을 확인하였다.

실시예 5. 낙지 세룰로플라스민 유래 펩타이드의 구리 노출에 따른 부화율 분석

낙지 세룰로플라스민 유래 펩타이드인 CP001(서열번호 3) 및 CP002(서열번호 4) 처리 및 구리 노출 여부에 따른 부화율을 분석하였다.

5-1. CP001

먼저, CP001 처리 및 구리 노출 여부에 따른 부화율을 조사하였다. 구체적으로, 야생형 제브라 피쉬를 교미하여 수정란을 확보하였다. 확보된 수정란을 다음과 같이 6개의 그룹으로 나누었다.

0.1% DMSO 처리군(음성 대조군)

CP001 1 μM 처리군

CP001 5 μM 처리군

CuSO₄ 4 μM 처리군(양성 대조군)

CuSO₄ 4 μM 및 CP001 1 μM 처리군

CuSO₄ 4 μM 및 CP001 5 μM 처리군

각 그룹별로 CP001 또는 CuSO₄를 처리한 후 현미경 하에서 부화 여부를 확인하였다. 부화 여부 확인 결과에 기초하여 부화율을 계산하였다. CP001 처리 및 구리 노출 여부에 따른 부화율을 계산한 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군(◆)은 48시간에 부화가 시작되어 54시간에 부화율이 100%가 된 것을 확인하였다. CP001을 1 또는 5 μM 처리군(■, ▲)은 52시간에 부화율이 100%가 된 것을 확인하였다. 이는 대조군에 비해 CP001 처리군의 부화율이 더 빠르게 진행되었다는 것을 의미한다.

또한 구리 노출 여부에 다른 부화율을 살펴보면, 수정란이 구리에 노출된 경우 부화가 지연되는 것을 확인하였다(CuSO₄ 4 μM 처리군, X). CP001 및 CuSO₄을 처리한 실험군(X, ●)은 CuSO₄만을 처리한 대조군에 비해 부화시간이 단축된 것을 확인하였다.

5-2. CP002

CP002 처리 및 구리 노출 여부에 따른 부화율을 조사하기 위하여, 다음과 같이 6개의 그룹으로 나누었다.

0.1% DMSO 처리군(음성 대조군)

CP002 5 μM 처리군

CP002 10 μM 처리군

CuSO₄ 4 μM 처리군(양성 대조군)

CuSO₄ 4 μM 및 CP002 5 μM 처리군

CuSO₄ 4 μM 및 CP002 10 μM 처리군

부화율 조사는 상기 실시예 5-1과 같은 방법으로 조사하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군(◆)은 48시간에 부화가 시작되어 54시간에 부화율이 100%가 된 것을 확인하였다. CP002 10 μM 처리군(▲)은 대조군(◆)과 동일하게 54시간에 부화율 100%에 도달하는 것으로 확인되나, 대조군보다 부화의 속도가 빠른 것을 알 수 있다. 또한 CP002 5 μM 처리군(■)은 부화율 대조군 대비 유의한 결과가 관찰되지 않았다.

또한 구리 노출 여부에 다른 부화율을 살펴보면, 수정란이 구리에 노출된 경우 부화가 지연되는 것을 확인하였다(CuSO₄ 4 μM 처리군, X). CP002 및 CuSO₄을 처리한 실험군(X, ●)은 CuSO₄만을 처리한 대조군에 비해 부화시간이 현저히 단축된 것을 확인하였다.

