KR20040088588A - 간세포 증식의 억제제와 자극제 및 그것들의 용도 - Google Patents

간세포 증식의 억제제와 자극제 및 그것들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명에는 간세포 사이클을 조절하고 화학요법후 말초혈 세포 회복을 가속화하기 위한 간세포 조절 인자를 단리하는 방법 및 그러한 간세포 조절 인자의 용도가 개시되어 있고 청구된다. 또한 본 발명에는 간세포 증식의 억제제 및 자극제가 개시되고 청구된다.

Description

간세포 증식의 억제제와 자극제 및 그것들의 용도{Inhibitor and Stimulator of Stem Cell Proliferation and Uses Thereof}
본 발명은 자기면역 질병, 노화, 암, 골수이형성증(myelodysplasia), 전백혈병 (preleukemia), 백혈병, 건선, 후천성 면역 결핍증 (AIDS), 척수이형성 증후군, 재생불능성 빈혈 또는 과다- 또는 저-증식성 질환을 포함한 다른 질병을 가지고 있는 사람 또는 동물들을 치료할 때 사용되는, 간세포 (stem cell) 사이클을 조절하기 위한 간세포 증식의 조절제의 용도, 및 그러한 화합물을 무통각증 (마취)에 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 화학요법제, 간세포 순환에 손상을 주는 다른 제제, 또는 방사선에 계속해서 노출되어야 하거나 또는 현재 노출되고 있는 사람 또는 동물들을 위한 치료 방법 및 생체외 치료중에 그러한 제제에 대하여 보호하는 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 자기- 및 동종-이식 과정 또는 유전자 전달을 위하여, 뿐만 아니라 그러한 과정을 개선시키기 위한 생체내 치료를 위하여 간세포 보유 또는 팽창 (expansion) 배양액을 개선시키는 것에도 관한 것이다.
재생 시스템에서 대부분의 최종-단계에 있는 세포들은 수명이 짧고, 또 계속해서 전 생애를 통하여 교체되어야만 한다. 예를 들면, 혈액 세포들은 다형잠재성(multipotent) 조혈 간세포 (HSC)의 자체-재생 집단으로부터 기원한다. 조혈 간세포는 조혈 세포들의 하위집단이다. 조혈 세포는 예를 들면 골수, 탯줄 혈액 또는 (이동되지 않았거나 또는 G-CSF 와 같은 제제로 이동된) 말초혈로부터 얻을 수 있고; 조혈 세포로는 간세포 집단, 선구 세포, 분화된 세포, 부속 세포, 간질 세포 및 성숙한 혈액 세포의 생성에 필요한 환경에 기여하는 다른 세포들이 있다. 조혈 선구 세포들은 그것들의 발생 능력(developmental potency)이 보다 더 제한되어 있는 간세포들의 하위세트이다. 선구 세포들은 단지 하나 또는 두 개의 계통 (예컨대 적혈구로만 발생하는 BFU-E 및 CFU-E 또는 과립구 및 대식세포로 발생하는 CFU-GM)으로 분화할 수 있는 한편, 간세포 (예컨대 CFU-MIX 또는 CFU-GEMM)는 다수의 계통 및/또는 다른 간세포들을 생성시킬 수 있다. 조혈 간세포들이 조혈 시스템 및 면역 시스템의 모든 성숙한 세포들의 발생에 필요하기 때문에, 조혈 간세포들의 생존은 화확요법 또는 다른 제제들로 치료된 환자들에게서 완전한 기능을 발휘할 수 있는 숙주 방어 시스템을 다시 정립하기 위해서 필수적이다.
조혈 세포 생성은 조혈 세포들의 성장 및 분화를 자극하는 일련의 인자들에 의해 조절되며, 그러한 인자들의 일부, 예를 들면 에리트로포이에틴, GM-CSF 및 G-CSF 는 현재 임상에서 실제 사용되고 있다. 그러나, 광범위하게 특성이 확인되어 있지 않은 조절 네트워크의 한 부분은 간세포들의 순환 상태를 조절하는 생리적 메카니즘이다 [Eaveset al., Blood 78:110-117, 1991; Lord, inStem Cells(C. S. Potten, Ed.)pp 401-422, 1997 (Academic Press, NY)].
로드와 동료들에 의한 초기 연구는 정상적으로 가용성 단백질 인자들이 존재하고, 이것이 간세포 증식을 억제 또는 자극할 수 있는 골수 추출물을 재생하고 있음을 밝혀냈다 [재검토: Lord and Wright, Blood Cells 6:581-593, 1980; Wright and Lorimore, Cell Tissue Kinet, 20:191-203, 1987; Marshall and Lord, Int. Rev. Cyt. 167:185-261; 1996]. 이들 활성은 각각 간세포 억제제 (SCI) 및 간세포 자극제 (SCS)로 표시되었다.
지금까지, 로드 등에 의해 설명된 바와 같이 (상기에서 언급된 검토 문헌) 제조된 골수 추출물로부터 정제되었던 후보 SCS 분자들은 없었다. 일차 공급원으로부터의 SCS 또는 SCI 의 정제는 대다수의 방사선 조사된 마우스들이 요구되는 생체내 검정에 고유한 어려움 때문에 이루어지지 않았었다. 이러한 문제점들을 해결하기 위한 시도로 프라그넬(Pragnell)과 동료들은 원시적인 조혈 세포 (CFU-A) 에 대한 시험관내 검정법을 개발하여 억제 활성의 공급원으로서의 셀라인을 스크린하였다 [참조: Grahamet al., Nature 344:442-444, 1990]. 보다 앞선 연구 결과 SCI 에 대한 가능한 공급원으로서 대식세포가 이미 확인된 바 있기 때문에 [Lordet al., Blood Cells 6:581-593, 1980], 마우스 대식세포 셀라인 J774.2 가 선택되었다 [Grahamet al., Nature 344:442-444, 1980]. 그레이엄 등에 의해 상기 셀라인으로부터 조절된 배지가 정제에 사용되었고; 앞서 설명된 사이토킨 대식세포 염증성 단백질 1-알파 (MIP-1α)와 동일한 것으로 입증된 펩티드가 단리되었다. MIP-1α 에 대한 수용체도 클론되었다; 다른 케모카인 수용체와 마찬가지로, 이들 MIP-1α 수용체도 G억제하위부류("Gi")의 구아닌 누클레오티드 (GTP) 결합 단백질에 커플되어 있는 7 개의 경막 도메인 (또는 "G-결합된")으로 구성되어 있는 수용체이다 [개관: Murphy, Cytokine ＆ Growth Factor Rev. 7:47-64, 1996]. Gi하위부류에 대한 "억제" 표시는 아데닐레이트 사이클라제에 대한 그것의 억제 활성을 말한다.
MIP-1α 는 일차 물질로부터가 아닌 셀라인으로부터 단리되었다. 그레이엄 등이 MIP-1α 에 대한 항체가 미정제 골수 추출물의 활성을 정지시킨다는 것을 관찰한 반면, 다른 연구자들은 다른 억제 활성이 중요하다는 것을 밝혀냈다. 예를 들면 그레이엄 등은 MIP-1α 가 아닌 TGFβ 가 조혈 간세포에 대한 일차적인 억제제임을 시사하였다 [Grahamet al., J. Exp. Med. 178:925-932, 1993]. 나아가, 입스 등은 MIP-1α 와 TGFβ 두가지가 모두 정상적인 골수에 아-최적 수준으로 존재하고, 억제는 이들 두 가지 인자들 사이의 상조 효과를 필요로 한다고 제시하였다 [Eaveset al., PNAS 90:12015-12019, 1993].
최근에 이르러, MIP-1α 유전자가 동종 재조합에 의하여 결실되어 있는 마우스들이 생성되었다 [Cooket al., Science 269:1583-1585, 1995]. 그러한 마우스들은 그들의 조혈 시스템이 전혀 교란되지 않았고, 따라서 정상적인 조혈 조건하에서 순환하는 간세포의 생리적인 조절제로서의 MIP-1α 의 역할에 대해 의문이 제기된다. 마찬가지로, 비록 전환시키는 성장 인자 베타 (TGFβ)가 또한 간세포 억제 활성을 가지고 있기는 하지만, 간세포가 이러한 사이토킨에 대하여 반응하는데 걸리는 긴 시간은 그것이 골수 추출물에 존재하는 내인성 인자가 아니라는 것을 시사한다; 나아가, TGFβ 에 대한 중화항체가 골수 상층액중의 SCI 활성을 없애지는 못한다 [Hampsonet al., Exp. Hemat. 19:245-249, 1991].
다른 연구자들은 추가의 간세포 억제 인자들에 대해 설명하였다. 프린델과 동료들은 태내 송아지 골수로부터 및 간세포 억제 활성을 가지고 있는 간 추출물로부터 테트라펩티드를 단리하였다 [Lenfantet al., PNAS 86:779-782, 1989]. 포코비츠 등은 그것이 단량체 형태로 존재할 때는 간세포 순환의 억제제이고, 이량체 형태로 존재할 때는 간세포 순환의 자극제인 펜타펩티드를 확인하였다 [Paukovitset al., Cancer Res. 50:328-332, 1990]. 다른 인자들 또한 다양한 시험관내 시스템에서 억제 활성을 나타낸다고 주장되었다 [참조: Wright and Pragnell inBailliere＇s Clinical Haematology, v. 5, pp. 723-739, 1992 (BailliereTinadall, Paris); Marshall and Lord, Int Rev. Cyt. 167:185-261, 1996].
실로바 등은 간세포 증식 억제제에 대한 정제 과정을 특허 출원 문헌에 발표하였다 [Tsyrlovaet al., SU 1561261 A1].
국제 특허 출원 공개 번호 WO 94/22915 및 WO 96/10634 호에는 간세포 증식의 억제제가 발표되어 있다.
지금까지, 이들 중 어느 것도 임상적인 용도가 입증된 것은 없었다. 그러나, 효과적인 간세포 억제제는 여전히 요구되고 있다. 화학요법 또는 방사선 요법과 관련된 주된 독성은 골수 억압 또는 위장관 독성을 초래할 수 있는 정상적인 증식 세포의 파괴이다. 효과적인 간세포 억제제는 이들 세포를 보호할 것이며, 이들 치료 요법의 최적화를 가능하게 할 것이다. 임상 상황에 따라 다양한 자극성 사이토킨 (즉, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 간세포 인자, flk2/flt3 리간드 등과 같은 사이토킨, 이것들은 조혈 세포의 순환을 자극한다)에 대하여 증명된 요구가 존재하기 때문에, 다양한 억제 인자들이 다양한 임상적 요구를 해결하기 위하여 요구될 것임은 명백하다.
나아가, 그러한 억제제의 활성을 신속하게 역전시키는 것이 필요하다. 로드 등의 원래의 연구는 (상기 언급된 문헌 참조) 억제 활성이 자극 활성의 첨가에 의해 역전될 수 있었음을 증명하였다. 다양한 간세포 자극성 사이토킨이 확인된 반면 (상기 참조), 골수 추출물에 존재하면서 억제제의 활성을 역전시킬 수 있는 것으로서 로드와 그의 동료들에 의해 설명된 활성을 나타내는 것으로 증명된 것은 없었다.
조혈 선구체 및 간세포들은 일차적으로 정상적인 성인의 골수에 존재한다. 그러나 특정 조건, 예를 들면 화학요법 또는 G-CSF 와 같은 사이토킨으로 치료받고 있는 경우에는 대다수의 선구체 및 간세포들이 말초혈안으로 들어가게 되며, 이 과정은 "이동 (mobilization)"으로 언급된다 [개관: Simmonset al., Stem Cells 12(suppl 1): 187-202, 1994; Schedinget al., Stem Cells 12(suppl 1):203-211, 1994; Mangan, Sem. Oncology 22:202-209, 1995; Moolten, Sem. Oncology 22:271-290, 1995]. 최근에 공개된 데이터는 이동된 선구체의 거의 대부분이 세포 사이클에서는 활성을 나타내지 않음을 나타낸다 [Roberts and Metcalf, Blood 86:1600-, 1995; Donahueet al., Blood 87:1644-, 1996; Siegert and Serke, Bone Marrow Trans. 17:467-, 1996; Uchidaet al., Blood 89:465-472, 1997].
헤모글로빈은 분자량이 대략 64,000 달톤인 고도로 보존된 4량체 단백질이다. 이것은 두 개의 알파 사슬과 두 개의 베타 사슬로 구성되어 있다. 각각의 사슬은 철을 함유하고 있는 배합단 (prosthetic group)인 헴 (페로프로토포르피린 IX)의 단일 분자에 결합되어 있다. 척추동물의 알파 및 베타 사슬들은 아마도 복제된 후 갈라진 단일한 선구 유전자로부터 유도되었을 것이다; 두 개의 사슬은 그것들 자체 사이에 및 다양한 척추동물 간에 큰 정도의 서열 동일성을 보유하고 있다 (도 16a 참조). 사람에서는, 염색체 16 상에 있는 알파 사슬 클러스트가 동일한 폴리펩티드를 코드하는 두 개의 알파 유전자(알파 1 및 알파 2)와, 또한 다른 알파-유사 사슬: 제타, 쎄타 및 여러 개의 전사되지 않는 위(pseudo)유전자를 코드하는 유전자들을 함유하고 있다 (사람 알파 사슬의 cDNA 및 아미노산 서열에 대해서는 도 16b 참조). 염색체 11 상에 있는 베타 사슬 클러스트는 하나의 베타 사슬 유전자와 여러 개의 베타-유사 유전자들: 델타, 엡실론, G 감마 및 A 감마 유전자들과, 또한 최소한 두 개의 발현되지 않는 위유전자들로 구성된다 (사람 베타 사슬의 cDNA 및 아미노산 서열에 대해서는 도 16c 참조).
이들 유전자의 발현은 발생중에 달라진다. 가장 연구가 많이 되어 있는 사람 조혈 과정에서, 배(embryo)의 적혈구 모세포는 두 개의 제타 사슬과 두 개의 엡실론 사슬로 구성된 사량체 (Gower I), 두 개의 알파 사슬과 두 개의 엡실론 사슬로 구성된 사량체 (Gower II) 또는 두 개의 제타 사슬과 두 개의 감마 사슬로 구성된 사량체 (Hb Portland)를 계속해서 합성한다. 배발생이 진행됨에 따라, 우세한 형태가 두 개의 알파 사슬과 두 개의 감마 사슬로 구성되는 태아의 헤모글로빈 (Hb F)을 구성하게 된다. 성인의 헤모글로빈 (두 개의 알파 및 두 개의 베타 사슬)은 태내에 있는 동안 합성되기 시작한다; 출생시에는 대략 50 % 의 헤모글로빈이 성인 형태의 것이며, 전환은 태어난지 약 6 개월정도에 완료된다. 성인의 거의 대부분 (대략 97 %)의 헤모글로빈이 두 개의 알파 및 두 개의 베타 사슬 변이체 (Hb A)로 이루어지며, 소량의 HbF 또는 델타 사슬 (Hb A2)도 검출가능하다.
대장균 및 효모에서 재조합 헤모글로빈 사슬을 발현시키기 위하여 여러 가지 방법들이 사용되어 왔다 [예를 들어, Jessenet al., Methods Enz. 231:347-364, 1994; Lookeret al., Methods Enz. 231:364-374, 1994; Ogdenet al., MethodsEnz. 231:374-390, 1994; Martin de Llanoet al., Methods Enz. 231:364-374, 1994]. 그러므로 아직까지는 단리된 사람 알파 사슬을 재조합 방법에 의하여 고수율로 발현시키는 것은 가능하지 않다 [예를 들면, Hoffmanet al., PNAS 87:8521-8525, 1990; Hernanet al., Biochem. 31:8619-8628, 1992]. 분명하게, 단리된 알파 사슬은 안정한 형태를 취하고 있지 못하며, 대장균내에서 쉽게 분해된다. 베타 사슬과 알파 사슬의 공동-발현은 그 결과 두가지 모두의 발현이 증가되는 것을 초래한다 [Hoffmanet al. and Hernanet al., 상기 인용 참조]. 알파 사슬이 베타 사슬의 일부분 및 인자 Xa인지 부위와의 융합 단백질로서 발현된 한편 [Nagai and Thorgersen, Methods Enz. 231:347-364, 1994], 이들 조건하에서는 불용성 봉입체로서 발현된다.
베타 사슬과 알파 사슬은 둘다 합토글로빈에 대한 결합 부위를 함유하고 있다. 합토글로빈은 헤모글로빈에 대하여 매우 높은 친화성을 가지고 있는 혈청 단백질이다 [예를 들면, Putnam inThe Plasma Proteins - Structure, Function and Genetic Control(F. W. Putnam, Ed.) Vol. 2, pp 1-49 (Academic Press, NY); Hwang and Greer, JBC 255:3038-3041, 1980]. 간으로의 합토글로빈의 수송은 헤모글로빈을 순환시키기 위한 주요 대사 경로이다. 알파 사슬상에는 합토글로빈에 대한 단일 결합 부위가 있고 (아미노산 121-127), 베타 사슬상에는 두 개의 결합 부위가 있다 (아미노산 영역 11-25 및 131-146) [Kazim and Atassi, Biochem J. 197:507-510, 1981; McCormick and Atassi, J. Prot. Chem. 9:735-842, 1990].
마취 활성을 가지고 있으면서 생물학적으로 활성인 펩티드들은 헤모글로빈을 단백질 가수분해적으로 분해시킴으로써 얻어질 수 있다 [개관: Karelinet al., Peptides 16:693-697, 1995]. 헤모글로빈 알파 사슬은 아미노산 94 와 95 사이에 산에 의해 가변적인 절단 부위를 가지고 있다 [Shaeffer, J. Biol. Chem. 269:29530-29536, 1994].
크레글러 등은 헤모글로빈이 마우스 골수의 CFU-C 선구 콜로니에 대하여 증강 활성을 가지고 있음을 발표하였다 [Kregleret al., Exp. Hemat. 9:11-21, 1981]. 그러한 검정법으로 CFU-MIX 와 같은 간세포와는 대조적으로 CFU-GM 및 CFU-M 선구체 집단에 대한 효과가 입증된다. 크레글러 등은 헤모글로빈의 단리된 알파 및 베타 사슬 두 가지에서 모두 활성을 관찰하였다. 이 활성은 N-에틸말레이미드로 처리함으로써 없어졌는데, 이러한 사실로 인하여 크레글러 등은 활성의 정지에 술프히드릴기가 필요하다고 제시하였다. 이러한 관찰을 자극 활성이 트립신으로 소화시켰을 때에도 유지되었다는 사실과 결부시켜, 크레글러 등은 C-말단의 소수성 도메인 또는 "코아" 영역이 활성에 기여한다고 생각하였다. 모가타쉬 등은 재조합 헤모글로빈이 CFU-E, BFU-E 및 CFU-GM 선구 세포수에 대해 자극적인 효과를 가지고 있으며, 이것은 헤민으로 관찰하였을 때와 유사함을 발표하였다 [Mogattashet al., Acta. Haematol. 92:182-186, 1994]. 뮬러 등은 정제된 성인의 헤모글로빈이 헤민과 유사한 방식으로 적혈구의 선구체를 자극한다고 발표하였다 [Muelleret al., Blood 86:1974, 1995].
피트로브 등은 Wv/Wv마우스에서 선천성 빈혈을 치료하는데 "미확인 골수펩티드 혼합물"을 사용하는 것에 대하여 발표하였다 [Petrovet al., Bioscience Reports 15:1-14, 1995]. 상기 혼합물은 비장 콜로니, 특히 적혈구 유형의 콜로니의 수를 증가시켰다.
헴(Heme)과 헤민은 그것들이 조혈에 미치는 영향에 대하여 집중적으로 조사되었다 [참조: S. Sassa, Seminars Hemat. 25:312-320, 1988 및 N. Abrahamet al., Int. J. Cell Cloning 9:185-210, 1991]. 헴은 적혈구 모세포의 성숙에 필요하다; 시험관내에서 헤민 (클로로페로프로토포르피린 IX - 즉, 추가의 염소 이온을 가지고 있는 헴)은 CFU-GEMM, BFU-E 및 CFU-E 의 증식을 증가시킨다. 유사하게, 헤민은 장기간 골수 배양물의 세포질을 증가시킨다.
"마취제"는 아편의 주된 활성 물질인 모르핀과 유사한 진통 성질을 가지고 있는 물질이다. 마취제는 예를 들면 모르핀과 다른 알칼로이드 또는 합성 화합물과 같은 작은 유기 분자, 또는 엔케팔린, 엔돌핀, 다이노르핀 및 그것들의 합성 유도체들과 같은 내인성 펩티드일 수 있다. 내인성 마취성 펩티드들은 생체내에서 보다 큰 선구체들, 예를 들면 Met- 및 Leu-엔케팔린에 대해서는 프레-프로엔케팔린 A, α, β, 및 γ 엔돌핀에 대해서는 프레-프로오피오멜라노코르틴, 및 다이노르핀 A 및 B, α-네오엔돌핀 및 β-네오엔돌핀에 대해서는 프레-프로다이노르핀으로부터 제조된다. 또한, 마취 활성을 가지고 있는 펩티드들은 고전적이지 않은 공급원, 예컨대 α 또는 β 카제인, 밀의 글루텐, 락트알부민, 시토크롬 또는 헤모글로빈과같은 단백질의 단백질 가수분해 또는 가수분해로부터, 또는 다른 종, 예를 들면 개구리의 피부 (데르모르핀) 또는 소의 부신 수질로부터 얻어질 수 있다. 그러한 펩티드들은 고전적인 엔돌핀과는 대조적으로 "엑소르핀 (exorphin)"으로 명명되었다; 그것들은 또한 비정형적인 마취성 펩티드로도 언급된다 [Zioudrouet al., JBC 254:2446-2449, 1979; Quirion and Weiss, Peptides 4:445, 1983; Loukaset al., Biochem. 22:4567, 1983; Brantl, Eur. J. Pharm. 106:213-214, 1984; Brantlet al., Eur. J. Pharm. 111:293-294, 1985; Brantlet al., Eur. J. Pharm. 125:309-310, 1986; Brantl and Neubert, TIPS 7:6-7, 1986; Glamstaet al., BBRC 184:1060-1066, 1992; Teschemacher, Handbook Exp. Pharm. 104:499-528, 1993; Petrovet al., Bioscience Reports 15:1-14, 1995; Karelinet al., Peptides 16:693-697, 1995]. 다른 내인성 펩티드들, 예를 들면 Tyr-MIF-1 패밀리도 또한 마취 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다 [Reedet al., Neurosci. and Biobehav. Rev. 18:519-525, 1994].
마취제들은 세 가지의 주요 약리학적 부류의 내인성 마취제 수용체 - 뮤(μ), 델타(δ), 및 카파(κ)에 결합함으로써 그것의 활성을 발휘한다. 각각의 약리학적 부류를 나타내는 수용체들은 이미 클론되었고 Gi에 커플된 G-결합된 수용체들임이 밝혀졌다 [개관: Reisine and Bell, TINS 16:506-510, 1993; Uhlet al., TINS 17:89-93, 1994; Knappet al., FASEB J. 9:516-525, 1995; Satoh and Minami, Pharm. Ther. 68:343-364, 1995; Kieffer, Cell. Mol. Neurobiol. 15:615-635,1995; Reisine, Neuropharm. 34:463-472, 1995; Zakiet al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 36:379-401, 1996].
각각의 수용체 형태 - 예를 들어 뮤 수용체 (이것은 DAMGO 및 DALDA 에 의해 선택적으로 활성화되고 CTOP 와 날록소나진에 의해 선택적으로 길항된다), 카파 수용체 (이것은 GR 89696 푸마레이트 또는 U-69593 에 의해 선택적으로 활성화되고 노르-바이날토르피민 염산염에 의하여 선택적으로 길항된다) 및 델타 수용체 (이것은 DADLE 및 DPDPE 에 의해 선택적으로 활성화되고 나트린돌에 의해 선택적으로 길항된다)에 대해서 특이한 아고니스트 및 길항제들이 사용될 수 있다. 또한, 상기 세가지의 모든 수용체 형태에 대하여 작용하는 광범위한 길항제 (예컨대 날록손) 및 아고니스트 (예컨대 에토르핀)들이 있다.
고전적인 및 비정형적인 마취제 펩티드들은 화학적으로 변경 또는 유도되어 그것들의 특이한 마취제 수용체 결합 성질이 변화될 수 있다 [개관: Hruby and Gehrig, Med. Res. Rev. 9:343-401, 1989; Schiller, Prog. Med. Chem. 28:301-340, 1991; Teschemacher, Handbook Exp. Pharm. 104:499-528, 1993; Handbook of Experimental Pharmacology, A. Hertz (Ed.) volumes 104/I and 104/II, 1993, Springer Verlag, Berlin; Karelinet al., Peptides 16:693-697, 1995]. 그러한 것들의 실예로는 데르모르핀의 유도체 (예컨대 DALDA) 및 엔케팔린의 유도체 (예컨대 DADLE, DAMGO 또는 DAMME)를 들 수 있다. 정상적으로는 마취제 수용체에 결합하지 않는 펩티드들, 예를 들면 소마토스타틴은 또한 특이한 마취제 수용체 결합 (예컨대 CTOP) [Hawkinset al., J. Pharm. Exp. Ther. 248:73, 1989]을 나타내도록유도될 수 있다. 변경된 수용체 결합 성질을 가지고 있는 모르핀 (예를 들면 헤로인, 코데인, 히드로모르폰, 옥시모르폰, 레보르파놀, 레발로르판, 히드로코돈, 옥시코돈, 날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부타노르파놀 및 날부핀)과 같은 유사체들이 또한 알칼로이드로부터 유도될 수 있다; 또한, 모르핀과 구조적으로 관련이 없는 작은 분자들 (예컨대 메페리딘 및 그것의 유사체들인 알파프로딘, 디페녹실레이트 및 펜타닐)도 마취제 수용체에 대해 작용할 수 있다 [Handbook of Experimental Pharmacology, 상기 인용 참조; Goodman and Gilman＇sThe Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed., A. G. Gilman, L. S. Goodman, T. W. Rall and F. Murad (Eds.) 1985 Macmillan Publishing Co. NY].
내인성 마취제 펩티드들 (엔케팔린, 엔돌핀 및 다이노르핀)은 보존된 N-말단의 테트라펩티드 Tyr-Gly-Gly-Phe 와 이어서 Leu 또는 Met 와 나머지 무작위의 C-말단 서열을 가지고 있다. N-말단의 Tyr 상에 있는 히드록실 기를 제거하면 (그 결과 N-말단은 Phe 이 된다) Met-엔케팔린에 대한 활성이 극적으로 손실되는 결과를 가져온다. 이들 구조적 데이터로 인해 "메세지-주소" 가설이 유도되었고, 그로써 N-말단의 "메세지"가 생물학적 활성을 부여하는 한편, C-말단의 "주소"는 특이성 및 증강된 잠재력을 부여한다 [Chzvkin and Goldstein, PNAS 78:6543-6547, 1981]. 엑소르핀은 일반적으로 고전적인 마취제 펩티드의 N-말단인 Tyr-Gly 를 대체하는 Tyr-Pro 을 가지고 있으며; 이 프롤린 잔기는 아미노펩티다제 분해에 대하여 보다 높은 안정성을 부여하는 것으로 여겨진다 [Shippet al., PNAS 86:287-, 1989; Glamstaet al., BBRC 184:1060-1066, 1992].
