DE69734766T2

DE69734766T2 - Hemmstoff und stimulator der proliferation haematopoietischer stammzellen und deren anwendungen

Info

Publication number: DE69734766T2
Application number: DE69734766T
Authority: DE
Inventors: D. Stephen WOLPE; Irena Tsyrlova
Original assignee: Wellstat Therapeutics Corp
Current assignee: Wellstat Therapeutics Corp
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1997-04-03
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2017-04-04
Also published as: EP1820805A3; IL126395A0; NZ331895A; EP0891377A4; ATE311406T1; NO984628D0; RU2292352C2; CN1174996C; JP4241927B2; IL176642A0; US5861483A; CN1541706A; CN1264856C; RU2292352C9; UA74128C2; DE69734766D1; CA2249716A1; UA85036C2; WO1997036922A1; NO984628L

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Modulatoren der Stammzellenproliferation zur Steuerung des Stammzellenzyklus in der Behandlung von Menschen oder Tieren mit Autoimmunerkrankungen, Alterung, Krebs, Myelodysplasie, Präleukämie, Leukämie, Psoriasis, erworbenes Immundefektsyndrom (AIDS), myelodysplastische Syndrome, aplastische Anämie oder andere Erkrankungen, die hyper- oder hypoproliferative Bedingungen mitsichbringen, sowie die Verwendung solcher Verbindungen zur Schmerzausschaltung. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Menschen oder Tieren, die chemotherapeutischen Mitteln oder anderen Mitteln, welche zyklierende Stammzellen schädigen, oder Strahlung ausgesetzt werden sollen oder ausgesetzt waren, und für den Schutz gegen solche Mitteln während ex vivo Behandlungen. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verbesserung von Kulturen zum Erhalt oder zur Expansion von Stammzellen für Auto- und Allotransplantationsverfahren oder für Gentransfer, sowie für in vivo Behandlungen um solche Verahren zu verbessern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die meisten Endstadium-Zellen in Erneuerungssystemen sind kurzlebig und müssen kontinuierlich während der Lebensdauer ersetzt werden. ZB stammen Blutzellen aus einer selbsterneuernden Population von multipotenten hämatopoetischen Stammzellen (HSC). Hämatopoetische Stammzellen sind eine Unterpopulation von hämatopoetischen Zellen. Hämatopoetische Zellen können zB aus Knochenmark, Nabelschnurblut oder peripherem Blut (entweder nicht mobilisiert oder mobilisiert mit einem Mittel wie G-CSF) erhalten werden; hämatopoetische Zellen umfassen die Stammzellenpopulation, Vorläuferzellen, differenzierte Zellen, akzessorischen Zellen, Stromazellen und andere Zellen, die zur Umgebung beitragen, die notwendig ist für die Herstellung von reifen Blutzellen. Hämatopoetische Vorläuferzellen sind eine Untermenge von Stammzellen, die in ihren Entwicklungsmöglichkeit eingeschränkter sind. Vorläuferzellen können nur in eine oder zwei Zelllinien differenzieren (zB BFU-E und CFU-E, die nur Erythrozyten entstehen lassen oder CFU-GM, die Granulozyten und Makrophagen entstehen lassen) wohin gegen Stammzellen (wie CFU-MIX oder CFU-GEMM) zahlreiche Zelllinien und/oder Stammzellen erzeugen können. Da die hämatopoetische Stammzellen für die Entwicklung aller reifen Zellen des hämatopoeti schen und Immunsystems notwendig sind, ist ihr Überleben essentiell um ein vollständig funktionierendes Wirtabwehrsystem in Subjekten, die mit Chemotherapie oder anderen Mitteln behandelt wurden, wieder einzurichten.
Die Produktion der hämatopoetischen Zellen wird durch eine Reihe von Faktoren, die das Wachstum und die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen stimulieren, gesteuert, von denen einige, zB Erythropoetin, GM-CSF und G-CSF, derzeit in der klinischen Praxis verwendet werden. Ein Teil des Steuernetzwerks das jedoch nicht sehr ausführlich charakterisiert ist, ist der physiologische Mechanismus der den Zyklierstatus von Stammzellen steuert (Eaves et al. Blood 78:110-117, 1991; Lord, in Stem Cells (C.S. Potten, Ed.) pp 401-22, 1997 (Academic Press, NY)).
Frühere Studien durch Lord und Mitarbeiter zeigten die Existenz von löslichen Proteinfaktoren in normalen und regenerierenden Knochenmarkextrakten, die die Stammzeilenproliferation entweder inhibieren oder stimulieren können (abgehandelt in: Lord and Wright, Blood Cells 6:581-593, 1980; Wright and Lorimore, Cell Tissue Kinet. 20:191-203, 1987; Marshall and Lord, Int Rev. Cyt. 167:185-261, 1996). Diese Aktivitäten wurden jeweils Stammzelleninhibitor (SCI) und Stammzellenstimulator (SCS), genannt.
Bis heute wurden keine Kandidat-SCS-Moleküle aus Knochenmarkextrakten gereinigt, wie es durch Lord et al. (oben angeführte Abhandlungen) beschrieben wurde. Die Reinigung von entweder SCS oder SCI aus Primärquellen wurde aufgrund der Schwierigkeiten, die einem in vivo Test, der eine große Anzahl bestrahlter Mäuse benötigt, eigen ist, nicht erreicht. In einem Versuch diese Probleme zu überwinden, entwickelten Pragnell und Mitarbeiter einen in vitro-Test für primitive hämatopoetische Zellen (CFU-A) und screenten Zelllinien als eine Quelle der inhibitorischen Aktivität (siehe Graham et al. Nature 344:442-444, 1990). Da frühere Studien Makrophagen als mögliche Quellen für SCI identifiziert hatten (Lord et al. Blood Cells 6:581-593, 1980), wurde eine Mäuse-Makrophagen-Zelllinie, J774.2, ausgewählt (Graham et al. Nature 344:442-444, 1990). Das konditionierte Medium von dieser Zelllinie wurde durch Graham et al. für die Reinigung verwendet; ein inhibitorisches Peptid wurde isoliert, welches sich als identisch zu dem zuvor beschriebenen Zytokin MIP-1α (macrophage inflammatory protein 1-alpha) herausstellte.
Rezeptoren für MIP-1α wurden geklont; wie andere Chemokinrezeptoren sind diese MIP-1α-Rezeptoren Sieben-Transmembran-Domäne-Rezeptoren (oder "G-linked") die an die Guanin-Nukleotid-Bindeproteine (GTP) der G_inhibitory("G_i")-Unterklasse gekoppelt sind (abgehandelt in Murphy, Zytokine & Growth Factor Rev. 7:47-64, 1996). Die "inhibitory" Bezeichnung für die G_i-Unterklasse bezieht sich auf die inhibitorische Aktivität auf die Adenylatzyklase.
MIP-1α wurde von einer Zelllinie isoliert, nicht aus Primärmaterial. Während Graham et al. beobachteten das Antikörper zu MIP-1α die Aktivität eines rohen Knochenmarkextraktes aufheben, haben andere Fachmänner gezeigt, dass andere inhibierende Aktivitäten wichtig sind. ZB haben Graham et al. (J. Exp. Med. 178:925-32, 1993) vorgeschlagen, dass TGFβ, nicht MIP-1α, ein primärer Inhibitor von hämatopoetischen Stammzellen ist. Ferner haben Eaves et al. (PNAS 90:12015-19, 1993) vorgeschlagen, dass sowohl MIP-1α als auch TGFβ in suboptimalen Niveus in normalem Knochenmark vorhanden sind, und dass die Inhibierung eine Synergie zwischen den beiden Faktoren benötigt.
Unlängst wurden Mäuse erzeugt, in welchem das MIP-1α Gen durch homologe Rekombination entfernt wurde (Cook et al., Science 269:1583-5, 1995). Solche Mäuse haben keine offensichtliche Störung ihres hämatopoetischen Systems, was die Rolle von MIP-1α als ein physiologischer Regulator des Stammzellenzyklierens unter normalen homöostatischen Bedingungen in Frage stellt. Ebenso, obwohl TGFβ (trans-forming growth factor beta) auch stammzelleninhibitorische Aktivitäten hat, legt die lange Zeitdauer, die es braucht das Stammzellen auf dieses Zytokin antworten, nahe, dass es nicht der endogene Faktor ist, der in Knochenmarkextrakten vorhanden ist; ferner heben neutralisierende Antikörper zu TGFβ die SCI-Aktivität in Knochenmarküberständen nicht auf (Hampson et al., Exp. Hemat. 19:245-249, 1991).
Andere Fachmänner haben zusätzliche stammzelleninhibitorische Faktoren beschrieben. Frindel und Mitarbeiter haben ein Tetrapeptid aus fötalen Kälberknochenmark und von Leberextrakten isoliert, welches stammzelleninhibitorische Aktivitäten hat (Lenfant et al., PNAS 86:779-782, 1989). Paukovits et al. (Cancer Res. 50:328-332, 1990) haben ein Pentapeptid charakterisiert, welches in seiner monomeren Form ein Inhibitor und in seiner dimeren Form ein Stimulator des Stammzellenzyklierens ist. Andere Faktoren wurden in verschiedenen in vitro-Systemen als inhibierend beansprucht (siehe Wright and Pragnell in Bailliere's Clinical Haematology v. 5, pp.723-39, 1992 (Bailliere Tinadall, Paris); Marshall and Lord, Int Rev. Cyt. 167:185-261, 1996).
Tsyrlova et al., SU 1561261 A1, offenbart ein Reinigungsverfahren für einen Stammzellenproliferationsinhibitor.
Allgemein besessene Anmeldungen WO 94/22915 und WO96/10634 offenbaren einen Inhibitor der Stammzellenproliferation und werden hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gänze eingebracht.
Bis heute wurde keiner dieser Faktoren für die klinische Verwendung erprobt. Es besteht jedoch die Notwendigkeit für wirkungsvolie Stammzelleninhibitoren. Die Haupttoxizität, die mit Chemotherapie oder Bestrahlungsbehandlung verbunden ist, ist die Zerstörung von normalen poliferierenden Zellen, was zu Knochenmarksdepression oder zu gastrointestinaler Toxizität führen kann. Ein wirkungsvoller Stammzelleninhibitor würde diese Zellen schützen und die Optimierung dieser therapeutischen Behandlungen erlauben. Da es eine nachgewiesene Notwendigkeit für eine Vielzahl von stimulierenden Zytokinen (i.e., Zytokine wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5,IL-6, 1L-7, IL-9,IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, Erythropoetin, Thrombopoetin, Stammzellenfaktor, flk2/flt3 Ligand, usw., welche das Zyklieren von hämatopoetischen Zellen stimulieren) abhängig von der klinischen Situation gibt, so ist es wahrscheinlich, dass eine Vielzahl von inhibitorischen Faktoren benötigt wird, um verschiedene klinische Bedürfnisse anzusprechen.
Ferner gibt es eine Notwendigkeit die Aktivität eines solchen Inhibitors rasch umzukehren. Die ursprünglichen Studien von Lord et al. (oben angeführte Abhandlungen) zeigten, dass die inhibierende Aktivität durch Zugabe der stimulierenden Aktivität umgekehrt werden kann. Während eine Vielzahl von stammzellenstimulierenden Zytokinen identifiziert wurden (siehe oben), wurde für keines gezeigt, dass es die durch Lord und Mitarbeiter beschriebene Aktivität aufweist, wenn es in Knochenmarkextrakten vorhanden ist und dass es fähig ist die Aktivität des Inhibitors umzukehren.
Hämatopoetische Vorläufer- und Stammzellen kommen bei normalen Ennrachsenen hauptsächlich im Knochenmark vor. Unter bestimmten Bedingung zB Chemotherapie oder Behandlung mit Zytokinen wie G-CSF, treten große Anzahlen von Vorläufer- und Stammzellen in das periphere Blut ein, ein Verfahren, das als "Mobilisierung" bezeichnet wird (abgehandelt in Simmons et al., Stem Cells 12 (suppl 1): 187-202, 1994; Schedinget al. Stem Cells 12 (suppl 1): 203-11, 1994; Mangan, Sem. Oncology 22:202-9, 1995; Moolten, Sem. Oncology 22:271-90, 1995). Unlängst veröffentlichte Daten legen nahe, dass die überwiegende Mehrheit von mobilisierten Vorläufern im Zellzyklus nicht aktiv sind (Roberts and Metcalf, Blood 86:1600-, 1995; Donahue et al., Blood 87:1644-, 1996; Siegert and Serke, Bone Marrow Trans. 17:467-1996; Uchida et al., Blood 89:465-72, 1997).
Hämoglobin ist ein hochkonserviertes tetrameres Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 64 000 Daltons. Es besteht aus zwei Alpha- und zwei Betaketten. Jede Kette bindet ein einzelnes Hämmolekül (Ferroprotoporphyrin IX), eine Eisen enthaltende prosthetische Gruppe. Alpha- und Betaketten von Wirbeltieren wurden wahrscheinlich von einem einzigen Urgen erhalten, das duplizierte und dann divergierte; die zwei Ketten enthalten einen großen Grad an Sequenzidentität sowohl zwischen einander als auch zwischen verschiedenen Wirbeltieren (siehe 16A). Bei Menschen enthält der Alphakettencluster am Chromosom 16 zwei Alphagene (Alpha1 und Alpha2) die für identische Polypeptide kodieren, sowie Gene die für andere alphaähnliche Ketten kodieren: Zeta, Theta und mehrere nichttranskribierte Pseudogene (siehe 16B in Bezug auf cDNA and Aminosäurensequenzen der humanen Alphakette). Der Betakettencluster am Chromosom 11 betsteht aus einem Betakettengen und mehreren betaähnlichen Genen: Delta, Epsilon, G Gamma and A Gamma, sowie mindestens zwei nicht exprimierten Pseudogenen (siehe 16C in Bezug auf cDNA and Aminosäuresequenzen der humanen Betakette).
Die Expression dieser Gene variiert während der Entwicklung. Bei humaner Hämatopoese, die extensiv charakterisiert wurde, synthetisieren embryonische Erythroblasten sukzessive Tetramere von zwei Zetaketten und zwei Epsilonketten (Gower I), zwei Alphaketten and zwei Epsilonketten (Gower II) oder zwei Zetaketten und zwei Gammaketten (Hb Portland). Wenn die Embryogenese fortschreitet besteht die vorherrschende Form aus fötalem Hämoglobin (Hb F), welches aus zwei Alphaketten und zwei Gammaketten zusammengesetzt ist. Adultes Hämoglobin (zwei Alpha- und zwei Betaketten) beginnt während der fötalen Periode synthetisiert zu werden; bei der Geburt ist ungefähr 50% des Hämoglobins in der adulten Form und der Übergang Übergang ist in einem Lebensalter von etwa 6 Monaten abgeschlossen. Die überwiegende Mehrheit des Hämoglobin (ungefähr 97%) im Erwachsenen ist von der Art mit zwei Alpha- und zwei Betaketten (Hb A) wobei kleine Mengen an Hb F oder Deltakette (Hb A₂) nachweisbar sind.
Verschiedene Verfahren wurden verwendet um rekombinante Hämoglobinketten in E.coli und in Hefe zu exprimieren (zB Jessen et al., Methods Enz. 231:347-364, 1994; Looker et al., Methods Enz. 231:364-374, 1994; Ogden et al., Methods Enz. 231:374-390, 1994; Martin de Llano et al., Methods Enz. 231:364-374, 1994). Es war bisher noch nicht möglich isolierte humane Alphakette in großen Mengen durch rekombinante Verfahren zu exprimieren (zB Hoffman et al., PNAS 87:8521-25, 1990; Hernan et al., Biochem. 31:8619-28, 1992). Offensichtlich nimmt die isolierte Alphakette keine stabile Gestalt an, und wird in E. coli. rasch abgebaut. Co-Expression von Betakette mit Alphakette führt zu erhöhter Expression von beiden (Hoffman et al. und Hernan et al., op. cit.). Obwohl die Alphakette als ein Fusionsprotein mit einem Abschnitt der Betakette und einer Faktor-Xa-Erkennungsstelle exprimiert wurde (Nagai und Thorgersen, Methods Enz. 231:347-364, 1994) wird sie als ein unlöslicher Einschlusskörper unter diesen Bedingungen exprimiert.
Sowohl die Betakette als auch die Alphakette enthalten Bindungsstellen für Haptoglobin. Haptoglobin ist ein Serumprotein mit extrem hoher Affinität für Hämoglobin (zB Putnam in The Plasma Proteins – Structure. Function and Genetic Control (F. W. Putnam, Ed.) Vol. 2, pp 1-49 (Academic Press, NY); Hwang und Greer, JBC 255:3038-3041, 1980). Haptoglobintransport zur Leber ist der bedeutendste katabolische Pfad für zirkulierendes Hämoglobin. Es gibt eine einzige Bindungsstelle für Haptoglobin an der Alphakette (Aminosäuren 121-127) und zwei an der Betakette (Aminosäurenbereiche 11-25 und 131-146) (Kazim and Atassi, Biochem J. 197:507-510, 1981; McCormick and Atassi, J. Prot. Chem. 9:735-742, 1990).
Biologisch aktive Peptide mit Opiataktivität wurden durch proteolytischen Abbau von Hämoglobin erhalten (abgehandelt in Karelin et al., Peptides 16:693-697, 1995). Die Hämoglobin-Alphakette hat eine säurelabile Spaltungsstelle zwischen den Aminosäuren 94-95 (Shaeffer, J. Biol. Chem. 269:29530-29536, 1994).
Kregler et al. (Exp. Hemat. 9:11-21, 1981) haben offenbart, dass Hämoglobin eine erhöhende Aktivität auf Mäuseknochenmark-CFU-C-Vorläuferkolonien hat. Solche Versuche zeigen Effekte auf CFU-GM- und CFU-M-Vorläuferpopulationen im Gegensatz zu Stammzellen wie CFU-MIX. Die Autoren beobachteten Aktivität sowohl in isolierten Alpha- als auch Betaketten von Hämoglobin. Diese Aktivität wurde durch Behandlung mit N-Ethylmaleimid aufgehoben, was Kregler et al. nahelegte, dass Sulfhydrylgruppen notwendig waren. Diese Beobachtung gekoppelt mit der Tatsache, dass die stimulierende Aktivität gegen Trypsinabbau beständig war, legten Kregler et al. nahe, dass die C-terminate hydrophobe Domäne oder "core"-Region für die Aktivität verantwortlich war. Moqattash et al. (Acta. Haematol. 92:182-186, 1994) haben offenbart, dass rekombinantes Hämoglobin eine stimulierende Wirkung auf die CFU-E-, BFU-E- und CFU-GM-Vorläuferzellanzahl hat, was ähnlich ist zu dem, was für Hämin beobachtet wurde. Mueller et al. (Blood 86:1974, 1995) haben offenbart, dass gereinigtes adultes Hämoglobin Erythroid-Vorläufer in einer Weise ähnlich zu jenen von Hämin stimuliert.
Petrov et al. (Bioscience Reports 15:1-14, 1995) offenbaren die Verwendung einer "nichtidentifizierten Myelopeptidmischung" in der Behandlung von angeborener Anämie, in der W^v/W^v Maus. Die Mischung erhöhte die Zahl der Milzkolonien, insbesondere jener des Erythroidtyps.
Häm und Hämin wurden ausführlich in Bezug auf ihre Einflüsse auf Hämatopoese untersucht (siehe S. Sassa, Seminars Hemat. 25:312-20, 1988 and N. Abraham et al., Int. J. Cell Cloning 9:185-210, 1991 für Abhandlungen). Häm ist für die Reifung von Erythroblasten erforderlich; in vitro erhöht Hämin (Chloroferroprotoporphyrin IX – d.h., Häm mit einem zusätzlichen Chloridion) die Proliferation von CFU-GEMM, BFU-E und CFU-E. Ähnlich erhöht Hämin die Zellularität in Langzeitknochenmark-Kulturen.
"Opiate" sind Substanzen mit schmerzstillenden Eigenschaften ähnlich wie Morphium, die am meisten aktive Substanz in Opium. Opiate können kleine organische Moleküle wie Morphium und andere Alkaloide oder synthetische Verbindungen, oder endogene Peptide wie Enkephaline, Endorphine, Dynorphine oder ihre synthetisch Derivate sein. Endogene Opiatpeptide werden in vivo von größeren Vorläufern erzeugt – Pre-proenkephalin A für Met- und Leu-Enkephaline, Pre-Proopiomelanocortin für α-, β-, und γ-Endorphine, und Pre-Prodynorphin für Dynorphine A and B, α-Neoendorphin und β-Neoendorphin. Zusätzlich können Peptide mit Opiataktivität von nicht klassischen Quellen wie Proteolyse oder Hydrolyse von Proteinen wie α- oder β-Casein, Weizengluten, Lactalbumin, Zytochrome oder Hämoglobin, oder von anderen Spezies wie Froschhaut (Dermorphine) oder bovinem Nebennierenmark erhalten werden. Solche Peptide wurden "Exorphine" genannt, im Gegensatz zu den klassischen Endorphinen; sie werden auch als atypische Opiatpeptide bezeichnet (Zioudrou et al., JBC 254:2446-9, 1979; Quirion and Weiss, Peptides 4:445, 1983; Loukas et al., Biochem. 22:4567, 1983; Brantl, Eur. J. Pharm. 106:213-14, 1984; Brantl et al., Eur. J. Pharm. 111:293-4, 1985; Brantl et al., Eur. J. Pharm. 125:309-10, 1986; Brantl and Neubert, TIPS 7:6-7, 1986; Glamsta et al., BBRC 184:1060-6, 1992; Teschemacher, Handbook Exp. Pharm. 104:499-28, 1993; Petrov et al., Bioscience Reports 15:1-14, 1995; Karelin et al., Peptides 16:693-7, 1995). Für andere endogene Peptide, wie für die Tyr-MIF-1-Familie, wurde ebenfalls gezeigt, dass sie Opiataktivität haben (Reed et al., Neurosci. und Biobehav. Rev. 18:519-25, 1994).
Opiate üben ihre Effekte aus, indem sie an drei pharmakologische Hauptklassen von endogenen Opiatrezeptoren binden – My, Delta und Kappa. Rezeptoren, die jede pharmakologische Klasse darstellen, wurden geklont und es wurde gezeigt, dass sie G-linked-Rezeptoren gekoppelt an G; sind (abgehandelt in: Reisine and Bell, TINS 16: 506-510, 1993; Uhl et al., TINS 17:89-93, 1994; Knapp et al., FASEB J. 9:516-525, 1995; Satoh and Minami, Pharm. Ther. 68:343-64, 1995; Kieffer, Cell. Mol. Neurobiol. 15:615-635, 1995; Reisine, Neuropharm. 34:463-472, 1995; Zaki et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 36:379-401, 1996).
Spezielle Agonisten und Antagonisten sind für jeden Rezeptortyp verfügbar zB für My-Rezeptoren (welche selektiv durch DAMGO und DALDA aktiviert werden und selektiv durch CTOP und Naloxonazin antagonisiert werden), für Kappa-Rezeptoren (welche selektiv durch GR 89696 Fumarat oder U-69593 aktiviert werden und selektiv durch nor-Binaltorphiminhydrochlorid antagonisiert werden) und für Delta-Rezeptoren (welche selektiv durch DADLE und DPDPE aktiviert und selektiv durch Natrindol antagonisiert werden). Zusätzlich gibt es Breitbandantagonisten (wie Nalkoxon) und -agonisten (wie Etorphin), die auf alle drei Rezeptoruntertypen wirken.
Sowohl klassische als auch atypische Opiatpeptide können chemisch verändert oder derivatisiert werden um ihre speziellen Opiatrezeptorbindungseigenschaften zu verändern (abgehandelt in Hruby und Gehrig, Med. Res. Rev. 9:343-401, 1989; Schiller, Prog. Med. Chem. 28: 301-40, 1991; Teschemacher, Handbook Exp. Pharm. 104:499-28, 1993; Handbook of Experimental Pharmacology, A. Hertz (Ed.) volumes 104/I and 104/II, 1993, Springer Verlag, Berlin; Karelin et al., Peptides 16:693-7, 1995). Beispiele enthalten Derivate von Dermorphin (zB DALDA) und Enkephaline (zB DADLE, DAMGO oder DAMME). Peptide die normalerweise nicht an Opiatrezeptoren binden, wie Somatostatin können ebenfalls derivatisiert werden, um spezielles Opiatrezeptorbinden zu zeigen (zB CTOP (Hawkins et al., J. Pharm. Exp. Ther. 248:73, 1989)). Analoga können auch von Alkaloiden wie Morphium mit geänderten Rezeptorbindeeigenschaften erhalten werden (zB Heroin, Codein, Hydromorphon, Oxymorphon, Levorphanol, Levallorphan, Codein, Hydrocodon, Oxycodon, Nalorphin, Naloxon, Naltrexon, Buprenorphin, Butanorphanol und Nalbuphin); zusätzlich können kleine Moleküle, die strukturell mit Morphium nicht verbunden sind, ebenfalls auf Opiatrezeptoren wirken (zB Meperidin und seine Begleitstoffe Alphaprodin, Diphenoxylat und Fentanyl) (siehe Handbook of Experimental Pharmacology, op. cit.; Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. 7thEd., A. G. Gilman, L. S. Goodman, T. W.Rall and F. Murad (Eds.) 1985 Macmillan Publishing Co. NY).
Die endogenen Opiatpeptide (Enkephaline, Endorphine und Dynorphine) haben konservierte N-terminale Tetrapeptide Tyr-Gly-Gly-Phe, gefolgt durch Leu oder Met und irgendeine verbleibende C-terminale Sequenz. Die Entfernung der Hydroxylgruppe am N-terminalen Tyr (die zu einem N-terminalen Phe führt) führt zu einem dramatischen Verlust von Aktivität für Met-Enkephalin. Diese strukturellen Daten führen zu der "message-address" Hypothese, nach der die N-terminale "message" biologische Aktivität verleiht, wohingegen die C-terminale "address" Spezifität und verbesserte Wirksamkeit verleiht (Chavkin and Goldstein, PNAS 78:6543-7, 1981). Exorphine haben im allgemeinen ein Tyr-Pro, das das N-terminale Tyr-Gly von klassischen Opitatpeptiden ersetzt; der Prolinrest, glaubt man, verleiht höhere Stabilität gegen Aminopeptidaseabbau (Shipp et al., PNAS 86: 287-, 1989; Glamsta et al., BBRC 184:1060-6, 192).
Vor kurzem wurde ein Orphanrezeptor ("ORL1") aufgrund von Sequenzverwandschaft zu den My-, Delta- und Kappa-Opiatrezeptoren geklont (Mollereau et al., FEBS 341:33-38, 1994; Fukuda et al., FEBS 343:42-46, 1994; Bunzow et al., FEBS 347:284-8, 1994; Chen et al., FEBS 347:279-83, 1994; Wang et al., FEBS 348:75-79, 1994; Keith et al., Reg. Peptides 54 143-4, 1994; Wick et al., Mol. Brain Res. 27: 37-44, 1994, Halford et al., J. Neuroimmun. 59:91-101, 1995). Der Ligand für diesen Rezeptor, verschieden genannt Nociceptin oder Orphanin FQ (im folgenden als "Nociceptin" bezeichnet), wurde geklont und es wurde gezeigt, dass er ein Heptadecapeptid ist, das von einem größeren Vorläufer erhalten wurde (Meunier et al., Nature 377:532-535, 1995; Reinscheid et al., Science 270:792-794, 1995). Es wurde demonstriert, dass er in vivo pronociceptive und Hyperalgesie-Funktionen hat, im Gegensatz zu klassischen Opiaten, die schmerzlindernde Eigenschaften haben. Nociceptin hat ein Phe-Gly-Gly-Phe... N-terminates Motiv im Gegensatz zu dem Tyr-Gly-Gly-Phe... N-terminalen Motiv von klassischen Opiatpeptiden, die oben abgehandelt wurden. Bei Beibehalt des Erfordernis für ein N-terminates Tyr für Opiataktivität in klassischen Opiatpeptiden zeigt Nociceptin wenig oder keine Affinität für My-, Kappa- oder Delta-Opiatrezeptoren. Ähnlich hat der Breitbandopiatantagonist Naloxon keine nennenswerte Affinität für ORL1.
Enkephaline wurden beobachtet, dass sie Effekte auf murine Hämatopoese in vivo unter Bedingungen von Immobilisierungsstress haben (Goldberg et al., Folia Biol. (Praha) 36:319-331, 1990). Leu-Enkephalin inhibierte und Met-Enkephalin stimulierte Knochenmarkhämatopoese. Diese Effekte waren indirekt, glaubte Goldberg et al., aufgrund von Effekten auf Glucocorticoidniveaus und T-Lymphozyten-migration. Krizanac-Bengez et al. (Biomed. & Pharmacother. 46:367-43, 1992; Biomed. & Pharmacother. 49:27-31, 1995; Biomed. & Pharmacather. 50:85-91, 1996) schauten auf die Effekte dieser Verbindungen in vitro. Vorbehandlung von murinem Knochenmark mit Met- oder Leu-Enkephalin oder Naloxon beeinflusste die Anzahl von GM-Vorläuferzellen, die in einem Kolonieversuch beobachtet wurden. Dieser Effekt war stark variabel und führte zu Suppression, Stimulation oder keinem Effekt; ferner gab es keine klare Dosis-Antwort. Diese Variabilität wurde von Krizanac-Bengez et al. Tag-Nacht-Rhythmen und akzessorischen Zellen zugeschrieben.
Vor kurzem wurde demonstriert, dass Mäuse in welchen der My-Opiatrezeptor durch homologe Rekombination entfernt wurde, erhöhte Anzahlen von CFU-GM, BFU-E und CFU-GEMM pro Oberschenkelknochen haben. Knochenmark- und Milzvorläufer zirkulierten rascher in diesen My-Rezeptor-Knockout-Mäusen im Vergleich zu normalen Mäusen. Es wurden nicht bestimmt ob diese Effekte aufgrund direktem oder indirektem Effekt auf Knochenmarkstammzellen resultierend von dem Fehlen des My-Rezeptors in diesen Tieren vorhanden waren (Broxmeyer et al., Blood 88:338a, 1997).
I. Chemotherapie und Strahlungstherapie von Krebs
Produktive Forschung in Bezug auf stimulierende Wachstumsfaktoren hat zur klinischen Verwendung einer Anzahl dieser Faktoren (Erythropoetin, G-CSF, GM-CSF, usw.) geführt. Diese Faktoren haben die Mortalität und Morbidität, die mit chemotherapeutischen und Bestrahlungsbehandlungen verbunden sind, verringert. Weitere klinische Vorteile für Patienten, die sich einer Chemotherapie oder Bestrahlung unterziehen, konnten durch eine alternative Strategie des Blockierens des Eintritts von Stammzellen in den Zellzyklus und dadurch durch Schützen derselben vor toxischen Nebenwirkungen, realisiert werden. Die Umkehrung dieses Schutzes, wird die rasche Erholung der Knochenmarksfunktion nach einer Chemo- oder Strahlungstherapie erlauben.
II. Knochenmark- und Stammzellentransplantation, Ex Vivo- Stammzellenexpansion und Tumorentfernung
Knochenmarkstransplantation (BMT) ist eine nützliche Behandlung für eine Vielzahl von hämatologischen autoimmunen und malignen Erkrankungen. Derzeitige Therapien enthalten hämatopoetische Zellen, die von Nabelschnurblut, fötaler Leber oder von peripherem Blut (entweder nicht mobilisiert oder mobilisiert mit Mitteln wie G-CSF oder Cyclophosphamid) sowie von Knochenmark erhalten werden; die Stammzellen können nicht gereinigt, teilweise gereinigt (zB Affinitätsreinigung der CD34+ Population) oder hoch gereinigt (zB durch einen fluoreszenzaktivierten Zellsorter unter Verwendung von Marker wie CD34, CD38 oder Rhodamin) sein. Ex vivo-Manipulation von hämatopoetischen Zellen wird derzeit verwendet um primitive Stammzellen auf eine Population zu expandieren, die für die Transplantation geeignet ist. Optimierung dieses Verfahrens erfordert: (1) ausreichende Anzahl von Stammzellen, die fähig sind Langzeitwiederherstellung von Hämatopoese aufrecht zu erhalten; (2) die Verarmung von Graft-versus-Host-induzierenden T-Lymphozyten und (3) das Fehlen von verbleibenden malignen Zellen. Dieses Verfahren kann durch Miteinbeziehen von (einem) Stammzelleninhibitor (en) und/oder (einem) Stammzellenstimulator (en) optimiert werden.
Die Effektivität der Bereinigung von hämatopoetischen Zellen mit zytotoxischen Arzneimitteln um die restlichen malignen Zellen zu eliminieren, ist begrenzt aufgrund der Toxizität dieser Verbindungen für normale hämatopoetische Zellen und insbesondere für Stammzellen. Es besteht eine Notwendigkeit für effektvollen Schutz von normalen Zellen, während der Bereinigung; Schutz kann durch Herausnehmen der Stammzellen aus dem Zyklus mit einem effektvollen Inhibitor gewährt werden.
III. Periphere Stammzellenernte
Periphere Blutstammzellen (PBSC) bieten eine Anzahl von möglichen Vorteilen gegenüber Knochmark für autologe Transplantation. Patienten ohne geeignete Knochenmarksammelstelle aufgrund Tumorbetroffenheit oder vorangegangener Radiotherapie können sich immer noch PBSC Sammlungen unterziehen. Die Verwendung von Blutstammzellen eliminiert die Notwendigkeit einer allgemein Anästhesie und eines chirurgischen Verfahrens bei Patienten, die dies nicht gut tolerieren würden. Die zum Sammeln von Blutzellen notwendige Apharesetechnologie ist effizient und verbreitet bei den meisten bedeutenden medizinischen Zentren verfügbar. Die bedeuternsten Beschränkungen des Verfahrens sind die geringe normale stationäre Zustandsfrequenz von Stammzellen in peripherem Blut und ihr hoher Zykluszustand nach Mobilisierungsverfahren mit Arzneimitteln oder Wachstumsfaktoren (zB Cyclophosphamid, G-CSF, Stammzellenfaktor). Ein wirksamer Stammzelleninhibitor wird nützlich sein, um solche Zellen in einen Ruhezustand zurückzuführen und dabei ihren Verlust durch Differenzierung zu verhindern.
IV. Behandlung von hyperproliferativen Störungen
Eine Anzahl von Erkrankungen ist durch einen hyperproliferativen Zustand charakterisiert, in welchem fehlregulierte Stammzellen eine Überproduktion von Endstadiumzellen hervorrufen. Solche Erkrankungszustände beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Psoriasis, wo eine Überproduktion von Epidermalzellen vorhanden ist, premaligne Bedingungen im Gastrointestinaltrakt, gekennzeichnet durch das Auftre ten von Intestinalpolypen, und AIDS (acquired immune deficiency syndrome), wo frühe Stammzellen nicht mit HIV infiziert sind, aber rasch zyklieren und zu einer Stammzellenerschöpfung führen. Ein Stammzelleninhibitor wird nützlich in der Behandlung solcher Zustände sein.
V. Behandlung von hypoproliferativen Störungen
Eine Anzahl von Erkrankungen ist durch einen hypoproliferativen Zustand charakterisiert, in welchem fehlregulierte Stammzellen eine Unterproduktion von Endstadiumszellen verursachen. Solche Erkrankungszustände beinhalten myelodysplastische Syndrome oder aplastische Anämie, in welcher eine Unterproduktion von Blutzellen vorhanden ist, und Zustände die mit dem Altern verbunden sind, wo ein Mangel in der Zellregeneration und im Zellersatz vorhanden ist. Ein Stammzellenstimulator wird in der Behandlung solcher Zustände nützlich sein.
VI. Gentransfer
Die Möglichkeit genetische Information in hämatopoetische Zellen zu transferieren, wird derzeit im klinischen Rahmen verwendet. Hämatopoetische Zellen sind ein nützliches Ziel für Gentherapie aufgrund des einfachen Zugangs, der umfassenden Erfahrung bei der Manipulation und Behandlung dieses Gewebes ex vivo und aufgrund der Möglichkeit von Blutzellen Gewebe zu durchdringen. Ferner kann die Korrektur von bestimmten humanen genetischen Defekten durch Einbringung eines funktionellen Gens in die primitiven Stammzellen des humanen hämatopoetischen Systems möglich sein.
Es gibt mehrere Beschränkungen für die Einbringung von Genen in humanen hämatopoetische Zellen unter Verwendung von entweder retroviralen Vektoren oder physikalischen Techniken des Gentransfers: (1) Die geringe Frequenz von Stammzellen in hämatopoetischen Geweben hat die Entwicklung von hocheffizienten Gentransfertechniken notwendig gemacht; und (2) rascher zyklierende Stammzellen haben sich als geeigneter für Vektorinfektion herausgestellt, aber die Erhöhung der Infektionsfrequenz durch Stimulation der Stammzellenproliferation mit Wachstumsfaktoren erzeugt negative Effekte auf Langzeit-Genexpression, da Zellen, die die Transgene enthalten, gezwungen werden irreversibel zu differenzieren und ihre Selbsterneue rung verlieren. Diese Probleme können durch die Verwendung eines Stammzelleninhibitors zur Verhinderung der Differenzierung und des Verlustes der Selbsterneuerung und eines Stammzellenstimulators zur Regulierung des Eintritts von Stammzellen in den Zyklus und dabei zur Erleichterung des retroviral vermittelten Gentransfers, verbessert werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbindungen einschließlich Peptiden und Polypeptiden, die Inhibitoren und/oder Stimulatoren der Stammzellenproliferation sind (INPROL und Opiatverbindungen) und ihre Verwendung.
Die vorliegenden Erfindung umfasst einen Inhibitor der Stammzellenproliferation, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

