DE19708454A1

DE19708454A1 - Die Proliferation von Zellen inhibierendes Peptid und dessen Verwendung

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Publication number: DE19708454A1
Application number: DE19708454A
Authority: DE
Inventors: Volker Ter Prof Dr Meulen; Sibylle Dr Schneider-Schaulies
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1997-02-17
Filing date: 1997-02-17
Publication date: 1998-08-27
Also published as: IL131409A0; JP2001512449A; AU6391598A; CA2281033A1; WO1998035983A1; EP0975661A1

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Verwendung eines Peptides mit der Sequenz Z-Phe-X-Gly-Y, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure ist und wobei Y carboxyl-OH oder eine synthe seabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe oder ein Oli gopeptid aus natürlichen Aminosäuren ist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein die Proliferation von Zellen lym phocytischer und/oder monocytischer und/oder granulo cytischer Herkunft inhibierendes Peptid.

Hierbei sind folgende Definitionen anzuwenden. Als natür liche Aminosäuren sind Aminosäuren mit in der Natur vor kommenden formelmäßigen Konstitutionen, unabhängig von der räumlichen Struktur, bezeichnet. Insofern fallen im Rahmen der hiermit gegebenen Definitionen auch solche Aminosäuren unter den Begriff natürlichen Aminosäuren, deren Kon stitution aus der Natur bekannt ist, deren stereochemische Struktur, insbesondere am Kohlenstoff, jedoch nicht in der Natur vorkommt. Ein Beispiel hierfür ist (D)Phenyl alanin. Phe steht für die Aminosäure Phenylalanin und Gly für die Aminosäure Glycin. Als Schutzgruppe ist eine chemische Verbindung bezeichnet, die den N-Terminus eines in der Synthese befindlichen Peptids gegen chemischen An griff von Synthesereagentien schützt. Peptide mit bis zu ca. 15-20 Aminosäuren werden üblicherweise chemisch syn thetisiert, beispielsweise mittels der gut bekannten Merrifield-Synthese. Sine solche Schutzgruppe kann (muß jedoch nicht zwingend) aber auch eine physiologische Wirkung eines damit ausgestatteten Peptids verursachen oder die physiologische Wirkung des Peptides verstärken. Insofern kann eine Schutzgruppe eine Doppelfunktion ausüben und in solchen Fällen wird die Schutzgruppe auch nach Abschluß der eigentlichen Peptidsynthese nicht abge spalten. Eine in der Peptidsynthese übliche Schutzgruppe ist beispielsweise die Benzyloxycarbonyl-Gruppe (C₆H₅-CH₂-O-CO-), auch als Carbobenzoxy-Gruppe bezeichnet. Als carboxyl-OH ist die zur Carboxylgruppe des C-Terminus gehörende OH-Gruppe bezeichnet. Mit anderen Worten ausge drückt, weist ein Peptid mit carboxyl-OH als Y eine Carb oxylgruppe am C-Terminus auf. Eine syntheseabspaltungs bedingte C-terminale Gruppe ist an den C-Terminus einer Aminosäure gebunden und stammt aus der Abspaltung des an sich fertigen Peptides von einer Synthesematrix. Der C- Terminus weist dann, je nach Art der Abspaltung beispiels weise folgende Strukturen auf: Amid (-CO-NH₂), Hydrazid (-CO-NH-NH₂) oder Ester (-COOR). In diesen Beispielen sind die syntheseabspaltungsbedingten C-terminalen Gruppen dann -NH₂, -NH-NH₂ oder -OR. Es versteht sich, daß abhängig vom Syntheseverfahren auch noch andere syntheseabspaltungs bedingte C-terminale Gruppen möglich sind. Ebenso wie im Fall der Schutzgruppen kann eine physiologische Wirkung bzw. eine Verstärkung einer physiologischen Wirkung durch eine syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe nicht ausgeschlossen werden. Oligopeptide Y gemäß der hiermit bestimmten Definition weisen 1 bis ca. 10 Aminosäuren auf.