최근에 이르러 오르판 수용체 ("ORL1")가 뮤, 델타 및 카파 마취제 수용체에 대한 서열 관련성에 의하여 클론되었다 [Mollereauet al., FEBS 341:33-38, 1994; Fukudaet al., FEBS 343:42-46, 1994; Bunzowet al., FEBS 347:284-288, 1994; Chenet al., FEBS 347:279-283, 1994; Wanget al., FEBS 348:75-79, 1994; Keithet al., Reg. Peptides 54:143-144, 1994; Wicket al., Mol. Brain Res. 27:37-44, 1994; Halfordet al., J. Neuroimmun. 59:91-101, 1995]. 다양하게 노시셉틴 또는 오르파닌 FQ (이하 "노시셉틴"으로 부르기로 한다)로 불리는 이 수용체에 대한 리간드도 클론되었고 보다 큰 선구체로부터 유도되는 헵타데카펩티드인 것으로 나타났다 [Meunieret al., Nature 377:532-535, 1995; Reinscheidet al., Science 270:792-794, 1995]. 이것은 진통 성질을 가지고 있는 고전적인 마취제와는 대조적으로 생체내에서 통각전 (pronociceptic), 통각과민 기능을 가지고 있는 것으로 증명되었다. 노시셉틴은 상기에서 논의된 고전적인 마취제 펩티드의 N-말단 모티프인 Tyr-Gly-Gly-Phe... 과는 대조적으로 N-말단 모티프로서 Phe-Gly-Gly-Phe 을 가지고 있다. 고전적인 마취제 펩티드들의 마취 활성에 대한 N-말단 Tyr 에 대한 요구를 지키게 되면 노시셉틴은 뮤, 카파 또는 델타 마취제 수용체에 대한 친화성을 거의 또는 전혀 나타내지 못한다. 마찬가지로, 광범위한 마취제 길항제인 날록손도 ORL1 에 대하여 인지할만한 친화성을 가지고 있지 않다.
고정화 스트레스를 받는 조건하에서 생체내에서 쥐과 동물의 조혈에 엔케팔린이 어떤 영향을 미치는 지에 대해 관찰되었다 [Goldberget al., Folia Biol. (Praha) 36:319-331, 1990]. Leu-엔케팔린은 골수 조혈을 억제하였고 met-엔케팔린은 골수 조혈을 자극하였다. 이들 효과는 골드버그 등이 믿기에는 간접적으로는 글루코코르티코이드 수준 및 T 림프구 이동에 미치는 영향 때문이었다. 크리자낙-벤게즈 등은 생체내에서 이들 화합물의 효과를 주시하였다 [Krizanac-Bengezet al., Biomed. ＆ Pharmacother. 46:367-343, 1992; Biomed. ＆ Pharmacother. 49:27-31, 1995; Biomed. ＆ Pharmacother. 50:85-91, 1996]. 쥐의 골수를 Met- 또는 Leu-엔케팔린 또는 날록손으로 예비처리한 결과 콜로니 검정에서 관찰되는 GM 선구 세포의 수가 영향을 받았다. 이 효과는 매우 가변적이었으며, 그 결과 억압, 자극 또는 아무런 영향을 미치지 못하는 결과를 낳았다; 나아가, 분명한 용량-반응도 없었다. 크리자낙-벤게즈 등은 이러한 가변성이 생물학적 주기의 24 시간 리듬 및 부속 세포가 원인이라고 생각했다.
최근에, 뮤 마취제 수용체가 동종 재조합에 의하여 결실되어 있는 마우스들에게서 대퇴골 당 CFU-GM, BFU-E 및 CFU-GEMM 의 수가 증가되었음이 증명되었다. 골수 및 비장의 선구체들은 정상적인 마우스에 비교하여 이러한 뮤 수용체가 결실되어 있는 마우스들에서 보다 신속하게 순환하였다. 그러나, 이들 결과가 상기 동물들에서 뮤 수용체가 없음으로써 초래된 골수 간세포에 대한 직접 또는 간접 효과에 기인한 것이었는지는 측정되지 않았다 [Broxmeyeret al., Blood 88:338a, 1997].
I. 암의 화학요법 및 방사선요법
자극 성장 인자에 대한 많은 연구 결과 많은 상기 인자들 (에리트로포이에틴, G-CSF, GM-CSF, 등)을 실제로 임상에 사용할 수 있게 되었다. 이들 인자들을사용함으로써 화학요법 및 방사선 치료와 관련된 사망률 및 이병률이 감소되었다. 화학요법 또는 방사선 치료를 받고 있는 환자들에게 돌아가는 추가의 임상적 이익은, 간세포가 세포 사이클로 들어가는 것을 차단하고 그로써 환자들을 독성 부작용으로부터 보호하는 대체 스트래티지에 의해 현실화될 수 있다. 이러한 보호의 역전은 화학- 또는 방사선요법에 따르는 골수 기능의 신속한 회복을 가능하게 할 것이다.
II. 골수 및 간세포 이식, 생체외 간세포 팽창 및 종양 제거
골수 이식 (BMT)은 다양한 혈액학적, 자기면역 및 악성 질병에 대한 유용한 치료법이다. 현재의 치료법은 골수로부터뿐만 아니라 탯줄 혈액, 태아의 간으로부터 또는 말초혈 (이동되지 않았거나 또는 G-CSF 또는 시클로포스파미드와 같은 제제로 이동된)로부터 얻어진 조혈 세포를 포함하며; 간세포는 정제되지 않을 수도 있고, 부분적으로 정제될 수도 있으며 (예컨대 CD34+집단의 친화성 정제), 또는 고도로 정제될 수도 있다 (예컨대 CD34, CD38 또는 로다민과 같은 마아커를 사용하여 형광 활성화된 세포 분류법을 통하여 정제됨). 조혈 세포의 생체외 조작은 현재 원시적인 간세포를 이식에 적당한 집단으로 팽창시키기 위하여 사용되고 있다. 이러한 과정의 최적화 조건은 다음과 같다: (1) 장기간동안 조혈이 재구성되는 것을 유지할 수 있는 충분한 수의 간세포의 존재; (2) 이식- 대 숙주-유도 T-림프구의 소모; 및 (3) 잔류하는 악성 세포의 부재. 이 과정은 간세포 억제제(들) 및/또는 간세포 자극제(들)을 포함함으로써 최적화될 수 있다.
잔류하는 악성 세포를 제거하기 위하여 세포독성 약물로 조혈 세포를 제거하는 과정의 유효성은 정상적인 조혈 세포 및 특히 간세포에 대한 이들 화합물의 독성에 기인하여 제한된다. 따라서 제거하는 동안 정상적인 세포를 효과적으로 보호할 필요가 있다; 이러한 보호는 유효한 억제제를 사용하여 간세포를 사이클 밖으로 제거함으로써 얻어질 수 있다.
III. 말초혈 간세포 수득
말초혈 간세포 (PBSC)는 자가 이식의 경우에 골수를 능가하는 많은 잠재적인 장점들을 제공한다. 종양이 있거나 이미 전에 방사선요법을 받아서 적당한 골수 수득 부위가 없는 환자들은 PBSC 수집을 받을 수 있다. 혈액의 간세포를 사용하게 되면, 일반적인 마취 및 수술 과정을 잘 견디지 못하는 환자들에게서 그러한 과정에 대한 필요가 없어진다. 혈액 세포를 수집하기 위하여 필요한 아페레시스 (apheresis) 기법이 효과적이며 대부분의 주요한 의료 센터에서 널리 사용되고 있다. 이 방법의 주요 한계점은 두 가지인데, 하나는 말초혈중의 간세포의 정상적인 고정 상태의 빈도가 낮다는 것이고, 다른 하나는 약물 또는 성장 인자 (예컨대 시클로포스파미드, G-CSF, 간세포 인자)로 이동된 후의 사이클 상태가 높다는 것이다. 효과적인 간세포 억제제는 그러한 세포를 정지 상태로 복귀시키고, 그로써 전체 분화 과정을 통하여 간세포의 손실을 방지하는 데 유용할 것이다.
IV. 과다증식성 질병의 치료
많은 질병들이, 조절이 곤란한 간세포가 최종 단계의 세포의 과잉생성을 유도하는 상태인 과다증식 상태를 나타내는 것을 특징으로 한다. 그러한 질병 상태로는, 그것들에만 한정되는 것은 아니지만, 표피 세포가 과잉생성되는 건선, 장내 폴립 생성을 특징으로 하는 위장관의 악성 전단계 질환, 및 초기 간세포가 HIV 에 의해 영향을 받지는 않지만 사이클이 신속하게 간세포 소모를 초래하는 후천성 면역 결핍증 (AIDS)을 들 수 있다. 간세포 억제제는 그러한 질환들을 치료하는데 유용할 것이다.
V. 저증식성 질병의 치료
많은 질병들이, 조절이 곤란한 간세포가 최종 단계 세포의 정상 이하 수준의 생성을 유도하는 상태인 저증식 상태를 특징으로 한다. 그러한 질병으로는, 혈액 세포가 정상 이하 수준으로 생성되는 골수이형성증 또는 재생불능성 빈혈, 및 세포 재생과 교체가 결핍되는 노화와 관련된 질환들이 있다. 그러한 질병을 치료하기 위해서는 간세포 자극제가 유용할 것이다.
VI. 유전자 전달
조혈 세포에 유전 정보를 전달하는 능력은 현재 임상 세팅에서 활용되고 있다. 조혈 세포는 접근 방법이 쉽고, 조작 경험이 풍부하며, 이 조직을 생체외에서 처리할 수 있기 때문에, 그리고 혈액 세포가 조직을 통과할 수 있는 능력 때문에 유전자 치료법에 유용한 표적이다. 나아가, 사람의 특정한 유전적 결핍의 보정이 사람의 조혈 시스템의 원시 간세포안에 기능성 유전자를 삽입시킴으로써 가능해질 수 있다.
그러나 레트로바이러스 벡터 또는 유전자 전달의 물리적 기법을 사용하여 사람의 조혈 세포안에 유전자를 도입시키는 데에는 몇가지 한계가 있다: 즉, (1) 조혈 조직안의 간세포 수가 낮아서 그 결과 필연적으로 고효율의 유전자 전달 기법의 개발이 필요해진다; (2) 보다 빠르게 순환하는 간세포는 벡터 감염에 보다 더 민감한 것으로 증명되었지만, 간세포 증식을 성장 인자들로 자극함으로써 감염 빈도를 증가시키면 교화된 유전자를 함유하고 있는 세포들이 비가역적으로 분화하도록 압력을 받고 그로써 그것의 자체-재생능력이 손실되기 때문에 장기간의 유전자 팽창에 대해서는 부정적인 효과를 나타낸다. 이들 문제점은 분화를 방지하고 자체-재생의 손실을 막기 위해서 간세포 억제제를 사용하고, 간세포가 사이클안으로 들어가는 것을 조절함으로써 레트로바이러스가 매개된 유전자 전달을 용이하게 하기 위해서 간세포 자극제를 사용함으로써 개선될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 간세포 증식의 억제제와 자극제 및 그것들의 용도를 제공하는데 있다.
도 1 내지 4는 각각의 정제 단계 후의 생성물의 SDS 폴리아크릴아미드 겔을 통과를 도시한다.
도 1의 레인 1은 키모트립시노겐, 레인 2: 오브알부민, 레인 3: BSA, 레인 4: 30 킬로달톤 미만의 분획, 레인 5: 30 내지 50 킬로달톤 사이의 분획 및 레인 6: 50 내지 100 킬로달톤 사이의 분획.
도 2의 레인 1은 암모늄 설페이트 침전 (40 -80 %) 단계후, 레인 2 내지 5: DEAE 분획 (레인 2가 활성 분획을 나타낸다).
도 3의 레인 1은 암모늄 설페이트 침전 단계후의 상층액, 레인 2: 활성 DEAE 분획, 레인 3 내지 5: 겔 여과 분획 (레인 5가 활성 분획을 나타낸다).
도 4의 레인 2는 최종 생성물을 나타낸다.
도 5는 최종 정제 단계의 역상 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 6은 돼지의 골수로부터 정제된 다양한 양의 INPROL (pINPROL)이 있을 때와 없을 때 (대조표준 = 0 % 억제)의 FDCP-혼합물의 세포안으로의 삼중수소처리된 티미딘 통합 (cpm)을 도시한다. 데이터는 대조값에 대하여 표준화되어 있다.
도 7은 테스토스테론 프로피오네이트 (TSP), TSP 와 pINPROL 의 혼합물, 또는 비히클 (대조표준)로 마우스를 처리한 후의 세포 사이클의 S 상에 있는 세포의 백분율을 도시한다. 각각의 군은 25 마리씩의 동물을 포함한다 (시간점당 3-4).
도 8은 pINPROL 로 처리했을 때와 처리하지 않았을 때의 2 회 용량의 5-FU 로 처리된 마우스들의 생존을 도시한다. 각각의 군은 30 마리씩의 동물들로 구성된다.
도 9는 pINPROL 로 처리했을 때와 처리하지 않았을 때의 방사선 조사된 마우스들의 생존을 도시한다. 각각의 군은 50 마리씩의 동물들로 구성된다.
도 10a 및 10b는 Ara-C 또는 Ara-C 와 pINPROL 의 혼합물로 처리된 후 1 주 (10a) 및 3 주 (10b)의 정상적인 골수 장기간 배양 세포의 재생을 도시한다.
도 11은 치명적인 양의 방사선을 조사하고, 4 시간동안 배지 (대조표준) 또는 pINPROL (25 ng/㎖) 과 함께 예비인큐베이션한 후의 3×104개의 골수 세포를 이식한 후의 마우스들의 생존을 도시한다 (각 군당 75 마리). 생존은 30 일동안 조사되었다.
도 12는 치명적인 양의 방사선을 조사하고 4 시간동안 배지 또는 pINPROL 과 함께 예비인큐베이션한 공여체의 골수 세포로 회복시킨 후의 마우스들로부터 얻은 골수 세포에 의해 배양후 14 일 후에 형성된 CFU-GM 수를 도시한다.
도 13은 매주 취하여 세척하고, 4 시간동안 배지 또는 pINPROL 과 함께 예비인큐베이션한 후의 IL-7 (10 ng/㎖) 과 함께 플레이트하여 장기간 배양한 림프구로부터 얻어진 팽창 세포를 도시한다.
도 14는 pINPROL 로 처리된 백혈병 말초혈 세포의 개선된 재집합 능력을 도시한다. 장기간 배양을 시작하는 세포들 (LTC-IC)은 고착성 및 비고착성 LTC 세포를 pINPROL 과 함께 또는 pINPROL 없이 플레이팅하고 제 7 일째에 CFU-GM 을 기록함으로써 측정되었다. 데이터는 대조값에 대하여 표준화되었다.
도 15a는 53 % 아세토니트릴에서 용출되는 정제된 pINPRL 의 C4 역상 크로마토그램을 도시한다. 레인 1 은 미정제 물질을 나타내고, 레인 2 는 분자량 마아커를 나타내며, 레인 3 은 정제된 물질을 나타낸다. 도 15b는 43.9 % 아세토니트릴에서 용출되는 MIP-1α 의 역상 크로마토그램을 도시한다. 도 15c는 미정제 pINPROL 제제와 정제된 제제의 역상후의 SDS-PAGE 크로마토그램을 도시한다.
도 16은 헤모글로빈 서열을 도시한다: 도 16a는 사람 알파 헤모글로빈의 cDNA 및 아미노산 서열을 도시하고, 도 16b는 사람 베타 헤모글로빈의 cDNA 및 아미노산 서열을 도시한다. 번호매김은 아미노산을 따른다. 도 16c는 사람, 쥐 및 돼지의 헤모글로빈의 알파 및 베타 사슬의 아미노산 서열을 비교하여 도시한다.
도 17은 pINPROL (도 17a) 과 결정화된 돼지의 헤모글로빈 (도 17b)의 C4 역상 HPLC 흔적을 비교하여 도시한다.
도 18은 결정화된 돼지 헤모글로빈의 C4 역상 HPLC 분리로부터 얻어진 분획들의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 레인 1 은 분자량 마아커를 나타내고, 레인 2 는 첫 번재 피크 (47.11 분에서 나타남)로부터 유도된 분획 48-49 를 나타내며, 레인 3은 두 번째 피크 (49.153 분에서 나타남)로부터 유도된 분획 50-51 을 나타내고, 레인4 는 세 번째 피크 (52.25 분에서 나타남)로부터 유도된 분획 54-55 를 나타내며, 레인5 는 다섯 번째 피크 (53.613 분에서 나타남)로부터 유도된 분획 56-57 을 나타낸다.
도 19는 pINPROL (도 19a)과 정제된 돼지의 베타 헤모글로빈 (도 19b)의 2-차원 겔 전기영동을 비교하여 도시한다.
도 20은 FDCP-MIX 검정에서 정제된 돼지의 알파 헤모글로빈, 베타 헤모글로빈 또는 pINPROL 의 효과를 비교하여 도시한다.
도 21은 약한 용출 구배를 사용하는 돼지의 헤모글로빈의 역상 분리를 도시한다.
도 22a는 호슐리 등의 플라스미드 (Hochuliet al., 1988)를 나타내고, 도 22b는 뢰트셔 등의 플라스미드 (Loetscheret al., 1991)를 나타내며, 도 22c는 pDSUb 플라스미드를 나타낸다.
도 23은 코블스톤 검정에서 INPROL 로 처리한 결과를 도시한다.
본 발명은 간세포 증식의 억제제 및/또는 자극제인 펩티드 및 폴리펩티드를 포함한 화합물 (INPROL 및 마취제 화합물) 및 그것들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 다음의 성질을 특징으로 하는 간세포 증식의 억제제를 포함한다:
(a) 쥐과 동물의 콜로니 형성 비장 (CFU-S) 검정에서 20 ng/㎖ 보다 작거나또는 동일한 비활성 (IC50) (실시예 4 참조),
(b) 10,000 달톤보다 크고 100,000 달톤 (한외여과에 의해 측정함)보다 작은 분자량,
(c) 트립신에 의한 분해에 민감한 활성,
(d) MIP-1α 또는 TGFβ 보다 소수성이 커서 이 두가지 물질로부터 역상 크로마토그래피에 의하여 분리가능함 (실시예 12 참조),
(e) 수용액중에서 37 ℃, 55 ℃ 또는 75 ℃ 에서 1 시간동안 가열된 후에도 보유되는 생물학적 활성, 및
(f) 아세톤중의 1 % 염산으로 침전시킨 후에도 보유되는 생물학적 활성.
본 발명은 또한 짧은 예비인큐베이션 기간후에 시험관내 검정에서 억제를 나타내는 능력에 의하여 다른 후보 간세포 억제제들 (예컨대 MIP-1α, TGFβ 및 다양한 올리고펩티드)과 구별되고 그것을 특징으로 한다 (실시예 5 참조).
본 발명은 또한 다양한 질병을 치료하기 위한 INPROL 을 함유하고 있는 약학 조성물을 포함한다.
본 발명은 간세포를 죽이거나 또는 손상시킬 수 있는 제제에 노출되고 있는 환자에게 유효량의 간세포 억제 조성물을 투여함으로써 상기 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법에 의해 보호되는 간세포는 통상적으로 골수, 탯줄, 태아 간에 존재하고 분할되거나 또는 말초혈 순환계안으로 이동되는 조혈 간세포일 수 있다. 이동되는 간세포의 대부분이 형광 활성화된 세포 분류기 (FACS) 분석에 따라정지 상태인 반면, 다형잠재성 간세포들은 순환하고 있고 간세포를 억제할 수 있는 양의 INPROL 로 억제될 수 있는 것으로 입증된다. 또는 달리, 예를 들면 소장 또는 두피의 상피 또는 신체의 다른 부분에 있을 수 있으며, 또는 재생 기관에 위치한 체세포 (germ cell)일 수 있다. 본 발명의 방법은 동물 치료도 본 발명의 방법에 포함되긴 하지만 바람직하게는 사람을 대상으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "대상" 또는 "환자"는 사람을 포함한 척추동물과 같은 동물을 말한다.
본 발명은 또한 환자에게 유효량의 간세포 자극 조성물을 투여함으로써 저증식성 간세포를 함유하고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법에 의해 자극된 간세포들은 통상적으로 골수, 탯줄, 태내 간에 존재하거나 또는 말초혈 순환계안으로 이동하는 조혈 간세포일 수 있다; 그러한 간세포들은 간세포를 자극하는 양으로 INPROL 을 사용함으로써 이미 사전에 정지 상태에 있을 수 있다. 간세포를 자극하는 양의 INPROL 은 원하는 때에, 예를 들면 생체외 팽창중에 사용하기 위하여 간세포를 수득한 후에, 또는 계속해서 생체내에서 간세포를 이식하고 합체시킬 때 간세포 순환을 자극할 수 있을 것이다. 또는 달리, 간세포들은 예를 들면 소장 또는 두피의 상피 또는 신체의 다른 부분에 있을 수 있으며, 또는 재생 기관에 위치한 체세포일 수 있다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 화학요법을 받고 있는 환자의 조혈, 면역 또는 다른 간세포 시스템을 보호 및 회복시키는 방법을 제공하는데, 그 방법은 환자에게 간세포를 억제하기에 효과적인 양의 INPROL 을 투여하고 및/또는 간세포를 자극하기에 효과적인 양의 INPROL 을 투여함으로써 화학요법 또는 방사선요법 후의회복을 자극한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 고형 종양 (예컨대 유방, 결장, 폐, 고환, 난소, 간, 신장, 췌장, 뇌, 육종)을 포함하는 어떠한 암이든지 그러한 암에 걸려 있는 환자에게 간세포를 억제하기에 효과적인 양의 INPROL 을 투여함으로써 골수, 위장관 또는 다른 기관의 간세포를 화학요법 또는 방사선요법의 독성 효과로부터 보호하고 및/또는 간세포를 자극하는 양의 INPROL 을 투여함으로써 화학요법 또는 방사선요법 후의 회복을 자극하는 암의 부속적인 치료 방법을 포함한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 그 안에 증식성 백혈병 세포를 가지고 있는 조혈 세포를 효과적인 양의 INPROL 로 치료함으로써 정상 간세포의 증식을 억제하고, 골수를 세포독성제로 치료하여 백혈병 세포를 파괴하는 것으로 이루어지는, 백혈병 (예컨대 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 골수종, 호지킨병)을 치료하는 것을 포함한다. 이 방법은 골수의 증식을 자극하는 다른 제제, 예를 들면 콜로니 자극 인자들 및/또는 INPROL 을 간세포를 자극하는 양으로 사용하여 골수를 추가로 치료함으로써 증강될 수 있다. 한 실시예에서 이 방법은 생체내에서 수행된다. 또는 달리, 이 방법은 이식을 위한 조혈 세포의 생체외 제거 및 팽창에도 유용하다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 방법은 간세포가 증식함으로써 유발된 질병중 어느 것이든지에 걸려 있는 환자를 치료하는 것을 포함한다. 그러한 질병, 예를 들면 건선, 골수이형성증, 몇가지 자기 면역 질병들, 노화의 면역-억압, 골수 이형성 증후군, 재생불능성 빈혈 또는 AIDS 에서의 간세포의 소모는 관심의 대상이되는 간세포의 증식을 억제 또는 자극하기에 효과적인 양의 INPROL 을 환자에게 투여함으로써 치료된다.
본 발명은 간세포를 죽이거나 또는 손상시킬 수 있는 세포독성제로부터의 손상으로부터 간세포를 가역적으로 보호하는 방법을 제공한다. 이 방법은 그러한 제제에 노출되는 환자에게 간세포를 억제하기에 효과적인 양의 INPROL 을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 화학요법 또는 방사선요법 후에 회복 단계에 있는 동안 간세포의 증식을 가역적으로 자극하는 방법을 제공한다. 이 방법은 그러한 제제에 노출되어 있는 환자에게 간세포를 자극하기에 효과적인 양의 INPROL 을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 다음의 과정 (실시예 12 참조)에 의하여 돼지 또는 다른 동물의 골수로부터 단리되는 간세포 증식의 억제제를 제공한다:
(a) 골수의 추출 및 여과를 통한 과립 물질의 제거,
(b) 56 ℃ 에서 40 분동안 열 처리한 후 얼음 조에서 냉각시킴,
(c) 10,000 g 에서 30 분동안 4 ℃ 에서 원심분리함으로써 침전물을 제거함,
(d) 1 부피 % 의 농축 염산을 함유하고 있는 교반된 빙-냉 아세톤 10 부피를 상층액에 첨가함으로써 산 침전시키고 4 ℃ 에서 16 시간동안 인큐베이션함,
(e) 20,000 g 에서 30 분동안 4 ℃ 에서 원심분리함으로써 침전물을 단리하고 저온 아세톤으로 세척한 후 건조시킴, 그리고
(f) 역상 크로마토그래피에 의하여 단리한 후, 5-플루오로우라실로 예비처리되고 쥐과 동물의 IL-3 의 존재시에 인큐베이트된 골수 세포에 의한 콜로니 형성의 억제에 의해, 및 280 nm 에서의 흡광도 및 SDS-PAGE 에 의하여 활성을 모니터함.
본 발명은 또한 하기에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 선행 단계들을 포함하고 있는, 실질적으로 다른 단백성 물질이 없는 간세포 증식의 억제제를 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 간세포 증식의 억제제가 간세포 과다증식에 의하여 유발된 면역 억압을 개선시키는 기능을 수행하는 사람 또는 동물의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 간세포를 자극하는 양의 INPROL 이 간세포 저증식에 의하여 유발된 골수 억압을 호전시키는, 사람 또는 동물의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 간세포가 세포독성 약물 또는 방사선 노출 과정에 의해 증식되도록 유도된 후에 상기 간세포 증식의 억제제가 투여되는, 사람 또는 동물의 치료 방법을 제공한다. 간세포는 정상적으로는 정지상태이지만 화학요법 후에는 세포 사이클 안으로 들어가도록 자극된다. 이것은 간세포가 두 번째의 화학요법에 대해 더욱 민감해지도록 하는 결과를 낳으며; 본 발명의 방법은 간세포를 이러한 처리로부터 보호한다.
본 발명은 또한 간세포 증식의 자극제 (예컨대 간세포를 자극하는 양의 INPROL)를 골수 재생을 촉진하기 위하여 간세포를 억제하는 양의 INPROL 을 투여하기 전 또는 후에 투여하는, 사람 또는 동물의 치료 방법을 제공한다. 간세포를 억제하는 양의 INPROL 은 간세포가 세포 사이클을 통과하고 화학치료요법 또는 방사선에 대해 보호하는 속도를 둔화시키며; 간세포를 자극하는 양의 INPROL 은 상기억제를 반전시키고 골수 회복을 촉진시킨다. 반대로, 간세포를 자극하는 양의 INPROL 은 골수 회복을 촉진시키기 위해 사용될 수 있는 한편, 간세포를 억제하는 양의 INPROL 은 일단 골수가 회복되면 간세포를 정지상태로 되돌리기 위하여 계속해서 사용된다.
본 발명은 또한 상기 간세포 증식의 억제제가 면역 반응을 증가시킬 목적으로 하는 예방접종 전에 또는 예방접종과 함께 투여되는 사람 또는 동물의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 포유동물에 면역을 자극할 수 있는 양의 INPROL 을 투여하는 것으로 이루어지는 포유동물의 면역 결핍증을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 포유동물에게 진정 효과를 유도하는 양의 INPROL 을 투여하는 것으로 이루어지는 포유동물의 동통 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포독성 약물이나 방사선으로 인한 손상에 대하여 간세포를 보호하기 위하여 간세포 증식을 억제하기에 효과적인 양의 억제제를 투여하는 것으로 이루어지는, 세포 독성 악물이나 방사선 치료를 받고 있는 사람 또는 동물의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 치료후 회복을 증강시키기 위하여 간세포를 자극하기에 효과적인 양의 INPROL 을 투여하는 것으로 이루어지는, 세포독성 약물 또는 방사선 치료를 받고 있는 사람 또는 동물의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 헤모글로빈과 약학적으로 허용되는 담체를 함유하고 있는 약학 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 헤모글로빈의 알파 사슬, 헤모글로빈의 베타 사슬, 헤모글로빈의 감마 사슬, 헤모글로빈의 델타 사슬, 헤모글로빈의 엡실론 사슬 및 헤모글로빈의 제타 사슬, 사람 알파 헤모글로빈 사슬의 아미노산 1-97 을 포함하고 있는 폴리펩티드 ("펩티드 1-97")와 사람 알파 헤모글로빈 사슬의 아미노산 1-94 를 포함하고 있는 폴리펩티드 ("펩티드 1-94")로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드와 (b) 약학적으로 허용되는 담체로 이루어지는 약학 조성물을 포함한다. 이러한 약학 조성물은 상기 군에서 선택된 하나의 폴리펩티드, 상기 군으로부터 선택된 폴리펩티드들의 혼합물, 또는 이량체 또는 다량체 형태로 존재하는 상기 군으로부터의 폴리펩티드들로 구성될 수 있으며, 여기에 헴이 있을 수도 있고 없을 수도 있다.