(a) spezifische Aktivität(IC₅₀) geringer oder gleich 20 ng/ml in einem murinen Colony-Forming-Spleen-Assay (CFU-S) (siehe Beispiel 4),
(b) Molekulargewicht größer als 10.000 und geringer als 100.000 Daltons (durch Ultrafiltration),
(c) Aktivität sensitiv für Abbau durch Trypsin,
(d) hydrophober als MIP-1α oder TGFβ und trennbar von beiden durch Reverse-Phase-Chromatographie (siehe Beispiel 12),
(e) biologische Aktivität beibehaltend nach Erwärmen für eine 1 Stunde bei 37°C, 55°C oder 75°C in wässriger Lösung und
(f) biologische Aktivität beibehaltend nach Präzipitation mit 1 % Salzsäure in Aceton.

Die vorliegende Erfindung ist ferner gekennzeichnet und unterschieden von anderen Kandidatstammzelleninhibitoren (zB MIP-1α, TGFβ und verschiedenen Oligopeptiden) durch sein Fähigkeit Inhibierung in einem in vitro-Assay nach einem kurzen Präinkubationszeitraum zu erzielen (siehe Beispiel 5).
Die vorliegende Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die INPROL für die Behandlung einer Vielzahl von Störungen enthält.
Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts, das erwartet einem Mittel ausgesetzt zu werden, das fähig ist Stammzellen zu töten oder zu schädigen, durch Verabreichung einer wirksamen Menge von der Stammzelleninhibitorzusammensetzung an das Subjekt. Die durch dieses Verfahren geschützten Stammzellen können hämatopoetische Stammzellen sein, die normalerweise in Knochenmark, dem Nabelschnurblut, der fötalen Leber vorhanden sind und sich teilen, oder in die periphere Blutzirkulation mobilisiert sind. Während die Mehrheit der mobilisierten Stammzellen gemäß Analyse mit fluoreszenzaktiviertem Zellsorter (FACS) ruhend sind, wurde gezeigt, dass die multipotentialen Stammzellen zyklieren und durch INPROL in stammzelleninhibitorischen Mengen inhibierbar sind. Alternativ können die Stammzellen epithelial sein, und zB in den Gedärmen oder der Kopfhaut oder anderen Bereichen des Körpers angeordnet sein, oder Keimzellen sein, die in den reproduktiven Organen angeordnet sind. Das Verfahren dieser Erfindung kann wünschenswerterweise an Menschen angewandt werden, obwohl die Behandlung von Tieren, durch dieses Verfahren ebenfalls umfasst ist. Wie sie hier verwendet sind betreffen die Ausdrücke "Subjekt" oder "Patient" ein Tier wie ein Säugetier, einschließlich des Menschen.
Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts mit hypoproliferativen Stammzellen durch Verabreichung einer wirksamen Menge von einer Stammzellen stimulierenden Zusammensetzung an das Subjekt. Die durch dieses Verfahren stimulierten Stammzellen können hämatopoetische Stammzellen sein, die normalerweise in Knochenmark, Nabelschnurblut, fötaler Leber vorhanden sind, oder in die periphere Blutzirkulation mobilisiert sind; solche Stammzellen können zuvor durch die Verwendung von INPROL in stammzelleninhibitorischen Mengen in den Ruhezustand versetzt worden sein. INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen wird die Stimulierung des Zyklierens der Stammzellen erlauben, wenn es erwünscht ist – zB nach der Gewinnung von Stammzellen für die Verwendung während ex vivo-Expansion, oder in vivo nachfolgend auf eine Stammzellentransplantation und -einbringung. Alternativ können Stammzellen epithelial sein, und zB in den Gedärmen oder der Kopfhaut oder anderen Bereichen des Körpers angeordnet sein, oder Keimzellen sein, die in reproduktiven Organen angeordnet sind.
In einem anderen Aspekt schafft die Erfindung ein Verfahren zum Schutz und zur Wiederherstellung des hämatopoetischen, Immun- oder anderen Stammzellensystem eines Patienten, der sich einer Chemotherapie unterzieht, welches die Verabreichung einer wirksamen stammzelleninhibitorischen Menge von INPROL umfasst und/oder um die Genesung nach Chemotherapie oder Bestrahlung zu stimulieren, durch Verabreichung einer wirksamen stammzellenstimulierenden Menge von INPROL.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur zusätzlichen Behandlung jedes Krebses, einschließlich jener die durch solide Tumore (zB Brust-, Dickdarm-, Lungen-, Hoden-, Eierstock-, Leber-, Nieren-, Bauchspeichel-, Gehirntumor, Sarkom) durch Verabreichung einer effektvollen stammzelleninhibitorischen Menge von INPROL an einen Patienten der Krebs hat, um die Stammzellen des Knochenmarks des Gastrointestinaltrakts oder anderer Organe vor den toxischen Effekten der Chemotherapie oder Strahlentherapie zu schützen und/oder um die Genesung nach Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie durch Verabreichung von stammzellenstimulierenden Mengen von INPROL zu stimulieren.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Behandlung von Leukämie (zB chronische myelogene Leukämie, akute myelogene Leukämie, chronische lymphozytische Leukämie, akute lymphozytische Leukämie, Myelom, Hodgkin-Krankheit) umfassend die Behandlung von hämatopoetischen Zellen, die proliferierende Leukämiezellen darinnen haben, mit einer wirksamer Menge von INPROL um die Proliferation von normalen Stammzellen zu inhibieren, und behandeln des Knochenmarks mit einem zytotoxischen Mittel um die Leukämiezellen zu zerstören. Dieses Verfahren kann durch einen nachfolgende Behandlung des Knochenmarks mit anderen Mitteln, die seine Proliferation stimulieren, zB koloniestimulierende Faktoren und/oder INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen verstärkt werden. In einer Ausführungsform wird dieses Verfahren in vivo durchgeführt. Alternativ ist dieses Verfahren auch für ex vivo-Bereinigung und -Expansion von hämatopoetischen Zellen für Transplantation nützlich.
In noch einem weiteren Aspekt umfasst das Verfahren die Behandlung eines Subjekts, das irgendeine Störung verursacht durch proliferierende Stammzellen hat. Solche Störungen, wie Psoriasis, Myelodysplasie, einige Autoimmunerkrankungen, Immun-Depression im Alter, myelodysplastisches Syndrom, aplastische Anämie oder Stammzellenerschöpfung bei AIDS, werden durch Verabreichung einer wirksamen Menge von INPROL an das Subjekt behandelt um die Proliferation von in Frage befindlichen Stammzellen zu inhibieren oder zu stimulieren.
Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren um Stammzellen reversibel vor Schaden durch ein zytotoxisches Mittel, das fähig ist Stammzellen zu töten oder zu schädigen, zu schützen. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirksamen stammzelleninhibitorischen Menge von INPROL an ein Subjekt, das einem solchen Mittel ausgesetzt werden soll.
Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Verfahren zum reversen Stimulieren der Proliferation von Stammzellen während der Genesungsphase nach Chemotherapie oder Bestrahlung. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirksamen stammzellenstimulierenden Menge von INPROL an ein Subjekt, das einem solchen Mittel ausgesetzt werden soll.
Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Einen Inhibitor für Stammzellenproliferation, der durch folgendes Verfahren von Schweine- oder anderem Knochenmark isoliert wurde (siehe Beispiel 12):

(a) Extraktion von Knochenmark und Entfernung von Teilchen durch Filtration,
(b) Wärmebehandlung bei 56°C für 40 Minuten gefolgt von Kühlen im Eisbad
(c) Entfernen des Präzipitats durch Zentrifugieren bei 10.000 g für 30 Minuten bei 4°C,
(d) Säurepräzipitation durch Zugabe des Überstandes zu 10 Volumina gerührten eiskalten Acetons enthaltend 1 Vol.% konzentrierte Salzsäure und Inkubation bei 4°C für 16 Stunden,
(e) Isolierung des Präzipitats durch Zentrifugieren bei 20.000 g für 30 Minuten bei 4°C und Waschen mit kaltem Aceton gefolgt von Trocknen,
(f) Isolieren durch Reverse-Phase-Chromatographie und Beobachtung von Aktivität durch Inhibierung der Koloniebildung bei Knochenmarkszellen, die mit 5-Fluorouracil vorbehandelt wurden und in Anwesenheit von murinem IL-3 inkubiert wurden, sowie durch Absorption bei 280 nm und durch SDS-PAGE.

Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Ein Verfahren zur Reinigung eines Inhibitors der Stammzellenproliferation im wesentlichen frei von anderen proteinartigen Materialen umfassend die vorangegangenen Schritte, wie sie auch detaillierter unten beschrieben sind.
Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Ein Verfahren zur Behandlung von Menschen oder Tieren, in dem ein Inhibitor der Stammzellenproliferation fungiert um die Immunsuppression, die durch Stammzellenhyperproliferation verursacht wurde, zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Ein Verfahren zur Behandlung von Menschen oder Tieren, in dem INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen die Knochenmarksuppression, die durch Stammzellenhypoproliferation verursacht wurde, verbessert.
Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Ein Verfahren zur Behandlung von Menschen oder Tieren, in dem dieser Inhibitor der Stammzellenproliferation verabreicht wird nachdem die Stammzellen durch Aussetzen einer zytotoxischen Medikaments oder einem Bestrahlungsverfahren angeregt wurden zu proliferieren. Stammzellen sind normalerweise ruhend, aber werden nach Chemotherapie dazu stimuliert in den Zellzyklus einzutreten. Dies macht sie sensitiver gegenüber einer zweiten Verabreichung von Chemotherapie; das vorliegende Verfahren schützt sie vor dieser Behandlung.
Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Ein Verfahren zur Behandlung von Menschen oder Tieren, in dem ein Stimulator der Stammzellenproliferation (zB INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen) verabreicht wird, und zwar vor oder nach INPROL in stammzelleninhibitorischen Mengen, um die Knochenmarksregeneration zu unterstützen. Stammzelleninhibitorische Mengen von INPROL verlangsamen die Rate, mit der die Stammzellen den Zellzyklus durchlaufen und schützen gegen Chemotherapie oder Bestrahlung; Stammzellen stimulierende Mengen von INPROL machen diese Inhibierung rückgängig und unterstützen die Knochenmarksgenesung. Umgekehrt können stammzellenstimulierende Mengen von INPROL verwendet werden um die Knochenmarksgenesung zu unterstützen, während stammzelleninhibitorische Mengen darauffolgend verwendet wer den, um die Stammzellen in den Ruhezustand zu bringen, wenn die Knochenmarksgenesung erzielt wurde.
Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Ein Verfahren zur Behandlung von Menschen oder Tieren, in dem dieser Inhibitor der Stammzellenproliferation als ein Adjuvans vor oder zusammen mit Impfung zum Zwecke der Erhöhung der Immunantwort verabreicht wird.
Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Ein Verfahren zur Behandlung von Immunschwäche bei Säugetieren, umfassend die Verabreichung einer immunstimulierenden Menge von INPROL an das Säugetier.
Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Ein Verfahren zur Behandlung von Schmerz bei einem Säugetier, umfassend die Verabreichung einer schmerzstillenden Menge von INPROL an das Säugetier.
Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Ein Verfahren zur Behandlung von Menschen oder Tieren, die zytotoxische Arzneimittel oder Bestrahlungsbehandlung erhalten, welches die Verabreichung einer wirksamen Menge des Inhibitors der Stammzellenproliferation umfasst, um die Stammzellen gegen Schaden zu schützen.
Die vorliegende Erfindung schafft auch:
Ein Verfahren zur Behandlung von Menschen oder Tieren, die zytotoxische Arzneimittel oder Bestrahlungsbehandlung erhalten, welches die Verabreichung einer wirksamen stammzellenstimulierenden Menge von INPROL umfasst, um die Genesung nach Behandlung zu verstärken.
Die Erfindung enthält auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Hämoglobin und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
Die Erfindung umfasst auch eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend (a) ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Alphakette von Hämoglobin, wobei das Polypeptid die Aminosäuren 1-97 der humanen Alpha Hämoglobinkette ("Peptid 1-97") enthält, und das Polypeptid die Aminosäuren 1-94 der hu manen Alpha-Hämoglobinkette ("Peptid 1-94") enthält, und (b) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können aus einem einzelnen Polypeptid, das aus dieser Gruppe ausgewählt ist, einer Mischung von Polypeptiden, die aus dieser Gruppe ausgewählt sind, oder Polypeptiden von dieser Gruppe, in Form von Dimeren oder Multimeren mit oder ohne Häm zusammengesetzt sein.
Die Erfindung umfasst auch Peptide mit den Sequenzen:
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val ("Peptid 43-55"),
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys,
wobei die beiden Cys-Reste eine Disulfidbindung bilden ("Zyklisches Peptid 43-55"),
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys,
wobei die beiden Cys-Reste durch eine Kohlenstoffbrücke verbunden sind,
Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Va-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala ("Peptid 64-82"), und
ein Peptid, das die ersten 97 N-terminalen Aminosäuren des humanen Alpha-Hämoglobins wie in 16A enthält.
Ebenfalls umfasst von der Erfindung sind Proteine und Peptidsequenzen, die aus modifizierten Versionen der humanen Alphakette bestehen, welche tammzelleninhibitorische und/oder -stimulierende Eigenschaften beibehalten. Solche Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Entfernung oder Modifizierung der Cterminalen hydrophoben Domäne (resultierend in verbesserten Löslichkeitseigenschaften) und/oder Entfernen oder Modifikation der Haptoglobin-Bindedomäne (resultierend in verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften). Die C-terminale hydrophobe Domäne in humanem Alpha-Hämoglobin ist in der Region von Aminosäure 98 (Phenylalanin) bis 141 (Arginin) enthalten und enthält 23 hydrophobe Aminosäuren von insgesamt 44. Die gesamte Domäne oder eine oder mehrere dieser hydrophoben Aminosäuren (6 Alanine, 4 Valine, 8 Leukine, 2 Proline and 3 Phenylalanine) können durch Deletion entfernt werden ("deletierte" C-terminale hydrophobe Domäne). Alternativ können eine oder mehrere dieser Aminosäuren durch eine nichtpolare Aminosäure (zB Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin oder Glutamin) substituiert werden ("substituierte" C-terminale hydrophobe Domäne).
In einer anderen Ausführungsform werden chemische Modifizierungen wie Carboxymethylation, was den hydrophoben Charakter dieser Region vermindert und die Löslichkeit erhöht, verwendet.
In einer anderen Ausführungsform werden hydrophobe Reste mit den entsprechenden hydrophilen Regionen in der humanen Beta Hämoglobinsequenz substituiert. ZB sind in der humanen Beta-Hämoglobinsequenz die Region zwischen Aminosäuren 107(Glycin) und 117 (Histidin) oder die Region zwischen den Aminosäuren 130 (Tyrosin) und 139 (Asparagin) jeweils relativ hydrophil und jede oder beide können durch die äquivalenten hydrophoben Regionen in humanem Alpha-Hämoglobin substituiert werden.
Die Haptoglobin-Bindedomäne ist in der C-terminalen hydrophoben Region enthalten und ist von den Aminosäuren 121-127 umfasst. Diese Region kann durch Deletion in ihrer Gesamtheit entfernt werden oder eine oder mehre Aminosäuren in dieser Region können deletiert werden ("deletierte" C-terminate Haptoglobin-Bindedomäne). Diese Region oder eine oder mehrere Aminosäuren in dieser Region können mit anderen Aminosäuren wie zB Poly-Alanin oder Poly-Glycin oder anderen Aminosäuren, die den Effekt haben die Bindung des Polypeptids an Haptoglobin aufzuheben, aber die stammzelleninhibitorische Aktivität beizubehalten, substituiert werden ("substituierte" C-terminale Haptoglobin-Bindedomäne).
Ebenfalls enthalten in der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die für die oben identifizierten Peptide kodieren, Vektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten und Wirtszellen, die diese Vektoren enthalten. Diese Peptide können unter Verwendung von chemischen Standardtechniken (zB Festphasensynthese) oder unter Verwendung rekombinanter Techniken (einschließlich Fusionsystemen, wie jenes das Glutathion-S-Transferase (D.B.Smith and K.S. Johnson, Gene 67:31-40, 1988), Thioredoxin (La-Vallie et al., Biotechnology 11:187-193, 1993) oder Ubiquitin (Butt et al., PNAS 86:2540-4, 1989; Cherney et al., Biochem. 30:10420-7, 1991; Baker et al., JBC 269:25381-6, 1994; US Patente 5 132 213; 5 196 321 and 5 391 490 und PCT WO 91/17245) einsetzt) synthetisiert werden. Jeder dieser Artikel, jede dieser Anmeldungen und jedes dieser Patente wird hiermit durch Bezugnahme eingebracht.
Die Erfindung enthält auch ein Verfahren zur Durchführung von Gentherapie in einem Säugetier umfassend