Der Ausdruck Proliferation bezeichnet die Zellvermehrung durch Teilung. Bei gesunden Zellen wird die Proliferation in aller Regel durch bestimmte, auf eine Zelle wirkende körpereigene Substanzen induziert. Solche Substanzen werden als Mitogene bezeichnet. Ebenso kann eine Prolif eration bei bestimmten Zellarten grundsätzlich auch durch Antigene induziert und/oder coinduziert werden. Eine spon tane Proliferation ist eine Zellvermehrung, die ohne Mito geninduktion und/oder Antigeninduktion stattfindet. Eine spontane Proliferation ist meist das Ergebnis einer Fehl funktion der betreffenden Zelle, hervorgerufen beispiels weise durch Mutation. Spontane Proliferation ist symptoma tisch für sogenanntes malignes Zellwachstum, auch Krebs genannt und folglich unerwünscht.

Eine unerwünschte Proliferation von Zellen insbesondere des Immunsystems kann aber auch aus anderen Gründen erfol gen. Wird einem Menschen oder einem Tier beispielsweise ein Organ transplantiert, so tritt eine Immunreaktion des Empfängerorganismus auf. Dies ist eine im wesentlichen spezifische Abstoßungsreaktion gegen "Fremd"-Zellen des implantierten Organs durch das Immunsystem des Organemp fängers, wobei dessen Lymphozyten durch ein oder mehrere Antigene des Organs zur Proliferation angeregt werden. Eine Mitogeninduktion ist für diese Art der Proliferation grundsätzlich nicht erforderlich. Es handelt sich also um eine antigenspezifische (d. h. "Fremd"-induzierte) Prolif eration. Unerwünschte antigenspezifische Proliferation kann aber auch in anderen medizinischen Zusammenhängen als der Transplantationsmedizin erfolgen, z. B. bei Autoimmu nerkrankungen.

Zum Verständnis der Erfindung ist folgender Stand der Technik wichtig. Aus den Literaturstellen Ch.D. Richardson et al., Virology, 1980, 105, 205-222, und Ch.D. Richardson et al., Virology, 1983, 131, 518-532, sind u. a. Peptide bekannt, deren Sequenzen lauten: B-Phe-Phe-Gly-Ala-Val- Ile-Gly-OH (B = Benzyloxycarbonyl-Gruppe, Ala = Alanin, Val = Valin, Ile = Isoleucin), B-Phe-Phe-Gly-OH, H-Phe-Phe-Gly-Ala-Val-Ile-Gly-OH und H-Phe-Phe-Gly-OH. Diese Peptide sind hergestellt worden, um die Mechanismen der Fusion von verschiedenen Viren mit Körperzellen zu untersuchen. Hintergrund ist, daß verschiedene Viren, so z. B. Sendai-Viren oder Masern Viren, die Teilsequenz -Phe- Phe-Gly- oder Consensus-Sequenzen dazu in einer Fusions domäne ihres F1-Membranfusionsproteins aufweisen. Bei die sen Untersuchungen wurde gefunden, daß die genannten Peptide (vermutlich aufgrund konkurrierender Bindung an zugeordneten Rezeptoren der Virus-Zielzellen) die Fusion des Virus mit den Virus-Zielzellen inhibieren. Die Fusion wurde auch durch das Peptid mit der Sequenz B-Phe-Phe-Gly- OH unterbunden, jedoch mit vergleichsweise schwacher Wirkung. Dieses Peptid wird in Tests mit Zellkulturen als Mittel zur Untersuchung der Inhibierung der viralen Fusion mit Virus-Zielzellen verwendet. Eine Anwendung dieses oder eines der anderen genannten Peptide zur Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische Behandlung ist dem gegenüber nicht bekannt. In der erstgenannten Litera turstelle ist auch festgestellt worden, daß CV-1-Zellen (adhärente, nicht-lymphoide oder nicht-monozytäre Zellen) durch die Peptide nicht in ihrer Proliferation gehemmt werden.