본 발명은 또한 다음의 서열들을 가지고 있는 펩티드를 포함한다:
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val ("펩티드 43-55"),
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
(상기에서 두 개의 Cys 잔기는 이황화 결합을 형성한다("고리형 펩티드 43-55")),
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
(상기에서 두 개의 Cys 잔기는 탄소 가교에 의해 결합된다),
Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala
("펩티드 64-82"), 및
도 16a 에 도시된 바와 같은 사람 알파 헤모글로빈의 처음 97 개의 N-말단 아미노산을 포함하고 있는 펩티드.
또한 본 발명에는 간세포를 억제 및/또는 자극하는 성질을 보유하고 있는 사람 알파 사슬의 변형된 부분들로 구성되는 단백질 및 펩티드 서열이 포함된다. 그러한 변형으로는, 그것들에만 한정되는 것은 아니지만, C-말단의 소수성 도메인의 제거 또는 변형 (그 결과 용해 특성이 개선된다) 및/또는 합토글로빈 결합 도메인의 제거 또는 변형 (그 결과 약동학 성질이 개선된다)이 있다. 사람 알파 헤모글로빈의 C-말단 소수성 도메인은 아미노산 98 (페닐알라닌)부터 141 (아르기닌) 까지의 영역으로 구성되며 총 44 개의 아미노산 중 23 개의 소수성 아미노산을 함유하고 있다. 전체 도메인 또는 이들 소수성 아미노산 (6 개의 알라닌, 4 개의 발린, 8 개의 로이신, 2 개의 프롤린 및 3 개의 페닐알라닌)중 하나 또는 그 이상은 결실에 의해 제거될 수 있다 ("결실된" C-말단 소수성 도메인). 또는 달리, 이들 아미노산중 하나 또는 그 이상은 비-극성 아미노산 (예컨대 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 또는 글루타민)으로 치환될 수 있다 ("치환된" C-말단 소수성 도메인).
다른 실시예에서는, 상기 영역의 소수성을 감소시켜서 용해도를 증가시키는 카르복시메틸화와 같은 화학적 변형이 사용된다.
또 다른 실시예에서는, 소수성 잔기들이 사람 베타 헤모글로빈 서열에 있는 상응하는 친수성 영역으로 치환된다. 예를 들면, 사람 베타 헤모글로빈 서열에서, 아미노산 107 (글리신)에서 117 (히스티딘)까지의 영역 또는 아미노산 130 (티로신)에서 139 (아스파라긴)까지의 영역이 각각 상대적으로 친수성이며, 각각 또는둘 다 사람 알파 헤모글로빈의 동등한 소수성 영역을 치환할 수 있다.
합토글로빈 결합 도메인은 C-말단 소수성 영역내에 함유되어 있고 아미노산 121-127 로 구성된다. 이 영역은 그것 전체를 결실시킴으로써 제거될 수 있거나 또는 이 영역내에 있는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결실될 수 있다 ("결실된" C-말단 합토글로빈 결합 도메인). 이 영역 또는 이 영역내에 있는 하나 또는 그 이상의 아미노산은 다른 아미노산, 예를 들면 폴리-아닐린 또는 폴리-글리신으로, 또는 합토글로빈에 대한 폴리펩티드의 결합을 푸는 효과를 가지고 있지만 간세포 억제 활성은 유지시키는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다 ("치환된" C-말단 합토글로빈 결합 도메인).
본 발명의 다른 실시예들은 베타 헤모글로빈 사슬 (C-말단 소수성 영역내의 및/또는 합토글로빈 결합 도메인 (아미노산 11-25 및 136-139)중 하나 또는 둘다)에 대한 상응하는 변형, 및 델타, 감마, 엡실론 및/또는 제타 헤모글로빈 사슬에 대한 상응하는 변형을 포함한다.
또한 본 발명에는 상기 확인된 펩티드를 코드화하는 DNA 서열, 상기 DNA 서열을 함유하고 있는 벡터 및 그 벡터를 함유하고 있는 숙주 세포들이 포함된다. 이들 펩티드들은 표준 화학적 기법들 (예컨대 고상 합성법)을 사용함으로써 또는 재조합 기법 (글루타티온-S-트란스페라제 [D.B. Smith and K.S. Jojnson, Gene 67:31-40, 1988], 티오레독신 [LaVallieet al., Biotechnology 11:187-193, 1993] 또는 유비퀴틴 [Buttet al., PNAS 86:2540-2544, 1989; Cherneyet al., Biochem. 30:10420-10427, 1991; Bakeret al., JBC 269:25381-25386, 1994; 미국 특허 제5,132,213 호; 5,196,321 호 및 5,391,490 호 및 PCT WO91/17245]을 사용하는 것과 같은 융합 시스템을 포함함)을 사용함으로써 합성될 수 있다.
추가로 본 발명은 조혈 세포를 마취제 수용체, 유익하게는 마취제 수용체의 뮤 하위부류와 결합할 수 있는 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 방법을 포함한다. 또한 본 발명은 조혈 세포를 노시십틴 수용체 (예컨대 ORL1)와 결합할 수 있는 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 방법을 포함한다. 나아가, 본 발명은 조혈 세포를 "마취제-유사" 수용체와 결합할 수 있는 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 방법을 포함한다.
마취제 활성을 나타내는 펩티드들 ("헤모르핀(hemorphin)"이라 불림)이 헤모글로빈으로부터 단리되었다 [예컨대 Brantlet al., Eur. J. Pharm. 125:309-310, 1986; Daviset al., Peptides 10:747-751, 1989; Hoffmanet al., PNAS 87:8521-8525, 1990; Hernanet al., Biochem. 31:8619-8628, 1992; Karelinet al., Bioch. Biophys. Res. Comm. 202:410-415, 1994; Zhaoet al., Ann. N.Y. Acad. Science 750:452-458, 1995; Petrovet al., Bioscience Reports, 15:1-14, 1995; Karelinet al., Peptides 16:693-697, 1995]. 다른 비정형적인 마취제 펩티드 및 작은 분자들도 또한 존재한다 [Zioudrouet al., JBC 254:2446-2449, 1979; Quirion and Weiss, Peptides 4:445, 1983; Loukaset al., Biochem. 22:4567, 1983; Brantl, Eur. J. Pharm. 106:213-214, 1984; Brantlet al., Eur. J. Pharm. 111:293-294, 1985; Brantl and Neubert, TIPS 7:6-7, 1986; Hruby and Gehrig,Med. Res. Rev. 9:343-401, 1989; Schiller, Prog. Med. Chem. 28:301-340, 1991; Glamstaet al., BBRC 184:1060-1066, 1992; Teschemacher, Handbook Exp. Pharm. 104:499-528, 1993; Handbook of Experimental Pharmacology, A. Hertz (Ed.) volumes 104/I 및 104/II, 1993, Springer Verlag, Berlin; Reedet al., Neurosci. and Biobehav. Rev. 18:519-525, 1994; Karelinet al., Peptides 16:693-697, 1995]. 본원에서 사용되는 바 용어 "마취제-유사 수용체"는 마취제, INPROL, 헤모르핀, 엑소르핀, 노시셉틴, Tyr-MIF-1 패밀리 구성원, 알카로이드 및/또는 적절한 양의 날록손을 포함시킴으로써 길항되는 방식으로 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 다른 화합물과 결합하는 능력에 의해 규정된다 (실시예 29 및 38 참조).
또한 본 발명은 수용체 결합 검정에 INPROL (유익하게는 펩티드 1-94, 1-97, 43-55 또는 64-82 와 같은 펩티드 형태임)을 사용하는 것으로 이루어지는, 수용체(들) 및 리간드를 확인하는 방법을 포함한다. 나아가, 본 발명은 아데닐레이트 사이클라제 검정에 INPROL 을 사용하는 것으로 이루어지는, 수용체(들) 및 리간드를 확인하는 방법을 포함한다.
추가로 본 발명은 조혈 세포를 GTP-결합 단백질, 유익하게는 G억제하위타입의 단백질들을 활성화시킬 수 있는 화합물 (예를 들면 마스토파란)과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 조혈 세포를 다음의 서열을 가지고 있는 헤모르핀 펩티드의군으로부터 선택된 펩티드와 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 방법을 포함한다:
Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe,
Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg,
Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln,
Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr,
Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp,
Leu-Val-Val-Tyr-Pro,
Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln,
Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe,
Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg,
Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln, 및
Tyr-Pro-Trp-Thr.
상기 펩티드들은 다른 비정형적인 마취제 펩티드들, 예를 들면 Tyr-MIF-1 패밀리의 펩티드들 [Reedet al., Neurosci. Biobehav. Rev. 18:519-525, 1994], 카제인-유도 카소모르핀 [Brantlet al., Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 360:1211-1216, 1979; Loukaset al., Biochem. 22:4567-4573, 1983; Fiat and Jolles, Mol. Cell. Biochem. 87:5-30, 1989], 시토크로핀으로 불리는, 시토크롬 b 로부터 유도된 펩티드 [Brantlet al., Eur. J. Pharm. 111:293-294, 1985], 다양한 엑소르핀 및 사람 및 사람이 아닌 종으로부터 유도된 마취제 펩티드 [Zioudrouet al., JBC 254:2446-2449, 1979; Brantl, Eur. J, Pharm. 106:213-214, 1984; Brantlet al., Eur. J. Pharm. 125:309-310, 1986; Brantl and Neubert, TIPS 7:6-7, 1986; Glamstaet al., BBRC 184:1060-1066, 1992; Teschemacher, Handbook Exp. Pharm. 104:499-528, 1993; Karelinet al., Peptides 16:693-697, 1995]에 대해서뿐만 아니라 마취제 수용체에 결합하는 것으로 스크린되는 조합 라이브러리로부터 유도되는 펩티드 [Dooleyet al., Peptide Research 8:124-137, 1995]에 대하여 유사한 생물학적 활성 및/또는 서열 유사성을 가지고 있다.
본 발명은 또한 조혈 세포를 Tyr-MIF-1 관련 펩티드, 카소모르핀, 시토크로핀 및 엑소르핀으로 이루어지는 군으로부터 선택된 펩티드와 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 방법을 포함한다. 구체적으로 다음의 서열을 가지고 있는 Tyr-MIF-1 펩티드가 포함된다:
Tyr-Pro-Try-Gly-NH2,
Tyr-Pro-Lys-Gly-NH2,
Tyr-Pro-Leu-Gly-NH2, 및
Pro-Leu-Gly-NH2.
본 발명은 또한 다음의 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택된 마취제 펩티드를 조혈 세포와 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 방법을 포함한다:
(D-Ala2,N-Me-Phe4,Gly-ol5)-엔케팔린 (DAMGO),
(D-Arg2,Lys4)-데르모르핀-(1-4)-아미드 (DALDA),
(Phe4)-데르모르핀(1-4)아미드,
Ac-Arg-Phe-Met-Trp-Met-Arg-NH2,
Ac-Arg-Phe-Met-Trp-Met-Lys-NH2, 및
H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Arg-Val-NH2.
본 발명은 또한 조혈 세포를 모르핀, 코데인, 메타돈, 헤로인, 메페리딘, 알파프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐, 수펜타닐, 알펜타닐, 레보르파놀, 히드로코돈, 디히드로코데인, 옥시코돈, 히드로모르폰, 프로폭시펜, 부프레노르핀, 에토르핀, 옥시모르폰, 덱스토프로폭시펜, 및 멥타지놀로 이루어지는 군으로부터 선택된 마취제 아고니스트 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 방법을 포함한다. 구체적으로 10-7몰 이하의 억제량으로 사용되는 모르핀이 포함된다.
본 발명은 또한 조혈 세포를 날록손, 날트렉손, 날로르핀, 펜타조신, 날부핀 및 부토르파놀로 이루어지는 군으로부터 선택된 마취제 길항제 또는 혼합된 아고니스트/길항제와 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 방법을 포함한다. 구체적으로 10-8몰 이하의 억제량으로 날록손이 사용된다.
본 발명은 또한 조혈 세포를 간세포를 자극하는 양의 INPROL, 미오글로빈, DAMGO 및 DALDA 를 포함하는 군으로부터 선택된 펩티드 또는 단백질과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 자극하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 다음의 단계로 이루어지는, 포유동물에서 유전자 치료법을 수행하는 방법을 포함한다:
a) 상기 포유동물로부터 조혈 세포를 제거하는 단계,
b) 상기 조혈 세포를 간세포를 자극하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물로 생체외에서 처리하는 단계,
c) 상기 조혈 세포를 예정된 유전자로 형질전환 또는 감염시키는 단계,
d) 상기 형질전환된 조혈 세포를 생체외에서 간세포를 억제하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물과 접촉시키는 단계,
e) 상기 포유동물에게 단계 d) 의 조혈 세포를 이식시키는 단계, 그리고
f) 상기 포유동물을 간세포를 억제 또는 자극하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물로 임의로 생체내에서 처리하는 단계.
본 발명은 또한 간세포를 억제하는 양의 INPROL 및 최소한 하나의 자극성 사이토킨으로 상기 조혈 세포를 처리하는 것으로 이루어지는, 생체외에서 간세포 팽창을 수행하는 방법을 포함한다. INPROL 은 자극성 사이토킨으로 접촉시키기 전에, 중에 및/또는 후에 조혈 세포와 접촉된다. 생체외 간세포 팽창은 탯줄 혈액, 태아의 간, 화학요법후의 자가조직 골수, 등과 같은 또는 정제 (예를 들면 CD34, CD38 또는 로다민과 같은 마아커를 사용하여 형광 활성화된 세포 분류법을 사용한 정제)후와 같은 제한된 공급원으로부터 충분한 양의 간세포가 생성되는 것을 가능하게 한다. 또한 특정한 조혈 계통을 선택적으로 성장시키는 능력으로 말미암아 임상의사가 개별적인 환자의 필요에 따라 간세포 이식을 구체적으로 디자인하는 것이 가능해진다.
본 발명은 또한 최소한 하나의 추가의 자극성 사이토킨의 존재 또는 부재와 함께 간세포를 자극하는 양의 INPROL 로 조혈 세포를 처리하는 것으로 이루어지는, 생체외에서 간세포 팽창을 수행하는 방법을 포함한다. INPROL 은 자극성 사이토킨(들)로 접촉시키기 전에, 중에 및/또는 후에 조혈 세포와 접촉된다. 생체외에서, 간세포 자극제는 간세포 및/또는 선구체들이 팽창하는 것을 가능하게 하는 한편 간세포 억제제는 간세포가 그것의 분화되지 않은 상태로 유지되도록 할 것이다. 이 과정은 또한 간세포가 생체내에서 이식되기 전까지 정지 상태로 유지되도록 간세포를 억제하는 양으로 INPROL 을 사용함으로써 최적화될 수 있으며, 그런 다음 골수 재생을 자극하기 위하여 간세포를 자극하는 양으로 INPROL 이 사용될 수 있다. 임의로, 조혈 세포는 2 개의 제제로 나누어져서, 그 중 하나는 간 세포를 자극하는 양의 INPROL 로 처리되어 간세포의 팽창이 촉진되고 및/또는 다른 하나는 간세포를 억제하는 양의 INPROL 로 처리되어 간세포가 그것들의 미분화 상태로 유지된다. 그런 다음 2 개의 제제가 조합되어 환자에게 주입될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) INPROL 과 (b) MIP-1α, TGFβ, TNFα, INFα, INFβ, INFγ, 펜타펩티드 pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys, 테트라펩티드 N-아세틸-Ser-Asp-Lys-Pro, 및 트리펩티드 글루타티온(Gly-Cys-γGlu)로 이루어지는 군으로부터 선택된최소한 하나의 억제 화합물을 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 (a) INPROL 과 (b) IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 간세포 인자, 델타-유사 단백질 및 flk2/flt3 리간드로 이루어지는 군으로부터 선택된 최소한 하나의 자극성 사이토킨을 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 발명은 MIP-1α, TGFβ, 프린델과 그의 동료들이 밝혀낸 테트라펩티드 또는 포코비츠와 그의 동료들이 밝혀낸 펜타펩티드 [Wright ＆ Pragnell, 1992, 상기 인용 참조]와 같은 종래 기술의 억제제와 상이한 간세포 억제제 (INPROL)를 설명하고 있다. 자연적으로 발생하는 천연 INPROL 은 한외여과에 의해 측정되는 바 10,000 달톤을 초과하는 분자량을 가지고 있으며, 이것은 펜타펩티드 뿐만 아니라 테트라펩티드와도 구별된다. 본 발명의 억제제는 역상 크로마토그래피 시스템에서 MIP-1α 또는 TGFβ 보다 더 소수성이며, 이로써 상기 사이토킨들과 본 발명의 억제제가 구별된다. 나아가, 작용 방식에 있어서도 예비인큐베이션 기간중에만 사용되는 때에도 생체내 검정에서 활성이라는 점에서 이전에 설명되었던 어떤 것과도 상이하다. 예를 들어 MIP-1α 는 예비인큐베이션 기간중에만 사용되었을 때에는 비활성적이다 (실시예 5). 나아가, 자연적으로 발생하는 INPROL 은 "고증식성 잠재 세포" (HPP-PFC) 를 측정하는 검정에서 활성인 반면, MIP-1α 는 비활성이었다 (실시예 6). INPROL 은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 간세포 인자, 및 flk2/flt3 리간드와 같은 당해 기술분야에서 알려져 있는 다른 자극제들과는 상이하다. 자연적으로 발생하는 INPROL 은 상기 사이토킨들과 서열이 전혀 또는 거의 유사하지 않다.
본 발명을 보다 완전하게 이해하기 위하여 다음의 상세한 설명을 제시한다. 하기의 설명은 본 발명의 예시로서 본 발명을 구체적으로 한정하는 것으로 인정되지 않아야 하며, 그러한 변형은 본 발명의 범주내에 있는 것으로 당업자에게는 인정될 것이다.
INPROL 은 간세포의 분할을 가역적으로 억제하거나 자극한다. 어떤 특정 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 간세포 억제제 및 자극제는 간세포가 세포 사이클을 통해 전이하는 속도에 영향을 미침으로써 그것들의 효과를 발휘하는 것으로 여겨진다. 구체적으로, INPROL 은 사용되는 양에 따라 조혈 간세포의 세포 분할을 일시적으로 억제 또는 자극하는데 효과적이다. 간세포 증식을 억제 또는 자극할 수 있는 화합물을 임상적으로 사용할 수 있는 능력으로 말미암아 예를 들면 화학요법, 간세포 이식 또는 유전자 치료 프로토콜중에 조혈 간세포의 사이클링을 아주 훌륭하게 조절하는 것이 가능해진다. 그러므로, 본 발명의 방법은 암 또는 바이러스를 통해 감염된 세포를 파괴하기 위하여 사용된 화학요법제 또는 방사선에 의해 유발된 손상으로부터 간세포를 보호하거나 또는 그러한 손상후에 회복을 자극함으로써 환자의 조혈 시스템, 골수 시스템 및 면역 시스템에 대한 화학요법의 바람직하지 못한 부작용을 경감시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, INPROL 은 간세포 분할을 억제하기에 충분한 용량으로 환자에게 투여되는 한편, 화학요법제는병에 걸린 세포에 작용한다. 화학요법제가 그것의 기능을 수행한 후에, INPROL 에 의해 억제된 간세포는 추가의 처리없이 세포 분할로 다시 복귀될 것이다. 만약 조혈의재생을 증강시킬 필요가 있다면, 자극성 성장 인자, 사이토킨 또는 간세포를 자극하는 양의 INPROL 이 추가로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바 용어 "INPROL" 은 간세포 증식을 억제 및/또는 자극하는 능력을 가지고 있는, 하기 실시예에서와 같이 정제된 포유동물 및 비-포유동물의 단백질, 헤모글로빈, 헤모글로빈의 알파 사슬 (헴 기가 있거나 없음), 헤모글로빈의 베타 사슬 (헴 기가 있거나 없음), 알파와 베타 사슬의 혼합물 (헴 기가 있거나 없음), 및 배 (embryonic), 태내 또는 성인 형태의 것을 포함하여 상기 단백질들의 단편 또는 유사체 (예컨대 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 또는 제타 사슬, 단독 또는 혼합물의 형태, 이량체 또는 다량체, 헴 기가 있거나 없음)를 포함한다. 용어 "INPROL" 은 상기 단백질의 비-자연적으로 발생하는 (예컨대 재조합적으로 및/또는 합성적으로 제조된) 형태뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 형태도 포함한다. 용어 "INPROL 폴리펩티드" 는 40 또는 그 이상의 아미노산으로 구성되는 INPROL 을 말한다.
본원에서 사용되는 바 용어 "마취제 화합물"은 마취제 수용체 (또는 마취제 수용체와 연관된 서열을 포함하고 있는 수용체, 예컨대 ORL1)에 결합하여 그것들의 아고니스트, 길항제 또는 혼합된 아고니스트/길항제 활성을 나타내는, INPROL 이 아닌 화합물을 말한다. 예를 들어, 뮤 수용체에 대하여 (이것은 DAMGO 및 DALDA 에 의해 선택적으로 활성화되고 CTOP 와 날록소나진에 의해 선택적으로 길항된다), 카파 수용체에 대하여 (이것은 GR 89696 푸마레이트 또는 U-69593 에 의하여 선택적으로 활성화되고 노르-비날토르피민 염산염에 의하여 선택적으로 길항된다) 및 델타 수용체에 대하여 (이것은 DADLE 및 DPDPE 에 의하여 선택적으로 활성화되고 나트린돌에 의하여 선택적으로 길항된다) 특이한 아고니스트 및 길항제가 각각 존재한다. 또한, 세가지의 모든 수용체 하위타입에 대하여 작용하는 광범위한 길항제 (예컨대 날록손) 및 아고니스트 (예컨대 에토르핀)가 있다. 노시셉틴은 특이적으로 ORL1 수용체를 길항한다. 간세포 자극 및/또는 억제 활성을 가지고 있는 마취제 화합물들은 INPROL 에 대하여 본원에서 설명된 각각에 대하여 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "간세포를 자극하는 양"이란 간세포의 증식을 유도하는 양이다. 본원에서 사용되는 용어 "간세포를 억제하는 양"은 간세포의 증식을 억제하는 양이다. 모든 경우에, 생체내에서 및 생체외에서, 선택되는 양은 선택된 특이한 INPROL 및 마취제 화합물 및 특이한 질환 또는 적용분야에 따라 좌우될 것이다; 특히 등몰량의 폴리펩티드 또는 INPROL 의 단편들이 등몰량의 마취제 펩티드 또는 작은 분자와 같이 활성적이다.
전형적인 임상 현장에서, 간세포의 억제가 요구되는 경우, 간세포의 순환이 억제되는 것이 바람직하다면 INPROL 은 예컨대 표준 화학요법 또는 방사선 치료가 시작되기 4 내지 60 시간전에 예를 들면 0.01 내지 100 mg/kg, 유익하게는 0.1 내지 1.0 mg/kg 의 INPROL 을 사용하여 단위 용량 형태로 환자에게 매일 정맥내 주사 또는 주입에 의하여 투여된다.
예컨대 화학요법 또는 방사선 치료후에 회복을 촉진시키기 위하여 간세포 순환의 자극이 필요한 경우에는, INPROL 은 간세포 자극량으로 사용된다. 그러한 용량은 전형적으로 1 내지 500 mg/kg, 유익하게는 10 mg 내지 100 mg/kg 이다.
간세포 순환을 억제 또는 자극하기 위해 마취제 화합물(들)을 사용하는 것이 바람직한 경우에는, 마취제 화합물(들)은 INPROL 에 대하여 설명된 것과 등몰 농도로 사용된다.
발명의 다른 실시예에서는, 간세포를 억제하는 양의 INPROL 로 예비처리함으로써 화학요법제 또는 방사선의 용량이 환자가 정상적으로 견디는 용량을 초과하여 증가되는 것이 가능해진다. 유사하게, INPROL 을 간세포를 자극하는 양으로 화학요법 또는 방사선 치료 후에 치료하면 화학요법 또는 방사선 치료시 정상적으로 허용되는 용량이 증가되는 것이 가능해진다.
조혈 간세포의 대부분은 정상적으로는 정지상태이다 (느리게 순환하거나 또는 순환하지 않는다). 그러나, 화학요법으로 인하여 유도된 조혈계의 손상에 대한 보상성 반응으로서 보다 큰 비율의 간세포는 화학요법 후에 순환계로 들어가며, 그것은 간세포가 계속해서 투여되는 세포독성 화학요법 또는 치료용 방사선 조사에 특히 공격당하기 쉽게 만든다. 그러한 간세포의 순환을 억제함으로써, INPROL 처리로 인하여 종래의 또는 증가된 용량으로 세포독성 화학요법의 1 회 용량을 계속해서 보다 먼저 또는 보다 빈번하게 투여하는 것이 가능해진다.
일부의 정상적인 개체는 자발적으로 빠르게 순환하는 간세포를 가지고 있다; 간세포를 자극하는 양의 INPROL 은 그것이 방사선치료 또는 화학요법의 첫 번째 투여보다 앞서 투여된다 하여도 그러한 개체에게는 유용하다.
본 발명의 한 실시예에서, INPROL (0.1 mgs 내지 6 mgs/kg 체중 - 유익하게는 1.0 내지 60 mgs/kg)이 화학요법의 최초 투여후 약 24 시간 내지 10 일후에 투여된다. 다시 4 내지 60 시간, 유익하게는 24 내지 48 시간이 지난후, 다른 1회분 용량의 화학요법이 투여된다. 이러한 화학요법과 INPROL 의 교대 사이클은 치료 이익에 따라 계속된다. 투여에 대한 화학요법제 및 프로토콜은 표준 임상 실시에서 특정의 종양 유형에 대한 적합성에 따라 선택된다. 임의로, 조혈 재구성을 추가로 개선시키기 위하여 화학요법 또는 방사선 치료 후에 G-CSF, 간세포 인자, 또는 INPROL 과 같은 자극성 성장 인자가 간세포를 자극하는 양으로 사용된다.
생체외 적용을 위해서는, 0.1 ng 내지 100 ng/106세포/㎖, 유익하게는 2 내지 50 ng/106세포/㎖ 의 INPROL 이 간세포 증식의 억제가 요구되는 경우에 사용된다. 간세포 자극이 요구되는 경우에는, 10 ng 내지 100 ㎍/106세포/㎖, 유익하게는 1 내지 100 ㎍/106세포/㎖ 의 INPROL 이 사용된다.
간세포 순환을 억제 또는 자극하기 위해 마취제 화합물(들)을 사용하는 것이 바람직한 경우에는, 마취제 화합물(들)이 INPROL 에 대해 설명된 것과 등몰 농도로 사용된다.
발명의 다른 실시예에서는, INPROL 이 이식을 위해 자가 조혈 세포를 제조하는 방법에서 사용된다. 조혈 세포들은 간세포 분할을 억제하기에 효과적인 양의 INPROL 로 생체외 처리된 후 효과적인 양의 화학요법제 또는 방사선이 골수 배양물에 투여됨으로써 암성 세포들이 제거된다. 세포의 순환에 대해 특이성을 가지고 있는 화학요법제들이 바람직하다. 그렇게 처리된 골수는 자체 공여체안에 다시 주입된다. 임의로, 환자는 환자의 조혈 재구성을 개선시키기 위하여 간세포를 자극하는 양의 INPROL 및/또는 조혈을 자극하는 것으로 알려져 있는 다른 제제로 처리된다. 그러한 기법은 자체 골수 이식중에 종양 세포의 효과적인 제거를 가능하게 하는 반면 조혈 간세포는 보호된다. 그러한 보호는 생체외 또는 생체내 제거 프로토콜을 이용하여 제공받을 수 있다. 일단 성공적으로 이식이 되면, 간세포가 쉽게 증식하여 정상적인 골수 기능을 재생하는 것이 필요하다. 이것은 간세포의 순환을 자극하고 골수 기능의 회복을 증강시키는 INPROL 을 간세포를 자극하는 양으로 사용함으로써 이루어질 수 있다.