a) Entfernen hämatopoetischer Zellen von diesem Säugetier,
b) Behandeln der hämatopoetischen Zellen ex vivo mit einer stammzellenstimulierenden Menge von INPROL,
c) Tranfizieren oder Infizieren dieser hämatopoetischen Zellen mit einem vorbestimmten Gen,
d) in Kontakt bringen der transfizierten hämatopoetischen Zellen ex vivo mit einer stammzelleninhibitorischen Menge von INPROL,
e) Transplantieren der hämatopoetischen Zellen aus Schritt d in dieses Säugetier,
f) gegebenenfalls Behandeln des Säugetiers in vivo mit einer stammzelleninhibitorischen oder -stimulierenden Menge INPROL.

Die Erfindung enthält auch ein Verfahren zur ex vivo-Durchführung von stammzellen-Expansion umfassend die Behandlung dieser hämatopoetischen Zellen mit Stammzelleninhibitorischen Mengen von INPROL und zumindest einem stimulierenden Zytokin. INPROL wird mit den hämatopoetischen Zellen vor, während und/oder nach Kontakt mit dem stimulierenden Zytokin in Kontakt gebracht. Ex vivo-Stammzellen-Expansion erlaubt die Herstellung von ausreichenden Mengen von Stammzellen von begrenzten Quellen wie Nabelschnurblut, fötaler Leber, autologem Knochenmark nach Chemotherapie usw. oder nach Reinigung (zB durch fluoreszenzaktivierten Zel-Isortern unter Verwendung von Markern wie CD34, CD38 oder Rhodamin). Die Möglichkeit zum selektiven Züchten bestimmter hämatopoetischer Zelllinien erlaubt auch dem Kliniker Stammzellentransplantate entsprechend den Notwendigkeiten eines individuellen Patienten speziell zu entwerfen.
Die Erfindung enthält auch ein Verfahren zur Durchführung von ex vivo-Stammzellen-Expansion umfassend die Behandlung hämatopoetischer Zellen mit stammzellenstimulierenden Mengen von INPROL mit oder ohne mindestens einem zusätzlichen stimulierenden Zytokin. INPROL wird mit den hämatopoetischen Zellen vor, während und/oder nach Kontakt mit dem(den) stimulierenden Zytokin(en) in Kontakt gebracht. Ex vivo wird ein Stammzellenstimulator eine Expansion von Stammzellen und/oder Vorgängern erlauben, während ein Stammzelleninhibitor die Stammzellen in ihrem undifferenzierten Zustand halten wird. Das Verfahren kann auch durch die Verwendung von INPROL in stammzelleninhibitorischen Mengen in vivo optimiert werden, um Stammzellen in einem ruhenden Zustand zu halten, bis sie eingebracht werden, wonach INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen verwendet werden kann, um die Knochenmarkregeneration zu stimulieren. Gegebenenfalls können die hämatopoetischen Zellen in zwei Präparate aufgetrennt werden und eine mit stammzellenstimulierenden Mengen von INPROL behandelt werden, um die Expansion der Stammzellen und/oder Vorläufer zu fördern, während das andere mit stammzelleninhibitorischen Mengen von INPROL behandelt wird, um die Stammzellen in ihrem nichtdifferenzierten Zustand zu halten. Die beiden Präparate können dann kombiniert und dem Patienten zugeführt werden.
Die Erfindung enthält auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die enthält (a) INPROL und (b) mindestens eine inhibierende Verbindung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus MIP-1α, TGFβ, TNFα, INFα, INFβ, INFγ, das Pentapeptid pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys, das Tetrapeptid N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro und das Tripeptide Glutathion (Gly-Cys-γGlu).
Die Erfindung enthält auch eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend (a) INPROL und (b) mindestens ein stimulierendes Zytokin ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, Erythropoetin, Thrombopoetin, Stammzellenfaktor, Deltaähnliches Protein und flk2/flt3 Ligand.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen Inhibitor von Stammzellen (INPROL), der verschieden ist von jenen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie MIP-1α, TGFβ, das Tetrapeptid von Frindel und Kollegen oder das Pentapeptid von Paukovits und Mitarbeitern (cf., Wright & Pragnell, 1192 (op. cit.)). Natürlich vorkommendes natives INPROL hat ein Molekulargewicht über 10.000 Daltons durch Ultrafiltration, was es von dem Tetrapeptid, sowie auch dem Pentapeptid unterscheidet. Es ist hydrophober als MIP-1α oder TFGβ in Reverse-Phase-Chromatographie-Systemen, wodurch es sich von diesen Zytokinen unterscheidet. Ferner ist seine Wirkungsart verschieden von jener jedes anderen vorbeschriebenen Inhibitors, indem er in einem in vitro -Assay aktiv ist, wenn er nur während der Präinkubationszeitdauer verwendet wird. MIP-1α zB ist nicht wirksam, wenn es nur während einer Präinkubationszeitdauer verwendet wird (Beispiel 5). Ferner ist natürlich vorkommendes INPROL in einem Assay, das "high proliferative potential cells" (HPP-PFC) misst aktiv, wohinge gen MIP-1α es nicht ist (Beispiel 6). INPROL ist von jenen Stimulatoren, die im Stand der Technik bekannt sind, wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, Enthropoetin, Thrombopoetin, Stammzellenfaktor, und flk2/flt3 Ligand verschieden. Natürlich vorkommendes INPROL hat geringe oder gar keine Sequenzähnlichkeit mit diesen Zytokinen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1-4 zeigen einen SDS-Polyacrylamidgel-Durchgang des Produkts nach jeden Schritt der Reinigung.
1 – Spur 1 ist Chymotrypsinogen, Spur 2 ist Ovalbumin, Spur 3 ist BSA, Spur 4 sind Fraktionen < 30 kD, Spur 5 sind Fraktionen von 30-50 kD and Spur 6 sind Fraktionen von 50-100 kD.
2 – Spur 1 ist nach Ammoniumsulfatpräzipitation (40-80%) und Spuren 2-5 sind DEAE-Fraktionen (Spur Nr.2 stellt die aktive Fraktion dar).
3 – Spur1 ist der Überstand nach Ammoniumsulfatpräzipitation, Spur 2 ist die aktive DEAE Fraktion, Spuren 3-5 stellen Gelfiltrationsfraktionen dar (Spur 5 stellt die aktive Fraktion dar)
4 – Spur 2 stellt das Endprodukt dar.
5 zeigt ein Reverse-Phase-HPLC-Chromatogramm der Endreinigung.
6 zeigt die Einbringung von tritiierten Thymidin (cpm) in Zellen der FDCP-Mixlinie ohne (Kontrolle = 0% Inhibierung) und mit verschiedenen Mengen von INPROL gereinigt aus Schweinknochenmark (pINPROL). Die Daten sind gegen den Kontrollwert genormt.
7 zeigt den Prozentsatz an Zellen in der S-Phase des Zellzyklus nach Behandlung von Mäusen mit Testosteronpropionat (TSP), TSP plus pINPROL oder Träger (Kontrolle). Jede Gruppe enthielt 25 Tiere (3-4 pro Zeitpunkt).
8 zeigt das Überleben von Mäusen, die mit 2 Dosen 5-FU behandelt wurden, mit und ohne pINPROL Behandlung. Jede Gruppe enthielt 30 Tiere.
9 zeigt das Überleben von bestrahlten Mäusen mit und ohne pINPROL Behandlung. Jede Gruppe enthielt 50 Tiere.
Die 10A und 10B zeigen die Regenerierung von normalen Knochenmark-Langzeitkulturzellen 1 Woche (10 A) und 3 Wochen (10 B) nach Behandlung mit Ara-C oder Ara-C plus pINPROL.
11 zeigt das Überleben von Mäusen (75 pro Gruppe) nach letaler Bestrahlung und Transplantation von 3 × 10⁴ Knochenmarkzellen nach Präinkubation mit Medium (Kontrolle) oder pINPROL (25 ng/ml) für 4 Stunden. Das Überleben wurde 30 Tage beobachtet.
Die 12 zeigt die CFU-GM-Anzahl gebildet nach 14 Tagen in Kultur von Knochenmarkszellen von Mäusen nach letaler Bestrahlung und Wiederherstellung mit Spender-Knochenmarkszellen, präinkubiert mit pINPROL oder Medium für 4 Stunden.
Die 13 zeigt Suspensionszellen von Lymphoidlangzeitkulturen, die jede Woche genommen, ausgewaschen und mit IL-7 (10 ng/ml) nach Präinkubation mit Medium oder pINPROL für 4 Stunden plattiert wurden.
14 zeigt verbesserte Repopulationsfähigkeit für leukämische periphere Blutzellen, die mit pINPROL behandelt wurden. Long term culture initiating cells (LTC-IC) wurden durch Plattieren von adherenten und nichtadherenten LTC Zellen mit und ohne pINPROL, und durch Zählen von CFU-GM am Tag 7 gemessen. Die Daten wurden auf Kontrollwerte genormt.
15A zeigt ein C4-Reverse-Phase-Chromatogramm von gereinigtem pINPROL eluierend bei 53% Acetonitril. Spur 1 ist das Rohmaterial, Spur 2 sind Molekulargewichtsmarker und Spur 3 ist das gereinigte Material. 15B zeigt ein C4-Reverse-Phase-Chromatogramm von MIP-1α eluierend bei 43.9% Acetonitril. 15C zeigt ein SDS-PAGE Chromatogramm des rohen pINPROL-Präparats und des gereinigten Präparats nach reverser Phase.
16 zeigt Hämoglobinsequenzen: 16A zeigt die cDNA und Aminosäurensequenzen von humanem Alpha-Hämoglobin und 16B zeigt die cDNA und Aminosäuresequenzen von humanem Beta-Hämoglobin. Die Nummerierung entspricht der Aminosäure. 16C zeigt einen Aminosäurensequenzvergieich der Alpha- und Betaketten von humanen, murinen und Schweinehämoglobinen.
17 zeigt einen Vergleich der C4-Reverse-Phase-HPLC-Spuren von pINPROL (17A) und des kristallisierten Schweinehämoglobins (17B).
18 zeigt ein SDS-PAGE-Gel von Fraktionen von einer C4-Reverse-Phase-HPLC-Trennung von kristallisiertem Schweinehämoglobin. Spur 1 zeigt Molekulargewichtsmarker, Spur 2 zeigt Fraktionen 48-49, erhalten von dem ersten Peak (bei 47.11 min), Spur 3 zeigt Fraktionen 50-51, erhalten von dem zweiten Peak (bei 49.153 min), Spur 4 zeigt Fraktionen 54-55, erhalten von dem dritten Peak (bei 52.25 min) und Spur 5 zeigt Fraktionen 56-57, erhalten von vierten Peak (bei 53.613 Minuten).
19 zeigt einen Vergleich der 2-dimensionalen Gelelektrophoresen von pINPROL (19A) und des gereinigten Schweinebetahämoglobins (19B).
20 zeigt einen Vergleich der Effekte von gereinigtem Schweine-Alphahämoglobin, -Betahämoglobin oder pINPROL im FDCP-MIX Assay.
21 zeigt die Reverse-Phase-Trennung von Schweinehämoglobin unter Verwendung eines flachen Elutionsgradienten.
22A zeigt das Plasmid von Hochuli et al., (1988); 22B zeigt das Plasmid von Loetscher et al., (1991); 22C zeigt das pDSUb Plasmid.
23 zeigt die Ergebnisse der Behandlung mit INPROL beim Cobbiestone Assay.
Damit die hier beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann, wird die folgende detailierte Beschreibung gegeben. Diese Beschreibung soll, wenn sie auch exemplarisch für die vorliegenden Erfindung ist, nicht als die Erfindung besonders beschränkend ausgelegt werden, und solche Abänderungen, welche im Können des Fachmannes auf diesem Gebiet liegen, sind als unter den Umfang dieser Erfindung fallend anzusehen.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
INPROL inhibiert oder stimuliert reversibel die Teilung von Stammzellen. Während nicht gewünscht wird an eine spezielle Theorie gebunden zu sein, üben Stammzelleninhibitor und -stimulatoren vermutlich ihre Effekte durch Beeinflussung der Rate, mit der Stammzellen den Zellzyklus durchlaufen, aus. Insbesondere ist INPROL effektiv um die Zellteilung von hämapoetischen Stammzellen abhängig von der verwendeten Menge temporär zu inhibieren oder zu stimulieren. Die Möglichkeit klinisch eine Verbindung zu verwenden, die die Stammzellenproliferation inhibieren oder stimulieren kann, erlaubt die ausgezeichnete Steuerung des Zyklierens von hämapoetischen Stammzellen während, zB, Chemotherapie, Stammzellentransplantation oder Gentherapieprotokollen. Somit kann das Verfahren dieser Erfindung eingesetzt werden um die unerwünschten Nebenwirkungen von Chemotherapie auf das hämatopoetische, myeloide und Immunsystem des Patienten zu vermindern und zwar durch Schutz der Stammzellen vor Schaden, der durch chemotherapeutische Mitteln oder Bestrahlung, das bzw. die zur Zerstörung von Krebs- oder viral infizierten Zellen verwendet werden, verursacht wird oder durch Stimulierung der Wiederherstellung nach einem solchen Schaden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird dem Patienten INPROL in einer Dosis verabreicht, die ausreicht die Stammzellenteilung zu inhibieren, während das chemotherapeutische Mittel auf erkrankte Zellen wirkt. Nachdem das chemotherapeutische Mittel seine Funktion ausgeübt hat, werden die durch INPROL inhibierten Stammzellen ohne weitere Behandlung wieder zu sich teilenden Zellen. Wenn es gewünscht ist, die Regenerierung der Hämatopoese zu fördern, können zusätzlich stimulierende Wachstumsfaktoren, Zytokine oder stammzellenstimulierende Mengen von INPROL verwendet werden.
Wie hierin verwendet umfasst der Ausdruck "INPROL" Proteine von Säugetieren und nicht Säugetieren, die wie in den Beispielen gereinigt sind, Hämoglobin, die Alphaket te von Hämoglobin (mit oder ohne der Hämgruppe), die Betakette von Hämoglobin (mit oder ohne der Hämgruppe), Mischungen von Alpha- und Betaketten (mit oder ohne der Hämgruppe) und Fragmente oder Analoga von diesen Proteinen einschließlich embryonischer, fötaler oder adulter Formen (zB Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon- oder Zetakette, entweder allein oder als Mischungen, Dimere oder Multimere, mit oder ohne der Hämgruppe), die die Fähigkeit haben Stammzellenproliferation zu inhibieren und/oder zu stimulieren. Der Ausdruck "INPROL" umfasst natürlich vorkommende sowie nicht natürlich vorkommende (zB rekombinant und/oder synthetisch hergestellte) Formen dieser Proteine. Der Ausdruck "INPROL Polypeptid" bezieht sich auf INPROL, das aus 40 oder mehr Aminosäuren besteht.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck "Opiatverbindungen" Verbindungen einschließlich Opiaten, aber nicht INPROL, welche an Opiatrezeptoren binden (oder an Rezeptoren, die Sequenzverwandschaft zu Opiatrezeptoren aufweisen zB ORL1) und entweder Agonisten, Antagonisten oder gemischte Agonisten/Antagonisten Aktivitäten ausüben. Zum Beispiel gibt es spezielle Agonisten und Antagonisten für My-Rezeptoren (die selektiv durch DAMGO and DALDA aktiviert werden und selektiv durch CTOP und Naloxonazin antagonisiert werden), für Kappa-Rezeptoren (die selektiv durch GR 89696-Fumarat oder U-69593 aktiviert werden und selektiv durch nor-Binaltorphiminihydrochlorid antagonisiert werden) und für Delta-Rezeptoren (welche selektiv durch DADLE und DPDPE aktiviert werden und selektiv durch Natrindol antagonisiert werden). Zusätzlich gibt es Breibandantagonisten (wie Naloxon) und Breitbandagonisten (wie Etorphin), die auf alle drei Rezeptoruntertypen wirken. Nociceptin agonisiert speziell den ORL1-Rezeptor. Opiatverbindungen mit stammzellenstimulierenden und/oder -inhibierenden Aktivitäten können für jede der Anwendungen, die hier für INPROL beschrieben sind, verwendet werden.
Wie hierin verwendet ist "stammzellenstimulierende Menge" jene Menge die Proliferation von Stammzellen induziert. Wie hierin verwendet ist "stammzelleninhibitorische Menge" jene Menge die Proliferation von Stammzellen inhibiert. In allen Fällen, sowohl in vivo als auch ex vivo, wird die ausgewählte Menge von dem speziellen ausgewählten INPROL oder der speziellen ausgewählten Opiatverbindung und von den speziellen Bedingungen oder der speziellen Anwendung abhängen; insbesondere sind äquimolare Dosen von Polypeptiden oder Fragmenten von INPROL aktiv, wie es äquimolare Opiatpeptide oder kleine Moleküle sind.
In einer typischen Kliniksituation wo Stammzelleninhibierung erwünscht ist, wird INPROL einem Patienten in einem täglichen Ablauf durch intravenöse Injektion oder Infusion in Dosiseinheitenform unter Verwendung von zB 0.01 bis 100 mg/kg, vorzugsweise 0.1 bis 1.0 mg/kg INPROL verabreicht, abgegeben, zB, 4 bis 60 Stunden vor herkömmlicher Chemotherapie- oder Strahlenbehandlungen, wenn es erwünscht ist das Stammzellenzyklieren zu inhibieren.
In Situationen wo die Stimulation des Stammzellenzyklierens erwünscht ist, wie um die Genesung nach Chemotherapie oder Bestrahlung zu unterstützen, wird INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen verwendet. Solche Dosen sind typischerweise 1-500 mg/kg, vorzugsweise 10 mg bis 100 mg/kg.
In Fällen wo es erwünscht ist eine Opiatverbindung oder Opiatverbindungen zu verwenden um das Stammzellenzyklieren zu inhibieren oder zu stimulieren, wird bzw. werden die Opiatverbindung(en) in äquimolaren Konzentrationen zu denen, die für INPROL beschrieben sind, verwendet.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung erlaubt die Vorbehandlung mit INPROL in stammzelleninhibitorischen Mengen die Erhöhung der Dosen von chemotherapeutischen Mitteln oder von Bestrahlung über die Dosen, die normalerweise von Patienten toleriert werden. Ebenso erlaubt die Behandlung mit INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen nach Chemotherapie oder nach Strahlung die Erhöhung der normalerweise tolerierten Dosen von Chemotherapie oder Bestrahlung.
Eine große Fraktion von hämatopoetischen Stammzellen ist normalerweise ruhend (langsam oder nicht zyklierend). Jedoch tritt als Kompensationsantwort auf chemotherapeutisch induzierten hämatopoetischen Schaden, ein größerer Anteil. von Stammzellen nach Chemotherapie in den Zyklus, was sie besonders angreifbar durch folgende Dosen von zytostatischer Chemotherapie oder therapeutischer Bestrahlung macht. Durch Inhibieren des Zyklierens solcher Stammzellen, erlaubt INPROL Behandlung frühere oder öftere Abgabe von folgenden Dosen von zytostatischer Chemotherapie, entweder bei herkömmlichen oder erhöhten Dosen.
Einige normale Individuen haben Stammzellen, die spontan rasch zyklieren; INPROL in stammzelleninhibitorischen Mengen ist bei solchen Individuen nützlich, selbst wenn es vor der ersten Dosis Bestrahlung oder Chemotherapie gegeben wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird INPROL (0,1 mg bis 6 g/kg Körpergewicht – vorzugsweise 1,0 to 60 mg/kg) etwa 24 Stunden bis 10 Tage nach einer Anfangsdosis Chemotherapie verabreicht. Nach weiteren 4 bis 60 Stunden vorzugsweise 24 bis 48 Stunden, wird eine weitere Dosis Chemotherapie verabreicht. Dieser Zyklus von alternierend Chemotherapie und INPROL wird entsprechend dem therapeutischen Nutzen fortgesetzt. Chemotherapiemittel und Protokolle für die Verabreichung werden entsprechend der Eignung für spezielle Tumortypen in Standardklinikpraxis ausgewählt. Gegebenenfalls werden stimulierende Wachstumsfaktoren wie G-CSF, Stammzellenfaktor, oder INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen nach Chemotherapie oder Bestrahlungsbehandlung verwendet, um die hämatopoetische Wiederherstellung weiter zu verbessern.
Für ex vivo-Anwendungen werden, in Fällen wo die Inhibierung von Stammzellenproliferation gewünscht ist, 0,1 ng bis 100 ng/10⁶ Zellen/ml, vorzugsweise 2-50 ng/10⁶ Zellen/ml INPROL verwendet. Für Fälle wo die Stammzellenstimulation gewünscht ist, werden 10 ng-100μg/10⁶ Zellen/ml, vorzugsweise 1-100μg/10⁶ Zellen/ml INPROL verwendet.
In Fällen wo es gewünscht ist eine Opiatverbindung oder Opiatverbindungen zu verwenden um Stammzellenzyklieren zu inhibieren oder zu stimulieren, wird (werden) die Opiatverbindung (en) in äquimolaren Konzentrationen zu den für INPROL beschriebenen verwendet.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird INPROL in einem Verfahren zur Herstellung autologer hämatopoetischer Zellen für Transplantation eingesetzt. Die hämatopoetischen Zellen werden ex vivo mit einer wirksamen Menge von INPROL behandelt, um die Stammzellenteilung zu inhibieren, und dann von krebsartigen Zellen durch Verabreichung einer wirksamen Menge von einem chemotherapeutischen Mittel oder Bestrahlung an die Knochenmarkkulturen, gereinigt. Chemotherapiemitteln mit Spezifität für zyklierende Zellen werden bevorzugt. So behandeltes Knochenmark wird in den autologen Spender reinjiziert. Gegebenenfalls wird der Patient mit stammzellenstimulierenden Mengen von INPROL und/oder anderen Mitteln, die bekannt sind Hämatopoese zu stimulieren, behandelt, um die hämatopoetische Wiederherstellung des Patienten zu verbessern. Eine solche Technik erlaubt die effektive Reinigung von Tumorzellen, während autologen Knochenmarkstransplantationen, während die hämatopoetischen Stammzellen geschützt werden. Ein solcher Schutz kann entweder mit ex vivo- oder in vivo- Bereinigungsprotokollen aufgebracht werden. Nachdem sie erfolgreich transplantiert wurden, besteht eine Notwendigkeit für die Stammzellen rasch zu poliferieren um die normale Knochenmarksfunktion wieder herzustellen. Dies kann durch die Verwendung von INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen aufgebracht werden, was das Zyklieren der Stammzellen stimuliert und die Genesung der Knochenmarksfunktion verbessert.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird INPROL in einem Verfahren zur Herstellung hämatopoetischer Zellen für Gentherapie eingesetzt. Die hämatopoetischen Zellen werden ex vivo mit INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen und/oder stimulierenden Zytokin(en) behandelt um Stammzellenteilung zu stimulieren, und dann mit dem Gen bzw. den Genen, die von Interesse sind, transfiziert (vorzugsweise infiziert unter Verwendung zB eines retroviralen Vektors) werden. Nachdem Transfektion erzielt wurde, werden die Zellen gewaschen und mit INPROL in Stammzelleninhibitorischen Mengen behandelt, um die Stammzellen in den Ruhezustand zurückzuführen. So behandeltes Knochenmark wird in den Spender reinjiziert. Gegebenfalls wird der Patient in vivo mit INPROL in stammzelleninhibitorischen Mengen behandelt, um die Stammzellen in ihrem Ruhezustand zu halten, und ihre Knochenmarks-Repopulationsfähigkeit zu erhöhen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird INPROL als eine zusätzliche Therapie in der Behandlung von Leukämie eingesetzt. Zum Beispiel werden in Krankheitsstadien, wo die Leukämiezellen nicht auf INPROL antworten, die hämatopoetischen Zellen ex vivo mit INPROL in stammzelleninhibitorischen Mengen behandelt. Die Proliferation von normalen Stammzellen wird durch Verabreichung von INPROL verhindert. So wird während der Zeit, in der die proliferierenden Leukämiezellen mit einem zellzyklusspezifischen zytotoxischen Mittel behandelt werden, eine Population an normalen Stammzellen vor Schaden geschützt. Zusätzlich wird optional ein stimulierendes Zytokin, wie IL-3, GM-CSF verabreicht um das Zyklieren in den Leukämiezellen während der Arzneimittel- oder Bestrahlungsbehandlung zu induzie ren, während die normalen Stammzellen mit INPROL geschützt werden. Der Patient wird mit Chemotherapiemitteln oder Bestrahlung behandelt, um Leukämiezellen zu zerstören, und das bereinigte Knochenmark wird dann in den Patienten rücktransplantiert um den hämatopoetischen Wiederaufbau zu etablieren.
Ähnlich werden in einer anderen Ausführungsform der Erfindung zu Behandlung von Patienten mit ernsten viralen Infektionen, die Blutzellen oder Lymphozyten beeinträchtigen, wie bei HIV Infektion, hämatopoetische Zellen ex vivo oder in vivo mit INPROL, gefolgt von antiviralen Mitteln, Arzneimitteln die die infizierten Zellen zerstören, oder antikörperbasierenden Systemen zur Entfernung infizierter Zellen behandelt. Nach myeloablativer Antiviral- oder myeloablativer Chemotherapie um virale Wirtszellen in Patienten auszurotten, werden die INPROL behandelten Knochenmarkszellen in den Patienten zurückgegeben.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird INPROL eingesetzt um Störungen verbunden mit hyperproliferativen Stammzellen zu behandeln. Zum Beispiel ist Psoriasis eine Störung, die durch hyperproliferierende epitheliale Zellen der Haut verursacht ist, und wird manchmal mit zytotoxischen Arzneimitteln behandelt. Andere präneoplastische Verletzungen, bei denen Stammzellenproliferation involviert ist, sind ebenfalls zugänglich für wirksame Mengen von INPROL, die eingesetzt werden um die Proliferation von Stammzellen zu inhibieren. Patienten mit AIDS (acquired immune deficiency syndrome) haben abnormal hohe Raten beim Stammzellenzyklieren, was zu einer Stammzellenerschöpfung führt; diese Patienten profitieren auch von der Behandlung mit wirksamen Mengen von INPROL um das Stammzellenzyklieren zu inhibieren. Für diese Verwendungen werden topisch oder transdermal abgebende Zusammensetzungen (zB Salben, Lotionen, Gels oder Pflaster), die INPROL enthalten, als eine Alternative zur parenteralen Verabreichung, wo es angemessen ist, eingesetzt.