Unter die allgemeine Sequenz des eingangs genannten Auf baus fallende spezifische Sequenzen sind grundsätzlich auch als Teilsequenzen aus anderen Zusammenhängen bekannt. So ist die Sequenz Phe-Phe-Gly eine Teilsequenz eines Tachykinins mit der Sequenz H-Arg-Pro-ys-Pro-Gln-Gln-Phe- Phe-Gly-Leu-Met-NH₂ (Arg = Arginin, Pro = Prolin, Lys = Lysin, Gln = Glutamin, Leu = Leucin, Met = Methionin), welches als Neurotransmitter/Neuromodulator oder als Regu lativ der Produktion von Zellen des Immunsystems (Lym phozyten) wirkt. Dabei versteht sich, daß bei den insofern bekannten Sequenzen die Aminosäuren stets mit (L)-Struktur vorliegen. Dieses Tachykinin wird auch als SP (substance P) bezeichnet. SP ist dabei in der Lage, die Proliferation von z. B. T-Zellen anzuregen, und zwar ohne die zusätzliche Anwesenheit einer anderen, als Mitogen wirkenden Substanz (siehe z. B. Kavelaars et al., J. Neuroimm. 1993, 42, 61-70). Insofern wirkt SP selbst vermutlich ähnlich einem Mitogen. Aus der hieran anschließenden Literaturstelle I.Z. Siemion et al., Mol. Immunol., 27, 887-890, ist es aus Zellkultur Experimenten wiederum bekannt, daß ein Pep tid mit der Sequenz H-Phe-Ph-Gly-Leu-Met-NH₂ dessen Se quenz mit der C-terminalen Sequenz von SP identisch - auch hinsichtlich des ausschließlich in (L)-Struktur vorlieg enden Phenylalanins identisch - ist, gegenüber dem Ergeb nis der zuvor genannten Literaturstelle zu einer Erniedrigung der Immnunglobulin-Synthese nicht mitogen aktivierter B-Zellen (eine Untergruppe der Lymphozyten) führt. Auswirkungen auf das Proliferationsverhalten sind aus dieser Literaturstelle jedoch nicht bekannt. Aus der Literaturstelle I.Z. Siemion et al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1994, 42, 201-203, ist es bekannt, daß Peptide mit den Sequenzen H-Phe-Tyr-Gly-Leu- Met-NH₂ (Tyr = Tyrosin), H-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH₂ und H-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂ entsprechendes bewirken, wobei auch hier stets mit (L)-Aminosäuren gearbeitet wurde und keine Angaben zum Proliferationsverhalten gemacht sind.

In der Literaturstelle Y. Yanagi et al, Virology, 1992, 187, 280-289, wovon die Erfindung ausgeht, ist die Auswirkung des Masern-Virus auf die Proliferation von T- Zellen (eine Untergruppe der Lymphozyten) in Zellkultur Experimenten untersucht worden. Hierbei wurde fest gestellt, daß das Masern-Virus die Proliferation in hibiert. Weiterhin wurde festgestellt, daß ein Peptid der Sequenz Z-Phe-Phe-Gly-OH, wobei Z die Benzyloxycarbonyl- Gruppe B ist, diese Masern-Virus-induzierte Inhibierung der T-Zell-Proliferation wieder aufhebt, d. h. daß die mi togeninduzierte Proliferation wieder praktisch normal von statten geht. Die Erkenntnis aus den Ergebnissen war folglich, daß das insofern bekannte Peptid einerseits den die Proliferation inhibierenden Effekt des Masern-Virus aufhebt, aber andererseits auch selbst keinen (nennenswer ten) inhibierenden Einfluß auf die (mitogen-induzierte) Proliferation der T-Zellen ausübt, jedenfalls innerhalb der getesteten Konzentrationen.

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Peptid anzugeben, das Verwendung in der Behandlung von Erkrankungen finden kann. Der Erfindung liegt insbesondere das technische Problem zugrunde, ein Peptid anzugeben, das die spontane Proliferation von Zellen mit malignem Zell wachstum inhibiert oder transplantationsbedingte Immun reaktionen inhibiert.