발명의 다른 실시예에서, INPROL 은 유전자 치료법을 위하여 조혈 세포를 제조하는 방법에서 사용된다. 조혈 세포들은 간세포를 자극하는 양의 INPROL 및/또는 다른 자극성 사이토킨(들)로 생체외에서 처리되어 간세포 분할이 자극된 후, 관심의 유전자(들)로 형질전환된다 (유익하게는 예컨대 레트로바이러스 벡터를 사용하여 감염된다). 형질전환이 이루어진 후에, 세포들은 세척되고 간세포를 억제하는 양의 INPROL 로 처리되어 간세포가 정지 상태로 복귀된다. 그렇게 처리된 골수는 공여체에 다시 주입된다. 임의로, 환자는 간세포를 그것들의 정지 형태로 유지하고 골수 재집합 기능을 증가시키기 위하여 간세포를 억제하는 양의 INPROL 로 생체내 처리된다.
발명의 다른 실시예에서는, INPROL 이 백혈병의 보조 치료법으로서 사용된다. 예를 들어, 백혈병 세포가 INPROL 에 반응하지 않는 질병 상태인 경우, 조혈 세포들은 간세포를 억제하는 양의 INPROL 로 생체외 처리된다. 정상적인 간세포의 증식은 INPROL 의 투여에 의해 방지된다. 그러므로, 증식하고 있는 백혈병 세포가 세포 사이클에 특이한 세포독성제로 치료되는 중에 정상적인 간세포의 집단이 손상으로부터 보호된다. 추가로, 자극성 사이토킨, 예컨대 IL-3, GM-CSF 가 임의로 투여되어 약물 또는 방사선 치료중에 백혈병 세포의 순환을 유도하는 한편, 정상적인 간세포는 INPROL 로 보호된다. 환자는 화학요법제 또는 방사선으로 치료되어 백혈병 세포가 파괴되고, 그런 다음 정화된 골수가 다시 환자에게 이식되어 조혈 재구성이 수립된다.
유사하게, 혈구 또는 림프구를 포함하는 심각한 바이러스 감염, 예컨대 HIV 감염에 걸려 있는 환자들을 치료하기 위한 발명의 다른 실시예에서는, 조혈 세포들이 INPROL 로 생체내 또는 생체외에서 처리된 후, 항바이러스제, 감염 세포를 파괴하는 약물, 또는 항체-기초 시스템으로 처리되어 감염된 세포가 제거된다. 환자로부터 바이러스 숙주 세포를 근절시키기 위해서 골수아구성 항바이러스 요법 또는 골수아구성 화학요법을 따르면, INPROL 로 처리된 골수 세포는 환자에게 되돌아온다.
발명의 다른 실시예에서, INPROL 은 과다증식성 간세포와 관련된 질병을 치료하기 위하여 사용된다. 예를 들면, 건선은 피부의 과다증식성 상피 세포에 의해 유발된 질병으로 때로는 세포독성 약물로 치료된다. 간세포 증식이 포함되는 다른 선-신생물형성 병변들도 또한 간세포의 증식을 억제하기 위하여 사용된 유효량의INPROL 에 잘 따른다. 후천성 면역 결핍증을 가지고 있는 환자들은 비정상적으로 높은 간세포 순환속도를 가지고 있어서 그 결과 간세포가 소모된다; 이들 환자도 간세포 순환을 억제하기 위한 효과적인 양의 INPROL 을 사용한 치료에 의해 좋은 치료 결과를 얻는다. 이들 용도에 대하여, INPROL 을 함유하고 있는 국소 또는 경피 조성물 (예컨대 연고, 로션, 젤 또는 반창고)이 비경구 투여에 대한 대체물로서 필요에 따라 사용된다.
대부분의 백혈병의 경우에, 백혈병 선구체들은 INPROL 에 의해 영향을 받지 않고 따라서 상술된 것들과 같이 INPROL 을 사용하는 방법들에 의해 치료되는 분화된 세포 집단이다. 백혈병 선구체들이 매우 원시적이어서 INPROL 에 의한 억제에 대해 직접적으로 민감하게 반응하는 경우에, 백혈병 세포의 증식은 유효량의 INPROL 을 투여함으로써 약화된다.
발명의 다른 실시예에서는, 저증식성 간세포와 관련된 질병들을 치료하기 위하여 INPROL 이 사용된다. 예를 들어, 골수이형성 증후군 및 재생불능성 빈혈은 골수의 저증식성 간세포에 의해 유발되는 질병들이다. 간세포 저증식이 포함되어 있는 다른 증후군도 간세포를 자극하는 양의 INPROL 로 치료가능하다.
단클론성 또는 다클론성 항체들은 INPROL 펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 표준 기법에 의해 개발된다. 이들 항체 또는 INPROL 펩티드 또는 폴리펩티드는 많은 유형이 당해 기술분야에 공지되어 있는 검출가능한 표지로 표지화된다. 그런 다음 표지된 INPROL 또는 항-INPROL 항체는 간세포 마아커로서, 그것을 진단 목적으로 환자에게 직접 투여함으로써 간세포를 확인하고 단리하기 위해 사용된다. 또는 달리, 이들 표지된 펩티드, 폴리펩티드 또는 항체들은 골수의 신생 세포를 제거하기 전에 그러한 세포들의 제거를 가능하게 하는 조혈 세포 제제중의 간세포를 확인하기 위하여 생체외에서 사용된다. 유사한 방식으로, 그런 표지된 펩티드, 폴리펩티드 또는 항체는 상피 또는 다른 간세포를 단리 및 확인하기 위하여 사용된다. 또한, 표지되거나 또는 표지되지 않은 그러한 항체들은 INPROL 활성의 중화를 통해 치료적으로 또는 순환하는 INPROL 수준의 검출을 통해 진단적으로 사용된다.
INPROL 은 표준 기법을 사용하여 재조합 사람 INPROL 의 발현을 위해 사람 유전자로부터 또는 cDNA 라이브러리로부터 클론될 수 있다. 예를 들면, 정제된 단백질로부터 얻어진 서열 정보를 사용하여, 예컨대 32-황으로 표지될 수 있는 올리고누클레오티드 프로브가 구성되어 적절한 cDNA 라이브러리 (예컨대 골수로부터의)를 스크린하기 위하여 사용된다. 또는 달리, 적절한 공급원 (예컨대 골수)으로부터 얻어지는 발현 라이브러리가 항체를 사용하여 또는 적절한 기능 검정법을 사용하여 (예컨대 실시예 2 에서 설명됨) INPROL 을 코드하는 cDNA 에 대하여 스크린된다. 헤모글로빈 자체와 개별적인 알파 및 베타 사슬도 당해 기술 분야에 공지되어 있는 방법들을 사용하여 클론되었고 발현되어 있다 [Pagnieret al., Rev. Fr. Transfus. Hemobiol. 35:407-415, 1992; Lookeret al., Nature 356:258-260, 1992; Methods in Enzymology vol. 231, 1994].
본 발명은 선택된 비-포유동물 숙주에 의한 발현을 위해 "바람직한" 코돈들의 통합; 제한 엔도노클레아제 효소에 의한 절단 부위들의 제공; 및 쉽게 발현된 벡터의 구성 또는 헤모글로빈의 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 및/또는 제타 사슬의 제조 또는 정제를 용이하게 하는 추가의 초기, 말단 또는 중간 DNA 서열의 제공을 포함하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 동일성 또는 위치의 견지에서 자연-발생적인 형태와 상이하고 (즉, 결실 유사체는 모든 특정된 잔기들보다 적은 잔기를 함유하고 있음; 치환 유사체는 특정된 하나 또는 그 이상의 잔기가 다른 잔기에 의해 대체되어 있음; 첨가 유사체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 말단 또는 중간에 첨가되어 있음), 자연-발생적인 형태와 일부 또는 전부의 성질을 공유하는 헤모글로빈 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 및/또는 제타 사슬의 폴리펩티드 유사체 또는 유도체를 코드하는 DNA 서열들을 제공한다.
바람직한 실시예에서, INPROL 은 게놈성 또는 cDNA 클로닝에 의해 또는 유전자 합성에 의해 얻어진 외인성 DNA 서열의 원핵성 또는 진핵성 숙주 발현 (예컨대 박테리아, 이스트, 고등 식물, 곤충 및 배양중의 포유동물 세포에 의한 발현)의 생성물이다. 즉, 바람직한 실시예에서 INPROL 은 "재조합 INPROL" 이다. 전형적인 이스트 (예컨대Saccharomyces cerevisiae) 또는 원핵생물 (예컨대 대장균) 숙주 세포들에서 발현된 생성물은 어떠한 포유동물의 단백질과도 관련이 없다. 척추동물 (예컨대 사람이 아닌 포유동물 (예를 들면 COS 또는 CHO) 및 조류) 세포에서 발현된 생성물은 어떠한 사람 단백질과도 관련이 없다. 사용된 숙주에 따라 본 발명의 폴리펩티드들은 글리코실화될 수도 있고 글리코실화되지 않을 수도 있다. 본 발명의 폴리펩티드들은 또한 임의로 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 (위치 -1 에) 포함할수 있다.
본 발명은 또한 헤모글로빈의 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 및/또는 제타 사슬의 폴리펩티드 유사체와 같은 다른 생성물도 포함한다. 그러한 유사체는 헤모글로빈의 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 및/또는 제타 사슬의 단편을 포함한다. 잘 알려져 있는 과정을 따라 당업자는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 동일성 또는 위치의 견지에서 (예컨대 치환, 말단 및 중간 첨가 및 결실) 본원에 특정된 것과는 상이한 기본 서열을 가지고 있는 폴리펩티드의 미생물적 발현물을 코드하는 유전자를 쉽게 디자인하고 제조할 수 있다. 또는 달리, cDNA 와 게놈 유전자의 변형은 잘 알려져 있는 부위-특정 돌연변이생성 기법에 의해 쉽게 이루어질 수 있으며, 헤모글로빈의 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 또는 제타 사슬의 유사체 및 유도체를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 생성물들은 INPROL 의 생물학적 성질을 최소한 하나 공유하지만 상호간에 상이할 수 있다. 실예로서, 본 발명의 생성물로는 예컨대 결실에 의해 단축된 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 또는 제타 사슬; 또는 가수분해에 대하여 보다 안정한 (그러므로 자연적으로 발생하는 것보다 더 분명한 또는 더 장기간 지속되는 효과를 가질 수 있는) 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 또는 제타 사슬; 또는 O-글리코실화 및/또는 N-글리코실화에 대한 하나 또는 그 이상의 잠재 부위가 결실 또는 첨가되도록 변경되어 있거나 또는 예컨대 알라닌 또는 세린에 의해 대체되거나 결실되어 있는 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 가지고 있으며 미생물 시스템으로부터 활성 형태로 보다 쉽게 단리되는 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 또는 제타 사슬; 또는 페닐알라닌에 의해대체되어 있는 하나 또는 그 이상의 티로신 잔기를 가지고 있으며 보다 쉽게 또는 덜 쉽게 표적 단백질 또는 표적 단백질 상에 있는 수용체에 결합하는 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 또는 제타 사슬이 있다. 또한 본 발명에는 그 단편들이 INPROL 의 한 가지 성질 (예컨대 수용체 결합)은 가질 수 있지만 다른 것들 (예컨대 간세포 억제 활성)은 가질 수 없는, 알파, 베타, 감마, 델타, 엡실론 또는 제타 사슬내에 있는 연속되는 아미노산 서열 또는 이차 형태의 단지 일부분만을 복제하는 폴리펩티드 단편들 또는 펩티드가 포함된다. 본 발명의 어떠한 하나 또는 그 이상의 생성물이 치료 활용성 [Weilandet al., Blut 44:173-175, 1982] 또는 다른 관점에서, 예컨대 억제 인자 길항작용의 검정에서의 활용성을 가지기 위해 활성이 반드시 필요한 것이 아니라는 것은 주목할 만하다. 경합적인 길항제들은 간세포 억제제 또는 그것의 수용체가 과잉생성되는 경우에 유용하다.
또한, 생물학적 활성을 보유하고 있는 단백질 서열로부터 유도된 펩티드는 표준 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 동일성 또는 위치의 관점에서 자연-발생적 형태와 상이하고 (예컨대, 결실 유사체는 모든 특정된 잔기들보다 적은 잔기를 함유하고 있음; 치환 유사체는 특정된 하나 또는 그 이상의 잔기가 자연 발생적이거나 또는 D-아미노산과 같은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 유사체와 같은 다른 잔기에 의해 대체되어 있음; 첨가 유사체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 화학적으로 변형되어 안정성, 용해도 및/또는 단백질 가수분해에 대한 내성이 증가되어 있음), 자연-발생적 형태의 일부 또는 모든 성질을 공유하는 헤모글로빈 알파, 베타,감마, 델타, 엡실론 및/또는 제타 사슬의 펩티드 유사체 또는 유도체를 코드하는 서열을 제공한다.
상술된 것과 같은 펩티드 서열들은 다양한 방법으로 확인될 수 있다. 검정에서 활성을 보이는 천연 헤모글로빈 사슬 (예컨대 알파 사슬)의 삼차원 구조를, 구조적으로 관련이 있으면서 비활성인 단백질 (예컨대 미오글로빈)과 비교함으로써, 삼차원 공간에서 상이한 형태를 가지고 있으며 따라서 활성 펩티드에 대한 후보 영역이 되는 영역들이 확인될 수 있다. 다른 접근법은 단백질을 가수분해하는 효소가 헤모글로빈 사슬의 제한된 소화물에 사용되어 그 결과 예를 들면 역상 HPLC 에 의해 분리될 수 있고, 그런 다음 간세포 억제에 대하여 검정되는 선택적인 단백질 가수분해를 사용한다. 펩티드들은 또한 화학적 합성법 (예컨대 고상 합성법)에 의해 생성될 수 있다; 관심의 헤모글로빈 사슬 (예컨대 알파 사슬)의 서열을 포함하고 있는 일련의 중복하는 펩티드 (예컨대 15 량체)가 쉽게 생성되어 간세포 검정에서 시험될 수 있다. 다중 화학적 합성법이 수행되고 선택된 아미노산 위치들이 가변적으로 만들어져서 그 결과 대다수의 펩티드 유사체들이 스크리닝용으로 제조되는 조합 라이브러리가 생성될 수 있다 [Dooleyet al., Peptide Research 8:124-137, 1995]. 또는 달리, 재조합 방법이 사용될 수도 있다. 부위 특정된 돌연변이생성법은 특정 헤모글로빈 사슬의 활성에 필요한 결정적인 잔기들을 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 간세포 억제제로서 활성이 있는 것으로 알려져 있는 사슬의 영역들 (예컨대 알파 사슬)은 관련은 있지만 비활성인 단백질 (예컨대 미오글로빈)로 치환될 수 있으며, 이것이 간세포 검정에서 시험되어 활성에 필요한 영역들의 확인이가능해진다. 그렇게 확인된 영역들은 펩티드로서 발현될 수 있으며 간세포 순환 검정에서 활성에 대해 시험된다.
다른 종으로부터 얻어지는 INPROL 의 상동 또는 상사 형태는 상술된 본 발명의 치료적 실시예와 유사한 다양한 수의학적 용도에 사용된다.
간세포를 억제하는 양의 INPROL 은 간세포를 분할하지 않는 상태 또는 느리게 분할하는 "휴면" 상태로 되돌려놓음으로써 순환하는 간세포에 작용한다. 정지하고 있는 간세포를 분할 상태로 자극하는 것이 바람직한 경우에는, 예를 들어 환자를 암 화학요법제 또는 방사선으로 치료한 후에 간세포를 자극하는 양으로 INPROL 이 사용될 수 있다. 또는 달리, 또는 추가로, 콜로니-자극 인자 및 다른 조혈 자극제가 개체에 투여될 수 있다. 그러한 인자들의 실예로는 그것들에만 한정되는 것은 아니지만, M-CSF (CSF-1), GM-CSF, G-CSF, 메가캐리오사이트-CSF, 트롬보포이에틴, 간세포 인자 또는 다른 사이토킨, 예를 들면 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, 또는 에리트로포이에틴이 있다.
INPROL 폴리펩티드 또는 간세포 자극 활성을 가지고 있는 활성 단편들은 하기에서 설명되는 프로토콜로 예시되는 바와 같이, 간세포 억제 활성에 대한 적절한 생체검정법과 함께 조합된 종래의 화학적인 방법들에 의해 정제되거나 합성된다.
발명의 한 실시예에서, 치료적으로 효과적인 양의 INPROL 단백질 또는 그것의 치료적으로 효과적인 단편이 약학적으로 허용되는 담체와 혼합되어 사용된다. 이런 INPROL 조성물은 일반적으로 비경구 주사 또는 주입에 의하여 투여된다. 이루어지는 치료 효과에 따라 피하, 정맥내, 또는 근육내 주사 경로가 선택된다.
전신적으로 투여되는 경우에는, 본 발명에 사용하기 위한 치료 조성물은 발열원이 없고, 비경구적으로 허용되는 수용액 형태이다. pH, 등장성, 안정성, 담체 단백질 등을 포함하고 있는 약학적으로 허용되는 멸균 단백질 용액은 당해 기술분야내에 있는 것이다.
또한 본 발명내에는 본 발명의 치료적으로 효과적인 양의 펩티드 또는 폴리펩티드 생성물을, INPROL 치료법에 유용한 적당한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 포함하고 있는 약학 조성물이 포함된다. 본원에서 사용되는 "치료적으로 효과적인 양"이란 주어진 조건 및 투여 요법에 대하여 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 그러한 조성물은 액체, 겔, 연고, 또는 동결건조되거나 그렇지 않으면 건조된 제형이며, 다양한 완충제 내용물 (예컨대 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도를 가지는 희석제, 표면에 대한 흡착을 방지하기 위한 알부민 또는 젤라틴과 같은 첨가제, 계면활성제 (예컨대 트윈 20, 트윈 80, 플루로닉 F68, 담즙산염), 가용화제 (예컨대 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜), 항산화제 (예컨대 아스코르브산, 소디움 메타비술파이트), 보존제 (예컨대 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 부피가 커보이게 하는 물질 또는 강장성 변형제 (예컨대 락토오스, 만니톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체의 단백질에 대한 공유 결합 부착물, 금속 이온과의 착화, 또는 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 하이드로겔 등과 같은 중합체 화합물의 과립 제제안으로의 또는 그것들에 대한 물질의 통합 또는 리포솜, 니오솜, 미소에멀젼, 미셸, 단층 또는 다층 소포, 생체내 분해가능한 주사가능한 미소캡슐 또는 미소구, 또는 단백질 매트릭스, 적혈구 고스트, 스페로플라스트, 피부 패취, 또는 다른 공지된 조제약의 배출 또는 포장 방법들을 포함한다. 그러한 조성물은 INPROL 의 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 것이다. 제어된 또는 지속되는 방출 조성물은 친유성 저장고 형태의 제형 (예컨대 지방산, 왁스, 오일)을 포함한다. 또한 본 발명에는 중합체 (예컨대 폴로옥사머 및 폴로옥사민)로 코팅된 과립 조성물 및 조직-특이적 수용체, 리간드 또는 항원에 대하여 지정된 항체와 커플된 또는 조직-특이적 수용체의 리간드와 커플된 INPROL 이 포함된다. 본 발명의 조성물의 다른 실시예에는 비경구, 폐, 비내, 국소 (피부 또는 점막) 및 경구를 포함하여 다양한 투여 경로를 위하여 보호 코팅, 프로테아제 억제 인자 또는 투과 증강제의 과립형태가 혼입되어 있다. 다른 실시예에서는, INPROL 을 함유하고 있는 조성물이 국소적으로 또는 경피 패취를 통하여 투여된다.
한 실시예에서, 본 발명의 조성물은 단위 투여 용량 형태로 멸균 바이알 또는 앰퓰로 포장된다.
본 발명은 또한 화학요법제 (예컨대 5-플루오로우라실(5FU), 시토신 아라비노시드, 시클로포스파미드, 시스플라틴, 카보플라틴, 독시루비신, 에토포시드, 탁솔, 알킬화제), 항바이러스제 (예컨대 AZT, 아시클로비어), TNF, 사이토킨 (예컨대 인터류킨), 반증식성 약물, 대사 길항물질, 및 DNA 대사를 간섭하는 약물과 같은 하나 또는 둘 이상의 추가 인자를 포함하는 조성물을 포함한다.
세포독성제에 노출되고 있는 환자를 치료하기 위한 또는 과다증식하고 있는 간세포를 치료하기 위한 방법에 포함된 용량 요법은, 약물의 작용을 변형시키는 다양한 인자들; 예컨대 상태, 체중, 성별, 및 환자의 식이요법, 어떠한 감염의 위험성, 투여 시간 및 다른 임상적 인자들을 고려하여 주치의에 의해 결정된다.
환자의 세포독성제 또는 방사선에 대한 노출에 뒤이어서, 본 발명의 치료 방법은 일반적으로 INPROL 를 사용한 선치료에 의해 억제된 간세포 (및 그것들의 자손)의 성장 및 분할을 자극하기 위하여 하나 또는 둘 이상의 림포킨, 콜로니 자극 인자 또는 다른 사이토킨, 헤마토포이에틴, 인터류킨 또는 성장 인자들을 임의로 포함하고 있는 INPROL 을 간세포를 자극하는 양으로 환자에게 투여하는 것을 임의로 사용한다. 조혈을 장려하는 그러한 치료제로는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, Meg-CSF, M-CSF (CSF-1), GM-CSF, G-CSF 또는 에리트로포이에틴이 있다. 이들 제제의 용량은 화학요법 또는 조혈 간세포의 이식후에 조혈 재구성을 촉진함에 있어서 효력을 나타내기 위한 임상적 시도에 사용한 결과 얻어진 지식에 따라서 선택된다. 이들 용량은 환자의 물리적 상태, 및 환자가 노출되는 화학요법제 또는 방사선의 양 및 유형의 변화를 상쇄하기 위하여 조정될 수 있다. 처리된 환자에서 INPROL 의 투여에 의해 유발된 간세포의 억제의반전의 진행 여부는 종래 방법에 의해 모니터된다.
백혈병의 치료에서, 정상적인 간세포 순환을 억제하기 위한 INPROL 과 백혈병 세포 성장의 자극제, 예를 들면 IL-3 또는 GM-CSF를 둘다 세포독성 약물 치료와 동시에 또는 방사선 조사중에 투여하는 것이 유익하다. 이 프로토콜에 의하여 정상 및 백혈병 세포의 순환하는 상태와 약물에 대해 민감성을 보이는 상태 사이에 가장 큰 차이를 얻는 것이 가능하다.
실 시 예
실시예 1: 생체내 간세포 증식 억제 검정
간세포 증식을 검출하기 위하여 세포 사이클의 S-상에 있는 CFU-S 의 수를3H-티미딘 "자살" 방법에 의하여 측정하였다 [Beckeret al., Blood 26:296-308, 1965].
성숙하지 않은 조혈 선구체 -- 비장의 콜로니 형성 단위 (CFU-S) -- 는 조혈 세포를 정맥내 주사한지 8 내지 12 일 후에 치명적인 양으로 방사선이 조사된 마우스의 비장에서 육안으로 볼 수 있는 콜로니를 형성함으로써 생체내에서 검출될 수 있다 [Till ＆ McCulloch, 1961].
표준 CFU-S 증식 검정을 위해서는 보통3H-티미딘 "자살" 방법이 사용된다 [Beckeret al., 1965]. 이 방법은 DNA 의 선구체인 방사성표지된 티미딘 (3H-티미딘)이 DNA 합성과정중에 세포안으로 통합되는 것을 토대로 한다. 시험시점에 세포 사이클의 S-상에 있는 CFU-S 는 고방사능에 의하여 죽으므로, 비장에서 콜로니는 형성할 수 없다. 그러므로,3H-티미딘이 없이 인큐베이션된 세포 샘플을 주입함으로써 형성된 CFU-S 의 수와3H-티미딘과 함께 인큐베이션된 동일한 세포의 수의 차이는 원래의 샘플중의 증식하고 있는 CFU-S 의 백분율을 나타낸다.
억제제 시험은 자극되지 않은 동물로부터 얻은 골수 간세포 집단으로는 수행할 수 없는데, 왜냐하면 억제제는 단지 순환하고 있는 CFU-S 에만 영향을 미치기 때문이며, 순환하고 있는 CFU-S 는 정상적인 마우스의 골수의 총 CFU-S 집단중 7 내지 10 % 정도로 아주 낮은 비율을 차지한다.
CFU-S 증식을 자극하기 위하여, 페닐히드라진 (PHZ), 또는 아치명적인 (sublithal) 방사선조사를 사용하였다 [Lord, 1976].
본 발명자들은 CFU-S 순환 [Byronet al., Nature 228:1204, 1970]에 대한 자극 효과를 토대로 하여 테스토스테론-프로피오네이트 (TSP)를 사용하는 방법을 개발하였고, 그것은 시험과정을 단순화시켰고 어떠한 부작용도 유발하지 않았다. TSP 는 주사후 20 내지 24 시간이내에 CFU-S 증식의 자극을 유도하였고, 이 효과는 최소한 7 일동안 볼 수 있었다.
억제제를 정제하는 동안 분획들의 스크리닝에 사용된 과정은 다음과 같았다:
마우스: 모든 시험과정을 통해서 BDF1또는 CBF1마우스 스트레인을 사용하였다.
S-상으로 CFU-S 의 30 내지 35 % 를 유도하기 위하여 마우스당 0.2 ㎖ 의 복강내 주사에 의하여 공여 마우스를 10 mg/100 g 용량의 TSP 로 처리하였다.
24 시간 후에 대퇴골로부터 골수를 취하여 세포 현탁액 제제를 만들었다. 그런 다음 ㎖ 당 5 내지 10 × 106세포를 상이한 대조 및 시험 분획과 함께 3.5 시간동안 37 ℃ 에서 수조에서 인큐베이션하였다. 이때, 각 군에 대하여 2 개씩의 튜브를 준비하였고, 그중 하나는 고온 (방사능)에 다른 하나는 저온 (비-방사능)에서 인큐베이션하였다.
3.5 시간이 지난후,3H-티미딘 (1 mCi/㎖, 비활성 18-25 Ci/mmole)을 각각의 고온 튜브에 세포 현탁액 1 ㎖ 당 200 ㎕ 의 부피로 첨가하였다; 저온 튜브에는 아무것도 첨가하지 않았다. 추가로 30 분동안 37 ℃ 에서 인큐베이션을 계속한다.
30 분동안 인큐베이션한 다음, 죽이는 반응은 400 ㎍/㎖ 의 비방사성 티미딘을 함유하고 있는 10 ㎖ 의 저온 (4 ℃) 배지를 첨가함으로써 종결시켰다. 세포를 집중적으로 세척하였다 (3 회).
세포를 재현탁시키고 주사에 바람직한 농도, 통상 0.3 내지 0.5 ㎖ 중에 마우스당 2 내지 4 × 104세포로 희석하였다.
각 군당 8 내지 10 마리씩의 수용체 마우스를 6 시간 이내로 방사선을 조사한 후, 주사하였다.
제 9 일 내지 12 일째에 수용체 마우스들의 비장을 취하여 텔레스니츠키 용액 (Tellesnitsky's solution)안에 고정시켰다; 콜로니를 육안으로 기록하였다. S-상에 있는 세포들의 백분율을 다음 식을 사용하여 계산하였다.