In den meisten Fällen von Leukämie sind die Leukämievorgänger differenzierte Zellpopulationen, die durch INPROL nicht angegriffen werden, und die daher durch Verfahren, die INPROL verwenden, wie jene die oben beschrieben sind, behandelt werden. In Fällen wo Leukämievorgänger sehr primitiv sind und direkt sensitiv für die Inhibierung durch INPROL sind, wird die Proliferation von Leukämiezellen durch Verabreichung von wirksamen Mengen von INPROL abgeschwächt.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird INPROL eingesetzt um Störungen in Verbindung mit hypoproliferativen Stammzellen zu behandeln. Zum Beispiel sind myelodysplastische Syndrome und aplastische Anämie Störungen, die durch hypoprolifererierende Stammzellen des Knochenmarks verursacht werden.
Andere Syndrome, bei welchen Stammzellenhypoproliferation involviert ist, sind mit stammzellenstimulierenden Mengen von INPROL behandelbar.
Antikörper, monoklonale oder polyklonale, werden durch Standardtechniken zu den INPROL Peptiden oder Polypeptiden entwickelt. Diese Antikörper oder INPROL Peptide oder Polypeptide werden mit detektierbaren Markern markiert, von welchen viele Arten aus dem Stand der Technik bekannt sind. Das markierte INPROL oder Anti-INPROL-Antikörper werden dann als Stammzellenmarker eingesetzt um Stammzellen durch Verabreichung an einen Patienten direkt für diagnostische Zwecke zu identifizieren und zu isolieren. Alternativ werden diese markierten Peptide, Polypeptide oder Antikörper ex vivo eingesetzt um Stammzellen in einem hämatopoetischen Zellpräparat zu identifizieren um ihre Entfernung vor dem Bereinigen neoplastischer Zellen in dem Knochenmark zu ermöglichen. In ähnlicher Weise werden solche markierten Peptide, Polypeptide oder Antikörper eingesetzt um epitheliale oder andere Stammzellen zu isolieren, und zu identifizieren. Zusätzlich werden solche Antikörper, markiert oder unmarkiert, therapeutisch durch Neutralisierung von INPROL-Aktivität oder diagnostisch durch Detektion von zirkulierenden INPROL-Niveaus eingesetzt.
INPROL kann von menschlichen Gen- oder cDNA-Datenbanken zur Expression von rekombinantem humanen INPROL unter Verwendung von Standardtechniken geklont werden. Zum Beispiel werden unter Verwendung von Sequenzinformation, die von dem gereinigten Protein erhalten wurde, Oligonukleotidsonden aufgebaut, die, zB mit 32-Phosphor, markiert werden können, und verwendet um eine geeignete cDNA-Datenbank (zB von Knochenmark) zu screenen. Alternativ wird eine Expressionsdatenbank von einer geeigneten Quelle (zB Knochenmark) nach cDNA's gescreent, die für INPROL kodieren, wobei Antikörper oder ein geeigneter funktioneller Assay (zB jener der in 2 beschrieben ist) verwendet werden. Hämoglobin selbst, sowie die einzelnen Alpha- und Betaketten wurden unter Verwendung von Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, geklont und exprimiert (siehe Pagnier et al., Rev.Fr. Transfus. Hemobiol. 35:407-15, 1992; Looker et al., Nature 356:258-60, 1992; Methods in Enzymology vol. 231, 1994)
Die vorliegende Erfindung umfasst DNA-Sequenzen, die enthalten: die Einbringung von für die Expression "bevorzugten" Codons durch ausgewählte Nichtsäugetierwirte: das Vorsehen von Stellen zur Spaltung durch Restriktionendonukleaseenzyme; und das Vorsehen von zusätzlichen Anfangs-, End-, oder Zwischen-DNA-Sequenzen, die den Aufbau von rasch-exprimierbaren Vektoren oder die Herstellung oder Reinigung von Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und/oder Zetaketten von Hämoglobin erleichtern.
Die vorliegende Erfindung schafft auch DNA Sequenzen, die für Polypeptidanaloga oder Derivate von Hämoglobin-Alpha, -Beta-, -Gamma-, -Delta-, -Epsilon- und/oder -Zetaketten kodieren, die von natürlich vorkommenden Formen, in Bezug auf die Identität oder die Position einer oder mehrerer Aminosäurereste differieren (i.e., Deletionsanaloga, die weniger als alle speziellen Reste enthalten; Substitutionsanaloga, wo ein oder mehrere spezielle Reste durch andere Reste ersetzt sind; und Hinzufügungsanaloga wo ein oder mehrere Aminosäurereste zu einem End- oder Mittelabschnitt des Polypeptids hizugefügt werden) und die einige oder alle Eigenschaften der natürlich vorkommenden Formen teilen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist INPROL das Produkt von prokaryotischer oder eukaryotischer Wirtexpression (zB durch Zellen von Bakterien, Hefe, höheren Pflanzen, Insekten und Säugetieren in Kultur) von exogenen DNA Sequenzen, die durch genomisches oder cDNA-Klonen oder durch Gensynthese erhalten wurden. Das heisst in einer bevorzugten Ausführungsform ist INPROL "rekombinantes INPROL". Das Expressionsprodukt in typischer Hefe (zB Saccharomyces cerevisiae) oder Prokaryoten-(zB E. coli)-Wirtzellen, ist frei von Assozation mit irgendeinem Säugetierprotein. Die Produkte der Expression in Wirbeltier-(zB nicht humanen Säugetieren (zB COS oder CHO) und Vögeln)-Zellen sind frei von Assozation mit irgendeinem humanen Protein. Abhängig vom eingesetzten Wirt, können die Polypeptide der Erfindung glykosyliert oder nicht glykosyliert sein. Polypeptide der Erfindung enthalten optional auch einen Anfangsmethionin-Aminosäurerest (an Position – 1).
Die vorliegende Erfindung umfasst auch andere Produkte wie Polypeptidanaloga der Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und/oder Zetakette von Hämoglobin. Solche Analoga enthalten Fragmente der Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und/oder Zetakette von Hämoglobin. Folgt man gut bekannten Verfahren, kann man einfach Gene entwerfen und herstellen, die für die mikrobielle Expression von Polypeptiden kodieren, die Primärsequenzen haben, die von jenen hierin angegebenen in Bezug auf die Identitität oder die Anordnung von einem oder mehreren Resten (zB Substitutionen, End- und Zwischeneinfügungen und Deletionen) differieren. Alternativ können Modifikationen von cDNA und genomischen Genen einfach durch gut bekannte stellengerichtete Mutagenesetechniken erreicht und eingesetzt werden um Analoga und Derivate von Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon- oder Zetaketten von Hämoglobin zu erzeugen. Solche Produkte teilen mindestens eine der biologischen Eigenschaften von INPROL, können aber bei anderen differieren. Als Beispiele umfassen die Produkte der Erfindung die Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon- oder Zetaketten, die zB durch Deletionen verkürzt sind; oder jene die stabiler gegen Hydrolyse sind (und daher betontere oder längeranhaltende Effekte als natürlich vollkommende haben); oder die geändert wurden, um eine oder mehrere potentielle Stellen für O-Glykosylation und/oder N-Glykosylation zu entfernen oder hinzuzufügen, oder die ein oder mehrere Cysteinreste entfernt oder ersetzt durch zB Alanin oder Serinreste haben, und einfacher in aktiver Form von Mikrobensystemen isoliert werden können; oder welche ein oder mehrere Tyrosinreste durch Phenylalanin ersetzt haben und mehr oder weniger rasch an Zielproteine oder an Rezeptoren an Zielzellen binden. Ebenfalls umfasst sind Peptid- oder Polypeptidfragmente, die nur einen Teil der kontinuierlichen Aminosäuresequenz oder des Sekundäraufbaus in den Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta-, Epsilon- oder Zetaketten duplizieren, welche Fragmente eine Eigenschaft von INPROL (zB Rezeptorbindung) besitzen können und nicht andere (zB stammzelleninhibitorische Aktivität). Es ist erwähnenswert das Aktivität nicht für eines oder mehrere der Produkte der Erfindung notwendig ist, um therapeutischen Nutzen (siehe Weiland et al., Blut 44:173-5, 1982) oder Nutzen in anderen Zusammenhängen, wie in Assays über inhibierende Faktorantagonismen, zu haben. Kompetitive Antagonisten sind in Fällen von Überproduktion von Stammzelleninhibitoren oder ihres Rezeptors nützlich.
Zusätzlich können Peptide, die von Proteinsequenzen stammen, die biologische Aktivität behalten, unter Verwendung von Standardverfahren chemisch synthetisiert wer den. Die vorliegende Erfindung schafft auch Sequenzen, die für Peptidanaloga oder Derivate von Hämoglobin-Alpha-, -Beta-, -Gamma-, -Delta-, -Epsilon- und/oder Zetaketten kodieren, die von natürlich vorkommenden Formen, im Bezug auf die Identität oder Anordnung von einem oder mehreren Aminosäureresten (zB Deletionsanaloga, die weniger als alle der speziellen Reste enthalten; Substitutionsanaloga, worin ein oder mehrere spezielle Reste durch andere Reste ersetzt sind, entweder natürlich vorkommende oder andere Analoga, die im Stand der Technik als D-Aminosäuren bekannt sind; und Hinzufügung von Analoga, worin ein oder mehrere Aminosäurereste, chemisch modifiziert sind, um die Stabilität, die Löslichkeit und/oder die Resistenz gegen Proteolyse zu erhöhen) und die eine oder alle der Eigenschaften von natürlich vorkommenden Formen teilen.
Peptidsequenzen, wie die oben beschriebenen, können durch eine Vielzahl von Mitteln identifiziert werden. Der Vergleich der dreidimensionalen Strukturen von nativen, im Assay aktiven Hämoglobinketten (zB Alphakette) mit strukturell verwandten Proteinen, die inaktiv sind, (zB Myoglobin) kann Bereiche identifizieren, die verschiedenen Aufbau im dreidimensionalen Raum haben, und die daher Kandidatregionen für aktive Peptide sind. Ein anderer Zugang verwendet die selektive Proteolyse, bei welcher proteolytische Enzyme in begrenztem Abbau von Hämoglobinketten verwendet werden, was zu Peptiden führt, die, zB durch Reverse-Phase-HPLC, getrennt werden können und dann auf Stammzelleninhibierung untersucht werden. Peptide können auch durch chemische Synthese (zB Festphasensynthese) erzeugt werden; eine Reihe von überlappenden Peptiden (zB 15-mere), welche die Sequenz der Hämoglobinkette von Interesse (zB Alphakette) umschließen, können einfach in Stammzellenassays erzeugt und getestet werden. Kombinatorische Datenbanken können erzeugt werden, in welchen multiple chemische Synthesen durchgeführt werden, und wo ausgewählte Aminosäurepositionen verfügbar gemacht werden, was zu einer großen Anzahl von Peptidanaloga zum Screenen führt (zB Dooley et al., Peptide Research 8:124-137, 1995). Alternativ können rekombinante Verfahren eingesetzt werden. Stellengerichtete Mutagenese kann verwendet werden um kritische Reste zu identifizieren, die für die Aktivität einer bestimmten Hämoglobinkette notwendig ist. Regionen einer Kette, die bekannt ist als ein Stammzelleninhibitor aktiv zu sein, (zB Alphakette) können mit Regionen von einem verwandten aber inaktiven Protein (zB Myoglobin) substituiert und in Stammzellenassays getestet werden, was die Identifizierung von für Aktivität notwendigen Regionen erlaubt. Solche identifizierten Regio nen können als Peptide exprimiert werden und auf Aktivität in Stammzellenzyklierungsassays getestet werden.
Homologe oder analoge Versionen von INPROL von anderen Spezies werden in verschiedenen Veterinärverwendungen eingesetzt, ähnlich den therapeutischen Ausführungsformen der Erfindung, wie oben beschrieben.
INPROL in stammzelleninhibitorischen Mengen wirkt auf zyklierende Stammzellen, indem es sie reversibel in einen nicht teilenden oder langsam teilenden "Ruhe"-Zustand bringt. Wenn es gewünscht ist, die ruhenden Stammzellen zur Teilung zu stimulieren, zB nach Behandlung eines Patienten mit Krebschemotherapiemitteln oder Krebsbestrahlung kann INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen verwendet werden. Alternativ oder zusätzlich können dem Subjekt koloniestimulierende Faktoren oder andere hämatopoetische Stimulanzien verabreicht werden. Beispiele solcher Faktoren beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf: M-CSF(CSF-1), GM-CSF, G-CSF, Megakaryocyt-CSF, Thrombopoeitin, Stammzellenfaktor oder andere Zytokine wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, oder Erythropoetin.
INPROL Polypeptide oder aktive Fragmente, die stammzelleninhibitorische Aktivität haben, werden durch herkömmliche chemische Prozesse, verbunden mit geeigneten Bioassys für stammzelleninhibitorische Aktivität, wie in den unten beschriebenen Protokollen veranschaulicht, gereinigt oder synthetisiert.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine therapeutisch wirksame Menge von dem INPROL Protein oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger eingesetzt. Diese INPROL Zusammensetzung wird im Allgemeinen durch eine parenterale Injektion oder Infusion verabreicht. Subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Injektionswege werden entsprechend dem erzielten therapeutischen Effekt ausgewählt.
Bei systematischer Verabreichung ist die therapeutische Zusammensetzung für die Verwendung in dieser Erfindung in der Form einer pyrogenfreien, parenteral annehmbaren, wässrigen Lösung. Eine pharmazeutisch annehmbare sterile Proteinlö sung, die in Bezug auf pH, Isotonizität, Stabilität entsprechend ist, Trägerproteine und der gleichen, liegen im Können des Fachmanns.
Ebenfalls umfasst durch die Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die therapeutisch wirksame Mengen von Peptid-, oder Polypeptidprodukten der Erfindung zusammen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Emulgiermitteln, Adjuvantien, und/oder Trägern, die in der INPROL Therapie nützlich sind, enthalten. Eine "therapeutisch wirksame Menge" wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Menge, die einen therapeutische Effekt für einen gegebenen Zustand und einen gegebenen Verabreichungsrythmus schafft. Solche Zusammensetzungen sind Flüssigkeiten, Gele, Salben oder lyophilisierte oder auf andere Weise getrocknete Formulierungen, und enthalten Lösungsmittel von verschiedenem Puffergehalt (zB Tris-HCL, Acetat, Phosphat), pH und ionischer Stärke, Zusatzstoffe wie Albumin oder Gelatine um die Adsorption an Oberflächen zu verhindern, Detergentien (zB Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, Gallensäuresalze), Lösungsmittel (zB Glycerol, Polyethylenglycol), Anti-Oxidantien (zB Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (zB Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Schüttsubstanzen oder Tonizitätsmodifizierer (zB Laktose, Mannitol), kovalentes Anhängen von Polymeren wie Polyethylenglykol an das Protein, Komplexbildung mit Metallionen oder Einbringung von dem Material in oder auf bestimmte Präparate von Polymerverbindungen wie polylaktische Säure, Polyglykolsäure, Hydrogele usw. oder in Liposome, Niosome, Mikroemulsionen, Myzellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, biologisch abbaubare, injizierbare Mikrokapseln oder Mikrosphären, oder Proteinmatrizen, Erythrozytspuren, Spheroplasten, Hautpflaster oder andere bekannte Verfahren zur Abgabe oder Abpackung von Pharmazeutika. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, die Stabilität und die Rate der in vivo-Abgabe und die Rate der in vivo-Beseitigung von INPROL beeinflussen. Zusammensetzungen zur kontrollierten oder anhaltenden Abgabe beinhalten Formulierungen in lipophilen Depots (zB Fettsäuren, Wachse, Öle). Ebenfalls umfasst durch die Erfindung sind Partikelzusammensetzungen beschichtet mit Polymeren (zB Poloxamere oder Poloxamine) und INPROL gekoppelt mit Antikörpern, die gegen gewebespezifische Rezeptoren, Liganden oder Antigene gerichtet sind, oder gekoppelt mit Liganden für gewebespezifische Rezeptoren. Andere Ausführungsformen der Zusammensetzung der Erfindung schließen Partikelformen von Schutzbeschichtungen, Proteaselnhibitorfaktoren, oder Permeationsverstärker für verschiede ne Verabreichungswege einschließlich paranteraler, pulmonaler, nasaler, topischer (Haut oder Schleimhaut) und oraler ein. In einer anderen Ausführungsform wird die INPROL enthaltende Zusammensetzung topisch oder durch ein transdermales Pflaster verabreicht.
In einer Ausführungsform sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in sterilen Röhrchen oder Ampullen in Einheitsdosisform abgepackt.
Die Erfindung umfasst auch Zusammensetzungen, die einen oder mehreren zusätzlichen Faktoren wie chemotherapeutische Mittel (zB 5-Fluoruracil (5 FU), Gytosin-Arabinosid, Zyklophosphamid, Zisplatin, Karboplatin, Doxyrubicin, Etoposid, Taxol, Alkylantien), antiverale Mitteln (zB AZT, Azyklovir), TNF, Zytokine (zB Interleukine), antiproliferative Arzneimittel, Antimetaboliten, und Arzneimittel die mit DNA Metabolismus in Wechselwirkung treten.
Das Dosisschema, das mit einem Verfahren zur Behandlung des Subjekts verbunden ist, das dem Aussetzen eines solchen zytotoxischen Mittels oder der Behandlung von hyperproliferierenden Stammzellen entgegen sieht, wird durch den befassten Arzt unter Beachtung verschiedenster Faktoren, die die Wirkung von Arzneimitteln verändern, zB der Zustand, Körpergewicht, Geschlecht und Ernährung des Patienten, die Schwere irgendeiner Infektion, Verabreichungszeit und andere klinische Faktoren, bestimmt.
Nachdem das Subjekt dem zytotoxischen Mittel oder der Bestrahlung ausgesetzt wurde, setzt das therapeutische Verfahren der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls die Verabreichung von INPROL in stammzellenstimulierenden Mengen, gegebenenfalls enthaltend ein oder mehrere Lymphokine, koloniestimulierende Faktoren oder andere Zytokine, Hämatopoetine, Interleukine, oder Wachstumsfaktoren an das Subjekt ein, um im Allgemeinen das Wachstum und die Teilung der Stammzellen (und ihrer Nachfahren), welche durch die vorhergehende Behandlung mit INPROL inhibiert waren, zu stimulieren. Solche therapeutischen Mittel, die die Hämatopoese fördern, umfassen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, Meg-CSF, M-CSF (CSF 1), GM-CSF, G-CSF oder Erythropoetin. Die Dosierungen dieser Mittel werden gemäß dem Wissen, das bei ihrer Verwendung in klinischen Versuchen zur Wirksamkeit bei der Förderung der hämatopoetischen Wiederherstellung nach Chemotherapie oder hämatopoetische Stammzellentransplantation erhalten wurde, ausgewählt. Diese Dosierungen würden eingestellt werden, um Variationen im körperlichen Zustand des Patienten und bei der Menge und des Typs des chemotherapeutischen Mittels oder der Strahlung, dem bzw. der das Subjekt ausgesetzt war zu kompensieren. Der Fortschritt der Umkehrung der Inhibierung der Stammzellen, die durch die Verabreichung von INPROL im behandelten Patienten verursacht wurde, wird durch herkömmliche Methoden beobachtet.
Bei der Behandlung von Leukämie ist es vorteilhaft, sowohl INPROL zum Inhibieren des normalen Stammzellenzyklierens, als auch einen Stimulator für das Wachstum der Leukämiezellen wie IL-3 oder GM-CSF, gleichzeitig mit der zytotoxischen Arzneimittelbehandlung oder während der Bestrahlung zu verabreichen. Durch dieses Protokoll ist es möglich die größte Differenz zwischen den Zyklierzuständen und Arzneimittelsensitivitäten von normalen und Leukämiezellen zu erzielen.
Beispiel 1: In Vivo Stammzellenproliferation Inhibierungsassay
Für das Detektieren von Stammzellenproliferation, wurde die Anzahl der CFU-S in S-Phase des Zellzyklus durch die ³N-Thymidin "suicide" Methode (Becker et al., Blood 26:296-308, 1965) gemessen.
Unreife, hämatopoetische Vorläufer –Colony Forming Units in der Milz (CFU-S)– können in vivo durch Ausbilden makroskopischer Kolonien in den Milzen von letal bestrahlten Mäusen 8-12 Tage nach der intravenösen Injektion von hämatopoetischen Zellen detektiert werden (Till & McCulloch, 1961).
Für den Standard-CFU-S-Proliferationsassay, wird normalerweise das Verfahren von ³H-Thymidin suicide" angewandt (Becker et al., 1965). Das Verfahren basiert auf der Aufnahme von radiomarkierten Thymidin, (³H-Thymidin) einem Vorgänger von DNA, in Zellen während der DNA Synthese. Die CFU-S, welche in S-Phase des Zyklus zum Zeitpunkt des Testens sind, werden durch die hohe Radioaktivität getötet, und sind daher nicht fähig, Kolonien in der Milz zu bilden. Daher zeigt der Unterschied zwischen der Anzahl der CFU-S, die bei der Injektion der Zellprobe, die ohne ³H-Thymidin inkubiert wurden, und der gleichen Zellen, die mit ³H-Thymidin inkubiert wurden, den Prozentsatz der proliferierenden CFU-S in der Originalprobe.
Das Testen des Inhibitors kann nicht mit der Knochenmarksstammzellenpopulation nichtstimulierter Tiere durchgeführt werden, da der Inhibitor nur auf zyklierende CFU-S wirkt, die so gering wie 7-10% der gesamten CFU-S Population in dem Knochenmark normaler Mäuse ist.
Um die CFU-S Proliferation zu stimulieren, wurde Phenylhydrazin (PHZ) oder subletale Bestrahlung verwendet (Lord, 1976).
Wir haben das Verfahren der Verwendung von Testosteron-Propionat (TSP) basierend auf seiner stimulierenden Wirkung auf das CFU-S zyklieren (Byron et al., Nature 228:1204, 1970) entwickelt, was das Testen vereinfachte und keine Nebenwirkungen verursachte. Das TSP induzierte Stimulation von CFU-S Proliferation innerhalb von 20-24 Stunden nach der Injektion und der Effekt konnte für zumindest 7 Tage gesehen werden.
Das Verfahren, dass zum Screenen der Fraktionen während der Reinigung des Inhibitors verwendet wurde, war wie folgt:
Mäuse: BDF₁ oder CBF₁ Mäusestämme wurden für alle Tests verwendet.
Spendermäuse wurden mit einer 10 mg/100 g Dosis von TSP durch intraperitonale Injektion von 0,2ml/Maus behandelt, um 30-35% der CPU-S in die S-Phase zu induzieren.
Vierundzwanzig Stunden später wurde das Knochenmark aus den Oberschenkelknochen für die Zellsuspensionsherstellung entnommen. Fünf bis Zehn Millionen Zellen pro ml wurden dann mit verschiedenen Kontroll- und Testfraktionen für 3,5 Stunden bei 37°C im Wasserbad, mit zwei Röhrchen für jede Gruppe (eins für heiße (radioaktive) und das andere für kalte (nichtradioaktive)) inkubiert.
Nach 3,5 Stunden wurde ³N-Thymidin (1 mCi/ml, spezifische Aktivität 18-25 Ci/mmol) zu jedem heißen Röhrchen in einem Volumen von 200 μl pro 1 ml Zellsuspension hinzugefügt; nichts wurde zu den kalten Röhrchen hinzugefügt. Inkubation wurde für weitere 30 Minuten bei 37°C fortgesetzt.
Nach den 30 Minuten Inkubation, wurde die Tötungsreaktion beendet, in dem 10 ml kaltes (4°C) Medium, dass 400 μg/ml nichtradioaktives Thymidin enthielt, zugegeben wurde. Die Zellen wurden extensiv (3 mal) gewaschen.
Die Zellen wurden resuspendiert und auf eine gewünschte Konzentration für die Injektionen, normalerweise 2-4 × 10⁴ Zellen pro Maus in 0,3-0,5 ml verdünnt.
Empfängermäuse, 8-10 pro Gruppe, wurden nicht später als 6 Stunden vor den Injektionen bestrahlt.
Empfängermilzen wurden am Tag 9-12 entnommen und in Tellesnitsky's Lösung fixiert; die Kolonien wurden durch Zählen mit dem Auge ausgewertet. Der Prozentsatz an Zellen in S-Phase wurde berechnet unter Verwendung der Formel.
wobei a – CFU-S Anzahl ohne ³H-Thymidin
wobei b – CFU-S Anzahl mit ³H- Thymidin ist.
Die Testdaten von INPROL, die in Tabelle 1 dargestellt sind, zeigen, dass die zyklierenden Stammzellen nach der Behandlung mit INPROL gegen die Wirkung von ³H-Thymidin resistent wurden. Für dieses und alle folgenden Beispiele bezieht sich der Ausdruck "pINPROL" auf das gereinigte Protein aus Schweineknochenmark. Den selben Schutz sieht man für die S-Phase spezifischen Zytotoxika Cytosin-Arabinosid und Hydroxy-Harnstoff (Daten nicht gezeigt). Wenn die behandelten Stammzellen dann mit den kalten Medien, die nicht radioaktives Thymidin enthalten, gewaschen wurden, proliferieren die überlebenden Stammzellen in Mäusemilzen, um normale Kolonien zu bilden. Tabelle 1 Inhibierende Aktivität von pINPROL auf CFU-S Proliferation während vierstündiger Inkubation mit Knochenmarkszellen