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung die Verwendung eines Peptides mit der Sequenz Z-Phe-X-Gly-Y oder eines Gemisches solcher Peptide zur Herstellung eines Arzneimittels für eine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure ist und wobei Y Carboxyl-OH oder eine syntheseabspaltungsbedingte C- terminale Gruppe oder ein Oligopeptid aus natürlichen Aminosäuren ist. Insbesondere lehrt die Erfindung die Ver wendung dieses Peptides oder eines Gemisches solcher Pep tide zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Erkrankungen mit malignem Wachstum von Zel len lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granu locytischer Herkunft- insbesondere der T-Zellen oder der B-Zellen, oder eines Arzneimittels für die Behandlung von Erkrankungen mit antigenspezifischen Immunreaktionen von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft. - Es versteht sich, daß die Arzneimittel dabei meist galenische Arzneimittel mit ar zneimittelüblichen Zusatzstoffen sind. Die Wahl der Zusatzstoffe ist für einen Fachmann ohne weiteres aus der galenischen Praxis und in Abstimmung auf die konkrete An wendungs- bzw. Darreichungsform durchführbar.

Die erstgenannte Indikation ist bei den verschiedenen Arten der Krebserkrankung Leukämie gegeben. Durch eine Gabe des beanspruchten Peptides oder einer Mischung sol cher Peptide wird die Proliferation der malignen Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulo cytischer Herkunft inhibiert. Eine spontane Proliferation dieser Zellen findet also nicht mehr oder nur noch in stark reduziertem Umfang statt. Die insofern deaktivierten malignen Zellen sind durch die Hemmung der Proliferation allerdings nicht zwangsläufig abgetötet. Dann empfiehlt sich die zusätzliche Gabe einer geeigneten (an das Peptid fusionierten) zelltoxischen Substanz (Toxinfusion). Beispiele für geeignete zelltoxische Substanzen sind: Methotrexate (target: DNA topoisomerase II) oder Polypep tide wie das Diphtherie-Toxin.

Die zweitgenannte Indikation ist insbesondere bei trans plantationsbedingten Immunreaktionen nach einer Organ transplantation und bei Autoimmunerkrankungen gegeben. Durch eine Gabe des beanspruchten Peptides oder einer Mischung solcher Peptide wird die antigenspezifische Pro liferation der (gesunden) Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft in hibiert. Es wird also die an sich gesunde und natürliche Immunantwort auf das fremde Organ unterdrückt mit der Folge daß das fremde Organ nicht abgestoßen wird.

Hinsichtlich der erfindungsgemäßen Verwendungen ist es bevorzugt, wenn die N-terminale Schutzgruppe eine Benzyloxycarbonyl-Gruppe ist. Vorteilhafterweise ist X Phe oder Ala, vorzugsweise Phe mit einer vom N-terminalen Phe verschiedenen stereochemischen Struktur am α-Kohlenstoff. Im einzelnen ist es bevorzugt, wenn die Sequenz des Pep tides Z-(D)Phe-(L)Phe-Gly-Y ist, wobei Z vorzugsweise die Benzyloxycarbonyl-Gruppe B und/oder Y vorzugsweise carboxyl-OH ist. Weiterhin kann Y ein Oligopeptid mit einer syntheseabspaltungsbedingten C-terminalen Gruppe, beispielsweise -NH₂, sein. Y kann insbesondere ein Dipeptid mit der Sequenz Leu-Met oder Val-Val sein, ggf. mit -NH₂ als syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe.

Die erfindungsgemäße Verwendung insbesondere des Peptids mit der Sequenz B-(D)Phe-(L)Phe-Gly-OH beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß dieses Peptid eine die spontane oder antigenspezifische Proliferation stark in hibierende Wirkung ausübt. Diese Erkenntnis ist über raschend, weil gemäß der nächstliegenden Literaturstelle Y. Yanagi et al, Virology, 1992, 187, 280-289, das insofern bekannte Peptid einerseits den die Proliferation inhibierenden Effekt des Masern-Virus aufhebt, aber ander erseits bei den getesten Konzentrationen auch selbst keinen inhibierenden Einfluß auf die (dort mitogen induzierte) Proliferation der T-Zellen ausübt. Somit weist diese Literaturstelle eher in die entgegengesetzte Richtung.