% S = (a-b)/a × (100 %)
상기 식에서, a 는3H-티미딘이 없을 때의 CFU-S 의 수
상기 식에서, b 는3H-티미딘이 있을 때의 CFU-S 의 수
하기 표 1 에 제시한 INPROL 의 시험 데이터는 INPROL 로 처리한 후의 순환하고 있는 간세포가3H-티미딘의 작용에 대하여 내성적이 됨을 입증한다. 본 실시예및 이하의 모든 실시예에 대하여, 용어 "INPROL" 은 돼지의 골수로부터 정제된 단백질을 말한다. 동일한 보호가 S-상에 특이적인 세포독성 약물인 시토신 아라비노시드 및 히드록시우레아에 대해서도 나타난다 (데이터는 제시하지 않음). 만약 처리된 간세포가 다음 단계로 비-방사성 티미딘을 함유하고 있는 저온 배지로 세척된다면, 살아있는 간세포는 마우스 비장내에서 증식하여 정상적으로 콜로니를 형성한다.
골수 세포와 함께 4시간 동안 인큐베이션하는 중에 CFU-S 증식에 미치는 pINPROL의 억제 활성
군 -3H-TdR +3H-TdR 3H-TdR에 의해 죽은 CFU-S 퍼센트
인큐베이션하지 않음 22.2±2.0* 13.7±2.4* 38.3±1.7
배지와 함께 4 시간동안 인큐베이션함 18.7±3.0* 11.4±1.3* 43.1±1.4
pINPROL과 함께 4 시간동안 인큐베이션함 21.2±2.3* 20.7±2.6* 2.1±0.08
*CFU-S /2 × 104세포
실시예 2: 시험관내 간세포 증식 억제 검정
다음의 시험 시스템을 사용하여 [Lordet al., inThe Inhibitors of Hematopoiesispp.227-239, 1987] INPROL 의 직접적인 효과를 나타냈다. 다중계통 인자 (IL-3) 에 의존적인 간세포 라인인 FDCP 혼합 A4 (A4)를, 콜로니를 자극하는 IL-3 의 공급원으로서 20 % 의 말 혈청과 10 % 의 WEHI-3-조절된 배지가 첨가된 IMDM 배지에서 유지시켰다.
증식을 측정하기 위하여 삼중수소 처리된 티미딘 통합 검정을 사용하였다: A4 세포 (20 % 의 말 혈청과 50 % 의 WEHI-3 CM 이 첨가된 100 ㎕ 의 배지중의 5× 104)를 37 ℃ 에서 5 % 의 CO2중에서 16 시간동안 인큐베이션하였다.
출발시점에 pINPROL 또는 미정제 BME (분획 IV) 를 첨가하였다. 그런 다음 삼중수소 처리된 티미딘 ((3H-Tdr) 740 GBq/mmole 에서 50 ㎕ 중에 3.7 KBq)을 각 군에 첨가하고 추가로 3 시간동안 인큐베이션하였다. 증식 수준을 세포를 수득함으로써 측정하였고 % 억제를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
% 억제 = (INPROL 이 없을 때의 cpm - INPROL 이 있을 때의 cpm)/ (INPROL 이 없을 때의 cpm) × (100%)
정상적인 골수 추출물 또는 pINPROL 의 누진량의 존재시에 성장된 FDCP혼합-A4 세포에 의한 삼중수소 처리된 티미딘 (3H-Tdr)의 통합을 도 6 에 도시한다. 도면으로부터 pINPROL 의 정제된 조성물이 출발 물질보다 최소한 100 배는 더 활성적임을 알 수 있다. 노출 시간 (16 시간)은 효과적인 억제에 중요한 인자이고 A4 셀라인의 간세포에 대한 pINPROL 의 직접적인 효과의 증거임을 보여준다.
실시예 3: 생체내 1 회 용량으로 주입된 INPROL 에 의한 CFU-S 증식의 억제 및 유효 기간
생체내 주입된 INPROL 의 효과에 대한 연구는 INPROL 이 CFU-S 가 사이클안으로 보충되는 것을 효과적으로 차단할 수 있고, 그로써 CFU-S 를 추가의 처리로 인한 세포독성 효과로부터 보호한다는 것을 나타내며, 이것은 INPROL 이 임상적으로 사용될 수 있는 잠재력이 있음을 나타낸다.
실험 프로토콜에는 두 개의 목표가 있었다: 생체내로 주입되었을 때 CFU-S 에 미치는 INPROL 의 효과를 조사하는 것과 간세포 순환과 관련하여 INPROL 활성의 유효 기간을 규정하는 것이었다.
CFU-S 증식을 자극하기 위하여, 테스토스테론-프로피오네이트의 주입을 상기 실시예 1 에서 언급된 효과를 토대로 하여 사용하였다.
마우스의 BDF1 에 제 0 일에 TSP (10 mg/100 g) 를 주입하였고; 24 시간이 지난후 각 실험군 (군 당 4 마리)의 마우스에게 마우스당 0 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍ 및 15 ㎍ 의 1 회 용량으로 pINPROL 을 한 번씩 i.p. 주사하였다.
pINPROL 을 주사하고 24 시간이 지난후, 마우스들을 희생시키고 순환하는 CFU-S 의 백분율을 실시예 1 에서 설명된 검정법에 의하여 측정하였다. TSP 주사로 처리되지 않은 마우스에서 7 % 인 것에 비교하여 약 50 % 의 CFU-S 가 순환계에 들어갔다. 2 ㎍/마우스 정도로 낮은 용량으로 사용했을 때에도 pINPROL 은 TSP 에 의해 유도된 증식이 정상 수준으로까지 낮아지는 것을 억제할 수 있었다.
유효 기간 평가를 위하여, 마우스의 한 군 (군 당 21 마리)에는 TSP 만을 주사하였고, 다른 군에는 TSP 와 pINPROL 을 주사하였다 (TSP 주사후 24 시간후에 pINPROL 을 주사함). CFU-S 순환을 각 군으로부터 3 마리씩을 취하여 1 주 동안에 매 24 시간마다 측정하였고, 상술된 방법 (실시예 1 참조)에 의하여 그 마우스들의 골수중의 CFU-S 사이클의 상태를 측정하였다. 도 7 에 나타낸 데이터는 TSP 의 유효 기간이 최소한 7 일인 반면, INPROL 의 1 회 주사로 CFU-S 를 정지 상태로 되돌릴 수 있었고 CFU-S 를 48 내지 72 시간이하의 시간동안 순환하지 못하도록 유지시켰음을 보여준다. 암 및 백혈병 화학요법에 사용된 대부분의 화학요법제가 생체내에서 상대적으로 짧은 반감기 - 통상 24 시간 이하 - 를 가지고 있기 때문에, 얻어진 데이터에 따른 INPROL 효과는 시토신 아라비노시드 또는 히드록시우레아와 같은 화학요법제가 생체내에서 활성인 유효 기간보다 더 긴 시간동안 유지된다. 보다 중요한 것은, 첫 번째 치료 (간세포를 손상시키지 않음)와 두 번째 치료 (CFU-S 에 손상을 입힘) 사이의 시간 간격이 더 긴 (24 시간 이상 및 96 시간 미만) 화학요법 및 방사선 치료에 대하여, 화학요법제 또는 방사선이 두 번 적용되는 시기 사이에 INPROL 을 단 1 회 주사하는 것으로 충분하다는 것이다. 여러번 반복될 수 있는 사이클의 세포독성 치료 또는 방사선 치료에 대하여 INPROL 의 유효 기간을 토대로 한 동일한 스트래티지가 적용될 수 있다.
실시예 4: 5-FU 로 처리된 후 신속하게 순환하도록 자극된 대부분의 원시 조혈 간세포는 두 번째 5-FU 노출에 대하여 INPROL 에 의하여 보호된다
약물 5-플루오로우라실 (5-FU)은 골수성 및 림프성 분실 (compartment)의 세포수를 극적으로 감소시킨다. 그것은 보통 세포 사이클의 S-상중에 또는 그 전에 누클레오티드 유사체가 DNA 안으로 통합되면 세포의 죽음이 유도되기 때문에, 세포-사이클에 특이적이고, 빠르게 증식하는 세포를 표적으로 하는 것으로 생각되어진다. 마우스의 골수의 장기간 생존 및 면역성 조혈 재구성은 5-FU 의 1 회 투여에 의해 영향을 받지 않는다; 그러나, 다능성 조혈 간세포 (PHSC)는 초기 투여후 약 3 내지 5 일이라는 짧은 기간동안의 두 번째 투여에는 영향을 받기 쉬운 것으로 증명되었다 [Harrisonet al., Blood 78:1237-1240, 1991]. PHSC 는 효과적이어야 할5-FU 의 1회 투여에 대해서는 정상적으로 너무 느리게 순환하고, 초기 5-FU 처리로부터 유발되는 자극에 의해 신속하게 순환하도록 자극된다. 본 발명자들은 PHSC 가 INPROL 에 의하여 느린 순환 상태로 복귀될 수 있고, 따라서 두 번째 5-FU 처리로부터 보호될 수 있음을 제시하였다.
이들 실험에 사용한 마우스들은 BDF1 수컷 마우스들이었다. 5-FU (Sigma)의 원액을 생리식염수중에 10 ㎍/㎖ 농도로 제조하였다. 각각의 처리된 마우스에게 체중 10 g 당 2 mg 의 5-FU 를 꼬리 정맥을 통하여 실험의 제 0 일째에 투여하였다; 24 시간이 지난후, 마우스들에게 pINPROL (체중 100 g 당 10 ㎍)을 복강내 주사하였고, 3 일째에 두 번째로 5-FU 를 주사하였다. 생존 연구는 각각 30 마리씩의 실험군 (pINPROL 로 처리됨)과 대조군에서 마우스들의 죽음을 모니터함으로써 수행하였다. 생존 곡선은 도 8 에 도시한다.
실시예 5: 골수 세포에서 INPROL 과 함께 및 MIP-1α 와 함께 예비인큐베이션할 때의 효과의 비교
본 실험의 목적은 시험관내에서 각각 pINPROL 및 MIP-1α 와 함께 예비인큐베이션했을 때 마우스의 골수세포에 미치는 억제 효과를 비교하는 것이었다.
다음의 과정을 사용하였다:
생체내: 생후 6 내지 15 주된 BDF1 마우스들에게 200 mg/kg 체중의 5FU 를 복강내 주사하고, 48 시간후에 대퇴골로부터 골수를 채취하였다.
시험관내: 단일 세포로 모아진 현탁액을 계수하여 5 × 106개의 세포를pINPROL 또는 MIP-1α 와 함께 또는 그것들 없이, 5 % 의 말 혈청, L-글루타민이 첨가된 IMDM 배지와 함께 총 2 ㎖ 로 하여 37 ℃ 에서 및 5 % CO2중에서 4 시간동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 두 번 세척하고 다시 계수하여 다음의 최종 조건으로 메틸셀룰로오스중에 놓았다:
0.8 % 의 메틸셀룰로오스
25 % 의 말 혈청
20 ng/㎖ 의 재조합 쥐의 IL-3
L-글루타민
5 × 105세포/㎖
IMDM 배지
플레이트를 11 일동안 37 ℃ 에서 및 5 % CO2및 100 % 습도에서 인큐베이션하였다. 50 세포 이상의 콜로니를 계수하였다.
군 콜로니 수 제어율
대조표준 31.0 100 %
pINPROL 21.25 68.5 %
MIP-1α 35.25 114 %
실시예 6: INPROL 은 HPP-CFC 증식을 억제한다
쥐과 동물의 재구성하는 간세포 및 초기 선구체를 평가하기 위한 시험관내 검정은 증식력이 매우 높은 콜로니 (HPP-PFC) 검정이다; 다른 관련된 검정, 예를 들면 CFU-A, CFU-GM, CFU-E 및 CFU-GEMM 은 점진적으로 제한된 선구체 집단을 검출한다 [M.Moore, Blood 177:2122-2128, 1991]. 본 실험은 세포를 pINPROL 로 예비처리하는 것이 세포의 증식을 억제하는 반면, MIP-1α 는 이들 실험 조건하에서 동일한 결과를 나타내지 못한다는 것을 보여준다.
BDF1 마우스들을 5-플루오로우라실 (200 mg/kg i.p.)로 처리한 후, 그들의 골수를 HPP-CFC 수에 대하여 검정하였다. 세포들을 원심분리에 의하여 세척한 후, 106내지 5 × 106/㎖ 의 밀도로 제제 첨가 없이 (대조표준), pINPROL (25 ng/㎖) 또는 MIP-1α (200 ng/㎖)를 첨가한 배지중에서 4 시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후에, 세포를 세척하고 30 % 의 FCS 가 첨가되어 있고 5637 및 WEHI-3B 셀라인으로부터의 조합된 조절된 배지 (각각의 조절된 배지는 7.5 %, Sharp 등 (1991)에 의해 권장된 바와 같음)가 첨가된 아가 (0.3 %)에 놓았다. 플레이팅 농도는 60 mm 접시에 5 × 104세포/㎖ 이었다. 콜로니를 14 일째에 기록하였고 그 결과를 하기에 나타낸다.
군 HPP-CFU 조절율
대조표준 15.5 ± 1.2 100 %
pINPROL 8.3 ± 0.7 53.5 %
MIP-1α 15.8 ± 0.9 101 %
이들 결과에 따르면, MIP-1α 는 단지 예비인큐베이션 기간중에만 존재할 때 대부분의 미성숙 선구체들의 증식을 억제하지 못하였다. pINPROL 은 이들 조건하에서 증식을 효과적으로 억제하였고, 이것은 생물학적 활성면에서 pINPROL 과 MIP-1α 사이에 기본적인 차이가 있음을 나타낸다.
실시예 7: 방사선-유도된 골수 무형성증으로부터의 회복에 미치는 INPROL 치료요법 효과
골수 무형성증은 방사선 암 치료요법의 일차적인 제한 독성이다. 몇몇의 성장 인자들 (예컨대 G-CSF, GM-CSF, 에리트로포이에틴)은 방사선-유도된 골수 무형성증으로부터의 회복을 가속화하는 것으로 증명되었다. 간세포 증식의 억제제를 사용함으로써 보호한다는 개념은 조혈 손상에 대처함에 있어 상이하고 상보적인 접근법이다. 앞서 개발된 (실시예 3, 4) 처리 과정을 따르기 위해서는 마우스들의 치명적인 방사선 노출 모델이 수립되었었다. 당해 기술분야에는 코발트 60 을 9Gy 받은 마우스들이 10 내지 14 일 후부터 죽기 시작했고; 30 일째에는 사망률이 대략 50 % 인 것으로 알려져 있다. 이런 치사량은 3 일간의 간격을 두고 각각 4.5 Gy 씩 계속해서 두 번 나누어 투여함으로써 본 모델에 사용하였다. 예비 데이터는 상기 모델에서의 생존 곡선이 9Gy 를 사용하여 1 회 방사선 노출시켰을 때 알려진 것과 매우 근접하였음을 나타냈다; 더욱이 CFU-S 증식에 대한 시험 결과는 첫 번째 방사선 노출후 24 시간이 지난후, 35 내지 50 % 의 CFU-S 의 증식이 유도되었음을 나타냈다. 그러한 세포들은 두 번째 투여전에 전달된 간세포 억제제에 의하여 보호될 수 있다.
이런 가능성을 조사하기 위하여, 마우스들 (군당 50 마리)에게 제 0 일에 4.5Gy 를 주었다. 24 시간이 지난후, 한 군에는 pINPROL (2 ㎍/마우스 i.p.)을 주었고, 다른 군에는 식염수를 주사하였다. 두 번째의 방사선 (4.5Gy)은 제 3 일에 조사하였다.
도 9 는 pINPROL 의 1 회 투여후에 증가된 생존율을 나타낸다. 모델의 조건은 고형 종양을 특징으로 하는 것들을 포함하여 모든 암을 치료하는 것과 임상적으로 관련이 있다; 그러한 치료는 암에 걸려 있는 환자에게 두 번의 연속되는 방사선 투여 사이에 유효량의 INPROL 을 전달함으로써 이루어질 수 있으며, 그로써 보다 많은 용량의 방사선이 암 치료에 사용되는 것이 가능해진다. 또한 화학요법제의 이러한 양상을 연장하는 것도 가능할 것이다.
실시예 8: 자가 골수 이식을 위한 INPROL 의 용도
골수 이식은 여러 가지 백혈병 (CML, AML, 및 기타)에 대한 유일한 공지의 치유력이 있는 치료법이다. 주입을 위한 자가 BMT 의 생체외 조절은, 백혈병으로 오염되지 않았고 수용체의 조혈 시스템을 재집합할 수 있어서 공격적이고 효과적인 치료요법이 허용되도록 정상 간세포의 잠재적인 자가 공급원을 제공하여야만 한다.
1.AraC 로 정화시키는 동안 정상적인 조혈을 보존시키는 INPROL 효과를 연구하기 위한 장기간 골수 배양물 L1210 백혈병 모델
장기간 골수 배양물 (LTBMC)을 토크소즈 등 [Toksozet al., Blood 55:931-936, 1980] 을 따라 정립하고, 백혈병 셀라인 L1210 을 2 주동안 함께 배양함으로써 LTBMC 에 적응시켰다. 정상 선구체 및 백혈병 선구체의 동시 성장이 이들 조합된 LTBMC/L1210 배양물에서 일어났고, 이것은 백혈병 환자의 골수에서 나타나는 상황과 유사하였다. 정상적인 콜로니 형성 단위 CFU 와 백혈병 CFU 사이의 구별은 그것들을 WEHI-3 (쥐과 동물의 IL-3 생성 셀라인)으로부터의 조절된 배지의 존재 또는 부재시에 아가 콜로니로서 성장시킴으로써 가능하였다. 정상적인 세포는 IL-3의 부재시에 아폽토시스 (apoptosis)가 진행된 반면, 백혈병 세포는 IL-3 의 부재시에 콜로니를 형성할 수 있었다. LTBMC-L1210 조성물로부터의 현탁 세포는 IL-3 이 있을 때 (정상적인 조혈 클론) 대략 150 콜로니를 생성하였고, IL-3 이 없을 때에는 (백혈병 클론) 플레이트된 50,000 세포당 70 콜로니를 생성하였다.
정화 과정은 다음과 같았다: 제 0 일에 모든 현탁 세포와 배지 (10 ㎖/플라스크)를 LTBMC-L1210 을 사용하여 플라스크 밖으로 꺼내고 200 ㎍ 의 시토신 아라비노시드 (AraC)를 함유하고 있는 배지 2 ㎖ 로 교체하였다 [Tsyrlovaet al., inLeukemia: Advances in Biology and Therapyv. 35, 1988]; 20 시간동안 인큐베이션한 후에 플라스크를 세척하고, 2 ㎖ 의 신선한 배지만으로 (대조군) 또는 25 ng/㎖ 의 pINPROL 을 함유하고 있는 배지로 교체한 다음 4 시간동안 인큐베이션하였다. 이 예비인큐베이션 단계후에, 세포를 다시 플라스크 당 100 ㎍ 의 AraC 와 함께 3 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 각 군에는 4 개씩의 플라스크가 포함된다. LTBMC-L1210 배양물을 3 회 세척하고 신선한 LTBC 배지로 교체하였다; 그것을 재생 연구를 위해 앞에서와 같이 3 내지 4 주동안 유지시켰다.
데이터를 도 10 에 나타낸다. AraC 로만 처리된 대조군에서는 세포 성장을 볼 수 없었던 반면, INPROL 로 보호된 플라스크에서는 조혈의 재생이 고착층으로부터의 선구체의 증식으로 인하여 훨씬 더 빠르게 일어났다. 더욱이, 실험군으로부터의 세포는 아가에 플레이트되었을 때 오로지 IL-3 의 존재시에만 성장하여 50,000 세포당 약 100 CFU 를 생성한 반면; 최소한 4 주동안에 백혈병 세포의 성장은 관찰되지 않았다. 그로써, 생체외에서 INPROL 과 조합된 유효량의 AraC 로 처리된 골수는 암성 세포가 제거될 수 있는 한편 간세포는 보호된다. 이 양상은 화학요법 또는 방사선 치료의 다른 형태에도 연장되는 것이 가능할 것이다.
2.골수 재집합 능력 (MRA) 및 30 일동안의 방사선 보호는 시험관 내에서 의 INPROL 처리에 의하여 증가된다.
치명적인 양의 방사선에 노출된 마우스들의 골수를 재집합하는 세포의 능력인 MRA 는, 30 일동안 방사선 보호를 제공하는 능력과 함께 골수억압된 동물을 지킬 수 있는 잠재력에 대한 직접적인 생체내 척도이다 [Visseret al., Blood Cells 14:369-384, 1988].
방사선 연구를 위하여, BDF1 마우스들을 9.5Gy 의 방사선에 노출시키고 테스토스테론으로 자극된 공여체로부터 얻은 골수를 이식함으로써 회복시켰다. 한 수용체군은 배지 (대조표준 - 군 A)와 함께, 그리고 다른 군 (군 B)은 25 ng/㎖ 의 pINPROL 과 함께 4 시간동안 예비인큐베이션한 골수 세포에 의해 회복되었다. 두 군의 세포를 모두 세척하고 마우스 당 30,000 세포를 방사선 노출된 동물들에게 이식하였다. 생존율 데이터를 도 11 에 도시한다. 3 회 실험의 합을 도시하는데, 대조표준을 100 % 로 규정하였다. pINPROL 과의 인큐베이션으로 대조군의 마우스들의 생존율이 36.5 % 에서 제 30 일에는 61.8 % 로까지 증가되었다.
INPROL 과의 예비인큐베이션으로 유도된 MRA 의 증가는 방사선 보호를 개선시키는 메카니즘중 하나일 수 있다. 이 가설을 조사하기 위하여, MRA 를 비써 등 [Visseret al., 상기 인용 참조]에 따라 측정하였다. 간단히 설명하면, 공여체 BDF1 마우스들을 테스토스테론으로 예비처리하고, 그들의 골수를 배지 또는pINPROL 로 4 시간동안 예비인큐베이션한 다음, 방사선에 노출된 동물에 주사하였다. 13 일째 되는 날, 수용체 대퇴골로부터 골수 세포를 취하여 20 % 의 말 혈청 및 10 % 의 WEHI-CM 의 존재하에 3 가지의 상이한 농도 (대퇴골의 0.01, 0.05, 0.1 동등물)의 아가에 플레이트하였다. 7 일째의 콜로니수는 그 때에 수용체의 골수의 콜로니-형성 세포가 공여체의 미성숙 간세포의 선구체인 한 MRA 를 나타냈다.
도 12 에서 알 수 있는 것처럼, INPROL 세포집단과 함께 예비인큐베이션된 MRA 는 대조군 (B)에서보다 더 크다.
실시예 9: 간세포에 미치는 INPROL 의 과다증식 억제 효과는 간세포의 분화 비정상을 변화시킬 수 있다.
CFU-S 의 과다증식은 세포독성 약물 치료 또는 방사선 노출후에 회복하는 중에 볼 수 있을 뿐만 아니라 정상적인 노화의 결과로서도 나타나며, 골수이형성 증후군 (MDS)의 중요한 특징이라 여겨진다. 그것은 적혈구 분화의 우세함과 같은 분화 방해물에 수반되는 한편, 과립구 경로에 따르는 분화는 감소된다.
골수 세포를 4 시간동안 37 ℃ 에서 25 ng/㎖ 의 pINPROL 과 함께 또는 배지와 함께 (대조표준) 인큐베이션하고, 세척한 다음, 20 % 의 말 혈청, 2U/㎖ 의 에리트로포이에틴, 및 10 % 의 WEHI-CM 이 첨가되어 있는 아가에 플레이트하였다. BFU-E 및 GM-CFU 콜로니의 수를 제 7 일에 기록하였다. 하기 표 4 에 나타낸 데이터는 3 회 실험으로부터 요약한 것이다 - 각 군에 대하여 포인트 당 4 마리의 동물을 취하였다; 4 개의 접시를 플레이트하였다.
하기 표 4 로부터 명백한 것처럼, 무상의 어린 동물 (생후 8 내지 12 주된BDF1)로부터 얻은 정상적인 골수 (NBM)를 INPROL 과 함께 인큐베이션하는 것은 상이한 유형의 콜로니의 수 또는 비율을 변화시키지 못하였다. 테스토스테론 프로피오네이트 (TSP)로 처리된 BDF1 공여체들은 앞서 (실시예 1, 3, 4) 볼 수 있었던 것처럼 CFU-S 증식이 동일하게 증가되는 것을 나타냈고, 적혈구 선구체수 (BFU-E 콜로니)가 약간 증가하였으며, GM-CFU 가 감소되었는데, 그것은 INPROL 과 함께 인큐베이션됨으로써 완전히 없어졌다. 또한, 비정상적으로 높은 CFU-S 증식 수준이 세포 사이클의 S-상의 CFU-S 의 10 % 로 복귀되었다. CFU-S 과다증식은 바이러스성 백혈병 유도에 민감한 몇몇 마우스 스트레인들, 예를 들어 Balb/c 마우스 (표 4)의 특징인 것으로 알려져 있고, 더 나이든 동물에서도 관찰될 수 있다 (표 4). TSP 처리된 BDF1 마우스들에서 볼 수 있는 구속된 (committed) 선구체의 동일한 재분포는 Balb/c 에서 및 더 나이든 (23 내지 25 달) BDF1 에서도 관찰되며, 이것들은 공통적으로 비정상적으로 높은 CFU-S 증식 수준을 가지고 있다. CFU-S 의 증식과 분화 둘 다의 보정은 INPROL 과 함께 인큐베이션함으로써 유도하였다. 무엇이 훨씬 더 임상적으로 관련이 있는 지를 연구한 결과, INPROL 의 생체내 주사 (2 ㎍/마우스) 가 CFU-S 의 증식 및 적혈구 (BFU-E) 및 GM-콜로니의 비율 둘 다에 영향을 미치는 것으로 나타났다 (하기 표 4).
구속된 선구체 BFU-E 및 CFU-GM 으로의 CFU-S 분화에 미치는 INPROL 효과
골수의 공여체 pINPROL 3HTdR 에 의해 죽은 % CFU-S BFU-E CFU-GM
어린 BDF1 -+ 12.0 ± 0.315.0 ± 1.3 28.33±1.9122.00±3.74 46.22±3.4447.70±3.72
나이든 BDF1 -+ 47.1 ± 1.911.4 ± 0.7 43.75±1.5415.25±1.45 24.0 ±1.3344.0 ±7.63
TSP 에 의해 자극된 BDF1 -+ 53.2 ± 1.67.2 ± 0.4 32.67±2.4412.00±1.83 15.71±2.2835.50±1.4
Balb/C -+ 57.0 ± 1.923.0 ± 2.4 47.60±2.9624.86±2.53 33.57±3.4570.60±4.96
실시예 10: INPROL 의 면역자극 활성
증식하고 있는 CFU-S 를 높은 비율로 함유하고 있는 골수 세포를 INPROL 과 함께 인큐베이션하는 것은 CFU-S 의 순환 뿐만 아니라, 과립구성 및 림프성 선구체들의 입장에서 우세하게 적혈구 분화를 교체하는 그것들의 분화를 변화시키는 것으로 관찰되었다. INPROL 의 이러한 성질은 세포독성 화학요법 또는 방사선요법의 면역억압 부작용과, 뿐만 아니라 과다증식성 간세포 질환 및 노화에 수반하는 면역억압으로 인하여 중요하다.
본 실시예는 위트록과 위트 [Wittlock ＆ Witte, Ann. Rev. Immun. 3:213-235, 1985] 에 따라 수립된 림프양 장기간 배양물 (LLTC)로부터 얻어지는 미성숙 선구체들이 프레-B 선구체로 분화하는 데 미치는 INPROL 의 직접적인 효과를, IL-7 을 함유하고 있는 메틸셀룰로오스중에서의 콜로니 형성을 측정함으로서 나타낸다.