* CFU-S pro 2 × 10⁴ Zellen

Beispiel 2: In Vitro Stammzellenproliferationsassay
Unter Verwendung des folgenden Testsystems (Lord et al., in The Inhibitors of Hematopoiesis pp. 227-239, 1987) wurde die direkte Wirkung von INPROL gezeigt. Die von Multilineagefaktor (IL3) abhängige Stammzelllinie FDCP mix A4 (A4), wurde in IMDM Medium ergänzt mit 20% Pferdeserum und 10% WEHI-3-konditionierten Medium als eine Quelle von koloniestimulierenden IL-3 erhalten.
Ein Assay zur Einbringung tritiierten Thymidins wurde verwendet um Proliferation zu messen: A4 Zellen (5 × 10⁴ in 100 μl Medium mit 20% Pferdeserum und 50% WEHI-3 CM) wurden bei 37°C in 5% CO₂ for 16 Stunden inkubiert.
pINPROL oder das rohe BME (Fraktion IV) wurden am Beginn zugesetzt. Tritiiertes Thymidin ((³N-Tdr) 3,7 KBq in 50 μl bei 740 GB q/mmol) wurden dann zu jeder Gruppe für eine weiter Inkubation von 3 Stunden hinzugefügt. Das Niveau der Proliferation wurde durch Entnahme von Zellen gemessen und die % Inhibierung wurde berechnet unter Verwendung der Formel
Einfügung von tritiierten Thymidin (³H-Tdr) durch FDCPmix-A4 Zellen gezüchtet unter Anwesenheit von gestaffelten Dosen von normalem Knochenmarkextrakt oder pINPROL ist in 6 dargestellt. Man kann sehen, dass gereinigte Zusammensetzung von pINPROL mindestens 1.000 mal aktiver ist als das Startmaterial. Die Aussetzungszeit (16 Stunden) ist ein wichtiger Faktor für wirkungsvolle Inhibierung und zeigt den Beweis der direkten Wirkung von pINPROL auf Stammzellen der A4 Zelllinie.
Beispiel 3: Hemmung der CFU-S Proliferation durch INPROL injizierte in vivo Dosen und die Dauer des Effekts.
Die Studien des Effekts von in vivo injizierten INPROL zeigten, dass INPROL effektiv die Rekrutierung von CFU-S in den Zyklus blockiert, daher diese Zellen vor den zytotoxischen Effekten der weiteren Behandlung schützt und sein Potential für die klinische Verwendung zeigt.
Die Versuchsanordnung hatte zwei Ziele: den Effekt von INPROL auf CFU-S, wenn es in vivo injiziert wird, zu überprüfen, und die effektive Dauer der INPROL Aktivität in Bezug auf die zyklierenden Stammzellen zu bestimmen.
Um die CFU-S Proliferation zu stimulieren, wurde die Injektion von Testosteron-Propionat basierend auf dem oben in Beispiel 1 genannten Effekt, verwendet.
BDF1 Mäuse wurden mit TSP (10 mg/100g) am Tag 0 injiziert; 24 Stunden später erhielten Mäuse aus jeder Versuchsgruppe (vier Mäuse pro Gruppe) eine einzelne pINPROL Injektion mit Dosen von 0 μg, 5 μg, 10 μg und 15 μg/Maus i.p..
24 Stunden nach der pINPROL Injektion wurden die Mäuse geopfert und der Prozentsatz der zyklierenden CFU-S wurde mittels des Assays beschrieben in Beispiel 1 gemessen. Die TSP Injektion induzierte etwa 50% der CFU-S in die Zyklierung in Vergleich zu 7% in unbehandelten Mäusen. pINPROL in Dosen, die so gering wie 2 μg/Maus waren, war dazu in der Lage die TSP induzierte Proliferation runter auf das normales Level zu inhibieren.
Für die Dauer der Effektevaluierung wurde eine Gruppe von Mäusen (21 Mäuse pro Gruppe) nur mit TSP injiziert und eine andere Gruppe wurde sowohl mit TSP als auch mit pINPROL (24 Stunden nach TSP) injiziert. Das CFU-S Zyklieren wurde alle 24 Stunden währen eine Woche, durch Entnahme von drei Spendern von jeder Gruppe und Messen des CFU-S Zyklusstatus in ihrem Knochenmark durch das beschriebene Verfahren (siehe Beispiel 1) gemessen. Die in 7 dargestellten Daten zeigen, dass, während die Dauer des Effekts von TSP zumindest 7 Tage beträgt, eine einzelne Injektion von INPROL die CFU-S in Ruhe versetzen kann und sie für nicht mehr als 48 bis 72 Stunden aus dem Zyklus halten. Nachdem die Mehrheit der chemotherapeutischen Agenzien, die für Krebs und Leukämie Chemotherapie verwendet werden, eine relativ kurze in vivo-Halbwertszeit haben, für gewöhnlich weniger als 24 Stunden, wird der INPROL Effekt, gemäß den erhaltenen Daten, für länger als die effektive Zeit während welcher die chemotherapeutischen Agenzien wie Cytosin-Arabinosid oder Hydroxi-Harnstoff in vivo aktiv sind, beibehalten. Noch wesentlicher ist, dass für chemo-therapeutische und Bestrahlungsbehandlungen mit längeren Intervallen (mehr als 24 Stunden und weniger als 96 Stunden) zwischen den ersten (nicht schädlich für die Stammzellen) und den zweiten (schädlich für die CFU-S) Behandlungen eine einzige Injektion von INPROL während der Intervalle zwischen den beiden Anwendungen des chemotherapeutischen Agens oder der Bestrahlung, ausreichend sein sollte. Für mehrere wiederholbare Zyklen zytotoxischer Therapie oder Bestrahlung kann die gleiche Strategie, basierend auf der Dauer des INPROL Effekts angewendet werden.
Beispiel 4: Primitivste hämatopoetische Stammzellen stimuliert zu schnellem Zyklieren nach Behandlung mit 5-FU sind durch INPROL bei der zweiten 5-FU Aussetzung geschützt:
Das Medikament 5-Fluorurazil (5-FU) reduziert die Anzahl von Zellen in den myeloiden und lympoiden Kompartimenten drastisch. Es wird im Allgemeinen als zellzyklusspezifisch betrachtet, wobei es auf sich rasch teilende Zellen abzielt, da die Aufnahme des Nukleotid-analogons in die DNA während der S-Phase des Zellzyklus oder davor, im Zelltod resultiert. Das Langzeitüberleben und die immunhämatopoetische Wiederherstellung des Knochenmarks von Mäusen ist nicht von einer einzelnen Dosis von 5-FU betroffen; jedoch wurde gezeigt (Harrison et al. Blood 78:1237-1240, 1991), dass pluripotente hämatopoetische Stammzellen (PHSC) für eine zweite Dosis von 5-FU für einen kurzen Zeitraum von etwa 3 bis 5 Tagen nach der Anfangsdosis anfällig werden. Es kann dadurch erklärt werden, dass PHSC normalerweise zu langsam zyklieren, damit eine einzelne Dosis von 5-FU effektiv sein kann, und dass sie in eine schnelle Zyklierung durch Stimuli stimuliert werden, die von der anfänglichen 5-FU Behandlung resultieren. Wir haben vorgeschlagen dass die PHSC durch INPROL in einen langsamen Zyklusstatus zurückversetzt werden können und daher vor der zweiten 5-FU Behandlung geschützt sind.
Die Mäuse, die in diesen Experimenten verwendet wurden, waren männliche BDF1 Mäuse. Eine Stammlösung von 5-FU (Sigma) wurde in physiologischer Saline mit einer Konzentration von 10 μg/ml hergestellt. Jede behandelte Maus erhielt 2 mg 5-FU pro 10 g Körpergewicht über eine Schwanzvene am Tag 0 des Experiments; 24 Stunden später wurden die Mäuse mit pINPROL (10 μg/100 g Körpergewicht) intraperitoneal injiziert und wurden am 3. Tag mit der 2. Dosis von 5-FU injiziert. Die Überlebensstudie wurde durch das Beobachten des Todes der Mäuse in Versuchs-(Behandlung mit pINPROL) und Kontrollgruppen von jeweils 30 Mäusen durchgeführt. Die Überlebenskurven sind in 8 gezeigt.
Beispiel 5: Effekte der Präinkubation mit INPROL gegenüber MIP-1α in Knochenmarkszellen.
Der Zweck dieses Experiments war es, die inhibierenden Effekte der Präinkubation mit pINPROL und MIP-1α auf Mausknochenmarkszellen in vitro zu vergleichen.
Der folgende Ablauf wurde verwendet:
In vivo: BDF1 Mäuse, 6-15 Wochen alt, werden mit 200 mg/kg 5-FU i.p. 48 Stunden vor dem Ernten des Marks aus den Oberschenkelknochen injiziert.
In vitro: Eine einzelzellengepoolte Suspension wird gezählt und 5 × 10⁶ Zellen werden in einer Gesamtmenge von 2 ml mit oder ohne pINPROL oder MIP-1α mit 5% Pferdeserum, IMDM Medium mit zugesetztem L-Glutamin bei 37°C und 5% CO₂ für 4 Stunden inkubiert. Die Zellen werden dann zweimal gewaschen und nochmals ge zählt. Sie werden in Methylzellulose mit den folgenden endgültigen Bedingungen plattiert:
0,8 % Methylzellulose
25 % Pferdeserum
20 ng/ml rekombinantes murines IL3
zugesetztes L-Glutamin
5 × 10⁵ Zellen pro ml
IMDM Medium
Die Platten werden für 11 Tage bei 37°C und 5% CO₂ in 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Kolonien mit mehr als 50 Zellen wurden gezählt.
Tabelle 2:
Beispiel 6: INPROL inhibiert die HPP-CFC Proliferation:
Ein in vitro Assay für das Beurteilen von murinen wiederherstellenden Stammzellen und frühen Vorläufern ist der high proliferative potential colony (HPP-PFC) Assay; andere verwandte Assays, zB CFU-A, CFU-GM, CFU-E und CFU-GEMM detektieren fortschreitend eingeschränkte Vorläuferpopulationen (M. Moore, Blood 177:2122-2128, 1991). Dieses Beispiel zeigt, dass die Vorbehandlung von Zellen mit pINPROL ihre Proliferation inhibiert, wohingegen dies MIP-1α unter diesen experimentellen Bedingungen nicht schafft.
BDF1 Mäuse wurden mit 5 Fluorurazil (200 mg/kg i.p.) behandelt, bevor ihr Knochenmark auf die HPP-CFC Zahlen untersucht wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewaschen und bei Dichten von 10⁶ bis 5 × 10⁶ /ml in Medium mit entweder keinem zugesetzten Agens (Kontrollen), pINPROL (25 ng/ml) oder MIP-1α (200 ng/ml) für 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewa schen und in Agar (0,3%) mit 30% FCS und kombiniert konditioniertem Medium von 5637 und WEHI-3B Zelllinien (7,5% von jedem konditioniertem Medium, wie empfohlen von Sharp et al. 1991) plattiert. Die Plattierungskonzentration war 5 × 10⁴ Zellen/ml in 60 mm Schalen. Die Kolonien wurden am Tag 14 abgezählt und die Ergebnisse sind unten angeführt.
Tabelle 3:
Gemäß diesen Ergebnissen inhibierte MIP-1α die Proliferation der meisten unreifen Vorläufer nicht, wenn es nur während der Präinkubationszeitspanne anwesend war. pINPROL inhibierte die Proliferation unter diesen Bedingungen effektiv, was fundamentale Unterschiede zwischen pINPROL und MIP-1α in Bezug auf ihre biologische Aktivität anzeigt.
Beispiel 7: INPROL Therapieeffekt auf die Erholung von strahlungsinduzierter Knochenmarksaplasie:
Knochenmarksaplasie ist die hauptsächliche limitierende Toxizität der Bestrahlungskrebs-therapie. Es wurde gezeigt, dass manche Wachstumsfaktoren (zB G-CSF, GM-CSF, Erythropoetin) die Erholung von strahlungsinduzierter Knochenmarksaplasie beschleunigen können. Die Idee des Schutzes durch die Verwendung eines Inhibitors der Stammzellenproliferation ist ein anderer und ergänzender Ansatz im Umgang mit hämatologischen Schädigungen. Um dem zuvor entwickelten Behandlungsverfahren zu folgen (Beispiele 3, 4) wurde ein Modell der letalen Bestrahlung von Mäusen etabliert. Es ist im Stand der Technik bekannt, dass Mäuse, die 9Gy von Kobalt 60 erhalten, nach 10 bis 14 Tagen zu sterben beginnen; Am 30. Tag entspricht die Sterbewahrscheinlichkeit in etwa 50%. Diese letale Dosis wurde in unserem Modell verwendet, wobei sie in zwei aufeinanderfolgende Anwendungen von 4,5Gy jeweils mit einem Intervall von drei Tagen zwischen den Dosen geteilt wurde. Vorausgehende Daten zeigten, dass die Überlebenskurve in diesem Modell sehr na he zu jener, die für eine einzelne Bestrahlung mit 9Gy bekannt ist, war; darüber hinaus zeigte der Test für die CFU-S Proliferation, dass 24 Stunden nach der ersten Bestrahlung 35 bis 50% der CFU-S zur Proliferation induziert sind. Solche Zellen können durch einen Stamm-zelleninhibitor, der vor der zweiten Dosis verabreicht wird, geschützt werden.
Um diese Möglichkeit zu untersuchen erhielten die Mäuse (50 Mäuse / Gruppe) 4,5Gy am Tag 0. 24 Stunden später erhielt eine Gruppe pINPROL (2 μg/Maus i.p.) und eine andere Kontrollgruppe wurde mit Saline injiziert. Die zweite Dosis der Bestrahlung (4,5 Gy) wurde am 3. Tag verabreicht.
9 zeigt das gesteigerte Überleben nach einer einzelnen Dosis von pINPROL. Die Bedingungen des Modells sind klinisch relevant für die Behandlung jeglichen Krebses, beinhaltend jene, gekennzeichnet durch solide Tumore; eine derartige Behandlung würde an einen Patienten mit Krebs durch die Gabe einer effektiven Dosis von INPROL zwischen zwei aufeinanderfolgenden Dosen von Bestrahlung verabreicht werden, wodurch es möglich wäre größere Dosen von Strahlung für die Behandlung des Krebses anzuwenden. Es sollte ebenfalls möglich sein, diese Modalität auf chemotherapeutische Agenzien zu erweitern.
Beispiel 8: INPROL Verwendung für die autologe Knochenmarkstransplantation
Knochenmarkstransplantation ist die einzig bekannte heilende Therapie für mehrere Leu-kämien (CML, AML und andere). Die ex vivo Aufbereitung von autologen BMT zur Infusion sollte potentielle autologe Quellen von normalen Stammzellen, frei von leukämischer Kontamination, und in der Lage das hämatopoetische System des Empfängers neu zu besiedeln, bereitstellen, um aggressive und effektive Therapie zu erlauben.
1. Langzeit Knochenmarkskultur-L1210-Leukämie-Modell für die Studie des INPROL Effekts der Erhaltung normaler Hämatopoese während der Bereinigung mit AraC.
Langzeit-Knochenmarkskulturen (LTBMC) wurden etabliert gemäß Toksoz et al. (Blood 55:931-936, 1980) und die leukämische Zelllinie L1210 wurde zu der LTBMC durch Kokultivierung während zwei Wochen eingesetzt. Das gleichzeitige Wachstum von normalen und leukämischen Vorläufern trat in diesen kombinierten LTBMC/L1210 Kulturen ähnlich zu der Situation im Knochenmark eines Leukämie-Patienten auf. Die Unterscheidung zwischen normalen colony forming units CFU und leukämischen CFU war durch das Wachsenlassen als Agarkolonien bei Vorhandensein oder in der Abwesenheit von dem konditionierten Medium von WEHI-3 (einer murinen IL-3 produzierenden Zelllinie) möglich. Normale Zellen durchleben Apoptose in der Abwesenheit von IL-3 wohingegen leukämische Zellen in seiner Abwesenheit Kolonien bilden können. Suspensionszellen von der LTBMC-L1210-Zusammensetzung ergeben ungefähr 150 Kolonien bei Vorhandensein von IL-3 (normale hämatopoe-tische Klone) und 70 Kolonien wenn sie ohne IL-3 wachsen (leukämische Klone) pro 50.000 plattierten Zellen.
Das Verfahren der Reinigung war wie folgt: Am Tag Null wurden alle Suspensionszellen und das Medium (10 ml pro Behälter) von den Behältern mit LTBMC-L1210 abgenommen und mit 2 ml Medium, beinhaltend 200 μg Cytosin-Arabinosid (AraC) versetzt (Tsyrlova et al. in Leukemia: Advances in Biology and Therapy v. 35, 1988); nach 20 Stunden Inkubation wurden die Behälter ausgewaschen und mit 2 ml frischem Medium alleine (Kontrollgruppe) oder Medium beinhaltend pINPROL bei 25 ng/ml für vier Stunden versetzt. Nach dieser Präinkubation wurden die Zellen wieder mit 100 μg/Behälter AraC für drei Stunden bei 37°C inkubiert. Jede Gruppe beinhaltete vier Behälter. Die LTBMC-L1210-Kulturen wurden dreimal gewaschen und mit frischem LTBC Medium versetzt; sie wurden wie zuvor für die Regenerationsstudien für 3-4 Wochen aufrechterhalten.
Die Daten sind in 10 dargestellt. Es wurde kein Zellwachstum in den nur mit AraC behandelten Kontrollkulturen beobachtet, während in den INPROL geschützten Behältern die Regeneration der Hämatopoese aufgrund der Proliferation der Vorläufer aus der haftenden Schicht viel schneller stattfand. Darüber hinaus wuchsen die Zellen von der Versuchsgruppe, wenn sie in Agar plattiert wurden, nur in der Gegenwart von IL-3, was etwa 100 CFU pro 50.000 Zellen ergab. Kein leukämisches Zellwachstum wurde zumindest während 4 Wochen beobachtet. Daher kann Mark, das ex vivo mit einer effektiven Dosis von AraC in Kombi-nation mit INPROL behandelt wird von krebsartigen Zellen bereinigt werden, während die Stammzellen geschützt sind. Es sollte möglich sein, diese Modalität auf andere Formen der Chemotherapie oder Bestrahlungsbehandlungen zu erweitern.
2. Marksneubesiedelungsfähigkeit (MRA = Marrow Repopulating Ability) und 30 Tage Strahlungsschutz sind gesteigert durch INPROL Behandlung in vitro.
MRA, die Fähigkeit von Zellen das Knochenmark von letal bestrahlten Mäusen neu zu besiedeln zusammen mit der Fähigkeit Strahlungsschutz für 30 Tage zu verleihen ist eine direkte in vivo-Maßnahme mit dem Potentials myelosupprimierte Tiere zu retten (Visser et al. Blood Cells 14:369-384, 1988).
Für die Strahlungsschutzstudien wurden BDF1 Mäuse mit 9,5Gy bestrahlt und durch Transplantation von Knochenmark von testosteronstimulierten Spendern wiederhergestellt. Eine Gruppe der Empfänger wurde durch Knochenmarkszellen wiederhergestellt, die für 4 Stunden mit Medium (Kontrollen – Gruppe A) präinkubiert wurden und anderen (Gruppe B), die mit 25 ng/ml pINPROL präinkubiert wurden. Die Zellen in beiden Gruppen wurden gewaschen und 30.000 Zellen pro Maus wurden in die bestrahlten Tiere transplantiert. Die Überlebensdaten sind in 11 gezeigt. Die Summe der 3 Experimente ist mit den Kontrollen normalisiert auf 100% dargestellt. Die pINPROL Inkubation steigerte das Überleben der Mäuse von 36,5% in der Kontrollgruppe auf bis zu 61,8 % am Tag 30.
Die Steigerung der MRA induziert durch die Präinkubation mit INPROL könnte einer der Mechanismen in der Verbesserung des Strahlungsschutzes sein. Um diese Hypothese zu unter-suchen, wurde die MRA gemäß Visser et al. (op.cit.) gemessen. Kurz beschrieben, wurden die Spender BDF1 Mäuse mit Testosteron vorbehandelt, ihr Knochenmark mit Medium oder pINPROL für 4 Stunden präinkubiert und in bestrahlte Tiere injiziert. Am Tag 13 wurden die Knochenmarkszellen von den Empfängeroberschenkelknochen in Agar, in 3 verschiedenen Konzentrationen (0,01, 0,05, 0,1 Äquivalente eines Oberschenkelknochen) in der Anwesenheit von 20% Pferdeserum und 10% WEHI-CM plattiert. Die Anzahl der Tag 7 Kolonien entspricht der MRA insoweit, als die koloniebildenden Zellen im Knochenmark der Empfänger zu dieser Zeit die Vorläufer der unreifen Stammzellen der Spender waren.
Wie in 12 zu sehen ist, ist die MRA der mit INPROL präinkubierten Zellpopulation größer als in der Kontrollgruppe (B).
Beispiel 9: Antihyperproliferativer Effekt von INPROL auf Stammzellen kann ihre Differen-tiationsabnormitäten verändern:
Hyperproliferation von CFU-S wird nicht nur während der Wiederherstellung von zytotoxischen Medikamenten oder von Bestrahlung beobachtet, sondern auch als eine Konsequenz des normalen Alterns und wird als ein Hauptmerkmal im myelodysplastischen Syndrom (MDS) betrachtet. Sie wird begleitet von Differentiationsstörungen, wie zB einem Überhandnehmen der erythroiden Differentiation während die Differentiation entlang des granulo-zytischen Pathways reduziert ist.
Die Knochenmarkszellen wurden für 4 Stunden bei 37°C mit 25 ng/ml pINPROL oder Medium (Kontrolle) inkubiert, gewaschen und dann in Agar mit 20% Pferdeserum, 2U/ml Erythro-poietin und 10% WEHI-CM plattiert. Die Anzahl der BFU-E und GM-CFU Kolonien wurde am Tag 7 gezählt. Die Daten dargestellt in Tabelle 4 sind von 3 Experimenten zusammengefasst – 4 Tiere pro Punkt wurden von jeder Gruppe genommen; 4 Schalen wurden plattiert.
Wie aus Tabelle 4 offensichtlich ist, hat die Inkubation von normalen Knochenmark (NBM) von unversehrten jungen Tieren (BDF1 8-12 Wochen alt) mit INPROL nicht die Anzahl oder die Proportion der verschiedenen Typen der Kolonien verändert. BDF1 Spender die mit Testosteron-Propionat (TSP) vorbehandelt wurden, zeigten die gleiche Steigerung in der CFU-S Proliferation wie zuvor beobachtet (Beispiele 1, 3, 4), eine geringfügige Steigerung in der erythroiden Vorläuferanzahl (BFU-E Kolonien) und einen Abfall der GM-CFU, welche durch die Inkubation mit INPROL komplett aufgehoben wurden. Zusätzliche wurde das abnormal hohe Level der CFU-S Proliferation auf 10% von CFU-S in der S-Phase des Zell-zyklus zurückgesetzt. CFU-S Hyperproliferation ist ein bekanntes Merkmal mancher Mausstämme, die empfänglich sind für virale Leukämieinduktion, zB Balb/c Mäuse (Tabelle 4), und kann ebenfalls in älteren Tieren (Tabelle 4) beobachtet werden. Die gleiche Umverteilung von festgelegten Vorläufern, beobachtet in mit TSP behandelten BDF1 Mäusen, wird in Balb/c und in älteren (23-25 Monate alten) BDF1, die das abnormal hohe Level der CFU-S Proliferation gemeinsam haben, beobachtet. Die Korrektur von sowohl der Proliferation der CFU-S als auch der Differentiation wurde durch die Inkubation mit INPROL induziert. Was darüber hinaus besonders klinisch relevant ist, ist das die Studien zeigten, dass die in vivo Injektion von INPROL (2 μg/Maus) sowohl die Proliferation von CFU-S als auch das Verhältnis der erythroiden (BFU-E) und GM-Kolonien (Tabelle 4) beeinflusste.
Tabelle 4 INPROL Effekt auf die CFU-S Differentiation in festgelegte Vorläufer BFU-E und CFU-GM.
Beispiel 10: Immunostimulatorische Aktivität von INPROL.
Es wurde beobachtet, dass die Inkubation von Knochenmarkszellen, beinhaltend einen hohen Anteil von proliferierenden CFU-S, mit INPROL nicht nur die Zyklierung der CFU-S verändert, sondern auch ihre Differentiation, wobei die überwiegende erythroide Differentiation bevorzugt auf granulozytische und lymphoide Vorläufer gewechselt wird. Diese Eigenschaft von INPROL ist wichtig aufgrund der immunosuppressiven Nebeneffekte von zyto-toxischer Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie, sowie der bei hyperproliferativen Stammzellenfunktionsstörungen und beim Altern begleitenden Immunsuppression.
Das Beispiel zeigt den direkten Effekt von INPROL auf die Differentiation von unreifen Vorläufern von der lymphoiden Langzeitkultur (LLTC) etabliert gemäß Wittlock & Witte (Ann. Rev. Immun. 3:213-35, 1985) in pre-B Vorläufer, gemessen durch die Formation von Kolonien in Methylzellulose beinhaltend IL-7.
Die LLTC wurden wie beschrieben etabliert und mit frischem LLTC-Medium (Terry Fox Labs., Vancouver, Kanada) zweimal pro Woche gefüttert. Nicht anhaftende Zellen wurden einmal pro Woche geerntet, von Faktoren freigewaschen und für 4 Stunden mit 25 ng/ml pINPROL oder Medium alleine für die Kontrolle inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und mit einer Konzentration von 10⁵ Zellen/ml in Methylzellulose, beinhaltend 30% FCS und 10 ng/ml IL-7, plattiert. Die Daten von 3 Wochen sind in 13 gezeigt. Die Anzahl der großen pre-B Kolonien variierte in der Kontrolle, wobei sie mit der Zeit zunahm, jedoch stimulierte die Präinkubation mit INPROL immer das Wachstum der Kolonien 4-8fach über das Level der Kontrolle. Dies demonstriert eine immunstimulatorische Eigenschaft von INPROL, was für die Korrektur von immunodefizienten Zuständen und in der Steigerung gewünschter Immunantworten, zB auf Impfung nützlich ist.
Beispiel 11: INPROL verbessert die Wiederbesiedelungsfähigkeit von Stammzellen – Langzeitkultur initiierende Zellen von Patienten mit CML.
Chronische myeloide Leukämie (CML) ist eine letale maligne Funktionsstörung hämatopoetischer Stammzellen. Die Behandlung von CML in der chronischen Phase mit Einzel-agenzien-Chemotherapie, Kombinationschemotherapie, Splenektomie oder Milzbestrahlung kann die klinischen Anzeichen und Symtome kontrollieren aber verlängert nicht wesentlich das Überleben. Sobald CML vom chronischen zum beschleunigten Stadium fortschreitet, ist die Standardtherapie nicht effektiv. Zur Zeit ist die Knochenmarkstransplantation (BMT) die einzig bekannte heilende Therapie für CML. Therapie mittels unverwandter Spender-BMT ist aufgrund von Problemen mit der Histoinkompatibilität schwierig. Weniger als 40% der ansonsten geeigneten CML Patienten wird einen geeigneten passenden verwandten Spender haben; daher ist die autologe Transplantation bevorzugt. Die ex vivo Konditionierung von autologer BMT für die Infusion zusammen mit der Fähigkeit nicht leukämische (Ph-negative) myeloide Vorgänger von Ph-positiven Patienten, die in Langzeitkulturen (LTC) wach sen, auszuwählen, legt das Potential von autologen Quellen von normalen Stammzellen nahe, um aggressive und effektive Therapie von CML zu erlauben.
Im Kontext von BMT kann eine hämatopoetische Stammzelle definiert werden als eine die die Fähigkeit hat reife Blutzellen für ausgedehnte Zeiträume zu bilden. Wir haben das humane LTC System entwickelt von C. Eaves & A. Eaves sowohl für die Quantifizierung der Stammzellzahlen als auch als ein Mittel sie für die therapeutische Verwendung zu manipulieren verwendet. Dies umfasst das Aussäen der Zellen auf eine voretablierte, bestrahlte humanmark-anhaftende Schicht; diese Kulturen werden dann für 5 Wochen aufrecht erhalten. Der Endpunkt ist die Ernte des gesamten Klonzellgehalts (anhaftend und nicht an-haftend) der Kulturen am Ende dieser Zeit. Der Klonzellertrag unter diesen Bedingungen ist linear in Beziehung stehend mit der Anzahl der Vorläufer (Langzeitkultur initiierende Zellen (LTC-IC)), die ursprünglich zugesetzt wurden; der durchschnittliche Ertrag von individuellen humanen LTC-IC ist 4 Klonvorläufer pro LTC-IC. Es wurde zuvor gezeigt, wenn Mark von Patienten mit CML unter gleiche Bedingungen gebracht wird, dass die leukämischen (Ph-positiven) Kionzellen rasch abnehmen. Durch die Verwendung der Quantifizierung von verbleibenden normalen LTC-IC in Patienten mit CML ist es möglich jene auszuwählen, die am wahrscheinlichsten von intensiver Therapie unterstützt durch die Transplantation von kultivierten Autotransplantaten profitieren (Phillips et al., Bone Marrow Transplantation 8:477-487, 1991).
Das folgende Verfahren wurde verwendet, um den Effekt von INPROL auf die Anzahl der Klonzellen (LTC-IC) unter Knochenmarkstransplantatzellen, etabliert vom peripheren Blut eines Patienten mit CML, zu untersuchen.
Die Kulturen wurden als Langzeitkulturen auf vorbestrahltem Stroma angesetzt. Das periphere Blut eines gesunden Spenders wurde als die Kontrolle verwendet. Periphere Blutzellen von CML Patienten wurden mit oder ohne pINPROL (25 ng/ml) für 4 Stunden präinkubiert, gewaschen und in das LTC-IC System für 5 Wochen zur Bestimmung der Kontrollzahl der LTC-IC eingebracht. Für Experimente wurden andere parallele Kulturen für 10 Tage etabliert. Die Mischung anhaftender und nicht anhaftender Zellen von für 10 Tage wachsenden Kulturen wurde mit oder ohne pINPROL präinkubiert und auf voretablierten Zuführer für zusätzliche 8 Wochen platziert. Die Anzahl der LTC-IC von jeder Versuchskultur wurde durch das Plattieren sowohl der anhaftenden wie auch nicht anhaftenden Zellen in Methylzellulose mit den geeigneten Wachstumsfaktoren (Terry Fox Laboratories, Vancouver, Kanada) und durch Zählen der resultierenden Gesamtzahl der koloniebildenden Zellen bestimmt. Die LTC-IC Werte, die durch die Verwendung dieses Verfahrens erhalten wurden, wurden abgeleitet von dem gesamten Klonzellen-(CFC)-Gehalt unter Verwendung der Formel: # LTC-IC = #CFC/4
Die in 14 dargestellten Daten zeigen, dass kein Verlust von LTC-IC während der ersten 10 Tage der Kultivierung, initiiert von dem Knochenmark des gesunden Spenders, stattfand und dass in etwa 30% der Zahl der Eingangs-LTC-IC nach 5 Wochen in Kultur noch vorhanden waren. Die Anzahl der LTC-IC des CML Patienten war drastisch reduziert auf etwa 8% während der 10 Tage Zeitspanne und erholte sich nicht während weiterer Inkubation, während die Präinkubation von Zellen mit INPROL das LTC-IC Level auf 30% der anfäng-lichen Anzahl steigerte und es wurde während 8 Wochen beibehalten.
Klinisch relevante Anwendungen von INPROL, die durch diese vorausgehenden Daten vorhergesagt wurden, beinhalten ihre Verwendung in Strategien für die selektive Verbesserung des normalen Stammzellgehalts von frischen oder kultivierten Marktransplantaten, Strategien für die Verbesserung der Rekrutierung von verbleibenden Stammzellen in vivo und auch Protokolle für die Transferierung neuen genetischen Materials in menschliche Markstammzellen für die weitere Transplantation in Patienten.
Beispiel 12A: Ein Verfahren der Isolation von immunoaktiven Inhibitoren der Proliferation von Stammzellen von Knochenmarkspräparaten.
Das Knochenmark wurde aus Schweinerippen isoliert. Die Rippen von den Schweinekadavern wurden getrennt und von den Muskelfasern und Fett gereinigt; in Stücke geschnitten und das Knochenmark wurde durch eine Hydropresse, hergestellt von dem Biophyzpribor, extrahiert. Die Knochenmarkszellen wurden durch Zentrifugation in einer K-70 Zentrifuge bei 2.000 Upm für 20 Min. getrennt. Der Extraktüberstand wurde dann nach und nach der Ultra-filtration durch Amicon USA Membranen XM- 100, PM30, PM-50 unterworfen. Gemäß der Analyse durch Elektrophorese ist der Hauptbestandteil des Produktes Albumin (siehe 1).
Biochemische Aufreinigung
Das Knochenmarksextrakt und die Proteinbestandteile der Fraktionen wurden bei jedem Schritt der Aufreinigung durch Gelelektrophorese in 10% Polyacrylamid, beinhaltend 0,1% Natriumdodecylsulfat, analysiert. Bis zu 7% Natriumdodecylsulfat und bis zu 0,5-1 % Mercaptoethanol wurden den Proben, welche vor dem Laden auf das Gel für 5 Minuten bei 70°C inkubiert wurden, zugesetzt.
Die Elektrophorese wurde bei 20Y cm des Gels für 5 Stunden durchgeführt. Danach wurde das Gel in 0,25% Coomassie CBBC250 in einer Mischung von Ethanol: Wasser: Essig-säure 5:5:1 für eine Stunde bei 20°C gefärbt und in mehreren Wechslungen von 7%iger Essigsäure gewaschen. Die Aktivität des Produkts wurde durch das Verfahren der Inhibierung der Proliferation von stammhämatopoetischen Zellen (CFU-S) beurteilt. Das Verfahren ist im Anschluß detailliert ausgeführt.
Stufe 1. Aufreinigung durch Präzigitation mit Ammoniumsulfat
Die Aktivität wurde durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat bei 25% mit Sättigung von 40 bis 80%, welche basierend auf den Ergebnissen in Tabelle 5 ausgewählt wurde, aufgereinigt.
Die Menge des Präparats, das für die Überprüfung nach jedem Schritt der Aufreinigung verwendet wurde, wurde gemäß dem Level der Aufreinigung und äquivalent zu der Dosis von 2 × 10^–2 mg des anfänglichen Produkts bestimmt. Die Aktivität wurde bestimmt durch die Formel: %Änderung = %Sa – %Sbwobei %Sa entspricht %S in der Kontrolle
%Sb entspricht %S nach Inkubation mit der Testfraktion.
Die Fraktion wurde entsalzt, um die Konzentration von Ammoniumsulfat 20fach vor jeder Überprüfung der Aktivität und vor jedem folgenden Aufreinigungsschritt zu senken.
Stufe 2. Der unreine Inhibitor aus Stufe 1 wird nach dem Entsalzen angewendet und frak-tioniert unter Verwendung von Ionenaustausch-Chromatographie, hier DEAE 23 Zellulose, und wird dann mit einem Gradienten Natriumacetatpuffer (pH 6,0) eluiert.
Die aktiven Fraktionen des Inhibitors eluieren zwischen 3-5 mM.
Das Volumen der Säule war 1 ml und die Geschwindigkeit der Elution war 4ml/Std. Die Detektion wurde durch den Chromatograph Millicrome bei 230 und 280 nm durchgeführt. Die Fraktion 1 (siehe 2), welche die höchste Aktivität zeigte, wurde isoliert und in 5 mM Natriumacetatpuffer (siehe Tabelle 6) eluiert.
Tabelle 6
Die Elektrophoresedaten deuten darauf hin, dass die Hauptproteinkontaminate-Albumin (siehe 3) von dieser Fraktion beseitigt ist, was zu einer zusätzlichen 4fachen Aufreinigung führt.
Stufe 3. Der teilweise aufgereinigte Inhibitor aus Stufe 2 wird direkt auf einer G-75 Sephadex Säule angewendet.
Das Volumen der Säule ist 20 ml (20 × 1), die Elutionsrate ist 2 ml/Std. Der Elutionspuffer ist 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5. Die Detektion wurde auf einem Chromatograph Millichrom bei 230 und 280 nm durchgeführt. Die Fraktion 5, die die höchste Aktivität hatte wurde isoliert.
Tabelle 7
Stufe 4. Die Reverse-Phasen Chromatographie (Pharmacia FPLC System) wird unter Verwendung von Pro-REC Säulen auf einer Ultrasfera Matrix durchgeführt. Das Protein wird unter Verwendung von 0,1%iger Trifluoressigsäure in einem Acetonitrilgradienten eluiert.
Die Homogenität eines Produkts mit MW 16-17kD entspricht 90%, wie in der Analyse des Acrylamid/Natriumdodecylsulfatgels gezeigt wurde (siehe 6). Das Ergebnis ist in 4 dargestellt. Die Aktivität wird auf der Fraktion 5 bestimmt. Die endgültige Ausbeute des Produkts ist 5%. Als Resultat daraus ist die gesamte Menge an Protein mit MW 16 kD nach der Aufreinigung 650 ng/ml des anfänglichen Produkts. Während des Aufreinigungsvorgangs wurde das Produkt der Hitzeinkubation bei 70°C für mehrere Minuten ausgesetzt, aber es wurde kein Verlust der biologischen Aktivität festgestellt.
Beispiel 12B: Alternativmethode für die Isolierung großer Mengen von INPROL
Anfängliche Isolation
Rippen von frischen Scheinekadavern wurden von Muskelfasern und Fett gereinigt, dann in Stücke geschnitten und in phosphatgepufferter Saline in dem Verhältnis 1:1 (Gewicht/Volumen) eingeweicht. Die erhaltene Mischung wird durch eine hydraulische Presse zerstoßen, um Knochenmark von dem festen Knochenmaterial zu trennen.
Die Suspension der Knochenmarkszellen wird gesammelt und durch vier Lagen von Seihtüchern gefiltert, um sie von festen Partikeln zu befreien. Das Filtrat wird bei 56°C für 40 Minuten inkubiert, dann in einem Eisbad auf 4°C gekühlt. Das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugation bei 10.000 g für 30 Minuten bei 4°C entfernt und verworfen.
Der klare Überstand wird tropfenweise während 30 Minuten zu 10 Volumina von gerührtem eiskalten Aceton, beinhaltend 1 % pro Volumen konzentrierte Salzsäure, zugesetzt. Die resultierende Mischung wird bei 4°C für 16 Stunden für die komplette Formation des Präzipitats beibehalten. Dann wird das Präzipitat durch Zentrifugation bei 20,000 g für 30 Minuten bei 4°C pelletiert. Das Pellet wird mit kaltem Aceton gewaschen und getrocknet.
HPLC Aufreinigung
Das Pellet wird in HPLC Elutionspuffer A, beinhaltend 5% Acetonitril (MeCN) und 0,1% Tri-fluoressigsäure (TFA), auf eine endgültige Proteinkonzentration von 8-10 mg/ml gelöst. Diese Lösung (0,5-0,6 ml) wird auf eine 250 × 4,6 mm HPLC Säule mit Polisil ODS-300 (10 mcm) gepackt und mit dem gleichen Puffer A äquilibriert.
Die Elution wird durch einen Gradienten von Puffer B (90% MeCN, 0,1% TFA) in Puffer A bei einer Durchflußrate von 1 ml/min gemäß dem folgendem Programm erreicht:

Zeit, Minute % von B

0 0

4 0

5 25

25 90
Ein zusätzlicher Schritt von 100% B wird für 5 Minuten verwendet, um die Säule vor der Re-äquilibrierung zu waschen. Dann wird die Säule wieder für das Zurücksetzen in den Anfangszustand äquilibriert und der nächste Teil der Proteinlösung kann geladen werden. Ein typisches Chromatogramm ist in 5 gezeigt.
Während der Auftrennung wird der Säulenausfluss bei 280 nm zur Detektion des Proteinpeaks beobachtet. Fraktionen die Proteinmaterial beinhalten werden gesammelt, getrennte Peaks werden gepoolt und bei 30°C zur Trockenheit rotationsevaporiert. Die erhaltenen Reste werden in destilliertem Wasser gelöst und durch Bioaktivitätstests und durch SDS-PAGE (14% Gel, reduzierende Bedingungen) untersucht.
Der Peak, der das aktive Material beinhaltet wird zwischen 70 und 80% des Puffers B eluiert und beinhaltet die Hauptproteinbande von 16kD und die Spuren von sich schneller fortbewegenden Proteinen wie untersucht durch das SDS-PAGE.
Eine Analyse des Materials, welches durch die Sammlung von nur dem 2. Haupt HPLC Peak erhalten wurde, ist in 15 gezeigt (A und C). Das Material, welches beide Peaks beinhaltet (zB 5) wird hier als pINPROL Präparat 1 bezeichnet und jenes, welches nur aus dem 2. Peak besteht wird als pINPROL Präparat 2 bezeichnet. 500 μg dieses aktiven gereinigten pINPROL Präparats 2 wurde auf eine C4 Reverse-Phase-Säule (Vydac) geladen und unter Verwendung eines linearen Gradienten von 595% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert. Das Material eluierte als ein einzelner Peak bei 53% Acetonitril (15A). Wenn jedoch 250 μg von MIP-1α (R&D Systems) unter identischen Bedingungen laufen gelassen wurden, eluiert es bei 43,9% Acetonitril (15B – anzumerken ist, dass frühere Peaks vor den 14% Acetonitril Artefakte sind und aufgrund von Luftblasen im Detektor auftreten). Daher ist natürlich auftretendes INPROL wesentlich mehr hydrophob als MIB-1α unter diesen Bedingungen. TGFβ ist dafür bekannt, bei geringeren Konzentrationen als jene, die für pINPROL unter diesen Bedingungen beobachtet wurden zu eluieren (Miyazono et al. J. Biol. Chem. 263:6407-15, 1988).
Ein Gel des eluierten pINPROL Materials ist in 15C gezeigt. Bahn 1 ist das Rohmaterial, Bahn 2 die Molekulargewichtsmarker und Bahn 3 das gereinigte Material. Es gibt zwei Hauptbanden, eine bei ungefähr 14kD und eine bei ungefähr 35kD. Es wird angenommen, dass die 35kD Bande eine Multimerform der 14kD Bande ist
Beispiel 13A: Aktive INPROL Präparate beinhalten eine Hämoglobin Betakette.
pINPROL wurde wie in 5 gezeigt hergestellt (dh pINPROL Präparate 1 (siehe Beispiel 12B))). Das Material wurde über eine SDS-PAGE laufen gelassen und unter Verwendung von Standardtechniken auf Nitrozellulose transferiert. Das Material wurde einer N-terminalen Sequenzanalyse, unter Verwendung eines ABI 477A Proteinsequenzierers mit 120A Online PTH-AA Analysierern, unter Verwendung von Standardtechniken, unterworfen. Die folgende N-terminale Sequenz wurde erhalten:
VHLSAEEKEAVLGLWGKVNVDEV......
Eine Computersuche der Proteindatenbanken zeigt, dass diese Sequenz Identität mit der N-terminalen Sequenz der Betakette von Schweine-Hämoglobin (vgl. 16C) hat.
Beispiel 13B: Aktive INPROL Präparate beinhalten eine Hämoglobin-Alphakette.
Wie gezeigt in 15C, resultiert Protein, welches durch Sammeln des 2. Hauptpeaks gezeigt in 5 (dh pINPROL Präparation 2) gereinigt wurde, in zwei Hauptbanden ent-sprechend den Molekulargewichten von etwa 15K und 30K, sowie mehreren geringeren Banden. SDS-PAGE Gele wurden auf Nitrozellulose unter Verwendung von Standardtech-niken transferiert und individuelle Banden wurden ausgeschnitten und N-terminaler Sequenzanalyse wie in Beispiel 13A unterworfen. Die folgende N-terminale Sequenz wurde für die 15kD Bande erhalten:
VLSAADKANVKAAWGKVGGQ.....
Die 30kD Bande wurde einem begrenzten proteolytischen Abbau unterworfen und die folgende interne Sequenz wurde erhalten:
**FPHFNLSHGSDQVK...........
Die erste Sequenz zeigt Identität mit der N-terminalen Sequenz der Schweine-Hämoglobin-Alphakette wohingegen die zweite Sequenz Identität zeigt mit den Resten 43-56 der SchweineHämoglobin-Alphakette (siehe 16C für einen Sequenzvergleich von humanen, murinen und Schweine-Alpha- und -Beta-Hämoglobinketten). Wiederholte Sequenzierung dieser Banden sowie von manchen der geringeren Banden lieferte übereinstimmende Abschnitte der Alphaglobinsequenz. Daher stellen die verschiedenen in 15C beobachteten Banden entweder Fragmente oder Aggregate der Schweine-Hämoglobin-Alphakette dar:
Beispiel 13C: Weitere Charakterisierungen von Schweine-INPROL
Um pINPROL mit Schweinehämoglobin weiter zu vergleichen, wurde zweifach kristallisiertes Schweinehämoglobin von Sigma Chemical Company erhalten und einer Reversen-Phase HPLC wie beschrieben in Beispiel 12B für 15 unterworfen. Wie in 17 zu sehen ist, ist das HPLC-Chromatogramm von intaktem Hämoglobin ähnlich dem, das für das pINPROL Präparat 1 zu sehen ist. Ferner zeigt das in 17A gezeigte pINPROL Präparat 2, (dh abgeleitet von dem zweiten Peak aus 5) in einem direkten Vergleich eine Überlappung mit jener der zweiten zwei Peaks des Schweine-Hämoglobins (17B) mit Retentionszeiten von jeweils 52,51 und 52,25 Minuten für die Hauptpeaks. Es sollte angemerkt werden, dass Häm mit dem ersten Hauptpeak des Hämoglobin komigriert, in diesem Fall bei 49-153 Minuten; Häm ist daher ein Bestandteil des pINPROL Präparats 1 aber nicht des Präparats 2. Dies wird bestätigt durch das Fehlen einer Absorbtion dieses pINPROL Präparats bei 575 nm, einer Wellenlänge, die für das Vorhandensein von Häm diagnostisch ist.
Die vorhergesagten Molekulargewichte von Schweine-Hämoglobin-Alpha- und -Betaketten sind jeweils 15.038 Dalton und 16.034 Dalton. Wie in dem SDS-PAGE Chromatogramm in 18 zu sehen ist, bestehen die ersten beiden Peaks aus der Kette mit höherem Molekulargewicht und die zweiten zwei bestehen aus der Kette mit geringerem Molekulargewicht. Daher scheinen die ersten beiden Peaks die Hämoglobin Betakette zu repräsentieren und die zweiten zwei Peaks die Hämoglobin Alphakette zu repräsentieren.
Zusätzliche Auftrennungen des Schweine-Hämoglobins wurde unter Verwendung eines flachen Elutionsgradienten (21) durchgeführt. Die N-terminalen Analysen dieser Peaks demonstrierten, dass der erste Peak die Schweine-Alphakette und der zweite die Schweine- Betakette ist. Bioassayergebnisse bestätigen, dass beide isolierten Hämoglobinketten biologisch aktiv sind (zB Beispiele 14 und 15).
Um das pINPROL Präparat 2 und die Hämoglobin-Betakette weiter zu vergleichen wurde eine zweidimensionale Elektrophorese durchgeführt (19). In einer ersten Dimension wurde die isoefektrische Fokusierung in Glasröhren unter Verwendung 2%iger pH 4-8 Ampholine für 9600 Volt-Stunden durchgeführt. Tropomyosin (MW 33kD, pI 5,2) wurde als ein interner Standard verwendet; seine Position ist auf dem endgültigen 2D Gel mit einem Pfeil gekennzeichnet. Das Röhrengel wurde in Puffer äquilibriert und auf die Oberseite eines Ladegels auf der Oberseite eines 12,5%igen Acrylamidplattengels dichtend aufgebracht. Die SDS-Plattengel Elektrophorese wurde für 4 Stunden bei 12,5 mA/Gel durchgeführt. Die Gele wurden mit Silber gefärbt und getrocknet.
Ein Vergleich der 2D Elektrophorese Muster zeigte nur ein oder zwei geringere Punkte, die zwischen der HPLC aufgereinigten Hämoglobin-Betakette und dem pINPROL Präparat 2 verschieden sind. Western Analysen, unter Verwendung von anti-Schweine-Hämoglobin- Antikörpern und entweder 1 D oder 2D Elektrophoresen bestätigten das Vorhandensein von Beta-Hämoglobin in dem Präparat. Daher ist das aktive pINPROL Präparat 2, das gemäß dem Beispiel 12B hergestellt wird, im wesentlichen die Schweine-Hämoglobin-Betakette.
Beispiel 14: Hämoglobin-Alphakette Hämoglobin-Betakette oder intaktes Hämoglobin zeigt stammzellhemmende Aktivität.
Um zu bestätigen, dass die Hämoglobin-Betakette INPROL Aktivität hat, wurde ein Suicide Assay unter Verwendung von Knochenmark von testosteronbehandelten Mäusen durchgeführt, wobei die Vorgehensweise wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung von Material, dass aufgereinigt wurde, wie in Beispiel 12B, verwendet wurde. Wie in Tabelle 8 gezeigt ist, wurden 15% der normalen Mausknochenmarkszellen getötet, im Gegensatz zu 36% in den testosteronbehandelten Tieren. Wie er wartet zeigte dies, dass die Testosteronbehandlung den Prozentsatz der Zellen im Zyklus steigert (und sie daher empfänglicher für das Sterben macht – zB Beispiel 1). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen von testosteronbehandelten Tieren, die mit entweder pINPROL oder gereinigter Hämoglobin Betakette bei 40 ng/ml inkubiert wurden eine dramatische Senkung des Prozentsatzes der Zellen im Zyklus von 36% auf jeweils 0% und auf 7%. Die höhere Dosis von 200 ng war weniger effektiv für beide Proteine. Als eine Positivkontrolle reduzierte der zuvor beschriebene Stammzelleninhibitor MIP-1α die Zyklierung auf 13%.
Ein ähnlicher Assay kann in vitro unter Verwendung des Zyklierungsstatus von CFU-MIX anstelle von CFU-S durchgeführt werden. Der Assay wird wie oben beschrieben für den CFU-S Assay durchgeführt, außer das Cytosin-Arabinosid (Ara C, 30 Mikrogramm/ml) als das zyklusspezifische toxische Agens anstelle von hohen Dosen von tritiiertem Thymidin (siehe B.I. Lord in Haemopoiesis – A Practical Approach, N.G. Testa and G. Molineux (Eds.), IRL Press 1993; Pragnell et al. in Culture of Hematopoietic Cells, R.I. Freshney, I.B. Pragnell und M.G. Freshney (Eds.), Wiley Liss 1994) und das ein Mausstamm mit hohen endogenen Zyklierungsraten (Balb/c) anstelle von testosteronbehandelten BDF₁ Mäusen, verwendet wird. Wie in Tabelle 9 gezeigt sind hoch aufgereinigte Schweine-Betaketten oder hoch aufgereinigte Schweine-Alphaketten beide in diesem Assay aktiv. Es ist anzumerken, dass in diesem Assay die Zyklierungslevel für Zellen, die mit pINPROL behandelt wurden manchmal negative Zahlen haben, was andeutet, dass sogar mehr Kolonien in dem Ara C behandelten Pool sind als in dem nicht behandelten Pool.
Wie in Beispiel 2 beschrieben inhibiert pINPROL die Proliferation der murinen Stammzellenlinie FDCP-MIX in einem tritiierten-Thymidin-Aufnahme-Assay. 20 zeigt, dass sowohl aufgereinigte Hämoglobin-Alpha- als auch -Betaketten in diesem Assay aktiv sind, wobei Inhibierungen bei < 2 ng/ml gesehen werden.
Das vorhergegangene deutet darauf hin, dass die Betakette von Schweine Hämoglobin INPROL Aktivität zeigt. Andere Daten (zB Tabelle 9, 20) zeigen, dass isolierte Alpha-ketten sowie auch intaktes Hämoglobin ebenfalls als Stammzellinhibitor aktiv sind. Aktive Präparationen beinhalten auch Mischungen von Alpha- und Betaketten (zB 5).
Die Beobachtungen, dass isolierte Alphaglobinketten und/oder isolierte Betaglobinketten aktiv sind, deuten darauf hin, dass die hier beschriebenen Aktivitäten nicht eine intakte drei-dimensionale Hämoglobinstruktur fordern. Fragmente von Alpha- und Betaketten sind ebenfalls als Stammzellinhibitoren und -stimulatoren aktiv. Tabelle 8