Grundsätzlich fallen natürlich auch die sonstigen Modifi kationen gemäß der Patentansprüche 1-9 unter die er findungsgemäße Verwendung, sofern diese Peptide eine inhibierende Wirkung auf die spontane oder antigen spezifische Proliferation ausüben. Geeignete Modifika tionen lassen sich auf einfache Weise durch übliche Syn theseverfahren herstellen und auf ebenso einfache Weise hinsichtlich ihrer inhibierenden Wirkung testen. Solche Tests werden üblicherweise mittels [³H]-Thymidin oder mit tels Alamar-Blau durchgeführt. Mittels [³H]-Thymidin wird die Menge an neu gebildeten Zellen in einer Kultur be stimmt (Messung der Radioaktivität). Mittels Alamar-Blau (ein Produkt der Firma BIOSOURCE Int., USA) wird der me tabolische Umsatz in einer Zelle gemessen (colorimetrische oder Fluoreszenz Messung). Hoher metabolischer Umsatz ist meist mit einer bevorstehenden Zellteilung korreliert. Diese jeweiligen Größen werden mit den entsprechenden Größen in einer Kontrollkultur gleicher Zellen, jedoch ohne Zugabe eines Inhibitors oder mit Zugabe eines nicht inhibierenden Peptids verglichen. Durch Verhältnisbildung wird auf einfache Weise die Inhibierung der Proliferation in % quantifiziert. Es handelt sich dabei um wohlbekannte Standardtests.

Da auch folgende Peptid-Modifikationen, die im o.g. Stand der Technik nicht bekannt sind, eine die spontane und/oder antigen-spezifische Proliferation inhibierende Wirkung ausüben, wird das der Erfindung zugrundeliegende tech nische Problem auch durch ein die Proliferation von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulo cytischer Herkunft inhibierendes Peptid mit der Sequenz Z-Phe-X-Gly-Y gelöst, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure - nicht jedoch Phe, Tyr, Val oder Ile; im Falle der Sequenz Z-(D)Phe-X-Gly-Y nicht jedoch Phe - ist und wobei Y carboxyl-OH oder eine syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe oder ein Oligopeptid aus natürlichen Aminosäuren ist. Eine weitere Lösung desselben technischen Problems ist gegeben durch ein die Proliferation von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft inhibierendes Peptid mit der Sequenz Z-Phe-X-Gly-Y, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe ist, wobei X Phe mit einer vom N-terminalen Phe verschiedenen stereochemischen Struktur am α-Kohlenstoff ist und wobei Y ein Oligopeptid aus natürli chen Aminosäuren mit maximal 10, vorzugsweise maximal 3, Aminosäuren, nicht jedoch -Ala-Val-Ile-Gly-, ist, ggf. mit einer syntheseabspaltungsbedingten C-terminalen Gruppe, vorzugsweise -NH₂. Konkrete Beispiele für solche neue Pep tide sind: B- (D) Phe-(L) Phe-Gly-Phe-Gly-R und B-(D)Phe- (L)Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-R, wobei R OH oder eine synthe seabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe sein kann und das stereochemisch nicht gekennzeichnete Phe vorzugsweise in (L)-Struktur vorliegt. In ersten Versuchen hat sich gezeigt, daß Peptide der genannten konkreten Struktur ver mutlich eine noch stärker inhibierende Wirkung auf die Proliferation von Zellen des Immunsystems haben. Die in sofern nochmals verbesserte biologische Aktivität beruht möglicherweise auf einer Stabilisierung des Peptides durch die der Kernsequenz angehängten Aminosäuren des Oligopep tides Y.

Solche neuen Modifikationen lassen sich, wie bereits vor stehend erläutert, auf einfache Weise synthetisieren und auf ihre die spontane und/oder die antigen-spezifische Proliferation inhibierende Wirkung testen. Als die spon tane oder die antigen-spezifische Proliferation inhibier ende Wirkung ist bezeichnet ein Maß der Inhibierung von mehr als 10%, vorzugsweise mehr als 50%, höchstvorzugs weise von mehr als 80%, gemessen durch Vergleich der auf übliche Weise gemessenen Proliferationsrate in einer mit dem Peptid behandelten Zellkultur mit der entsprechend gemessenen Proliferationsrate in einer Zellkultur, die nicht oder mit einem unwirksamen Peptid behandelt wurde. Mit bestimmten Zellinien ist eine Inhibierung von sogar praktisch 100% gefunden worden.