종합적으로 본 발명자들은 낙지의 세룰로플라스민 유래 다중구리산환효소 펩타이드 CP001 및 CP002를 제작하였다. 또한 실험을 통해 제작된 CP001 및 CP002가 발생독성이 없을 뿐만 아니라 난태생 또는 난생 동물의 부화를 촉진하는 효과가 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 낙지 세룰로플라스민 유래 펩타이드 CP001 및 CP002는 동물의 사육·번식 관련 산업 및 연구 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> National Marine Biodiversity Institute of Korea <120> Ceruloplasmin-derived peptide and composition for promoting hatching comprising the same <130> 1-5P <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3178 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Octopus minor <400> 1 aatcgatatg tctcacactt tgtggacggg attctttctc tgtatactag ggatagtttc 60 ccaagtgaag gcagataatg tggaatattt tatcgcagcc caagaagtta tctgggatta 120 tgccccgagt ggaaatgatt tggtcacagg aggcgatgat tacaaaacat tcttggagca 180 cacttctaat agaattggaa gtaagtacaa gaaagtcatc tatatgcagt atacagactt 240 cacgtttact aaagaaatac cgaagcctaa atcacttggt cttttgggac ctattataag 300 tggatctgtt gggcaatcac tccatgttta tttctttaac aatgccagtc gaccttatac 360 cattcaccca catggtcttt tctacacaaa aggaaatgaa ggagcattat atcgagatga 420 gacaaagcca tctgagaaag ctgatgattc tgttaaacct ggacaaacct tcaactatac 480 ttggataatc gaaccctttg atggcccaac aaaagatgat gctgattgtc tcccttggat 540 gtatcactct cacattgaac cagttaagga tatgaatgct ggccttatgg gaatgttgat 600 tctctgcaaa aaatctaaaa catacaatcc tgaaaacacc cagcatttgt taatgaaagt 660 tatggatgaa aatttaagct ggtaccttga ggaaaatatt caaatgttca taaacaatac 720 ggttgataaa gaagatgaag atttccagga gagtaataaa atgcatgcct taaacggcct 780 tatgtatggc aacttggaat tggaagcttg cattgctgat aaagtcactt ggtatttgat 840 gggaatgggg aatgaagtgg acatacatac tcttaatgtt aatggtcatt cctttgagta 900 taatcatcac aggaaagagt ccatcaactt gtacccagca gaattcagtg ttgcagaaat 960 ggttatcggg agcgaaggat catggctagt gaaatgtcat gttcatgacc attacgtggg 1020 tggcatggag accttgttga acgtgttcta ctgtaacaag accaataact ataatgtggg 1080 ttctacgatt ataaattact ttattacggc tgaagaagta gaatggagtt actcaagatc 1140 tggcaggaat ctctatgatg gtggatctct cacagaaccc gacagtgctt cagaagtatt 1200 tttcaaaaaa ggtaaacata gaattggtgg aaaatacatg aaagctatgt attatcaata 1260 cactgatggt agttttacaa caaagatgtc cagagggaca gatgaagaac acctgggtaa 1320 tttagggcct gtgattcgag ctactgttgg agacataatc aaagtagtat tctttaataa 1380 ggcatcacag aattattcca ttcatccata tggagtaaga tataataaac ctgatgaggg 1440 tgctttctac actgatggga aagataaagg tattgttcca ccacaaacaa gaaaaactta 1500 ctactggtat atatcaagag atatgggacc tcttgaaaaa gatcctgatt gtttgacgag 1560 tatgtatgcc tcagaagtaa ataccatgaa agacacatac tctggccttg ttggaccaat 1620 gcttatatgc aaaaagggta gtcttgatcg gcatagaaaa cagaaaaggg tagataaaga 1680 gttctttctc ttatttatgg tgactgatga aaacaattcc tggtacttga aggagaacat 1740 aaaaaagtac gctgaagatc ctgaaggtgt tgatttagaa gatgaagatt ttatggaatc 1800 