Behandlung % getötet

NBM 15

TPBM 36

pINPROL 200 ng/ml 23

40 ng/ml 0

Hbg 200 ng/ml 25

40 ng/ml 7

MIP-1α 200 ng/ml 13

Tabelle 9

Behandlung % getötet

Kontroll 43

Schweine-Alphakette –4

Schweine-Betakette –14
Beispiel 15: Gereinigtes INPROL gereinigtes Schweine-Alpha-Hämoglobin oder gereinigtes Schweine-Beta-Hämoglobin sind in vivo aktiv.
Um die Fähigkeit von gereinigten Schweine-Hämoglobinketten in vivo zu agieren zu testen, wurden BDF₁ Mäuse mit Testosteron-Propionat wie beschrieben in Beispiel 1 injiziert. 24 Stunden später erhielten die Mäuse intravenös 500 ng von entweder pINPROL, Schweine- Hämoglobin-Alphaketten (gereinigt aus peripheren roten Blutzellen wie in 21), Schweine-Hämoglobin-Betaketten (gereinigt aus peripheren roten Blutzellen wie in 21) oder das äquivalente Volumen eines Trägers. 48 Stunden später wurde das Knochenmark von jeder Maus geerntet und der CFU-MIX Assay wurde wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt. Wie gezeigt in Tabelle 10 waren alle pINPROL, Schweine-Alphaketten und Schweine-Betaketten in vivo aktiv, wobei der Prozentsatz von CFU-MIX im Zyklus auf Basislevel gesenkt wurde. Tabelle 10

Behandlung % getötet

Kontrolle 45

pINPROL 5

Schweine Alphakette 5

Schweine Betakette –5

Basis 4
Beispiel 16: Gereinigte humane Hämoglobin-Alphakette biotinylierte humane Hämoglobin- Alphakette biotinylierte humane Hämoglobin-Betakette humane Hämoglobin-Gammakette und humane Hämoglobin-Deltakette zeigen alle stammzelleninhibitorische Aktivität in vitro.
Humanes Hämoglobin wurde entweder von Sigma Chemical Cooperation erhalten oder wurde durch Standardmittel von adultem humanen peripheren Blut oder Nabelschnurblut isoliert. Individuelle Ketten wurden durch Reverse-Phase HPLC in ähnlicher Weise wie oben für Schweine-Alpha- und -Betaketten beschrieben isoliert (siehe B. Masala und L. Manca, Methods in Enzymology vol. 231 pp. 21-44, 1994). Gereinigte Alpha-, Beta-, Gamma- und Deltaketten wurden erhalten. Für biotinylierte Alpha- und Betaketten wurden 1 mg von adultem humanen Hämoglobin mit 37 μg von NHS LC Biotin (Pierce) behandelt und die Ketten durch Reverse-Phase-Chromatographie wie oben getrennt.
Wie gezeigt in den Tabellen 11, 12 und 13 sind alle gereinigten Human-Alpha-, biotinylierten Human-Alpha-, biotinylieren Human-Beta-, Human-Gamma- und Human-Delta-Hämoglobinketten in dem CFU-MIX Zyklierungsassay aktiv. Tabelle 11

Behandlung % getötet

Kontrolle 49

Human-Alphakette –1

Human-Betakette 41

Human-Gammakette –63

Tabelle 12

Behandlung % getötet

Kontrolle 47

Human-Gammakette 12

Human-Deltakette –4

Tabelle 13

Behandlung % getötet

Kontrolle 68

Human-Alphakette 19

Biotinylierte Alphakette 7

Human-Betakette 55

Biotinylierte Betakette 25
Beispiel 17: Gereinigte humane Alphakette Alpha-Beta-Dimer oder Hämoglobin sind in vivo aktiv.
Gereinigte humane Alphaketten, Alpha-Beta-Dimere oder Hämoglobin wurden in einem in vivo-Assay wie in Beispiel 15 beschrieben getestet. Wie in Tabelle 14 gezeigt waren jede dieser bei einer Konzentration von 500 ng/Maus aktiv. Tabelle 14

Behandlung % getötet

Kontrolle 49

Human Alphakette –22

Humanes Alpha-Beta-Dimer 14

Humanes Hämoglobin –31
Beispiel 18: Schweine-INPROL ist in vitro aktiv auf humane mononukluare oder CD34+ Nabelschnurblutzellen.
Um die Fähigkeit von gereinigtem INPROL von Schweineknochenmark das Zyklieren von humanen Vorläufern zu beeinflussen zu untersuchen, wurden Nabelschnurblutzellen gewonnen. Entweder wurde die gesamte mononukleare Zellfraktion, erhalten nach der Separation auf Ficoll, oder die CD34+ Fraktion, erhalten nach der Fraktionierung auf Anti-CD34 Affinitätssäulen (CellPro Inc.), verwendet. Die Zellen wurden für 48 Stunden in vitro in der Gegenwart von Interleukin 3 (IL-3) und Stammzellfaktor (SCF) (100 ng/ml jeweils) inkubiert, um sicherzustellen, dass die frühen Stammzellen im Zyklus waren. Nach dieser Prä-inkubation wurden Zyklierungsassays wie in Beispiel 14 für die Maus beschrieben durchgeführt, außer dass CFU-GEMM (anstelle von CFU-MIX) am 18. Tag nach dem Plattieren gezählt wurden. Wie in Tabelle 15 gezeigt, inhibierte Schweine-INPROL die Zyklierung von CFU-GEMM in sowohl den bulk-mononuklearen Zellen oder in der CD34+ Fraktion.
Tabelle 15
Beispiel 19: Gereinigtes Human-Alpha-Hämoglobin ist aktiv auf humanen CFU-GEMM.
Humane Nabelschnurblut-mononukleare Zellen wurden erhalten und in IL-3 und SCF inkubiert und in einem Zyklierungsassay wie in Beispiel 18 beschrieben verwendet. Wie in Tabelle 16 gezeigt waren sowohl Schweine INPROL gereinigt aus Knochenmark und humanes Alpha-Hämoglobin gereinigt aus peripherem Blut in diesem Assay aktiv. Tabelle 16

Behandlung % getötet

Kontrolle 100

pINPROL –6

Human-Alphakette –23
Beispiel 20: Peptide erhalten von humanen Alpha-Hämoglobin- und von humanen Beta-Hämoglobinseguenzen sind aktiv.
Um aktive Peptidsequenzen zu identifizieren wurde die dreidimensionale Struktur von Myoglobin (welches in diesem Assay inaktiv ist) auf die native dreidimensionale Struktur der Alphakette, die in adultem humanen Hämoglobin vorhanden ist, unter Verwendung eines Computer-Modellierungsprogrammes aufgesetzt. Zwei Peptide (gleichbedeutend mit den Aminosäuren 43-55 und 64-82, die Regionen sind, welche strukturell unterschiedlich von Myoglobin im dreidimensionalen Raum sind) wurden in dem CFU-MIX Zyklierungsassay als aktivitätsaufweisend identifiziert. Um den Loop, der in der nativen Alphakette gefunden wurde, näher anzugleichen, wurde auch ein zyklisches Derivat des 43-55 Peptids (c43-55) (unter Verwendung einer disulfiden Bindung) synthetisiert und für aktiv befunen.
Die Sequenz dieser Peptide ist wie folgt:
Zwei Hämorphinsequenzen, Hämorphin 10 (Aminosäuren 32-41 der Betakettensequenz) und Hämorphin 7 (Aminosäuren 33-40) wurden getestet und für aktiv befunden.
Die Sequenzen waren wie folgt:

Hämorphin 10 Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe

Hämorphin 7 Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg
Um die Aktivität dieser Sequenzen zu testen, wurde der CFU-MIX Zyklierungsassay wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt. Wie in den Tabellen 17- 19 gezeigt sind all diese Peptide in diesem Assay aktiv. Tabelle 17

Behandlung % getötet

Kontrolle 47

pINPROL 0

Peptide (43-55)

100 ng/ml 2

10 ng/ml 18

1 ng/ml 11

Tabelle 18

Behandlung % getötet

Kontrolle 43

Peptid (43-55) 5

Peptid (64-82) 9

Hämorphin 10 1

Hämorphin 7 0

Tabelle 19

Behandlung % getötet

Kontrolle 47

Zyklisches Peptid 43-55 0
Beispiel 21: Ein Peptidfragment erhalten aus humanem Alpha-Hämoglobin durch Ameisensäurespaltung ist aktiv.
Die humane Alpha-Hämoglobinkette hat eine Ameisensäurespaltungsstelle zwischen Aminosäureposition 94 und 95 (Asp-Pro). Die Spaltung wurde durch Inkubation der gereinigten humanen Alphakette (wie in Beispiel 16) bei einer Konzentration von 1 mg/ml in 70%iger Ameisensäure für 72 Stunden bei 37°C erhalten. Das 1-94 Fragment wurde von der ungespaltenen Alphakette und das 95-141 Fragment durch Reverse-Phase HPLC wie in Beispiel 16 gereinigt; den Fraktionen wurde unter Verwendung von SDS-PAGE gefolgt (wie in Beispiel 22). Die Identität des gereinigten 1-94 Proteinfragments wurde durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bestätigt.
Um die stammzelleninhibitorische Aktivität dieses Fragments zu beurteilen wird der CFU-MIX Zyklierungsassay wie in Beispiel 14 verwendet. Tabelle 20

Behandlung % getötet

Kontrolle 50

Human Alpha 12

1-94 Fragment 0
Beispiel 22: Expression der Hämoglobin-Alphakette Polypeptid 1-141 Polypeptid 1-97 Peptid 43-55 und Peptid c(43-55) in E. coli als Ubiquitin Fusionen
Die Gene für die Peptide 43-55 ("p13") und c43-55 ("p15") (wie in Beispiel 20) wurden durch Annealing der korrespondierenden Oligonukleotide gemäß der optimalen Codonverwendung von E. coli synthetisiert (Anderssen und Kurland, Micro. Reviews 54:198-210, 1990). Das Gen für die intakte humane Alpha-Hämoglobinkette "p141" wurde durch das Designen eines Sets von Oligos für die PCR-Amplifizierung aus einem humanen Knochenmarks-cDNA-Pool (Clontech, Palo Alto, CA) erhalten. Das Gen für das 1-97 Fragment ("p1-97) wurde nach geeigneter Subklonierung durch PCR-Amplifizierung des Plasmids, beinhaltend das p141 Gen, erhalten.
Die obengenannten Gene wurden als Ubiquitinfusionsproteine exprimiert (siehe US Patente 5,132,213; 5,196,321 und 5,391,490 und PCT WO 91/17245). Der Wirtstamm E. coli DHSαF'IQ (Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD) wurde mit dem Ubiquitin- Expressionsvektor, pDSUb, der das geeignete synthetisierte Gen (obengenannt) beinhaltet, transformiert. pDSUb ist ein Derivat von pDS78/RBSII, das humanes Ubiquitin exprimiert (22A) (Hochuli et al., Biotechnology 6:1321-5, 1988). Loetscher et al. (JBC 266:11213-11220, 1991) modifizierte pDS78/RBSII durch das Herausschneiden der Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT)-Sequenz aus dem Hochuli-Plasmid und der Wiederligierung des Plasmids (22B). Ein synthetisches Ubiquitin-Gen wurde durch paarweises Annealing von kinasierten synthetischen Oligonukleotiden die für humanes Ubiquitin kodieren, mit einer Codonverwendung optimiert für die bakterielle Expression, konstruiert. pDSUb wurde dann durch das Einsetzen des syn-thetischen Ubiquitingens, das aus angeordneten Oligonukleotiden besteht, in einen Klenow-stumpfen-Bam HI – Bgl II-Abbau des derivatisierten pDS78/RBSII, konstruiert. Das resultierende Plasmid, pDSUb (22C), zeigte hohe Level an Expression von Ubiquitin in E. coli.
Das Plasmid, das p97 beinhaltet, und jenes, das p141 beinhaltet, wurden durch das Einsetzen von Afl II- Pst I-abgebauten PCR-Produkten, die für das p97 oder p141 Protein kodieren und Fusionsverbindung in einer direktionalen Klonierung in pDSUb, das zuvor mit Afl II und Pst I abgebaut wurde, konstruiert. Ähnlich wurden das Plasmid, das p13 beinhaltet, und jenes, das p15 beinhaltet, durch das Einsetzen kinasierter und annealter Oligonukleotide, die die geeigneten Sticky-Ends aufweisen und für die Peptide kodieren, und Fusionsverbindung in mit Afl II-Pst II abgebautem pDSUb, konstruiert.
Transformanten wurden mit 100 μg/ml Ampicillin, 5 μg/ml Neomycin selektiert, wobei Kolonien nach 2 Tagen bei 30°C auftauchten. Die Transformanten wurden durch PCR über die Insertions-Site gescreent. Kolonien, die das Insert mit korrekter Größe beinhalteten, wurden dann auf die Expression eines Fusionsproteins mit der geeigneten Größe mittels SDS-PAGE gescreent (siehe weiter unten). Die Ubiquitinfusion wurde durch die Zugabe von IPTG, welches den Lac-Repressor titriert und ihn von dem Promotor von pDSUb entfernt, überexprimiert (DH5αF'IQ beinhaltet ein hochreguliertes LacI^q-Gen auf dem F' Faktor, welcher mit 10 μg/ml Neomycin selektiert wird.)
Plasmid DNA von Klonen, die ein überexprimiertes induziertes Ubiquitinfusionsprotein zeigten wurde präpariert und durch die Di-Deoxy-Methode unter Verwendung der Sequenase Version 2.0 (United States Biochemical) sequenziert. Positive Klone wurden dann runtergefroren und in Glycerin bei –80°C gelagert. Positive Klone wurden auf LB-Platten beinhaltend Ampicillin (100 μg/ml), Neomycin (10 μg/ml) und 1% Glucose bei 30°C beibehalten. Sie wurden wöchentlich für bis zu 10 Passagen ausgestrichen, nach welchen ein frischer Ausstrich von einer gefrorenen Saatphiole für serielle Kulturen genommen wurde, um Stammauthentizität sicherzustellen.
Um Protein für den Assay zu erhalten, wurden 100 ml Starterkulturen in 250 ml Schüttelbehältern von Einzelkolonien durch Übernacht-Inkubation (16-20 Stunden in 2xYT-Medium mit Ampicillin (100 μg/ml), Neomycin (10 μg/ml) und 1 % Glucose wachsen gelassen. Die Schüttelbehälterkulturen wurden bei 30°C und 250 Upm in einem New Brunswick Schüttelinkubator beibehalten.
Am nächsten Morgen wurde die Kultur auf 1 Liter mit Medium verdünnt. Die Zellen wurden durch Zugabe von IPTG auf 1 mM (endgültige Verdünnung) bei OD₆₀₀ = 0,5 induziert und bei OD₆₀₀ = 0,8 durch Zentrifugation geerntet. Die geernteten Zellen wurden in hypotonische Lysispuffer resuspendiert (100 μl von 50 mM Tris, pH 10,0). Die bakteriellen Zellen wurden durch das Aussetzen der Suspension zu drei Zyklen von Gefrieren-Auftauen lysiert (Trockeneis-Ethanolbad für das Gefrieren und 60°C für das Auftauen). Die Suspension wurde dann für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt und bei 12.000 g für 10 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde als "S1" bezeichnet. Das Zellpellet wurde in 50 mM Tris pH10 und 2x SDS-Tricin-Ladepuffer resuspendiert (Novex, San Diego, CA) (1:1). Die Mischung wurde dann bei 95°C für 15 Minuten erhitzt und bei 12.000 g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Anteil des Präzipitats, der in der Lage war, in dieser Weise wieder gelöst zu werden wurde "P1" genannt. Der Anteil des Präzipitats abgeleitet von dem verbleibenden Pellet wurde "P2" genannt. P2 wurde in Ladepuffer ebenso wie P1 resuspendiert. Proben von S1, P1 und P2 wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
SDS-PAGE Gele wurden unter Verwendung eines Zwei-Puffer-Tricin-Systems in einer Mini-Gel-Apparatur mit 10-20% Tricingel (Novex) laufen gelassen. Der Anoden-(Boden)-Puffer war 0,2 M Tris, pH 9,0. Der Kathoden-(obere)-Puffer war 0,1 M Tris, 0,1 M Tricin, 0,1% SDS, pH 8,25. Ein kommerzieller Molekulargewichtsmarker, "Multi-Mark" (Novex), wurde verwendet. Bovines Ubiquitin, welches als ein Standard vewendet wurde, wurde von Sigma gekauft. Die Gele wurden bei einer konstanten Spannung von 4 mA laufen gelassen, bis der Farbmarker den Boden des Gels erreicht hat. Die Gele wurden mit 0,25% Coomassie Blue R250 (Sigma) in Essigsäure: Methanol (10%:40%) gefärbt und in der gleichen Lösung ohne den Farbstoff entfärbt.
Der Haupteil (>70%) des intakten p141-Ubiquitinfusionsproteins wurde in dem Präzipitat (P1 und P2) nach Zentrifugation des bakteriellen Lysats gefunden. In starkem Gegensatz dazu wurde der Hauptteil (>70%) des p97-Ubiquitinfusionsproteins in der löslichen Fraktion (S1) gefunden. Dies bestätigt, dass das Entfernen der C-terminalen hydrophoben Region in einem Produkt mit verbesserten Lösungseigenschaften resultiert. In ähnlicher Weise waren die p13 und p15 Peptide ebenfalls in der löslichen Fraktion enthalten.
Das UCH-L3 Ubiquinaseenzym (Recksteiner, M. (Ed.) Ubiquitin, Plenum Press (NY) 1988; Wilkinson et al., Science 246:670-73, 1989) wurde in pRSET exprimiert (Invitrogen, San Diego, CA), welcher benutzt wurde, um den Wirtstamm BL21/DE3 zu transformieren. UCH-L3 ist eine ubiquitinspezifische Protease, die an der C-terminalen Ubiquitinverlängerung schneidet. Sie wurde teilweise aus bakteriellen Lysaten durch eine 35% (w/v) Ammoniumsulfat Präzipitation gereinigt. Der exakte Prozentsatz von verwendetem Ammoniumsulfat wurde durch SDS-PAGE auf das Vorhandensein einer 25,5 kD Bande beobachtet. Der Überstand wurde gegen 50 mM Tris, pH 7,4 dialysiert und gegen ein Ubiquitinpeptidfusionssubstrat geprüft. Der aktive Überstand wurde aliquotiert und bei –20°C eingefroren. Ein typisches Reaktionsgemisch beinhaltet 3 μl Lysat, 1 μl 1M DTT, 1 μl UCH-L3 (wie oben) und 5μl Reaktionspuffer (50 mM Tris, pH 7,4). Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten durchgeführt. Für einen Abbau in größerem Maßstab wurden 300 μl Lysat mit 100 μl 1M DTT, 20 μl UCH-L3 und 580 μl Reaktionspuffer gemischt.
Peptide oder Proteine, die in der löslichen (S₁) Fraktion enthalten sind, wurden durch Reverse-Phase-HPLC wie in Beispiel 16 aufgereinigt; die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE kontrolliert und ihre Identität durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bestätigt (siehe weiter unten). Die gereinigten Peptide oder Proteine wurden durch UCH-L3 wie oben enzymatisch abgebaut, was in einem nicht ubiquinierten Endprodukt resultierte. Dieses geschnittene Material wurde dann durch Reverse-Phase-HPLC wieder aufgereinigt. Die Aufreinigung wurde durch SDS-PAGE verfolgt und die Identität des Endprodukts durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bestätigt.
Eine Alternative zu der oben beschriebenen in vitro Spaltung mit UCH-L3 wie oben beschrieben ist es ein ubiquitinspaltedes Enzym im gleichen Bakterium wie die gewünschte Ubiquitinfusion zu exprimieren. Für diesen Zweck wurde ein Vektor (pJT184), der die Ubiquinase UBP1 (Tobias und Varshavsky, JBC 266:12021-12028, 1991) exprimiert, verwendet. Bakterien, die die p97 Ubiquitinfusion und UBP1 koexprimieren zeigten in vivo einen vollständigen Abbau des Fusionsproteins; Bakterien, die die p141 Ubiquitinfusion und UBP1 koexprimierten, zeigten einen teilweisen (ungefähr 70%) Abbau des Fusionsproteins. Das in vivo verdaute p97 Protein wurde durch Ammoniumsulfatpräzipitation gefolgt von Reverser-Phase-HPLC wie oben gereinigt.
Um die Identität der exprimierten und gereinigten Polypeptide zu bestätigen, wurde eine Elek-trospray-Ionisations-Massenspektrometrie unter Verwendung eines VG Biotech BIO-Q Instruments mit einem Quadrupolanalysator durchgeführt. Myoglobin wurde zur Kalibrierung des Instruments verwendet. Der Hauptbestandteil, der mit gereinigtem p97 erhalten wurde, war ein einzelner Peak mit einem Molekulargewicht von 10.339 Dalton; dies vergleicht sich in günstiger Weise mit dem berechneten Molekulargewicht von 10.347, was die Identität des rekombinaten p97 Fragments bestätigt.
Beispiel 23: Rekombinantes p1-97 behält stammzelleninhibitorische Aktivität.
Um die Bioaktivität des rekombinanten p1-97 zu beurteilen wurde der CFU-GEMM Zyklierungsassay wie in Beispiel 18 verwendet: Tabelle 21