LLTC 를 설명된 바와 같이 수립하고 1 주일에 2 회 신선한 LLTC-배지(Terry Fox Labs., Vancouver, Canada)를 공급하였다. 비고착 세포를 1 주일에 한 번 수득하여 인자가 없도록 세척하여 4 시간동안 25 ng/㎖ 의 pINPROL 과 함께 또는 대조표준을 위해 배지만으로 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에, 세포를 세척하여 30 %의 FCS, 및 10 ng/㎖ 의 IL-7 을 함유하고 있는 메틸셀룰로오스중에 105세포/㎖ 의 농도로 플레이트하였다. 3 주동안의 데이터를 도 13 에 도시한다. 큰 프레-B 콜로니의 수는 대조표준에서는 변하였고, 시간이 지남에 따라 증가하였지만, INPROL 과의 예비인큐베이션은 항상 콜로니의 성장을 대조 수준보다 4 내지 8 배 이상으로 자극하였다. 이것은 면역결핍 상태를 보정하고 원하는 면역 반응을 예컨대 예방접종으로까지 증가시키는데 유용한 INPROL 의 면역자극 성질을 증명해준다.
실시예 11: INPROL 은 간세포 - CML 에 걸린 환자의 장기간 배양 초기 세포의 재집합 능력을 개선시킨다
만성 골수성 백혈병 (CML)은 조혈 간세포의 치명적인 악성 질병이다. 만성 상태에 있는 CML을 1 회용 제제의 화학요법, 조합 화학요법, 비장절제술, 또는 비장의 방사선 노출로 치료하며 임상 신호 및 증후를 조절할 수 있지만, 유의할만하게 생존을 연장시키지는 못한다. CML 이 만성 상태로부터 가속화된 단계로까지 진행됨에 따라, 표준 치료요법은 더 이상 효과적이지 못하다. 현재에는 골수 이식 (BMT)만이 CML 에 대한 유일한 공지의 치유력이 있는 치료요법이다. 관련성이 없는 공여체의 BMT 를 이용하여 치료하는 것은 조직적합성 문제 때문에 어렵다. 그렇지 않다면 자격이 있는 CML 환자들의 40 % 미만이 적절하게 조화되는 관련된 공여체가 될 것이다; 그러므로 자가 이식이 바람직하다. 장기간 배양물 (LTC)중에서 성장하는 Ph-양성 환자들로부터 얻어지는 비-백혈병성 (Ph-음성) 골수성 선구체들을 선택하는 능력과 함께 주입시키기 위한 자가 BMT 의 생체외 조절화는 점진적이고 효과적인 CML 의 치료요법을 가능하게 하기 위한 정상적인 간세포의 자가 공급원의 가능성을 시사한다.
BMT 와 관련하여, 조혈 간세포는 연장된 기간동안 성숙한 혈액 세포를 생성하는 능력을 가지고 있는 것으로서 규정될 수 있다. 본 발명자들은 시. 입스와 에이. 입스 (C. Eaves ＆ A. Eaves)에 의해 개발된 사람 LTC 시스템을, 두가지 목적, 즉 간세포 수를 정량하고 간세포를 치료 용도로 조작하기 위한 수단으로서 사용하였다. 이것은 세포를 사전에 수립되어 있는, 방사선에 노출되어 있는 사람 골수 고착층위에 심고 (seeding); 그런 다음 이 배양을 5 주동안 계속하는 것을 포함한다. 이 시기의 끝에서 수득된 배양물의 총 클론-생성성 세포 함량 (고착성 + 비고착성)이 배양의 종점이다. 이들 조건하에서의 클론 생성성 세포 생산은 초기에 첨가된 선구체 (장기간 배양 초기 세포 (LTC-IC))의 수와 선형으로 관련이 있다; 개별적인 사람 LTC-IC 로부터의 평균 생산은 LTC-IC 당 4 개의 클론 생성성 선구체이다. 이미 앞서 CML 에 걸려 있는 환자로부터 취한 골수가 유사한 조건하에 놓이게 될 때, 백혈병성 (Ph-양성) 클론 생성성 세포가 급속하게 감소한다는 것이 밝혀져 있다. 남아있는 정상적인 LTC-IC 를 사용함으로써, CML 에 걸려 있는 환자들에서 배양된 자가이식편의 이식에 의해 지지된 집중적인 치료요법으로부터 이익을 보는 것같은 환자들을 선택하는 것이 가능하다 [Phillipset al., Bone Marrow Transplantation 8:477-487, 1991].
CML 에 걸려 있는 환자의 말초혈로부터 수립된 골수 이식 세포들중에서 클론 생성성 세포 (LTC-IC)의 수에 미치는 INPROL 의 효과를 조사하기 위하여 다음의 과정을 사용하였다.
배양은 방사선 노출전 기질 (stroma) 상에서 장기간 배양으로서 시작하였다. 건강한 공여체의 말초혈을 대조표준으로서 사용하였다. CML 에 걸린 환자의 말초혈 세포를 pINPROL (25 ng/㎖) 의 첨가없이 또는 첨가하여 4 시간동안 예비인큐베이션한 후, 세척하고 LTC-IC 시스템에 5 주동안 놓아두어 LTC-IC 의 대조 수를 측정하였다. 실험을 위하여, 다른 대응하는 배양물을 10 일동안 수립하였다. 10 일동안 성장한 배양물로부터 얻어지는 고착 및 비고착 세포의 혼합물을 pINPROL 의 첨가없이 또는 첨가하여 예비인큐베이션한 다음 사전에 수립하여 놓은 공급체 (feeder) 위에 추가로 8 주동안 놓아 두었다. 각 실험 배양물로부터 얻어지는 LTC-IC 의 수를, 고착 세포 및 비고착 세포를 둘 다 적절한 성장 인자들 (Terry Fox Laboratories, Vancouver, Canada)이 첨가되어 있는 메틸셀룰로오스에 놓고 그 결과의 총 콜로니 형성 세포를 계수함으로써 평가하였다. 이 과정을 사용하여 얻어진 LTC-IC 값을 다음 식을 사용하여 총 클론 생성성 세포 (CFC) 함량의 평가로부터 유도하였다:
#LTC-IC = #CFC/4
도 14 에 나타낸 데이터는 건강한 공여체의 골수로부터 시작한 배양의 처음 10 일동안에는 LTC-IC 에 전혀 손실이 없었고, 생산되는 LTC-IC 의 수의 대략 30 % 가 배양 5 주후에도 여전히 존재하였음을 보여준다. CML 환자의 LTC-IC 의 수는 10 일의 배양 기간중에 약 8 % 로 극적으로 감소하였고, 추가의 인큐베이션 기간중에 회복되지 않은 반면, INPROL 과 함께 예비인큐베이션한 것은 LTC-IC 수준을 초기수의 30 % 까지 증가시켰고 그 상태가 8 주동안 지속되었다.
이들 예비 데이터에 의해 예견되는 INPROL 의 임상적으로 관련된 적용분야로는 새로운 또는 배양된 골수 이식편의 정상적인 간세포 함량을 선택적으로 개선시키기 위한 스트래티지에서의 용도, 잔류하는 정상적인 간세포의 생체 내에서의 보충을 증강시키기 위한 스트래티지에서의 용도, 또한 환자에게로의 추가의 이식을 위하여 사람 골수 간세포안으로 새로운 유전 물질을 전달하기 위한 프로토콜에서의 용도가 있다.
실시예 12A: 골수 제제로부터 간세포 증식의 면역활성 억제제를 단리하는 방법
돼지의 늑골로부터 골수를 단리하였다. 돼지의 시체로부터 늑골을 분리하고 근육 섬유 및 지방을 제거한 후, 여러 조각으로 자른 다음 바이오피즈프라이버 (Biophyzpribor)에 의해 조작되는 유압 (hydropress)에 의해 골수를 추출하였다. 골수 세포를 원심분리기 K-70 으로 2,000 rpm 에서 20 분동안 원심분리함으로써 분리하였다. 그런 다음 추출물 상층액에 대하여 계속해서 아미콘 USA 막 XM-100, PM30, PM-50 을 통하여 한외여과하였다. 전기영동에 의한 분석에 따르면, 생성물의 주요 성분은 알부민이다 (도 1 참조).
생물학적 정제
골수 추출물 및 분획들의 단백질 성분들을 정제의 모든 단계에서 0.1 % 의 소디움 도데실 술페이트를 함유하고 있는 10 % 폴리아크릴아미드 중에서 겔 전기영동함으로써 분석하였다. 7 % 까지의 소디움 도데실 술페이트와 0.5 내지 1 % 까지의 메르캅토에탄올을 샘플에 첨가하여 그것을 5 분동안 70 ℃ 에서 인큐베이션 한후에 겔위에 로딩하였다.
전기영동을 겔의 20Y cm 에서 5 시간동안 수행하였다. 그런 다음 겔을 5:5:1 의 에탄올:물:아세트산의 혼합물중에서 0.25 % 의 쿠마찌 CBBC250 으로 1 시간동안 염색하고, 7 % 의 아세트산을 여러 번 교체하면서 세척하였다. 생성물의 활성을 조혈 간세포 (CFU-S)의 증식의 억제 방법에 의하여 평가하였다. 그 방법을 아래에 상세하게 설명한다.
단계 1.암모늄 설페이트를 사용한 재침전에 의한 정제
하기 표 5 의 결과를 토대로 선택한 포화도 40 내지 80 % 의 암모늄 설페이트를 25 % 로 사용한 재침전에 의하여 활성을 정제하였다.
포화도 (%) 0 - 40 40 - 60 60 - 80 80 - 100
활성 (%) 37.2-35.4= 1.8 % 37.2-1.8= 35.4 % 37.2-12.8= 24.4 % 37.2-26.1= 11.1 %
정제의 각 단계후의 시험에 사용한 제제의 양은 정제 수준에 따라 결정하였고, 초기 생성물의 2 × 10-2mg 의 양에 동등하였다. 활성은 다음 식에 의하여 측정하였다:
% 변화 = % Sa - % Sb
상기 식에서, % Sa 는 대조표준의 % S 이고,
% Sb 는 시험 분획과 함께 인큐베이션한 후의 % S 이다.
각각의 활성 시험 전 및 각각의 다음 정제 단계전에 암모늄 설페이트의 농도를 20 배 낮추기 위하여 분획을 탈염시켰다.
단계 2. 단계 1 로부터 얻은 불순한 억제제를 탈염후 적용하고 이온 교환 크로마토그래피 - 본 실시예에서는 DEAE 23 셀룰로오스 - 를 사용하여 분획화한 후, 아세트산 나트륨 완충액 (pH 6.0)의 구배로 용출한다.
억제제의 활성 분획은 3 내지 5 mM 사이에서 용출된다.
칼럼의 부피는 1 ㎖ 이었고 용출 속도는 4 ㎖/시간이었다. 검출은 230 및 280 nm 에서 크로마토그래프 밀리크롬에 의하여 수행하였다. 가장 높은 활성을 나타낸 분획 1 (도 2 참조)을 단리하여 5 mM 의 아세트산 나트륨 완충액중에서 용출하였다 (하기 표 6 참조).
분획 1 2 3 4 5
활성 46.3-0= 46.3 % 46.3-14.1= 32.2 % 46.3-42.1= 4.2 % 46.3-19.6= 26.7 % 46.3-45.1= 1.2 %
전기영동 데이터는 주요 단백질 오염물 - 알부민 (도 3 참조)이 추가의 4 배 정제로 유도하는 이 분획으로부터 제거되었음을 나타낸다.
단계 3. 단계 2 로부터 부분적으로 정제된 억제제를 G-75 세파덱스 칼럼에 적용한다.
칼럼의 부피는 20 ㎖ (20 × 1)이었고, 용출 속도는 2 ml/시간이었다. 용출 완충액은 50 mM 의 NaCl, 10 mM 의 트리스-HCl, pH 7.5 였다. 검출은 230 및 280 nm 에서 크로마토그래프 밀리크롬상에서 수행하였다. 가장 높은 활성을 나타내는 분획 5 를 단리하였다.
분획 1 2 3 4 5
활성 42.2-19.1= 23.1 % 42.2-35.2= 7.0 % 42.2-21.5= 20.7 % 42.2-38.8= 3.4 % 42.2-0= 42.2 %
단계 4. Pro-REC 칼럼을 사용하여 역상 크로마토그래피 (Pharmacia FPLC System)를 울트라스페라 (Ultrasfera) 매트릭스상에서 수행한다. 단백질은 아세토니트릴 구배중에 0.1 % 의 트리플루오르아세트산을 사용하여 용출시킨다.
분자량이 16 내지 17 kD 인 생성물의 균질성은 아크릴아미드/소디움 도데실 설페이트 겔을 분석한 결과에서 알 수 있는 바와 같이 90 % 에 가깝다 (도 6 참조). 결과는 도 4 에 도시한다. 활성은 분획 5 위에서 측정된다. 생성물의 최종 수율은 5 % 이다. 그 결과로서, 정제 단계후에 분자량이 16 kD 인 단백질의 총량은 초기 생성물의 650 ng/㎖이다. 정제 과정중에 생성물을 70 ℃ 에서 수분동안 가열 인큐베이션하였지만 생물학적 활성이 손실되지 않은 것으로 검출되었다.
실시예 12B: 보다 많은 양으로 INPROL 을 단리하기 위한 대체 방법
초기 단리
새로운 돼지 시체로부터 얻은 늑골에서 근섬유 및 지방을 제거한 후, 여러 조각으로 잘라서 인산염으로 완충된 식염수에 1:1 비율 (중량/부피)로 담가둔다. 얻어진 혼합물을 유압에 의해 눌러서 고형 골 물질로부터 골수를 분리한다.
골수 세포의 현탁액을 수집하고 치즈-클로쓰의 4 개 층을 통과시켜 고체 입자가 없도록 여과한다. 여과물을 56 ℃ 에서 40 분동안 인큐베이션한 다음, 얼음-조에서 4 ℃ 로 냉각시킨다. 그 결과의 침전물을 10,000 g 에서 30 분동안 4 ℃ 에서 원심분리함으로써 제거한 후 버린다.
정화된 상층액을 30 분에 걸쳐서 1 부피 % 의 농축 염산을 함유하고 있는 10 부피의 교반된 빙-냉 아세톤에 적가한다. 그 결과의 혼합물을 4 ℃ 에서 16 시간동안 유지시켜서 침전이 완전하게 형성되도록 한다. 그런 다음 침전물을 20,000 g 에서 30 분동안 4 ℃ 에서 원심분리함으로써 펠릿화한다. 이 펠릿을 저온 아세톤으로 세척한 후, 건조시킨다.
HPLC 정제
상기 펠릿을 5 % 의 아세토니트릴 (MeCN)과 0.1 % 의 트리플루오로아세트산 (TFA)을 함유하고 있는 HPLC 용출 완충액 A 에 최종 단백질 농도가 8 내지 10 mg/㎖ 이 되도록 용해시킨다. 이 용액 (0.5 내지 0.6 ml)을 폴리실 (Polisil) ODS-300 (10 mcm) 으로 충전되어 있고 동일한 완충액 A 로 평형화되어 있는 250 × 4.6 mm HPLC 칼럼에 로딩한다.
용출은 완충액 A 중의 완충액 B (90 % 의 MeCN, 0.1 % 의 TFA)의 구배를 사용하여 다음 프로그램에 따라 1 ml/분의 유속에서 수행한다:
시간(분) B의 %
0 0
4 0
5 25
25 90
재-평형화전에 칼럼을 세척하기 위하여 100 % 의 B 로 5 분동안 용출시키는 추가의 단계를 사용한다. 그런 다음 칼럼을 초기 상태로 되돌리기 위하여, 다시 평형화시키고, 단벡질 용액의 다음 부분을 로딩할 수 있다. 전형적인 크로마토그램을 도 5 에 도시한다.
분리중에 칼럼 용출액을 280 nm 에서 모니터하여 단백질 피크를 검출한다. 단백질 물질을 함유하고 있는 분획을 모으고, 분리된 피크를 모아서 30 ℃ 에서 건고상태로 회전 증발시킨다. 얻어진 잔류물을 증류수에 녹여서 생체내 활성 시험에 의하여 및 SDS-PAGE (14 % 의 겔, 환원 조건)에 의하여 검정한다. 활성 물질을 함유하고 있는 피크는 완충액 B 의 70 내지 80 % 사이에서 용출되고, SDS-PAGE 에 의하여 평가되는 바, 16 kD 의 주요 단백질과 더 빠르게 이동하는 미량의 단백질을 함유하고 있다.
두 번째의 주요 HPLC 피크만을 수집함으로써 얻어진 물질의 분석은 도 15 에 도시한다 (a 및 c). 두 개의 피크를 모두 함유하고 있는 물질 (예컨대 도 5)을 본원에서는 pINPROL 제제 1 로 언급할 것이고, 단지 두 번째 피크만으로 이루어진 물질은 pINPROL 제제 2 로서 언급할 것이다. 이 활성의 정제된 pINPROL 제제 2 500 ㎍ 을 C4 역상 칼럼 (Vydac) 위에 로딩하고 0.1 % 의 트리플루오로아세트산중의 59.5 % 의 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 용출하였다. 물질은 53 % 의 아세토니트릴에서 단일 피크로서 용출되었다 (도 15a). 그러나, 250 ㎍ 의 MIP-1α (R ＆ D Systems) 를 동일한 조건하에서 달리게 하였을 때에는, 43.9 % 의 아세토니트릴에서 용출하였다 (도 15b - 14 % 의 아세토니트릴 전에 나타나는 앞의 피크들은 인공적인 것으로 검출기안의 공기 거품으로 인한 것임을 주의해야 한다). 그로써, 자연적으로 발생하는 INPROL 은 이들 조건하에서는 MIP-1 α 보다 실질적으로 더 소수성이다. TGFβ 는 이들 조건하에서 pINPROL 에 대해서 관찰된 것보다 더 낮은 농도에서 용출되는 것으로 알려져 있다 [Miyazonoet al., J. Biol. Chem.263:6407-6415, 1988].
용출된 pINPROL 물질의 겔은 도 15c 에 도시한다. 레인 1 은 미정제 물질을 나타내고, 레인 2 는 분자량 마아커를 나타내며, 레인 3 은 정제된 물질을 나타낸다. 겔상에는 두 개의 주요 밴드가 있는데, 하나는 대략 14 kD 에 있고 다른 하나는 대략 35 kD 에 있다. 35 kD 밴드가 14 kD 밴드의 다량체 형태인 것으로 여겨진다.
실시예 13A: 활성 INPROL 제제는 헤모글로빈 베타 사슬을 함유한다.
pINPROL 을 도 5 에서 도시한 바와 같이 제조하였다 (즉 pINPROL 제제 1 (실시예 12B)). 물질을 SDS-PAGE 상에서 달리게 하고 표준 기법을 사용하여 니트로셀룰로오스에 옮겼다. 물질에 대해 120A 온라인 PTH-AA 분석기가 구비되어 있는 ABI 477A 단백질 서열기를 사용하여 표준 기법을 사용하여 N-말단 서열을 분석하였다. 다음의 N- 말단 서열을 얻었다:
VHLSAEEKEAVLGLWGKVNVDEV....
단백질 데이터베이스에 대한 컴퓨터 연구는 상기 서열이 단백질 헤모글로빈의 베타 사슬의 N-말단 서열과 동일성을 가지고 있음을 나타낸다 (도 16c 참조).
실시예 13B: 활성 INPROL 제제는 헤모글로빈 알파 사슬을 함유한다.
도 15c 에서 볼 수 있는 바와 같이, 도 5 에 도시된 두 번째 주요 피크 (즉 pINPROL 제제 2)는 분자량이 대략 15 K 와 30 K 에 상응하는 두 개의 주요 밴드와 여러 개의 작은 밴드들을 나타냈다. SDS-PAGE 겔을 표준 기법을 사용하여 니트로셀룰로오스에 옮기고 각각의 밴드를 절출시킨 다음 실시예 13A 에서와 같이 각각에대하여 N-말단 서열을 분석하였다. 다음의 N-말단 서열을 15 kD 밴드에 대하여 얻었다:
VLSAADKANVKAAWGKVGGQ....
30 kD 밴드에 대해서는 제한 단백질 가수분해 소화를 수행하였고, 다음의 내부 서열을 얻었다: ** FPHFNLSHGSDQVK....
첫 번째 서열은 돼지의 헤모글로빈 알파 사슬의 N-말단 서열과 동일성을 나타내는 한편, 두 번째 서열은 돼지 헤모글로빈 알파 사슬의 잔기 43-56 과 동일성을 보인다 (사람, 쥐 및 돼지의 알파 및 베타 헤모글로빈 사슬의 서열 비교는 도 16c 참조). 작은 밴드중 일부뿐만 아니라 이들 밴드의 반복된 서열화는 일관되게 알파 글로빈 서열의 부분들을 나타냈다. 그러므로 도 15c 에서 관찰되는 다양한 밴드들은 돼지 헤모글로빈 알파 사슬의 단편들 또는 응집체를 나타낸다.
실시예 13C: 돼지 INPROL 의 추가의 특성확인
pINPROL 을 돼지 헤모글로빈과 추가로 비교하기 위하여, 두 번 결정화된 돼지의 헤모글로빈을 시그마사 (Sigma Chemical Company)로부터 얻어서 도 15 에 대하여 실시예 12B 에서 설명된 바와 같이 역상 HPLC 를 수행하였다. 도 17 에서 알 수 있는 바와 같이, 무상 헤모글로빈의 HPLC 크로마토그램은 pINPROL 제제 1 에 대하여 볼 수 있는 것과 유사하다. 나아가, 직접적인 비교에서, 도 17a 에 도시된 (즉 도 5 의 두 번째 피크로부터 유도된) pINPROL 제제 2는 돼지 헤모글로빈의 두 번째 두 개의 피크의 것과 중복하는 것으로 나타나며 (도 17b), 이 때 주요 피크에 대한 보유 시간은 각각 52.51 과 52.25 분이다. 헴은 이 경우에는 49.153 분에서헤모글로빈의 첫 번째 주요 피크와 함께 이동하는 것을 주지하여야 한다; 그러므로 헴은 pINPROL 제제 1의 성분이지만 제제 2 의 성분은 아니다. 이것은 헴의 존재에 대한 진단적 파장인 575 nm 에서 이 pINPROL 제제의 흡수가 일어나지 않음으로써 확인된다.
돼지 헤모글로빈 알파 및 베타 사슬의 예견되는 분자량은 각각 15038 달톤 및 16034 달톤이다. 도 18 의 SDS-PAGE 크로마토그램에서 알 수 있는 바와 같이, 첫 번째의 두 개의 피크는 더 큰 분자량 사슬로 구성되며, 두 번째의 두 개의 피크는 더 작은 분자량 사슬로 구성된다. 그러므로 첫 번째 두 개의 피크는 헤모글로빈 알파 사슬을 나타내는 것같고, 두 번째의 두 개의 피크는 헤모글로빈 베타 사슬을 나타내는 것같다.
돼지 헤모글로빈의 추가의 분리는 폭이 작은 용출 구배를 사용하여 수행하였다 (도 21). 이들 피크의 N-말단을 분석한 결과 첫 번째 피크가 돼지의 알파 사슬이며 두 번째 피크가 돼지의 베타 사슬임이 증명되었다. 생체 검정 결과 두 개의 단리된 사슬이 생물학적으로 활성임이 확인되었다 (예컨대 실시예 14 및 15).
추가로 pINPROL 제제 2 와 헤모글로빈 베타 사슬을 비교하기 위하여, 2-차원 전기영동을 수행하였다 (도 19). 1-차원으로서 2 % 의 pH 4 내지 8 의 암폴린을 사용하여 9600 볼트-시간동안 유리 튜브에서 등전성 포커싱 (isoelectric focusing)을 수행하였다. 내부 표준으로서 트로포미오신 (Tropomyosin, MW 33 kD, pI 5.2)을 사용하였다; 그것의 위치는 최종 2 차원 겔상에 화살표로 표시한다. 튜브 겔을 완충액중에서 평형화시키고 스택킹 겔의 상부를 12.5 % 의 아크릴아미드슬랩 겔의 상부에 밀봉시켰다. SDS 슬랩 겔 전기영동을 4 시간동안 12.5 mA/겔에서 수행하였다. 겔을 은으로 염색하고 건조시켰다.
2 차원 전기영동 패턴을 비교한 결과 HPLC 정제된 헤모글로빈 베타 사슬과 pINPROL 제제 2 사이에 상이한 단지 하나 또는 두 개의 작은 반점이 나타났다. 항-돼지 헤모글로빈 항체 및 1 차원 또는 2 차원 전기영동을 사용하여 웨스턴 분석한 결과, 제제중에 베타 헤모글로빈의 존재가 확인되었다. 그러므로, 실시예 12B 에 따라 제조된 활성 pINPROL 제제 2 는 실질적으로 돼지의 헤모글로빈 베타 사슬이다.
실시예 14: 헤모글로빈 알파 사슬, 헤모글로빈 베타 사슬 또는 무상의 헤모글로빈은 간세포 억제 활성을 나타낸다.
헤모글로빈이 INPROL 활성을 가지고 있는 지를 확인하기 위하여, 테스토스테론으로 처리된 마우스로부터 얻은 골수를 사용하여 자살 검정을, 실시예 12B 에서 정제된 물질을 사용하여 실시예 1 에서 설명된 방법을 사용하여 수행하였다. 하기 표 8 에서 알 수 있는 바와 같이, 정상적인 마우스 골수 세포의 15 % 가 죽은 반면, 테스토스테론으로 처리된 동물에서는 36 % 가 죽었다. 예상되었던 것과 같이, 이것은 테스토스테론 처리가 순환하는 세포의 백분율을 증가시킴 (그로써 그것들이 죽음에 더 민감하게 된다 - 예컨대 실시예1)을 나타낸다. 아주 대조적으로, pINPROL 또는 40 ng/㎖의 정제된 헤모글로빈 베타 사슬의 어느 하나와 함께 인큐베이션된 테스토스테론-처리 동물로부터 얻은 세포는 순환하는 세포의 백분율이 36 % 에서 각각 0 % 로 및 7 % 로 극적으로 강하되었음을 보여주었다. 더 많은 용량인200 ng 을 사용했을 때에는 두가지 단백질에 대하여 덜 효과적이었다. 양성 대조표준으로서, 이미 특성이 확인되어 있는 간세포 억제제 MIP-1α 는 순환을 13 % 로 감소시켰다.
유사한 검정을 CFU-S 대신에 순환하고 있는 상태의 CFU-MIX 를 사용하여 생체외에서 수행할 수 있었다. 이 검정은 순환-특이적 독성제로서 다량의 삼중수소화된 티미딘 대신에 시토신 아라비노시드 (Ara C, 30 ㎍/ml)를 사용하고 [B.I. Lord inHaematopoiesis - A Practical Approach, N.G. Testa and G. Molineux (Eds.), IRL Press 1993; Pragnellet al., inCulture of Hematopoietic Cells, R.I. Freshney, I.B. Pragnell and M.G. Freshney (Eds.), Wiley Liss 1994], 테스토스테론-처리된 BDF1 마우스 대신에 높은 내인성 순환율을 가지고 있는 마우스 스트레인 (Balb/c)을 사용하는 것을 제외하고는 CFU-S 에 대해 상술된 것과 같이 수행한다. 하기 표 9 에서 알 수 있는 바와 같이, 고도로 정제된 돼지의 베타 사슬, 또는 고도로 정제된 돼지의 알파 사슬은 둘다 이 검정에서 활성이다. 이 검정에서, pINPROL 로 처리된 세포에 대한 순환하는 수준은 때로 음의 수를 나타내는데, 이것은 Ara C 로 처리된 푸울의 콜로니가 처리되지 않은 푸울에서보다 훨씬 더 많음을 가리킨다.
실시예 2 에서 설명된 바와 같이, pINPROL 은 삼중수소처리된 티미딘 흡수 검정에서 쥐과 동물의 간세포 라인인 FDCP-MIX 의 증식을 억제한다. 도 20 은 정제된 헤모글로빈 알파 또는 베타 사슬이 둘다 이 검정에서 활성이며, 2 ng/㎖보다 적은 농도에서 억제를 나타냈음을 입증해준다.