aaatttgatg catggtatca atggctacct ttatgggaat ctttatgaac cggaaatgtg 1860 catgaatgat aaaatcagct ggcatatcat ggctcttggc aacgaagtcg atttacacac 1920 tgtttatttc catggaaaca ctttcactgt tcatcaaaac cataaagata ctttcagtgt 1980 acttccagga atgttacaaa cactagaaat gaaagctata aatcctggta catgggcttt 2040 ggaatgtgta accaatgatc acttcaatgc tggaacaaag gccatgtaca aagtacaacg 2100 ctgtgggaga cgacaaaaaa ctatatcacg gaaagcgaaa gttattgaat atttcattca 2160 agctgaagaa attgaatggg attatgcacc aggtcataaa gacctcatct ataacaaatc 2220 ccttgatgac cctgataatc ctgggtatgc atttgttaaa tcttcagatt atctcattgg 2280 aagcaaatat attaaagcag tttatcgagg ttatacaaac gacagctttc taacacccct 2340 ggaccaccca gaatcatttg gaattcttgg acctctaata aaagctgaag taggagatat 2400 catatcagtg acctttagga atttagcaag atataatttt tcaattcttg ctcatggagt 2460 tctttatgaa aagtcaagtg aaggtacaaa atatgcagac cttaacgaga ataaaggaaa 2520 tgctgtcgaa aaggatgaca tttacacata tacatggact gtaccaaaga gttctggacc 2580 tgggccaggg gatccagatt gtatcaatta cgcatactat tcagctgtaa acccatcaca 2640 agacacaaat gctgggttac ttggacctct cgttatctgc cgaaagaata aatcagactt 2700 taacaataca atattcttcc cacttttatt taatgtattt gatgaaaacg aaagtatata 2760 tcttgatgac aacattaaga aatacgcaga aaaggcaaat aaagaagacg atgagtttat 2820 tgagaacaac aaaaaccatg ctattaatgg ttttctcttt ggaggtctgc aaggtctgga 2880 tatgaataaa caggataaag tctactggtt tttaatagga acaggaacag aagttgacat 2940 acattctatt catttccatg gcaacacatt tatccattat acagactaca aacacagaaa 3000 agatactttg gatctgtggc ccggttcatt taaaactatc ttcatggttc ctgaaaatcc 3060 aggtaaatgg ttacttcact gccacgttga tgatcacatc atagggggta tgagtgcaat 3120 ctatacagtt aacgatatat cctaattccg gacttgattg taagaaaccc tctcgagg 3178 <210> 2 <211> 1045 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Octopus minor <400> 2 Met Ser His Thr Leu Trp Thr Gly Phe Phe Leu Cys Ile Leu Gly Ile 1 5 10 15 Val Ser Gln Val Lys Ala Asp Asn Val Glu Tyr Phe Ile Ala Ala Gln 20 25 30 Glu Val Ile Trp Asp Tyr Ala Pro Ser Gly Asn Asp Leu Val Thr Gly 35 40 45 Gly Asp Asp Tyr Lys Thr Phe Leu Glu His Thr Ser Asn Arg Ile Gly 50 55 60 Ser Lys Tyr Lys Lys Val Ile Tyr Met Gln Tyr Thr Asp Phe Thr Phe 65 70 75 80 Thr Lys Glu Ile Pro Lys Pro Lys Ser Leu Gly Leu Leu Gly Pro Ile 85 90 95 Ile Ser Gly Ser Val Gly Gln Ser Leu His Val Tyr Phe Phe Asn Asn 100 105 110 Ala Ser Arg Pro Tyr Thr Ile His Pro His Gly Leu Phe Tyr Thr Lys 115 120 125 Gly Asn Glu Gly Ala Leu Tyr Arg Asp Glu Thr Lys Pro Ser Glu Lys 130 135 140 Ala Asp Asp Ser Val Lys Pro Gly Gln Thr Phe Asn Tyr Thr Trp Ile 145 150 155 160 Ile Glu Pro Phe Asp Gly Pro Thr Lys Asp Asp Ala Asp Cys Leu Pro 165 170 175 Trp Met Tyr His Ser His Ile Glu Pro Val Lys Asp Met Asn Ala Gly 180 185 190 Leu Met Gly Met Leu Ile Leu Cys Lys Lys Ser Lys Thr Tyr Asn Pro 195 200 