Vorzugsweise ist das Peptid so ausgebildet, daß die Se quenz Z-(D)Phe-X-Gly-Y ist. Ansonsten können auch alle Modifikationen gemäß der vorstehenden Erläuterungen zu der erfindungsgemäßen Verwendung und/oder der Patentansprüche 2 bis 9 entsprechend eingerichtet sein, solange X nicht Phe, Tyr, Val oder Ile oder im Falle der Sequenz Z-(D)Phe- X-Gly-Y nicht Phe ist oder das Oligopeptid Y nicht -Ala- Val-Ile-Gly- ist.

Neben dem neuen Peptid nach Patentanspruch 10 oder 11 ist auch die Verwendung dieses neuen Peptids zur Herstellung eines Arzneimittels für eine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere für die Behandlung von Erkrankungen mit malignem Wachstum von Zel len lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft, beispielsweise der T-Zellen oder der B-Zellen, oder für die Behandlung von Erkrankun gen mit antigenspezifischen Immunreaktionen von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulo cytischer Herkunft Gegenstand der Erfindung. Zur Erfindung gehört weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Pep tides nach Anspruch 10 oder 11, ggf. mit Modifikationen wie oben erwähnt, wobei das Peptid mittels eines üblichen Syntheseverfahrens, beispielsweise der Merrifield-Synthese bzw. Festphasensynthese, hergestellt wird. Die Erfindung umfaßt schließlich auch ein Arzneimittel, das entsprechend der Patentansprüche 1 bis 9 oder 13 hergestellt worden ist. Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

In allen folgend dargestellten Ergebnissen wurde die Pro liferation in den jeweiligen Zellkulturen entweder mittels der [³H]Thymidin-Methode oder mittels der Alamar-Blau- Methode quantifiziert. Gemessen wurde dabei die spontane Proliferation, d. h. ohne Zugabe einer als Mitogen wirk enden Substanz. In allen Beispielen wurde das Peptid B-(D)Phe-(L)Phe-Gly-OH als die Proliferation hemmendes Peptid (in den Tabellen als pepX bezeichnet) eingesetzt.

In den Versuchen wurde meist selbstsynthetisiertes Peptid verwendet. Ein solches Peptid ist jedoch auch käuflich erwerbbar (z. B. von Sigma oder Bachem). Als Kontrollpeptid wurde B-Gly-(L)Phe-(L)Phe-OH (in den Tabellen als pepC bezeichnet) verwendet. Im einzelnen wurden die Zellinien bzw. Zellproben in 96-cluster (well) Platten mit einer Dichte bzw. Zellzahl/well von 5 × 10⁴ in einem Volumen von 100 µl/well eingebracht. Dann wurden die Peptide in den in den Tabellen angegebenen Mengen zugegeben und 72 h inku biert. Hierauf wurde mit [³H)Thymidin (0,5 µCi/ml; 1Ci = 37GBq) oder mit Alamar-Blau für 16h gelabelt. Die Assays wurden dreifach ausgeführt. Nach dem Ernten der Zellen wurden die Proliferationsraten bzw. die Stoffwech selerhöhung durch Bestimmung der Inkorporation an Tritium mittels β-Detektor oder durch Bestimmung der Färbung bzw. Fluoreszenz ermittelt. Diese Werte wurden dann mit Werten aus entsprechenden unbehandelten Zellkulturen ins Verhält nis gesetzt, wodurch die Inhibierung der spontanen Prolif eration in % erhalten wurde. Bei den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen wurde die Inhibierung in % gegen Versuche mit dem Kontrollpeptid bestimmt.