Behandlung % getötet

Kontrolle 62

Human-Alpha 11

p97 0
Beispiel 24: Humanes Alpha-Hämoglobin und Peptid43-55 inhibieren CFU-MIX Zyklierung in vivo in testosteron- oder 5-Fluoruracil (5FU) behandelten Mäusen.
Um die stammzelleninhibitorische Aktivität des Peptids 43-55 in vivo zu beurteilen wurden B6D2 F₁ Mäuse mit Testosteron-Propionat wie in Beispiel 1 beschrieben oder mit 5FU vorbehandelt. Im Speziellen wurde Testosteron-Propionat (100 mg/kg Körpergewicht) am Tag 0 in die Mäuse i.p. injiziert. Alternativ wurden die Mäuse am Tag 0 mit 5FU (200 μg/kg Körpergewicht) injiziert.
24 Stunden später (Tag 1) wurden variierende Dosen des Peptids 43-55 oder Träger i.v. injiziert. Das Knochenmark wurde am Tag 2 geerntet und der CFU-MIX Zyklierungsassay wurde wie in Beispiel 14 durchgeführt. Im Speziellen wurden die Mäuse geopfert und Einzelzellen-knochenmarkssuspensionen von den Oberschenkelknochen hergestellt. Die Zellen wurden einmal gewaschen und die Konzentration auf 5 × 10⁶ Zellen/ml in Fischer's Medium eingestellt. Für jede Testbedingung wurden 1 ml der Zellen zu jedem von 2 Polypropylenröhrchen zugesetzt. Die Röhrchen wurden bei 37°C für 3 Stunden ohne ("Kontrolle") oder mit ("Versuch") den geeigneten Konzentrationen der Testsubstanz inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde 30 μg/ml Cytosin-Arabinosid ("Ara C" (Sigma)) zu der Hälfte der Röhrchen zugegeben und das gleiche Volumen Fischer's Medium wurde den anderen zugegeben. Die Röhrchen wurden für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert, danach wurden sie auf Eis gestellt und zweimal mit kaltem Fischer Medium gewaschen.
Die Zellen wurden auf 5 × 10⁴ bis 10⁶/ml in Fischer's Medium wieder eingestellt und 0,5 ml der Zellsuspension wurden zu 5 ml Methocult M3430 Methylzellulosemedium (Stem Cell Technologies, Vancouver, British Columbia) zugegeben. Die Mischung wurde mit einem Vortexer energisch gemischt und 1 ml wurde in jede von fünf 35 mm Schalen verteilt. Die 35 mm Schalen wurden ihrerseits danach in eine abgedeckte 150 mm Schale mit einer offenen 35 mm Schale, die steriles Wasser enthielt, gegeben. Die CFU-MIX Kolonien wurden unter der Verwendung eines invertierten Mikroskops nach 7 Tagen der Inkubation bei 37°C gezählt.
Die Unterschiede in der Koloniezahl zwischen den Röhren, die mit Medium behandeit wurden, gegenüber den Röhren, die mit Ara C behandelt wurden, repräsentieren den Prozentsatz der Zellen im Zyklus unter diesen Bedingungen, gemäß der Formel:
Wobei a = Anzahl der CFU-MIX von einer nur mit Medium allein inkubierten Röhre
b = Anzahl der CFU-MIX von einer mit Ara C inkubierten Röhre
Tabelle 22¹

Behandlung % getötet

Kontrolle 35

Human-Alphakette (500 ng) 13

Peptid 43-55 (0,5 ng) 0

Tabelle 23¹

Behandlung % getötet

Kontrolle 62

Human-Alphakette (500 ng) 0

Peptid 43-55 (0,5 ng) 3

Zyklisches Peptid 43-55 (0,5 ng) 14
Beispiel 25: Peptid 43-55 ist als ein Stammzelleninhibitor aktiv wenn es an den N-terminalen Phe (Phe₄₃) biotinyliert oder am Phe₄₃ oder Phe₄₆ iodiniert ist.
Das Peptid 43-55 wurde durch Solid Phase Peptide Synthetic Techniques (American Peptide Co., Sunnyvale, CA) synthetisiert. Peptidanaloga wurden mit Jod an der Paraposition von Phe₄₃ oder Phe₄₆ synthetisiert. Biotinylierte Peptide 43-55 wurden durch Verbinden des COOH von Biotin mit einem C₄ Kohlenstoff-Linker an den N-Terminus NH₂ von Phe₄₃ synthetisiert. Tabelle 24

Behandlung % getötet

Kontrolle 31

Peptid 43-55 (1 ng/ml) 8

Biotinyliertes Peptid 43-55 (1 ng/ml) 15
Beispiel 26: Morphium inhibiert die Zyklierung von murinen CFU-MIX in vitro.
Morphium wurde in dem CFU-MIX Zyklierungsassay unter Verwendung von Knochenmark von Balb/c Mäusen wie in Beispiel 24 getestet: Tabelle 25

Behandlung % getötet

Kontrolle 44

Human-Alphakette (100 ng/ml) 0

Morphium (10^–7 M) 10

(10^–9 M) 15

(10^–11 M) 32
Beispiel 27: Die Opiatpeptide DAMGO und DALDA inhibieren Zyklierung von murinen CFU-MIX in vitro.
DAMGO und DALDA wurden in dem CFU-MIX Zyklierungsassay unter Verwendung von Knochenmark von Balb/c Mäusen wie in Beispiel 24 getestet. Tabelle 26

Behandlung % getötet

Kontrolle 33

DAMGO (10^–5 M) 15

(10^–7 M) 0

(10^–9 M) 38

DALDA (10^–5 M) 47

(10^–7 M) 0

(10^–9 M) 34
Beispiel 28: Nociceptin inhibiert die Zyklierung von murinen CFU-MIX in vitro.
Nociceptin wurde in dem CFU-MIX Zyklierungsassay unter Verwendung von Knochenmark von Balb/c Mäusen wie in Beispiel 24 getestet: Tabelle 27

Behandlung % getötet

Kontrolle 31

Peptid 43-55 (1 ng/ml) 8

Nociceptin (10^–7 M) 6

(10^–9 M) 0
Beispiel 29: Naloxon wirkt gegen die inhibitorische Aktivität der humanen Alpha- und Delta-Hämoglobinketten, Hämorphin 10 und Peptid 43-55.

Der CFU-MIX Zyklierungsassay wurde wie in Beispiel 24 durchgeführt. Die Testsubstanzen wurden für sich selbst oder in Gegenwart von Naloxon (10^–5 bis 10^–7 M) geprüft. Naloxon selbst hatte keinen Effekt auf den Assay bei diesen Konzentrationen. Tabelle 28:

Behandlung	% getötet
Kontrolle	38
Naloxon	36
Human-Alpha (100 ng/ml)	0
Human-Alpha + Naloxon	52
Peptid 43-55 (10 ng/ml)	6
Peptid 43-55 + Naloxon	50
Hämorphin 10 (100 ng/ml)	0
Hämorphin 10 + Naloxon	36

Tabelle 29:

Behandlung	% getötet
Kontrolle	32
Human-Delta (100 ng/ml)	10
Human-Delta + Naloxon	31

Beispiel 30: Geringe Konzentrationen von Naloxon inhibieren die Zyklierung von murinen CFU-MIX
Der CFU-MIX Assay wurde wie in Beispiel 24 durchgeführt.
Tabelle 30:

Behandlung % getötet

Kontrolle 38

Human-Alpha (100 ng/ml) 0

Naloxon (10^–10 M) 0
Beispiel 31: Der My-Opiatrezeptor-Antagonist CTOP wirkt entgegen der inhibitorischen Aktivität der humanen Hämoglobin-Alphakette, des Peptids 43-55 und des Peptids 64-82.
CTOP (H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH₂, mit einem Disulfid zwischen Cys₂ und Pen₇) ist ein Analogon von Somatostatin, welches ein My-Opiatrezeptorspezifischer Antagonist ist. Die Testsubstanzen wurden für sich selbst oder in der Gegenwart von CTOP(10^–7 M) geprüft. CTOP für sich selbst hatte bei dieser Konzentration keinen Effekt auf den Assay wirkte aber gegen die Zellzyklusinhibierung verursacht durch Alpha-Hämoglobin oder das Peptid 43-55. Tabelle 31

Behandlung % getötet

Kontrolle 42

CTOP 36

Human-Alpha (100 ng/ml) 0

Human-Alpha + CTOP 20

Peptid 43-55 (10 ng/ml) 8

Peptid 43-55 + CTOP 21
Beispiel 32: Vorbehandlung mit humaner Alphakette steigert die Anzahl der sich spät bildenden Cobblestone-Forming Cells.
Der Cobblestone-Assay wurde wie von Ploemacher und Kollegen (Ploemacher et al., Blood 74:2755-63, 1989; van der Sluijs et al., Exp. Hematol. 18:893-6, 1990; Ploemacher et al., Blood 78:2527-33, 1991; Ploemacher et al., J. Tiss. Cult. Meth. 13:63-68, 1991; Down und Ploemacher, Exp. Hematol. 21:213-21, 1993) beschrieben durchgeführt. Der Cobblestone- Assay misst das Auftauchen von Gruppen von Zellen (oder "Cobblestones") innerhalb eines Monolayers von Stroma-Zellen. Sehr primitive Stammzellen bilden keine Kolonien in weichem Agar, bilden aber Cobblestones in Gegenwart eines Stroma-Monolayers. Die Zellen, die Cobblestones bilden, werden als "cobblestone area forming cells" (CAFC) bezeichnet. Die weiter differenzierten (zB GM-CFC) Vorläufer bilden vorübergehende Cobblestones, die auftauchen und dann innerhalb der ersten paar Wochen der Kultivierung verschwinden, wohingegen primitivere Stammzellen (zB langfristige repopulierende Zellen) Cobblestones bilden, die nur nach 4-5 Wochen der Kultivierung auftauchen. Daher sind CAFC-Bildung an den Tagen 7-14 der Kultivierung in CFU-GM angereichert, CAFC-Bildung an den Tagen 28-35 in CFU-MIX angereichert und CAFC-Bildung an den Tagen 28-35 in langfristig repopulierenden Zellen angereichert.
B6D2F1 Mäuse wurden mit Testosteron-Propionat wie in Beispiel 24 behandelt. Am nächsten Tag wurde das Knochenmark entnommen und für 4 Stunden mit oder ohne Humanen Alpha-Hämoglobinkette (100 ng/10⁶ Zellen) inkubiert, und danach würden Sie in einem Cobblestone-Assay plattiert. Der verwendete Assay besteht aus einer Vereinzelung durch Verdünnung von Langzeit-Knochenmarkskulturen (LTBMC) in 96-Well-Platten. Die Kulturen wurden vorbereitet durch das Wachsenlassen der murinen FBMD-1 Stroma Zelllinie (Breems et al., Leukemia 11:142-50, 1997) bis sie konfluent waren; 96-Well-Platten mit konfluenten Monolayern wurden bei 33 °C bis zum Assay gelagert. Murine Knochenmarkszellen wurden als eine Einzelzellsuspension vorbereitet und die folgenden Verdünnungen von Zellen wurden pro Well in 0,2 ml LTBMC Medium (Stem Cell Technologies, Vancouver) plattiert: 27.000; 9.000; 3.000; 1.000; 333; Zwanzig Wells wurden für jede Verdünnung pro Bedingung plattiert und über 2 Platten verteilt.
Die Frequenz der cobblestone area forming cells (CAFC) wurde wie zuvor beschrieben berechnet (Ploemacher et al., Blood 78:2527-33, 1991; Ploemacher et al., J. Tiss. Cult. Meth. 13:63-68, 1991; Breems et al., Leukemia 8:1095-104, 1994). Die Ergebnisse sind in 23 gezeigt. Die Präinkubation der zyklierenden Stammzellen mit humanen Alpha-Hämoglobinketten steigerte den Anteil der sich spät bildenden CAFC um ungefähr das Fünffache. Die Behandlung von nicht zyklierenden Stammzellen mit Alphaketten hatte keinen Effekt.
Beispiel 33: Humanes Alpha-Hämoglobin und Peptide 43-55 zyklisches 43-55 und 64-82 inhibieren die Zyklierung von Humanen Nabelblutschnur CFU-GEMM
Der Humane-Nabelblutschnur-CFU-GEMM-Zyklierungsassay wurde wie in Beispiel 19 durchgeführt. Im Speziellen wurden mononukleare Zellen aus humanen Nabelschnurblutzellen isoliert und in IMDM Gewebekulturmedium angereichert mit 10% FPS, 100 ng/ml Kit-Liganden und 100 ng/ml humanem IL-3 auf 2 – 4 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt. Die Zellen wurden für 48 Stunden bei 37°C inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und in serumfreiem IMDM bei einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Ein ml Zellen wurde zu jedem von zwei Polypropylenröhrchen pro Bedingung zugegeben und der Zyklierungsassay wurde wie in Beispiel 24 für Mausknochenmark durchgeführt. Nach der Ara C Inkubation wurden die Zellen mit kaltem IMDM gewaschen und auf 10.000 bis 20.000 Zellen pro 0,5 ml IMDM eingestellt und mit 5 ml Methocult H4433 (Stem Cell Technologies) gemischt. Alternativ wurde Methocult H4435 Methylzellulosemedium (Stem Cell Technologies) verwendet wobei in diesem Fall die Zellkonzentration auf 2500-5000 Zellen pro 0,5 ml IMDM eingestellt wurde. Die Zellen wurden wie in Beispiel 24 plattiert und die CFU-GEMM Kolonien an den Tagen 14-18 abgezählt. Tabelle 32

Behandlung	% getötet
Kontrolle	52
Human-Alphakette (100 ng/ml)	0
Peptid 43-55 (1 ng/ml)	20
(10 ng)	12
(100 ng)	5
Zyklisches Peptid 43-55 (1 ng/ml)	32
(10 ng)	0
(100 ng)	11
Peptid 64-82 (1 ng/ml)	21
(10 ng)	20
(100 ng)	39

Beispiel 34: Humanes Alpha Hämoglobin und Peptid 43-55 inhibiert die Zyklierung von adulten humanen Knochenmarks-CFU-GEMM.
CD34+ Stammzellen wurden von Poietic Technologies (Gaithersburg, MD) nach Aufreinigung aus humanen Knochenmarkszellen mittels einer CellPro Säule erhalten.
Die Zellen wurden für 48 Stunden mit Kit-Liganden und IL-3 inkubiert und in einem CFU-GEMM-Zyklierungsassay wie im Beispiel 26 verwendet. Tabelle 33

Behandlung % getötet

Kontrolle 47

Human-Alphakette (ng/ml) 0

Peptid 43-55 (ng/ml) 0
Beispiel 35: CFU-GEMM in mobilisiertem humanen peripheren Blut zyklieren aktiv und sind durch humanes Alpha-Hämoglobin Peptid 43-55 DAMGO oder Morphium inhibierbar.

Peripheres Blut wurde von Brustkrebspatienten, die eine periphere Stammzellenmobilisation mit Cyclophosphamid und G-CSF gemäß Standardprotokolenl durchleben, erhalten. Rote Blutzellen wurden mit Ficoll Hypaque entfernt (Zellen wurden 1:1 mit IMDM verdünnt und 20 ml wurden über 16 ml Ficoll geschichtet und bei 800 g für 30 Minuten zentrifugiert; Mononukleare Zellen wurden von der Interphase entfernt und 2x in IMDM gewaschen). In einem Fall wurden die mononuklearen Zellen in flüssigem Stickstoff vor dem Assay gelagert. Die mononuklearen Zellen wurden für den CFU-GEMM Zyklierungsassay wie in Beispiel 26 plattiert, außer dass 2,5 bis 5 × 10⁵ Zellen pro Schale plattiert wurden. Tabelle 34

Behandlung	% getötet
Kontrolle (Patient # 1)	48
Human-Alphakette (100 ng/ml)	0

Tabelle 35

Behandlung	% getötet
Kontrolle (Patient # 2)	67
Human-Alphakette (ng/ml)	2
Peptid 43-55 (10 ng/ml)	0
Morphium (10^–7 M)	24
Morphium (10 ^–9 M)	0
DAMGO (10^–7 M)	15
DAMGO (10^–9 M)	0

Tabelle 36

Behandlung	% getötet
Kontrolle (Patient # 3)	29
Peptid 43-55 (0,1 ng/ml)	23
Peptid 43-55 (1,0 ng/ml)	0
Peptid 43-55 (10 ng/ml)	15

Beispiel 36: Hohe Dosen von humanem Alpha- oder Betahämaglobin, Myoglobin, Peptid 1-97 Peptid 43-55 Peptid 64-82 Nociceptin oder DALDA stimulieren die Zyklierung von ruhenden murinen Stammzellen.
Microgramm pro Mililiter Dosen von Hämoglobinketten, Myoglobin und Peptiden wurden auf die Stimulierung von ruhenden Stammzellen geprüft. Knochenmark wurde aus unbehandelten B6D2F₁ erhalten, und in dem CFU-MIX-Zyklierungsassay wie in Beispiel 24 getestet. Aus unbehandelten B6D2F₁-Mäusen isolierte Stammzellen sind normalerweise langsam zyklierend sofern sie nicht zB durch Testosteron Propionat (vgl Beispiel 1) oder Chemotherapie wie zB 5FU (vgl Beispiel 4) stimuliert werden, um in den Zyklus einzutreten. Tabelle 37

Behandlung % getötet

Kontrolle 3

Human-Alphakette (1 μg/ml) 0

(10 μg/ml) 24

(100 μg/ml) 40

Tabelle 38

Behandlung % getötet

Kontrolle 9

Human-Betakette (μg/ml) 55

Humanes Myoglobin (μg/ml) 30

Tabelle 39

Behandlung % getötet

Kontrolle 3

Human-Alphakette (100 μg/ml) 41

DALDA (10^–5 M) 24

(10^–3 M ) 41

DADLE (10^–5 M) 0

(10^–3 M) 0

Tabelle 40

Behandlung % getötet

Kontrolle 0

Human-Alphakette (100 μg/ml) 30

Peptid 43-55 (10 μg/ml) 26

Tabelle 41

Behandlung % getötet

Kontrolle 16

Peptid 1-97 (10 μg/ml) 62

Peptid (10 μg/ml) 41

Tabelle 42

Behandlung % getötet

Kontrolle 4

Peptid 64-82 (1 μg/ml) 25

Nociceptin (10^–5 M) 36
Beispiel 37: Intravenöse Verabreichung von hohen Dosen von humanem Alphahämoglobin stimuliert die Zyklierung von ruhenden murinen Stammzellen.
Humanes Alphahämoglobin wurde i.v. in unbehandelte B6D2F₁ Mäuse injiziert. 24 Stunden später wurden die Mäuse geopfert, das Knochenmark aus den Oberschenkelknochen gesammelt und der CFU-MIX-Assay wie in Beispiel 24 durchgeführt. Tabelle 43

Behandlung % getötet

Kontrolle (Unbehandelt) 0

Medium (Injektionskontrolle) 0

Human-Alphakette (150 μg/Maus) 48

Beispiel 38: Naloxon wirkt gegen die stammzellstimulatorische Aktivität von hohen Dosen von humanem Alphahämoglobin, Peptid 43-55. Tabelle 44

Behandlung % getötet

Kontrolle 6

Human-Alphakette (100 ng/ml) 48

+ Naloxon 0
Während die vorliegende Erfindung hinsichtlich der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht es sich, dass Variationen und Modifikationen für den Durchschnittsfachmann möglich sind.

Claims

Polypeptid, das eine α-Kette von Hämoglobin aufweist, die durch 16 dargestellt wird, wobei die C-terminale hydrophobe Domäne substituiert oder deletiert wurde.
Polypeptid, das eine α-Kette von Hämoglobin aufweist, die durch 16 dargestellt wird, wobei die C-terminale Haptoglobin-Bindungsdomäne substituiert oder deletiert wurde.
Polypeptid, das aus den Aminosäuren 1-97 der α-Kette von humanem Hämoglobin besteht, wobei die entsprechende volle Länge der α-Kette von humanem Hämoglobin durch 16 dargestellt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die (a) ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 und (b) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein aus den Aminosäuren 1-97 oder den Aminosäuren 1-94 der α-Kette von humanem Hämoglobin bestehendes Polypeptid, wobei die entsprechende volle Länge der α-Kette von humanem Hämoglobin durch 16 dargestellt wird, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5 in Einheitsdosisform.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die 0,1 mg bis 6 g einer oder zweier Verbindungen enthält, ausgewählt aus der aus einem Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 1-97 der α-Kette von humanem Hämoglobin und einem Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 1-94 der α-Kette von humanem Hämoglobin bestehenden Gruppe.
Verwendung einer die Proliferation hämatopoetischer Stammzellen inhibierenden Menge eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Proliferation hämatopoetischer Stammzellen.
Verfahren, um hämatopoetische Stammzellen eines Säugers ex vivo zu erhalten, welches das Inkontaktbringen hämatopoetischer Stammzellen mit einer die Stammzellproliferation inhibierenden Menge eines Polypeptids nach Anspruchs 1 oder 2 beinhaltet.
Verwendung einer hämatopoetische Stammzellen schützenden Menge eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments, um bei einem Säuger normale hämatopoetische Stammzellen, nicht jedoch Krebszellen differenzierend vor Chemotherapie oder Bestrahlung zu schützen.
Verfahren zur Durchführung von ex-vivo-Expansion hämatopoetischer Stammzellen, welches das Inkontaktbringen hämatopoetischer Stammzellen mit einem Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 und mindestens einem stimulierenden Cytokin beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 1-97 der α-Kette von humanem Hämoglobin, die durch 16 dargestellt wird, und einem Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 1-94 der α-Kette von humanem Hämoglobin.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die (a) ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 und (b) mindestens eine hemmende Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus MIP-1α, TGFβ, TNFα, INFα, INFβ, INFγ, dem Pentapeptid pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys, dem Tetrapeptid N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro und dem Tripeptid Giutathion (Gly-Cys-γGlu), oder mindestens eine stimulierende Verbindung; die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, Erythropoietin, Thrombopoietin, Stammzellfaktor und flk2/flt3-Ligand, enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 1-97 der α-Kette von humanem Hämoglobin, die durch 16 dargestellt wird, und einem Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäuren 1-94 der α-Kette von humanem Hämoglobin, die durch 16 dargestellt wird.
Verfahren zum Exprimieren von C-terminale Substitution oder Deletion aufweisenden Analoga des α-Hämoglobins, das durch 16 dargestellt wird, welches Verfahren das Exprimieren dieser Substitutions- oder Deletions-Analoga als Ubiquitin-Fusion beinhaltet, wobei der Expressionsschritt vorzugsweise in E.coli erfolgt und wobei der Expressionsschritt vorzugsweise die Expression eines Ubiquitin spaltenden Enzyms einschließt.
Polypeptid mit der Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biotin-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, (Iod)Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Phe-Pro-His-(Iod)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val und (Iod)Phe-Pro-His-(Iod)Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val.
Verwendung einer die Proliferation hämatopoetischer Stammzellen stimulierenden Menge INPROL zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Verhindern der Erschöpfung hämatopoetischer Stammzellen, wobei INPROL ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Peptiden mit der Sequenz: Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys (worin die beiden Reste Cys eine Disulfidbindung bilden) und Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 11, worin die hämatopoetischen Stammzellen aus der aus Knochenmarkszellen, peripheren Blutzellen, mobilisierten peripheren Blutzellen, fötalen Leber- und Nabelschnurblutzellen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.