205 Glu Asn Thr Gln His Leu Leu Met Lys Val Met Asp Glu Asn Leu Ser 210 215 220 Trp Tyr Leu Glu Glu Asn Ile Gln Met Phe Ile Asn Asn Thr Val Asp 225 230 235 240 Lys Glu Asp Glu Asp Phe Gln Glu Ser Asn Lys Met His Ala Leu Asn 245 250 255 Gly Leu Met Tyr Gly Asn Leu Glu Leu Glu Ala Cys Ile Ala Asp Lys 260 265 270 Val Thr Trp Tyr Leu Met Gly Met Gly Asn Glu Val Asp Ile His Thr 275 280 285 Leu Asn Val Asn Gly His Ser Phe Glu Tyr Asn His His Arg Lys Glu 290 295 300 Ser Ile Asn Leu Tyr Pro Ala Glu Phe Ser Val Ala Glu Met Val Ile 305 310 315 320 Gly Ser Glu Gly Ser Trp Leu Val Lys Cys His Val His Asp His Tyr 325 330 335 Val Gly Gly Met Glu Thr Leu Leu Asn Val Phe Tyr Cys Asn Lys Thr 340 345 350 Asn Asn Tyr Asn Val Gly Ser Thr Ile Ile Asn Tyr Phe Ile Thr Ala 355 360 365 Glu Glu Val Glu Trp Ser Tyr Ser Arg Ser Gly Arg Asn Leu Tyr Asp 370 375 380 Gly Gly Ser Leu Thr Glu Pro Asp Ser Ala Ser Glu Val Phe Phe Lys 385 390 395 400 Lys Gly Lys His Arg Ile Gly Gly Lys Tyr Met Lys Ala Met Tyr Tyr 405 410 415 Gln Tyr Thr Asp Gly Ser Phe Thr Thr Lys Met Ser Arg Gly Thr Asp 420 425 430 Glu Glu His Leu Gly Asn Leu Gly Pro Val Ile Arg Ala Thr Val Gly 435 440 445 Asp Ile Ile Lys Val Val Phe Phe Asn Lys Ala Ser Gln Asn Tyr Ser 450 455 460 Ile His Pro Tyr Gly Val Arg Tyr Asn Lys Pro Asp Glu Gly Ala Phe 465 470 475 480 Tyr Thr Asp Gly Lys Asp Lys Gly Ile Val Pro Pro Gln Thr Arg Lys 485 490 495 Thr Tyr Tyr Trp Tyr Ile Ser Arg Asp Met Gly Pro Leu Glu Lys Asp 500 505 510 Pro Asp Cys Leu Thr Ser Met Tyr Ala Ser Glu Val Asn Thr Met Lys 515 520 525 Asp Thr Tyr Ser Gly Leu Val Gly Pro Met Leu Ile Cys Lys Lys Gly 530 535 540 Ser Leu Asp Arg His Arg Lys Gln Lys Arg Val Asp Lys Glu Phe Phe 545 550 555 560 Leu Leu Phe Met Val Thr Asp Glu Asn Asn Ser Trp Tyr Leu Lys Glu 565 570 575 Asn Ile Lys Lys Tyr Ala Glu Asp Pro Glu Gly Val Asp Leu Glu Asp 580 585 590 Glu Asp Phe Met Glu Ser Asn Leu Met His Gly Ile Asn Gly Tyr Leu 595 600 605 Tyr Gly Asn Leu Tyr Glu Pro Glu Met Cys Met Asn Asp Lys Ile Ser 610 615 620 Trp His Ile Met Ala Leu Gly Asn Glu Val Asp Leu His Thr Val Tyr 625 630 635 640 Phe His Gly Asn Thr Phe Thr Val His Gln Asn His Lys Asp Thr Phe 645 650 655 Ser Val Leu Pro Gly Met Leu Gln Thr Leu Glu Met Lys Ala Ile Asn 660 665 670 Pro Gly Thr Trp Ala Leu Glu Cys Val Thr Asn Asp His Phe Asn Ala 675 680 685 Gly Thr Lys Ala Met Tyr Lys Val Gln Arg Cys Gly Arg Arg Gln Lys 690 695 700 Thr Ile Ser Arg Lys Ala Lys Val Ile Glu Tyr Phe Ile Gln Ala Glu 705 710 715 720 Glu Ile Glu Trp Asp Tyr Ala Pro Gly His Lys Asp Leu Ile Tyr Asn 725 730 735 Lys Ser Leu Asp Asp Pro Asp Asn Pro Gly Tyr Ala Phe Val Lys Ser 740 745 750 Ser Asp Tyr Leu Ile Gly Ser Lys Tyr Ile Lys Ala Val Tyr Arg Gly 755 760 765 Tyr Thr