In Tabelle 1 sind die Ergebnisse von ersten Untersuchungen an Proben maligner Zellen von Patienten mit verschiedenen Krebserkrankungen dargestellt. In Tabelle 2 sind weitere Untersuchungen an Proben maligner Zellen von Patienten mit verschiedenen Krebserkrankungen dargestellt. Man erkennt in Tabelle 1 zunächst, daß die Inhibierung der spontanen Proliferation durch pepX stärker ist als durch das meist praktisch inaktive Kontrollpeptid pepC. Man erkennt aus Tabelle 1 weiterhin, daß die Inhibierung durch pepX mit hoher Wahrscheinlichkeit dosisabhängig ist, was die in hibierende Wirkung des Peptides selbst und nicht einer Versuchsrandbedingung belegt. Die Inhibierung der Prolif eration ist in % angegeben. Der Index a bezeichnet Werte, die mit [³H]-Thymidin erhalten wurden. Der Index b bezeich net Werte, die mit Alamar-Blau erhalten wurden. Generell ist festzustellen, daß die Alamar-Blau-Methode gegenüber der [³H]Thymidin-Methode vergleichsweise weniger sensitiv ist.

Tabelle 1

Tabelle 2

Die verwendeten Abkürzungen der Diagnosen stehen für fol gende Befunde: CLL: chronisch lymphatische Leukämie; CML: chronisch myeloische Leukämie; AML: akute myeloische Leukämie; RARS: refraktäre Anämie mit Blastenexess; NHL: non Hodgin Lymphom; HD: Hodgin's disease; ITP: Immunotrom bopenie; HCL: hairy cell leukemia; ThroPE: Thrombopenie; MPS: myeloproliferatives Syndrom; PCV: Polycythaemia vera; IC: Immunocytom; PLZ: Plastozytom; cb/cc: centroblastisch/centrocystisches Lymphom; MAG-CA Magen- Karzinom; MEG-M: Megacaryocytäre Myelose.

Die in den den Tabellen 1 und 2 zugrundeliegenden Ver suchen untersuchten Zellen wurden durch Ficoll/Paque (Pharmacia) Dichtegradientenzentrifugation aus heparinis iertem Blut der Patienten isoliert. Die so isolierten Zel len wurden ebenfalls in PPMI 1640 Medium enthaltend 10% FCS (fetal calf serum) kultiviert.

Beispiel 2

Die in der Tabelle 3 angegebenen Daten zur Proliferations hemmung an menschlichen Zellen wurden entsprechend der Vorgehensweise zu Tabelle 1 erhalten. Die Versuche wurden mit autologen PBL's (PBL: peripheral blood lymphocyte), allogenen PBL's (Hemmung der antigenspezifischen, durch UV-inaktivierte "Fremd"-PBL's induzierten Proliferation) und verschiedenen spontan proliferierenden Zellinien (Hem mung der spontanen Proliferation) durchgeführt. Im Falle der autologen PBL's wurde in der Gegenwart von PHA (PHA: Phytohämagglutinin, bewirkt Aktivierung von T- und B- Zellen) gemessen. Gearbeitet wurde ausschließlich mit [³H]-Thymidin, wenn nicht durch Index b gekennzeichnet. Im alle der allogenen PBL's wurde die Inhibierung gegen Pro ben mit pepC berechnet.

Tabelle 3

Man erkennt auch hier in allen Fällen zunächst, daß die Inhibierung der Proliferation durch pepX stärker ist als durch das praktisch inaktive oder vergleichsweise nur ger ing aktive Kontrollpeptid pepC. Man erkennt weiterhin, daß die Inhibierung durch pepX dosisabhängig ist, was auch in diesem Fall die inhibierende Wirkung des Peptides selbst und nicht einer Versuchsrandbedingung belegt.

U-937, U-937-X (U-937 Subclon defizient in der CD46 Ex pression) und HL60 sind monocytische Zellen. BJAB (lym phoblastoide B-Zellen), Raji und Jurkat (CD4+ T-Zellen) sind menschliche lymphoide Zellen.

Beispiel 3

In diesem Beispiel sind Ergebnisse an nicht lymphatischen bzw. nicht monocytären menschlichen Zellinien zum Ver gleich mit Beispiel 2 dargestellt. Die Untersuchungen er folgten unter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 angegeben.

Tabelle 4

Man erkennt, daß die untersuchten nicht lymphatischen bzw. nicht monozytären Zellinien demgegenüber nicht gehemmt werden.