전술한 설명들은 돼지의 헤모글로빈이 INPROL 활성을 억제한다는 증거를 제공한다. 다른 데이터 (예컨대 하기 표 9, 도 20)는 무상의 헤모글로빈 뿐만 아니라 단리된 알파 사슬이 또한 간세포 억제제로서 활성적임을 증명한다. 활성 제제로는 또한 알파와 베타 사슬의 혼합물이 있다 (예컨대 도 5).
단리된 알파 글로빈 사슬 및/또는 단리된 베타 글로빈 사슬이 활성이라는 관찰은, 본원에서 설명된 활성이 무상의 삼-차원 헤모글로빈 구조를 필요로 하지 않는다는 것을 가리킨다. 알파 및 베타 사슬의 단편들도 또한 간세포 억제제 및 자극제로서 활성적이다.
처리 치사율
NBM1 15
TPBM2 36
pINPROL 20 ng/ml40 ng/ml 230
Hbg3200 ng/ml40 ng/ml 257
MIP-1α 200 ng/ml 13
1NBM = 정상 골수
2TPBM = 테스토스테론으로 처리된 마우스로부터 얻은 골수
3Hbg = C4 역상 정제된 돼지의 헤모글로빈 베타 사슬 (2 회 결정화된 돼지의 헤모글로빈으로부터 유도됨)
처리 치사율
대조표준1 43
돼지의 알파 사슬2 -4
돼지의 베타 사슬2 -14
1대조표준 - Balb/c 마우스로부터 얻은 골수
2100 ng/㎖(도 21 에서와 같이 정제됨)
실시예 15: 정제된 INPROL, 정제된 돼지 알파 헤모글로빈 또는 정제된 돼지 베타 헤모글로빈은 생체내에서 활성이다.
정제된 돼지 헤모글로빈 사슬들이 생체내에서도 작용하는 지를 시험하기 위하여, BDF1마우스들에게 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 테스토스테론 프로피오네이트를 주사하였다. 24 시간이 지난후, 마우스들에게 500 ng 의 pINPROL, 돼지의 헤모글로빈 알파 사슬 (도 21 에서와 같이 말초 적혈구로부터 정제됨), 돼지의 베타 사슬 (도 21 에서와 같이 말초 적혈구로부터 정제됨) 또는 동등한 부피의 담체중 어느 하나를 정맥내 투여하였다. 48 시간이 지난후 각 마우스로부터 골수를 수득하여 실시예 14 에서 설명된 바와 같이 CFU-MIX 검정을 수행하였다. 하기 표 10 에서 알 수 있는 바와 같이, pINPROL, 돼지의 알파 사슬 및 돼지의 베타 사슬은 모두 생체내에서 활성이었고, 순환하는 CFU-MIX 의 백분율을 기본값으로까지 감소시켰다.
처리 치사율
대조표준1 45
pINPROL2 5
돼지의 알파 사슬2 5
돼지의 베타 사슬2 -5
기본값3 4
1대조표준 - 테스토스테론으로 처리된 BDF 마우스로부터 얻은 골수
2100 ng/ml
3기본값 - 처리되지 않은 BDF 마우스로부터 얻은 골수
실시예 16: 정제된 사람 헤모글로빈 알파 사슬, 비오티닐화된 사람 헤모글로빈 알파 사슬, 비오티닐화된 사람 헤모글로빈 베타 사슬, 사람 헤모글로빈 감마 사슬 및 사람 헤모글로빈 델타 사슬은 모두 시험관내에서 간세포 억제 활성을 나타낸다.
사람 헤모글로빈을 시그마사 (Sigma Chemical Company)로부터 얻거나 또는 성인 말초혈로부터 또는 탯줄 혈액으로부터 표준 방법에 의하여 단리하였다. 상기에서 돼지의 알파 및 베타 사슬에 대하여 설명된 바와 유사한 방식으로 역상 HPLC 에 의하여 개별적인 사슬을 단리하였다 [B. Masala and L. Manca, Methods in Enzymology vol. 231 pp. 21-44, 1994 참조]. 정제된 알파, 베타, 감마 및 델타 사슬을 얻었다. 비오티닐화된 알파 및 베타 사슬을 얻기 위해서는, 1 mg 의 성인 헤모글로빈을 37 ㎍ 의 NHS LC 비오틴 (Pierce)으로 처리하고 사슬을 상기와 같이 역상 크로마토그래피에 의하여 분리하였다.
하기 표 11, 12 및 13 에서 알 수 있는 바와 같이, 정제된 사람 알파, 비오티닐화된 사람 알파, 비오티닐화된 사람 베타, 사람 감마 및 사람 델타 헤모글로빈사슬들은 모두 CFU-MIX 순환 검정에서 활성을 나타낸다.
처리 치사율
대조표준1 49
사람 알파 사슬2 -1
사람 베타 사슬2 41
사람 감마 사슬2 -63
1대조표준 - Balb/c 마우스로부터 얻은 골수
2100 ng/ml
처리 치사율
대조표준1 47
사람 감마 사슬2 12
사람 델타 사슬2 -4
1대조표준 - Balb/c 마우스로부터 얻은 골수
2100 ng/ml
처리 치사율
대조표준1 68
사람 알파 사슬2 19
비오티닐화된 알파 사슬2 7
사람 베타 사슬2 55
비오티닐화된 베타 사슬2 25
1대조표준 - Balb/c 마우스로부터 얻은 골수
2100 ng/ml
실시예 17: 정제된 사람 알파 사슬, 알파-베타 이량체 또는 헤모글로빈은 생체내에서 활성이다.
정제된 사람 알파 사슬, 알파-베타 이량체 또는 헤모글로빈을 실시예 15 에서 설명된 바와 같이 생체내 검정법으로 시험하였다. 하기 표 14 에서 나타난 바와 같이, 이들 각각은 마우스 당 500 ng 의 농도에서 활성적이었다.
처리 치사율
대조표준1 49
사람 알파 사슬 -22
사람 알파-베타 이량체 14
사람 헤모글로빈 -31
1대조표준 - 테스토스테론으로 처리된 BDF1마우스로부터 얻은 골수
실시예 18: 돼지의 INPROL 은 시험관내에서 사람 단핵 또는 CD34 + 탯줄 혈구에 대하여 활성이다.
돼지 골수로부터 얻은 정제된 INPROL 이 사람 선구체에 대한 순환에 영향을 미치는 능력을 연구하기 위하여 탯줄의 혈액 세포를 얻었다. 피콜상에서 분리후에 얻어진 총 단핵 세포 분획 또는 항-CD34 친화성 칼럼 (CellPro Inc.)상에서 분획화후에 얻어진 CD34+분획중 어느 하나를 사용하였다. 세포를 48 시간동안 시험관내에서 인터류킨 3 (IL-3) 및 간세포 인자 (SCF) (각각 100 ng/ml)의 존재하에 인큐베이션하여 초기 간세포가 확실하게 순환상태에 있도록 하였다. 이 예비인큐베이션 단계후에, 실시예 14 에서 설명된 바와 같이 마우스에 대하여 순환 검정을 수행하되, 단 플레이트하고 18 일 째에 CFU-MIX 대신에 CFU-GEMM 을 계수하였다. 하기 표 15 에서 알 수 있는 바와 같이, 돼지의 INPROL 은 벌크 단핵세포 또는 CD34+분획중 어느 하나에서 CFU-GEMM 의 순환을 억제하였다.
처리 치사율
단핵 세포 대조표준 93
pINPROL1 16
CD34+세포 대조표준 41
pINPROL1 21
1100 ng/ml
실시예 19: 정제된 사람 알파 헤모글로빈은 사람 CFU-GEMM 에 대하여 활성이다.
사람 탯줄의 혈액 단핵세포를 얻어서 IL-3 및 SCF 중에서 인큐베이션하여 실시예 18 에서 설명된 바와 같은 순환 검정에 사용하였다. 하기 표 16 에서 알 수 있는 바와 같이, 골수로부터 정제된 돼지의 INPROL 및 말초혈로부터 정제된 사람 알파 헤모글로빈은 둘 다 이 검정에서 활성이었다.
처리 치사율
대조표준 100
pINPROL -6
사람 알파 사슬1 -23
1100 ng/ml
실시예 20: 사람 알파 헤모글로빈으로부터 및 사람 베타 헤모글로빈 서열로부터 얻어진 펩티드는 활성이다.
활성 펩티드 서열을 확인하기 위하여, 미오글로빈 (이것은 본 검정에서는 비활성이다)의 삼차원 구조를 컴퓨터 모델화 프로그램을 사용하여 성인 헤모글로빈에 존재하는 알파 사슬의 본래의 삼차원 구조위에 포개놓았다. 두 개의 펩티드 (아미노산 43-55 및 64-82 를 나타냄, 이것들은 삼차원 공간에서 구조적으로 상이한 영역들이다)를 CFU-MIX 순환 검정에서 활성을 가지는 것으로서 확인하였다. 본래의 알파 사슬에서 발견된 루프에 보다 가깝게 근접하기 위하여, 43-55 펩티드의 고리형 유도체 (c43-55) (이황화 결합을 이용하여 만듬)를 또한 합성하였고, 그것도 또한 활성인 것으로 나타났다.
이들 펩티드의 서열은 다음과 같다:
43-55 Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
("펩티드 43-55")
c(43-55) Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
(상기에서 두 개의 Cys 잔기는 이황화결합이다) ("고리형 펩티드 43-55")
64-82
Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala -Leu-Ser-Ala
("펩티드 64-82")
두 개의 헤모르핀 서열, 헤모르핀 10 (베타 사슬 서열의 아미노산 32-41) 및 헤모르핀 7 (아미노산 33-40)을 시험하였고 이것들도 활성인 것으로 나타났다.
서열은 다음과 같다:
헤모르핀 10 Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe
헤모르핀 7 Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg
이들 서열의 활성을 시험하기 위하여, CFU-MIX 검정을 실시예 14 에서 설명된 것과 같이 수행하였다. 하기 표 17 내지 19 에서 알 수 있는 바와 같이. 이들 펩티드는 이 검정에서 활성이다.
처리 치사율
대조표준 47
pINPROL1 0
펩티드 (43-55)100 ng/ml10 ng/ml1 ng/ml 21811
1100 ng/ml
처리 치사율
대조표준 43
펩티드 (43-55)1 5
펩티드 (64-82)1 9
헤모르핀 101 1
헤모르핀 71 0
1모든 펩티드를 100 ng/㎖에서 시험하였다.
처리 치사율
대조표준 47
고리형 펩티드 43-551 0
1100 ng/ml에서 시험함
실시예 21: 포름산 절단에 의해 사람 알파 헤모글로빈으로부터 얻어진 펩티드 단편은 활성이다.
사람 알파 헤모글로빈 사슬은 아미노산 위치 94 와 95 (Asp-Pro)사이에 포름산 절단 부위를 가지고 있다. 절단은 정제된 사람 알파 사슬 (실시예 16 에서와 같이 수행함)을 70 % 의 포름산중의 1 mg/㎖의 농도에서 72 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션함으로써 얻었다. 1-94 단편을 절단되지 않은 알파 사슬로부터 정제하고 95-141 단편을 실시예 16 에서와 같이 역상 HPLC 에 의하여 정제하였다; 얻어진 분획들에 SDS-PAGE 를 수행하였다 (실시예 22 에서와 같이). 정제된 1-94 단편의 정체를 전기분무 (electrospray) 이온화 질량 분광측정법에 의하여 확인하였다.
이 단편의 간세포 억제 활성을 평가하기 위하여, CFU-MIX 순환 검정을 실시예 14 에서와 같이 사용한다:
처리 치사율
대조표준1 50
사람 알파2 12
1-94 단편3 0
1Balb/c 마우스 골수
2정제된 비-재조합 사람 알파 헤모글로빈, 실시예 16 에서와 같음 (100 ng/ml)
3정제된 포름산 절단된 단백질, 본 실시예에서와 같음 (100 ng/ml)
실시예 22: 헤모글로빈 알파 사슬, 폴리펩티드 1-141, 폴리펩티드 1-97, 펩티드 43-55 및 펩티드 c(43-55) 의 유비퀴틴 융합물로서 대장균에서의 발현
펩티드 43-55 ("p13") 및 c43-55 ("p15") (실시예 20 에서와 같음)에 대한 유전자를 최적의 대장균 코돈 관용법 [Anderssen and Kurland, Micro. Reviews 54:198-210, 1990]에 따라 상응하는 올리고누클레오티드를 아닐링함으로써 합성하였다. 무상의 사람 알파 헤모글로빈 사슬 ("p141")에 대한 유전자는 사람 골수 cDNA 푸울 (Clontech, Palo Alto, CA)로부터 PCR 에 의해 증폭시키기 위하여 올리고 세트를 디자인함으로써 얻었다. 1-97 단편 ("p1-97")에 대한 유전자는 적절한 하위클로닝후에 p141 유전자를 함유하고 있는 플라스미드를 PCR 에 의해 증폭시킴으로써 얻었다.
상기 유전자들을 유비퀴틴 융합 단백질로서 발현시켰다 (미국 특허 제 5,132,213 호; 5,196,321 호 및 5,391,490 호 및 PCT WO 91/17245 참조). 숙주 스트레인인 대장균 DH5αFIQ (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)를 적절하게 합성된 유전자 (상기)를 함유하고 있는 유비퀴틴 발현 벡터 pDSUb 로 형질전환시켰다. pDSUb 는 사람 유비퀴틴을 발현하는 pDS78/RBSII 의 유도체이다 (도 22a)[Hochuliet al., Biotechnology 6:1321-1325, 1988]. 뢰트셔 등 [Loetscheret al., JBC 266:11213-11220, 1991]은 클로르암페니콜 아세틸 트란스페라제 (CAT) 서열을 호슐리의 플라스미드로부터 절출하고 플라스미드를 재결찰시킴으로써 pDS78/RBSII 를 변형시켰다 (도 22b). 합성 유비퀴틴 유전자는 사람 유비퀴틴을 코드화하는 키나아제 처리된 합성 올리고누클레오티드를 박테리아 발현에 대해 최적화된 코돈 관용법으로 한 쌍씩 아닐링함으로써 제조하였다. 그런 다음 pDSUb 를 조립된 올리고누클레오티드로 구성된 합성 유비퀴틴 유전자를, 유도된 pDS78/RBSII의 클레노우 블런트 단부 처리된Bam H1-BglII소화물안에 삽입시킴으로써 제조하였다. 그 결과 생성된 플라스미드, pDSUb (도 22c) 는 대장균내에서 높은 수준으로 유비퀴틴을 발현하는 것으로 나타났다.
p97 을 함유하고 있는 플라스미드와 p141 을 함유하고 있는 플라스미드를, p97 또는 p141 단백질 및 융합 접합물을 코드화하는AflII-PstI 소화된 PCR 생성물을 직접적인 클로닝 방법으로, 이미AflII 와PstI 으로 소화시켜 놓은 pDSUb 안에 삽입시킴으로써 제조하였다. 유사하게, p13 을 함유하고 있는 플라스미드와 p15 를 함유하고 있는 플라스미드를, 적절한 스티키 단부를 포함하고 있고 펩티드 및 융합 접합물을 코드화하는, 키나아제로 처리되고 아닐링된 올리고누클레오티드를,AflII-PstI 소화된 pDSUb 안에 삽입시킴으로써 제조하였다.
100 ㎍/㎖ 의 암피실린, 5 ㎍/㎖ 의 네오마이신을 사용하여 30 ℃ 에서 2 일후에 나타나는 콜로니로써 형질전환체를 선택하였다. 형질전환체를 삽입 부위를 가로지르는 PCR 에 의하여 스크리닝하였다. 그런 다음 정확한 크기의 삽입물을 함유하고 있는 콜로니들을 적절한 크기의 융합 단백질의 발현에 대하여 SDS-PAGE 에 의하여 스크리닝하였다 (아래의 설명 참조). 유비퀴틴 융합물은 lac 리프레서를 적정하여 그것을 pDSUb 의 프로모터로부터 제거하는 IPTG 를 첨가함으로써 과잉발현되었다 (DH5αF' IQ 는 10 ㎍/㎖의 네오마이신으로 선택된, F' 인자상의 상승조절된 lacIq 유전자를 함유하고 있다).
과잉발현되고 유도된 유비퀴틴 융합 단백질을 나타낸 클론들로부터 플라스미드 DNA 를 제조하고, 시쿼나제 버전 (Sequenase Version) 2.0 키트 (United StatesBiochemical)를 사용하여 디데옥시 방법에 의하여 서열화하였다. 그런 다음 양성 클론들을 냉동시켜서 -80 ℃ 에서 글리세롤중에 보관하였다. 양성 클론들을 100 ㎍/㎖ 의 암피실린, 10 ㎍/㎖ 의 네오마이신 및 1 % 의 글루코오스를 함유하고 있는 LB 플레이트상에서 30 ℃ 에서 유지시켰다. 양성 클론들을 주마다 10 계대까지 스트리킹하고, 그런 다음 일련의 배양을 위하여 냉동 시드 바이알로부터 새로운 스트리크를 취하여 스트레인의 확실성을 보증하였다.
검정을 위한 단백질을 얻기 위하여, 250 ㎖용 진동 플라스크에 들어 있는 100 ㎖ 의 출발 배양물을, 100 ㎍/㎖ 의 암피실린, 10 ㎍/㎖ 의 네오마이신 및 1 % 의 글루코오스가 첨가되어 있는 2×YT 배지중에서 밤샘 인큐베이션 (16 내지 20 시간)함으로써 단일 콜로니로부터 성장시켰다. 진동기 플라스크 배양물을 30 ℃ 및 250 rpm 에서 뉴 브륀스윅 환경 진동기 인큐베이터 (New Brunswick environmental shaker incubator)안에서 유지시켰다. 다음 날 아침 배양물을 배지를 사용하여 1 리터로 희석시켰다. 세포를 OD600= 0.5 에서 1 mM (최종 희석농도)로 IPTG 를 첨가함으로써 유도하고, OD600= 0.8 에서 원심분리에 의하여 수득하였다. 수득된 세포를 저장성 (hypotonic) 용해 완충액 (100 ㎕ 의 50 mM 트리스, pH 10.0)중에 재현탁시켰다. 현탁액에 대하여 냉동-해동 주기 (냉동을 위해서는 드라이 아이스-에탄올 조에 넣고, 해동을 위해서는 60 ℃ 로 가열함)를 3 회 반복함으로써 박테리아 세포를 용해시켰다. 그런 다음 현탁액을 10 분동안 초음파 처리하고, 12,000 g 에서 10 분동안 원심분리하였다. 그 결과의 상층액을 "S1"으로서 표시하였다. 세포펠릿을 50 mM 의 트리스, pH 10 및 2×SDS 트리신 로딩 완충액 (Novex, San Diego, CA) (1:1)중에 재현탁시켰다. 그런 다음 이 혼합물을 95 ℃ 에서 15 분동안 가열하고, 12,000 g 에서 10 분동안 원심분리하였다. 이런 방식으로 재용해할 수 있는 침전물 부분을 "P1" 으로 명명하였다. 나머지 펠릿으로부터 유도된 침전물 부분을 "P2" 로 명명하였다. P2 를 P1 에 대해서처럼 로딩 완충액중에 재현탁시켰다. S1, P1 및 P2 로부터의 샘플을 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다.
SDS-PAGE 겔을 미니겔 장치에서, 10 내지 20 % 의 트리신 겔 (Novex) 을 사용하여 두가지의 완충액 트리신 시스템을 사용하여 작동시켰다. 음극 (바닥) 완충액은 0.2 M 트리스, pH 9.0 이었고, 양극 (상단) 완충액은 0.1 M 트리스, 0.1 M 트리신, 0.1 % SDS, pH 8.25 였다. 시판되는 분자량 마아커, "다중-마아커" (Novex) 를 사용하였다. 표준으로서 사용한 소의 유비퀴틴은 시그마사로부터 구입하였다. 겔을 염료 마아커가 겔의 바닥에 도달할 때까지 4 mA 의 일정한 전류에서 작동시켰다. 그런 다음 겔을 아세트산:메탄올 (10 %:40 %)중의 0.25 % 의 쿠마찌 블루 R250 (Sigma) 으로 염색하고, 염료가 없는 동일한 용액에서 탈염시켰다.
대부분 (> 70 %)의 무상의 p141-유비퀴틴 융합 단백질은 박테리아 용해물을 원심분리한 후의 침전물 (P1 및 P2)에서 발견되었다. 이와는 극히 대조적으로, 대부분 (> 70 %)의 p97-유비퀴틴 융합 단백질은 가용성 분획 (S1)에서 발견되었다. 이것은 C-말단의 소수성 영역을 제거한 결과 용해도 특성이 개선된 생성물이 생성되었음을 확인시켜주는 것이다. 유사하게, p13 및 p15 펩티드들도 또한 가용성 분획안에 포함되어 있었다.
UCH-L3 유비퀴나제 효소 [Recksteiner, M. (Ed.)Ubiquitin, Plenum Press (NY) 1988; Wilkinsonet al., Science 246:670-673, 1989]는 숙주 스트레인 BL21/DE3 을 형질전환시키기 위하여 사용된 pRSET (Invitrogen, San Diego, CA)에서 발현되었다. UCH-L3 은 유비퀴틴 C-말단 연장부에서 절단하는 유비퀴틴-특이적 프로테아제이다. 그것은 박테리아 용해물로부터 35 % (w/v) 암모늄 설페이트 침전법에 의해 부분적으로 정제된다. 사용되는 암모늄 설페이트의 정확한 백분율을 SDS-PAGE 에 의해 25.5 kD 밴드의 존재에 대하여 모니터하였다. 상층액을 50 mM 트리스, pH 7.4 에 대하여 투석하고, 유비퀴틴 펩티드 융합 기질에 대하여 검정하였다. 활성 상층액을 일정액씩으로 나누어 -20 ℃ 에서 냉동시켰다. 전형적인 반응 혼합물에는 3 ㎕ 의 용해물, 1 ㎕ 의 1 M DTT, 1 ㎕ 의 UCH-L3 (상기와 같음) 및 5 ㎕ 의 반응 완충액 (50 mM 트리스, pH 7.4) 이 함유되어 있다. 반응을 실온에서 20 분동안 수행하였다. 대규모 소화를 위해서는, 300 ㎕ 의 용해물을 100 ㎕ 의 1 M DTT, 20 ㎕ 의 UCH-L3 및 580 ㎕ 의 반응 완충액과 혼합하였다.
가용성 분획 (S1)에 함유된 펩티드 또는 단백질을 추가로 실시예 16 에서와 같이 역상 HPLC 에 의하여 정제하였다; 분획들을 SDS-PAGE 에 의하여 모니터하고 그것들의 정체를 전기분무 이온화 질량 분광측광법에 의해 확인하였다 (아래의 설명 참조). 정제된 펩티드 또는 단백질을 상기와 같이 효소적으로 UCH-L3 에 의하여 소화시키고, 그 결과 유비퀸이 없는 최종 생성물을 얻었다. 그런 다음 이 절단된 물질을 역상 HPLC 에 의하여 다시 정제하였다. 정제는 SDS-PAGE 를 따랐으며, 최종 생성물의 정체는 전기분무 이온화 질량 분광측광법에 의하여 확인하였다.
상술한 바와 같이 시험관내에서 UCH-L3 로 절단하는 것을 대체하는 방법은, 원하는 유비퀴틴 융합물로서 동일한 박테리아내에서 유비퀴틴을 절단하는 효소를 공동-발현시키는 것이다. 이 목적을 위하여, 유비퀴나제 UBP1 [Tobias and Varshavsky, JBC 266:12021-12028, 1991]을 발현하는 벡터 (pJT184)를 사용하였다. p97 유비퀴틴 융합물과 UBP1 을 함께 발현하는 박테리아는 생체내에서 융합 단백질을 완전히 소화시키는 것으로 나타났다; p141 유비퀴틴 융합물과 UBP1 을 함께 발현하는 박테리아는 융합 단백질을 부분적으로 (거의 70 %) 소화시키는 것으로 나타났다. 생체내에서 소화된 p97 단백질을 상기와 같이 암모늄 설페이트 침전법과 이어서 역상 HPLC 에 의하여 정제하였다.
발현되고 정제된 폴리펩티드의 정체를 확인하기 위하여, 사중극 분석기가 구비되어 있는 VG 바이오테크 BIO-Q 기기를 사용하여 전기분무 이온화 질량 분광측광을 수행하였다. 기기를 보정하기 위하여 미오글로빈을 사용하였다. 정제된 p97 로 얻어진 주요 성분은 분자량이 10,339 달톤인 단일 피크였다; 이것은 계산된 분자량 10,347 과 유리하게 비교되며, 따라서 재조합 p97 단편의 동일성을 확인시켜준다.
실시예 23: 재조합 p1-97 은 간세포 억제 활성을 보유한다.
재조합 p1-97 의 생체내 활성을 평가하기 위하여, 실시예 18 에서와 같이 CFU-GEMM 순환 검정을 수행하였다:
처리 치사율
대조표준1 62
사람 알파2 11
p973 0
1사람 골수 단핵 세포
2실시예 16 에서와 같은 정제되고 비-재조합체인 사람 알파 헤모글로빈
(100 ng/ml)
3실시예 22 에서와 같은 정제된 재조합 p97 (100 ng/ml)
실시예 24: 사람 알파 헤모글로빈 및 펩티드 43-55 는 테스토스테론 또는 5-플루오로우라실 (5FU)로 처리된 마우스들에서 생체내에서 CFU-MIX 순환을 억제한다.
펩티드 43-55 의 생체 내에서의 간세포 억제 활성을 평가하기 위하여, B6D2 F1마우스들을 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 테스토스테론 프로피오네이트로 또는 5FU 로 사전에 처리하였다. 구체적으로, 테스토스테론 프로피오네이트 (100 mg/kg 체중)를 제 0 일에 마우스에게 복강내 주사하였다. 또는 달리, 마우스들에게 체중 kg 당 200 ㎍ 의 5FU 를 제 0 일에 주사하였다.
24 시간 후 (제 1 일), 다양한 양의 펩티드 43-55 또는 비히클을 정맥내 주사하였다. 골수를 제 2 일에 수득하고 CFU-MIX 순환 검정을 실시예 14 에서와 같이 수행하였다. 구체적으로, 마우스들을 희생시켜서 대퇴골로부터 단일 세포 골수 현탁액을 제조하였다. 세포를 한 번 세척하고, 농도를 피셔 배지중에 배지 1 ㎖ 당 5 × 106세포로 조정하였다. 각각의 시험 조건을 위해서는, 1 ㎖ 의 세포를 두 개의 폴리프로필렌 튜브 각각에 첨가하였다. 튜브를 적절한 농도의 시험 물질의 존재하에 ("실험") 또는 시험 물질 없이 ("대조표준") 37 ℃ 에서 3 시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝날 때 30 ㎍/㎖ 의 시토신 아라비노시드 ("Ara C")(Sigma)를 튜브들의 반에 첨가하였고, 나머지 절반의 튜브에는 동일한 부피의 피셔 배지를 첨가하였다. 튜브들을 추가로 1 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션한 다음, 그것들을 얼음위에 놓고 저온 피셔 배지로 두 번 세척하였다.
세포를 다시 피셔 배지중에서 5 × 104- 106세포로 조정하고, 0.5 ㎖ 의 세포 현탁액을 5 ㎖ 의 메토컬트 (Methocult) M3430 메틸셀룰로오스 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver, British Columbia)에 첨가하였다. 이 혼합물을 와동 (vortex)을 이용하여 격렬하게 혼합하고, 1 ㎖ 씩을 덜어 5 개의 35 mm 접시 각각에 분배하였다. 35 mm 접시를 계속해서 뚜껑이 달려 있는 150 mm 접시에 넣었고, 그 중 하나는 식염수가 함유되어 있는 열려 있는 35 mm 접시였다. CFU-MIX 콜로니를 37 ℃ 에서 7 일동안 인큐베이션 한 후에 역상 현미경을 사용하여 계수하였다.