Asn Asp Ser Phe Leu Thr Pro Leu Asp His Pro Glu Ser Phe 770 775 780 Gly Ile Leu Gly Pro Leu Ile Lys Ala Glu Val Gly Asp Ile Ile Ser 785 790 795 800 Val Thr Phe Arg Asn Leu Ala Arg Tyr Asn Phe Ser Ile Leu Ala His 805 810 815 Gly Val Leu Tyr Glu Lys Ser Ser Glu Gly Thr Lys Tyr Ala Asp Leu 820 825 830 Asn Glu Asn Lys Gly Asn Ala Val Glu Lys Asp Asp Ile Tyr Thr Tyr 835 840 845 Thr Trp Thr Val Pro Lys Ser Ser Gly Pro Gly Pro Gly Asp Pro Asp 850 855 860 Cys Ile Asn Tyr Ala Tyr Tyr Ser Ala Val Asn Pro Ser Gln Asp Thr 865 870 875 880 Asn Ala Gly Leu Leu Gly Pro Leu Val Ile Cys Arg Lys Asn Lys Ser 885 890 895 Asp Phe Asn Asn Thr Ile Phe Phe Pro Leu Leu Phe Asn Val Phe Asp 900 905 910 Glu Asn Glu Ser Ile Tyr Leu Asp Asp Asn Ile Lys Lys Tyr Ala Glu 915 920 925 Lys Ala Asn Lys Glu Asp Asp Glu Phe Ile Glu Asn Asn Lys Asn His 930 935 940 Ala Ile Asn Gly Phe Leu Phe Gly Gly Leu Gln Gly Leu Asp Met Asn 945 950 955 960 Lys Gln Asp Lys Val Tyr Trp Phe Leu Ile Gly Thr Gly Thr Glu Val 965 970 975 Asp Ile His Ser Ile His Phe His Gly Asn Thr Phe Ile His Tyr Thr 980 985 990 Asp Tyr Lys His Arg Lys Asp Thr Leu Asp Leu Trp Pro Gly Ser Phe 995 1000 1005 Lys Thr Ile Phe Met Val Pro Glu Asn Pro Gly Lys Trp Leu Leu His 1010 1015 1020 Cys His Val Asp Asp His Ile Ile Gly Gly Met Ser Ala Ile Tyr Thr 1025 1030 1035 1040 Val Asn Asp Ile Ser 1045 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CP001 <400> 3 Gly Ser Trp Leu Val Lys Cys His Val His Asp His Tyr Val Gly Gly 1 5 10 15 Met Glu Thr Leu Leu 20 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CP002 <400> 4 Gly Lys Trp Leu Leu His Cys His Val Asp Asp His Ile Ile Gly Gly 1 5 10 15 Met Ser Ala Ile Tyr 20 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP forward primer <400> 5 aatcgatatg tctcacactt tgtggacg 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CP reverse primer <400> 6 cctcgagagg gtttcttaca atcaagtc 28

Claims (9)

1. 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드.
2. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 세룰로플라스민 유래인, 펩타이드.
3. 제2항에 있어서,
   상기 세룰로플라스민은 낙지(Octopus minor) 유래인, 펩타이드.
4. 농도가 0.1 내지 5 μM인 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드; 또는
   농도가 0.1 내지 10 μM인 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드;를 포함하는, 어류 또는 연체동물류의 부화 촉진용 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 부화 촉진은 구리 노출 환경에서 부화를 촉진하는 것인, 어류 또는 연체동물류의 부화 촉진용 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 어류 또는 연체동물류의 수정란에 처리하는 단계;를 포함하고,
   상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 농도가 0.1 내지 5 μM이며,
   상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 농도가 0.1 내지 10 μM인,
   어류 또는 연체동물류의 부화 촉진 방법.
   

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