배지로 처리된 튜브 대 Ara C 로 처리된 튜브 사이의 콜로니수의 차이는 다음 식에 따라 그 조건하에서 순환하는 세포의 백분율을 나타낸다:
% S = (a - b)/a × 100 %
상기에서, a 는 배지만을 넣어 인큐베이션한 튜브로부터의 CFU-MIX 의 수
b 는 Ara C 와 함께 인큐베이션한 튜브로부터의 CFU-MIX 의 수
테스토스테론으로 예비처리된 동물
처리 치사율
대조표준 35
사람 알파 사슬 (500 ng)2 13
펩티드 43-55 (0.5 ng)2 0
220 그람의 마우스 당 정맥내 주사된 양
5FU 로 처리된 동물
처리 치사율
대조표준 62
사람 알파 사슬 (500 ng)2 0
펩티드 43-55 (0.5 ng)2 3
고리형 펩티드 43-55 (0.5 ng)2 14
220 그람의 마우스 당 정맥내 주사된 양
실시예 25: 펩티드 43-55 는 N-말단 Phe (Phe43)에서 비오티닐화되거나 또는 Phe43 또는 Phe46 에서 요오드화될 때 간세포 억제제로서 활성이다.
펩티드 43-55 를 고상 펩티드 합성 기법 [American Peptides Co., Sunnyvale, CA)에 의하여 합성하였다. 펩티드 유사체는 Phe43 또는 Phe46 의 파라 위치에 요오드를 사용하여 합성하였다. 비오티닐화된 펩티드 43-55 는 비오틴의 COOH 를 C4 탄소 링커를 사용하여 Phe43 의 N-말단 NH2에 연결시킴으로써 합성하였다.
처리 치사율
대조표준 31
펩티드 43-55 (1 ng/ml) 8
비오티닐화된 펩티드 43-55 (1 ng/ml) 15
실시예 26: 모르핀은 생체내에서 쥐과 동물의 CFU-MIX 의 순환을 억제한다.
실시예 24 에서와 같이, Balb/c 마우스들로부터 얻은 골수를 사용하여 모르핀을 CFU-MIX 순환 검정에서 시험하였다:
처리 치사율
대조표준 44
사람 알파 사슬 (100 ng/ml) 0
모르핀 (10-7M)(10-9M)(10-11M) 101532
실시예 27: 마취제 펩티드 DAMGO 및 DALDA 는 쥐과동물의 CFU-MIX 의 순환을 시험관내에서 억제한다.
DAMGO 와 DALDA 를 실시예 24 에서와 같이 Balb/c 마우스들로부터 얻은 골수를 사용하여 CFU-MIX 순환 검정으로 시험하였다:
처리 치사율
대조표준 33
DAMGO (10-5M)(10-7M)(10-9M) 15038
DALDA (10-5M)(10-7M)(10-9M) 47034
실시예 28: 노시셉틴은 쥐과동물의 CFU-MIX 순환을 시험관내에서 억제한다.
노시셉틴을 실시예 24 에서와 같이, Balb/c 마우스들로부터 얻은 골수를 사용하여 CFU-MIX 순환 검정으로 시험하였다:
처리 치사율
대조표준 31
펩티드 43-55 (1 ng/ml) 8
노시셉틴 (10-7M)(10-9M) 60
실시예 29: 날록손은 사람 알파 및 델타 헤모글로빈 사슬, 헤모르핀 10 및 펩티드 43-55 의 억제 활성을 길항한다.
CFU-MIX 순환 검정을 실시예 24 에서와 같이 수행하였다. 시험 물질을 그것들 자체만으로 또는 10-5내지 10-7M 의 날록손의 존재하에 검정하였다. 날록손 자체는 상기 농도에서 검정에 어떠한 영향도 미치지 않았다.
처리 치사율
대조표준 38
날록손1 36
사람 알파 (100 ng/ml) 0
사람 알파 + 날록손1 52
펩티드 43-55 (10 ng/ml) 6
펩티드 43-55 + 날록손1 50
헤모르핀 10 (100 ng/ml) 0
헤모르핀 10 + 날록손1 36
110-5M 의 최종 농도에서 사용함
처리 치사율
대조표준 32
사람 델타 (100 ng/ml) 10
사람 델타 + 날록손1 31
110-7M 의 최종 농도에서 사용함
실시예 30: 저농도의 날록손은 쥐과동물의 CFU-MIX 의 순환을 억제한다.
CFU-MIX 검정을 실시예 24 에서와 같이 수행하였다.
처리 치사율
대조표준 38
사람 알파 (100 ng/ml) 0
날록손 (10-10M) 0
실시예 31: 뮤 마취제 수용체 길항제 CTOP 는 사람 헤모글로빈 알파 사슬, 펩티드 43-55 및 펩티드 64-82 의 억제 활성을 길항한다.
CTOP (H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2, Cys2와 Pen7사이에 이황화 결합이 있음)는 뮤 마취제 수용체에 특이적인 길항제인 소마토스타틴의 유사체이다. 시험 물질을 그것들 자체만으로 또는 CTOP (10-7M)의 존재하애 검정하였다. CTOP 자체는 이 농도에서 검정 결과에 어떠한 영향도 미치지 못하였지만, 알파 헤모글로빈 또는 펩티드 43-55 에 의해 유발된 세포 순환 억제를 길항하였다.
처리 치사율
대조표준 42
CTOP1 36
사람 알파 (100 ng/ml) 0
사람 알파 + CTOP1 20
펩티드 43-55 (10 ng/ml) 8
펩티드 43-55 + CTOP1 21
110-7M 의 최종 농도에서 사용함
실시예 32: 사람 알파 사슬로의 예비처리는 후기-형성 코블스톤-형성 세포의 수를 증가시킨다.
플로마허와 그의 동료들 [Ploemacheret al., Blood 74:2755-2763, 1989; van der Sluijset al., Exp. Hematol. 18:893-896, 1990; Ploemacheret al., Blood 78:2527-2533, 1991; Ploemacheret al., J. Tiss. Cult. Meth. 13:63-68,1991; Down and Ploemacher, Exp. Hematol. 21:213-221, 1993]에 의해 설명된 바와 같이 코블스톤 검정을 수행하였다. 코블스톤 검정은 간질 세포의 단층내에 있는 세포들의 그룹 (또는 "코블스톤")의 출현을 측정하는 것이다. 매우 원시적인 간세포는 연 (soft) 아가에서 콜로니를 형성하지 않을 것이지만, 간질 단층이 존재할 때는 코블스톤을 형성한다. 코블스톤을 형성하는 세포들은 "코블스톤 영역 형성 세포" (CAFC)로 언급된다. 보다 분화된 (예컨대 GM-CFC) 선구체들은 배양의 처음 수주 동안에 나타났다가 사라지는 일시적인 코블스톤을 형성하는 한편, 보다 원시적인 간세포 (예컨대 장기간 재집합 세포)는 배양 시작후 4 내지 5 주후에만 나타나는 코블스톤을 형성한다. 그러므로, 배양의 7 내지 14 일째에 형성되는 CAFC 는 CFU-GM 에 풍부하며, 배양의 28 내지 35 일째에 형성되는 CAFC 는 CFU-MIX 에 많고, 28 내지 35 일에 형성되는 CAFC 는 장기간 재집합 세포에 풍부하다.
B6D2F1 마우스들을 실시예 24 에서와 같이 테스토스테론 프로피오네이트로 처리하였다. 다음 날, 골수를 제거하여 4 시간동안 사람 알파 헤모글로빈 사슬 (100 ng/106세포)과 함께 또는 없이 인큐베이션한 다음, 코블스톤 검정을 수행하였다. 사용된 검정은 96-웰 플레이트에 있는 제한 희석 장기간 골수 배양물 (LTBMC) 로 구성된다. 배양물을 FBMD-1 쥐의 간질 셀라인 [Breemset al., Leukemia 11:142-150, 1997]을 집밀 상태가 될 때까지 성장시킴으로써 제조하였다; 집밀 단층이 플레이트된 96-웰 플레이트를 33 ℃ 에서 검정할 때까지 보관하였다. 쥐의 골수 세포를 단일 세포 현탁액으로서 준비하고, 그 다음 세포의 희석액을 웰 당 0.2㎖ 의 LTBMC 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver): 27,000; 9,000; 3,000; 1,000; 333 의 비율로 플레이트하였다. 20 개의 웰을 조건당 각 희석액에 대하여 플레이트하고 2 개의 플레이트로 분배하였다.
코블스톤 영역 형성 세포 (CAFC)의 빈도를 앞서 설명된 바와 같이 계산하였다 [Ploemacheret al., Blood 78:2527-2533, 1991; Ploemacheret al., J. Tiss. Cult. Meth. 13:63-68, 1991; Breemset al., Leukemia 8:1095-1104, 1994]. 그 결과를 도 23 에 도시한다. 순환하는 간세포를 사람 알파 헤모글로빈 사슬과 함께 예비인큐베이션함으로써 후기-형성 CAFC 의 비율이 대략 5 배 증가되었다. 순환하지 않는 간세포를 사람 알파로 처리하는 것은 아무런 영향도 미치지 못하였다.
실시예 33: 사람 알파 헤모글로빈 및 펩티드 43-55, 고리형 43-55 및 64-82 는 사람 탯줄 혈액의 CFU-GEMM 을 억제한다.
사람 탯줄 혈액 CFU-GEMM 순환 검정을 실시예 19 에서와 같이 수행하였다. 구체적으로, 사람 탯줄 혈액으로부터 단핵 세포를 단리하고, 10 % 의 FBS, 100 ng/㎖ 의 키트 리간드 및 100 ng/㎖ 의 사람 IL-3 가 첨가되어 있는 IMDM 조직 배양 배지중에 배지 ㎖ 당 2 내지 4 × 104세포로 조정하였다. 세포를 48 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션한 다음, 세포를 세척하고, 혈청이 없는 IMDM 에 106세포/㎖ 의 농도로 재현탁하였다. 1 ㎖ 의 세포를 조건 당 두 개의 폴리프로필렌 튜브의 각각에 첨가하고, 실시예 24 에서와 같이 마우스의 골수에 대하여 순환 검정을 수행하였다. Ara C 인큐베이션후에, 세포를 저온 IMDM 으로 세척하고 0.5 ㎖ 의 IMDM 당 10,000 내지 20,000 세포로 조정한 다음 5 ㎖ 의 메토컬트 H4433 (Stem Cell Technologies)과 혼합하였다. 또는 달리, 메토컬트 H4435 메틸셀룰로오스 배지 (Stem Cell Technologies)를, 세포 농도가 0.5 ㎖ 의 IMDM 당 2500 내지 5000 세포로 조정된 경우에 사용하였다. 세포를 실시예 24 에서와 같이 플레이트하고 제 14 내지 18 일에 CFU-GEMM 콜로니를 기록하였다.
처리 치사율
대조표준 52
사람 알파 (100 ng/ml) 0
펩티드 43-55 (1 ng/ml)(10 ng)(100 ng) 20125
고리형 펩티드 43-55 (1 ng/ml)(10 ng)(100 ng) 32011
펩티드 64-82 (1 ng/ml)(10 ng)(100 ng) 212039
실시예 34: 사람 알파 헤모글로빈 및 펩티드 43-55 는 성인 골수 CFU-GEMM 의 순환을 억제한다.
포이에틱 테크놀로지스사 (Poietic Technologies)로부터 CellPro 칼럼에 의하여 사람 골수로부터 정제된 후의 CD34+간세포를 얻었다. 세포를 키트 리간드 및 IL-3 과 함께 48 시간동안 인큐베이션한 다음, 실시예 26 에서와 같은 CFU-GEMM 순환 검정에 사용하였다.
처리 치사율
대조표준 47
사람 알파 사슬 (ng/ml) 0
펩티드 43-55 (ng/ml) 0
실시예 35: 이동된 사람 말초혈에서 CFU-GEMM 은 능동적으로 순환하고 사람 알파 헤모글로빈, 펩티드 43-55, DAMGO 또는 모르핀에 의하여 억제가능하다.
말초혈을 표준 프로토콜에 따라 시클로포스파미드 및 G-CSF 를 이용하여 말초 간세포가 이동된 유방암 환자로부터 얻었다. 적혈구를 피콜 하이파크 (Ficoll Hypaque)를 이용하여 제거하였다 (세포를 IMDM 으로 1:1 로 희석하고, 16 ㎖ 의 피콜의 상부위에 20 ㎖ 의 희석액을 놓고 800 g 에서 30 분동안 원심분리하였다; 단핵세포를 중간층으로부터 제거하고 IMDM 으로 두 번 세척하였다). 한 경우에 단핵 세포를 액체 질소중에 냉동 보관하였다가 후에 검정에 사용하였다. 단핵 세포를 실시예 26 에서와 같이 CFU-GEMM 순환 검정에 대하여 플레이트하되, 단 접시 당 2.5 내지 5 × 105세포를 플레이트하였다.
처리 치사율
대조표준 (환자 #1) 48
사람 알파 사슬 (100 ng/ml) 0
처리 치사율
대조표준 (환자 #2)1 67
사람 알파 사슬 ( ng/ml) 2
펩티드 43-55 (10 ng/ml) 0
모르핀 (10-7M)(10-9M) 240
DAMGO (10-7M)(10-9M) 150
처리 치사율
대조표준 (환자 #3)1 29
펩티드 43-55 (0.1 ng/ml) 23
펩티드 43-55 (1.0 ng/ml) 0
펩티드 43-55 (10 ng/ml) 15
1검정하기 전 냉동 보관했던 세포임
실시예 36: 다량의 사람 알파 또는 베타 헤모글로빈, 미오글로빈, 펩티드 1-97, 펩티드 43-55, 펩티드 64-82, 노시셉틴 또는 DALDA 는 정지상태의 쥐 간세포의 순환을 자극한다.
㎍/㎖ 용량의 헤모글로빈 사슬, 미오글로빈 및 펩티드들을, 그것들이 정지상태의 간세포를 자극하는지에 대하여 검정하였다. 골수를 실시예 24 에서와 같이 CFU-MIX 순환 검정에서 시험된 처리되지 않은 B6D2F1마우스들로부터 얻었다. 처리되지 않은 B6D2F1마우스들로부터 단리된 간세포는 순환하도록 자극 (예컨대 테스토스테론 프로피오네이트 (실시예 1 참조)에 의해 또는 5FU (실시예 4 참조)와 같은 화학요법에 의하여)되지 않는 한 정상적으로는 느리게 순환한다.
처리 치사율
대조표준 3
사람 알파 사슬 (1 ㎍/ml)(10 ㎍/ml)(100 ㎍/ml) 02440
처리 치사율
대조표준 9
사람 베타 사슬 (㎍/ml) 55
사람 미오글로빈 (㎍/ml) 30
처리 치사율
대조표준 3
사람 알파 사슬 (100 ㎍/ml) 41
DALDA (10-5M)(10-3M) 2441
DADLE (10-5M)(10-3M) 00
처리 치사율
대조표준 0
사람 알파 사슬 (100 ㎍/ml) 30
펩티드 43-55 (10 ㎍/ml) 26
처리 치사율
대조표준 16
펩티드 1-97 (10 ㎍/ml) 62
펩티드 1-97 (100 ㎍/ml) 41
처리 치사율
대조표준 4
펩티드 64-82 (1 ㎍/ml) 25
노시셉틴 (10-5M) 36
실시예 37: 다량의 사람 알파 헤모글로빈을 정맥내 주사하면 정지상태의 쥐과 동물의 간세포의 순환이 자극된다.
사람 알파 헤모글로빈을 처리되지 않은 B6D2F1마우스들에게 정맥내 주사하였다. 24 시간이 지난후, 마우스들을 희생시키고 대퇴골로부터 골수를 수집하여서 실시예 24 에서와 같이 CFU-MIX 검정을 수행하였다.
처리 치사율
대조표준 (처리되지 않음) 0
중간 (주사 대조표준) 0
사람 알파 사슬 (150 ㎍/마우스) 48
실시예 38: 날록손은 다량의 사람 알파 헤모글로빈, 펩티드 43-55 의 간세포 자극 활성을 길항한다.
처리 치사율
대조표준 6
사람 알파 사슬 (100 ng/ml) 48
사람 알파 사슬 + 날록손1 0
110-7M 의 최종 농도로 사용됨
본 발명이 바람직한 실시예의 관점에서 설명되었지만, 변형 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자들에게 있어 자명하다. 첨부된 청구항은 청구되는 본 발명 범위 내에 포함되는 상기의 모든 동등한 변형을 포함한다.
본 발명의 제제는 간세포 증식을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (43)

  1. 비오틴-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, (요오도)Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Phe-Pro-His-(요오도)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val 및 (요오도)Phe-Pro-His-(요오도)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지고 있는 펩티드.
  2. 조혈 세포를 간세포를 자극하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식의 자극 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 INPROL 이 헤모글로빈의 알파 사슬, 헤모글로빈의 베타 사슬, 헤모글로빈의 감마 사슬, 헤모글로빈의 델타 사슬, 헤모글로빈의 엡실론 사슬, 헤모글로빈의 제타 사슬, 사람 알파 헤모글로빈 사슬의 아미노산 1 내지 97 의 서열로 구성되는 폴리펩티드, 및 사람 알파 헤모글로빈 사슬의 아미노산 1 내지 94 의 서열로 구성되는 폴리펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 INPROL 이 다음의 서열로 구성되는 펩티드들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val,
    Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
    (상기에서 두 개의 Cys 잔기는 이황화 결합을 형성한다),
    Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala,
    Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr,
    Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe,
    Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg,
    Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln,
    Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr,
    Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp,
    Leu-Val-Val-Tyr-Pro,
    Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln,
    Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe,
    Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg,
    Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln, 및
    Tyr-Pro-Trp-Thr.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 마취제 화합물이 모르핀, 에토르핀, 코데인, 헤로인, 히드로모르핀, 옥시모르핀, 레보르파놀, 레발로르판, 히드로코돈, 옥시코돈, 날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부타노르파놀, 날부핀, 메페리딘, 알파프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐, DAMGO, DALDA 및 노시셉틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 조혈 세포를 마취제 수용체와 결합할 수 있는 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 자극하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 화합물이 마취제 수용체의 뮤 하위부류에 대한 선택성을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 조혈 세포를 노시셉틴 수용체와 결합할 수 있는 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 억제 또는 자극하는 방법.
  9. 조혈 세포를 GTP 결합 단백질의 G억제하위부류를 활성화시킬 수 있는 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 간세포 증식을 자극 또는 억제하는 방법.
  10. 조혈 세포를 고전적인 뮤, 카파 또는 델타 마취제 수용체 또는 ORL1 을 포함하지 않는 마취제-유사 수용체에 결합할 수 있는 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는 간세포 증식을 자극 또는 억제하는 방법으로서, 상기 수용체가 (a) 간세포 자극 및/또는 억제 성질을 가지고 있고 (b) 날록손에 의해 길항될 수 있는 상기 간세포 자극 및/또는 억제 능력을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 마취제-유사 수용체가 1 마이크로몰보다 작거나 같은 분해 상수 (Kd)를 가지고 있으며 펩티드 Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val 에 결합하는 능력을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 분해 상수가 10 나노몰보다 작거나 같은 것을 특징으로 하는 방법.
  13. INPROL 에 대한 수용체를 함유하고 있는 물질을 수용체-결합 검정에서 INPROL 과 접촉시키는 것으로 이루어지는, INPROL 에 대한 수용체를 확인하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 INPROL 이 헤모글로빈의 알파 사슬, 헤모글로빈의 베타 사슬, 헤모글로빈의 감마 사슬, 헤모글로빈의 델타 사슬, 헤모글로빈의 엡실론 사슬, 헤모글로빈의 제타 사슬, 사람 알파 헤모글로빈 사슬의 아미노산 1 내지 97 의 서열로 구성되는 폴리펩티드, 사람 알파헤모글로빈 사슬의 아미노산 1 내지 94 의 서열로 구성되는 폴리펩티드, Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, 비오틴-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, (요오도)Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Phe-Pro-His-(요오도)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val 및 (요오도)Phe-Pro-His-(요오도)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe -Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, 및 Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. INPROL 에 대한 수용체를 함유하고 있는 물질을 아데닐레이트 사이클라제 검정에서 INPROL 과 접촉시키는 것으로 이루어지는, INPROL 에 대한 수용체를 확인하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 INPROL 이 헤모글로빈의 알파 사슬, 헤모글로빈의 베타 사슬, 헤모글로빈의 감마 사슬, 헤모글로빈의 델타 사슬, 헤모글로빈의 엡실론 사슬, 헤모글로빈의 제타 사슬, 사람 알파 헤모글로빈 사슬의 아미노산 1 내지 97 의 서열로 구성되는 폴리펩티드, 사람 알파헤모글로빈 사슬의 아미노산 1 내지 94 의 서열로 구성되는 폴리펩티드, Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, 비오틴-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, (요오도)Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Phe-Pro-His-(요오도)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val 및 (요오도)Phe-Pro-His-(요오도)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe- Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, 및 Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 간세포 증식을 억제하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물을 포함하며, 상기 화합물이 방사선요법 및/또는 화학요법의 진행전, 진행중 또는 진행 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 암에 걸린 포유동물의 암 치료용 약학적 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 마취제 화합물이 모르핀, 에토르핀, 코데인, 헤로인, 히드로모르핀, 옥시모르핀, 레보르파놀, 레발로르판, 히드로코돈, 옥시코돈, 날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부타노르파놀, 날부핀, 메페리딘, 알파프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐, DAMGO, DALDA 및 노시셉틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 암 치료용 약학적 조성물.
  19. 간세포 증식을 자극하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물을 포함하는, 간세포를 손상시키거나 파괴하는 제제에 노출된 포유동물의 간세포 분할 자극용 약학적 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 제제가 항바이러스제 또는 항-신생물제인 것을 특징으로 하는 포유동물의 간세포 분할 자극용 약학적 조성물.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 마취제 화합물이 모르핀, 에토르핀, 코데인, 헤로인, 히드로모르핀, 옥시모르핀, 레보르파놀, 레발로르판, 히드로코돈, 옥시코돈, 날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부타노르파놀, 날부핀, 메페리딘, 알파프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐, DAMGO, DALDA 및 노시셉틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 간세포 분할 자극용 약학적 조성물.
  22. 조혈 세포를 간세포 증식을 자극하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 포유동물의 조혈 간세포를 생체외에서 유지시키는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 조혈 세포가 골수 세포, 말초혈 세포, 이동된 말초혈 세포, 태아 간 및 탯줄 혈액 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 마취제 화합물이 모르핀, 에토르핀, 코데인, 헤로인, 히드로모르핀, 옥시모르핀, 레보르파놀, 레발로르판, 히드로코돈, 옥시코돈,날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부타노르파놀, 날부핀, 메페리딘, 알파프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐, DAMGO, DALDA 및 노시셉틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 자극하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물을 포함하는, 골수증식성 질병, 조혈 또는 상피 간세포 저증식증에 걸려 있는 포유동물의 상기 질병 치료용 약학적 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 골수증식성 질병이 골수이형성 증후군 또는 재생불능성 빈혈인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  27. 제 25 항에 있어서, 상기 마취제 화합물이 모르핀, 에토르핀, 코데인, 헤로인, 히드로모르핀, 옥시모르핀, 레보르파놀, 레발로르판, 히드로코돈, 옥시코돈, 날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부타노르파놀, 날부핀, 메페리딘, 알파프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐, DAMGO, DALDA 및 노시셉틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  28. 간세포 증식을 억제하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물을 포함하는, 간세포 소모의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 간세포 소모가 후천성 면역 결핍 증후군 때문인 것을 특징으로 하는 간세포 소모의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 마취제 화합물이 모르핀, 에토르핀, 코데인, 헤로인, 히드로모르핀, 옥시모르핀, 레보르파놀, 레발로르판, 히드로코돈, 옥시코돈, 날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부타노르파놀, 날부핀, 메페리딘, 알파프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐, DAMGO, DALDA 및 노시셉틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 간세포 소모의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  31. 간세포를 보호하는 양의 마취제 화합물을 포함하는, 화학요법 또는 방사선요법으로부터 포유동물의 정상적인 간세포의 차등적 보호용 약학적 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 마취제 화합물이 모르핀, 에토르핀, 코데인, 헤로인, 히드로모르핀, 옥시모르핀, 레보르파놀, 레발로르판, 히드로코돈, 옥시코돈, 날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부타노르파놀, 날부핀, 메페리딘, 알파프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐, DAMGO, DALDA 및 노시셉틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 간세포의 차등적 보호용 약학적 조성물.
  33. 생체외에서 간세포를 자극하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물을 포함하며, 상기 INPROL 및/또는 마취제 화합물은 예정된 유전자로 형질전환된 조혈 세포와 접촉되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 유전자 치료용 약학적 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 마취제 화합물이 모르핀, 에토르핀, 코데인, 헤로인, 히드로모르핀, 옥시모르핀, 레보르파놀, 레발로르판, 히드로코돈, 옥시코돈, 날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부타노르파놀, 날부핀, 메페리딘, 알파프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐, DAMGO, DALDA 및 노시셉틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 유전자 치료용 약학적 조성물.
  35. 조혈 세포를 간세포를 자극하는 양의 INPROL 및/또는 마취제 화합물과 접촉시키는 것으로 이루어지는, 생체외에서 간세포 팽창을 수행하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 조혈 세포가 골수 세포, 말초혈 세포, 이동된 말초혈 세포, 태아 간 및 탯줄 혈액 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 35 항에 있어서, 상기 마취제 화합물이 모르핀, 에토르핀, 코데인, 헤로인, 히드로모르핀, 옥시모르핀, 레보르파놀, 레발로르판, 히드로코돈, 옥시코돈, 날로르핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부타노르파놀, 날부핀, 메페리딘, 알파프로딘, 디페녹실레이트, 펜타닐, DAMGO, DALDA 및 노시셉틴으로 이루어지는 군으로부터 선되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. (a) 마취제 화합물 및 (b) MIP-1α, TGFβ, TNFα, INFα, INFβ, INFγ, 펜타펩티드 pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys, 테트라펩티드 N-아세틸-Ser-Asp-Lys-Pro, 및 트리펩티드 글루타티온 (Gly-Cys-γGlu)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 억제 화합물을 포함하고 있는 약학적 조성물.
  39. (a) 마취제 화합물 및 (b) IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 간세포 인자, 및 flk2/flt3 리간드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 자극성 화합물을 포함하고 있는 약학적 조성물.
  40. 진정효과를 유도하는 양의 INPROL 을 포함하는, 포유동물의 동통 치료용 약학적 조성물.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 INPROL 이 헤모글로빈의 알파 사슬, 헤모글로빈의 베타 사슬, 헤모글로빈의 감마 사슬, 헤모글로빈의 델타 사슬, 헤모글로빈의 엡실론 사슬, 헤모글로빈의 제타 사슬, 사람 알파 헤모글로빈 사슬의 아미노산 1 내지 97 의 서열로 구성되는 폴리펩티드, 및 사람 알파 헤모글로빈 사슬의 아미노산 1 내지 94 의 서열로 구성되는 폴리펩티드,
    Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val,
    Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, 및
    Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 동통 치료용 약학적 조성물.
  42. 면역자극량의 INPROL 을 포함하는, 포유동물의 면역 결핍증 치료용 약학적 조성물.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 INPROL 이 헤모글로빈의 알파 사슬, 헤모글로빈의 베타 사슬, 헤모글로빈의 감마 사슬, 헤모글로빈의 델타 사슬, 헤모글로빈의 엡실론 사슬, 헤모글로빈의 제타 사슬, 사람 알파 헤모글로빈 사슬의 아미노산 1 내지 97 의 서열로 구성되는 폴리펩티드, 및 사람 알파 헤모글로빈 사슬의 아미노산 1 내지 94 의 서열로 구성되는 폴리펩티드,
    Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val,
    Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, 및
    Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 면역 결핍증 치료용 약학적 조성물.
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