Beispiel 4

In Tabelle 5 sind die Ergebnisse von Untersuchungen an verschiedenen Rodent-(Nager-)Zellen bzw. Zellinien dargestellt. Die Untersuchungsmethodik war dieselbe wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Ratten-PBL- und die Maus-Milz- Zellen wurden mit ConA (Concanavalin A) stimuliert. Man erkennt auch hier in allen Fällen zunächst, daß die In hibierung der mitogen-stimulierten oder der spontanen Pro liferation durch pepX stärker ist als durch das praktisch inaktive oder vergleichsweise nur gering aktive Kontroll peptid pepC Man erkennt weiterhin, daß die Inhibierung durch pepX dosisabhängig ist, was auch in diesem Fall die inhibierende Wirkung des Peptides selbst und nicht einer Versuchsrandbedingung belegt.

Die genannten Zellinien sind wie folgt abgekürzt. EL4: Thymom-Linie; YAC1: Lymphom; P815: Mastozym; FQK45.5, S107RelB, S107NFKB und TIB221: B-Zellen, S107 . . . weisen bestimmte Mutationen intrazellulärer Signalwege auf; P388D1: lymphoid macrophage; L929: Fibroblast.

Tabelle 5

Beispiel 5

In diesem Beispiel werden Ergebnisse präsentiert, die zei gen, daß eine Behandlung mit pepX oder pepC nicht begleitet ist von einem vom Peptid induzierten apop totischen Signal (programmierter oder durch exogene Stim uli induzierter Zell-Tod).

Als Methoden wurden Annexin-staining und TUNEL-staining verwendet. Beim Annexin-staining wird Annexin stark an Phosphatidyl-serin, welches normalerweise innerhalb der Zellmembran lokalisiert ist und als einer der ersten Schritte der Apoptose an die Oberfläche der Zellen tran sloziert wird, gebunden. Die Bindung des fluoreszenz markierten Annexins an Zellen ist somit ein Nachweis einer sehr frühen Phase der Induktion von Apoptose. TUNEL steht für Terminal Uridin-transferase Nucleotide End Labeling. Es werden markierte Nukleotide an freie DNA-Enden, die aus Apoptose induzierten DNA Strangbrüchen herrühren, über tragen. Diese Reaktion kann erst in der Spätphase der Apoptose beobachtet werden. Die mit beiden Methoden erhal tenen Ergebnisse sind Zeitkinetiken, d. h. Färbungen, die nach unterschiedlichen Zeiten seit Kontakt mit dem Peptid durchgeführt wurden. Gemessen wurde jeweils 6h, 12h, 24h und 48h nach Exposition mit dem Peptid. Die zugegebene Menge Peptid betrug stets 200 µg/ml.

Getestet-wurden BJAB (B-Zellen), HL-60 (Monozyten), PBL's, U937 (Monozyten), J16 (Jurkat-Zellen, selektioniert auf maximale Sensitivität gegenüber Apoptose), J16.6 (Subclon von J16, weniger sensitiv gegenüber Apoptose) und J17 (Subclon von J16). Für HL-60, PBL's und J16 sind als Kon trolle Bedingungen gewählt worden, die Apoptose induzieren (positiv-Kontrolle).

Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen.

BJAB: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von 2% bis 16%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation.

HL-60: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von 1% bis 8%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, 5 keine Zeitkorrelation. Dagegen 70% bei Zugabe von 0,2 µg/ml Camptothecin.

PBL's: stochastische Schwankungen des Anteils Fluorescein-12-dUTP positiver Zellen im Bereich von 4% bis 15%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation. Dagegen 57% bei Zugabe von 1 µg/ml αCD3 + 100 U/ml IL2 + (nach 16h) 5 µg/ml αFAS.

U937: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von 2% bis 15%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation.

J16: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von 1% bis 15%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation. Dagegen 45% bei Zugabe von 5 µg/ml αFAS.

J16.6: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von 2% bis 8%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation.

J17.6: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von 7% bis 18%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation.

Beispiel 6

In diesem Beispiel wird gezeigt, daß die mit dem Peptid pepX bewirkte Proliferationshemmung wieder reversiert wer den kann. Hierzu wurden PBL's 3 Tage in Gegenwart von PHA mit pepX behandelt bis zu einer Proliferationshemmung von 95%. Danach wurden die Zellen für weitere 6 bzw. 12 Tage mit IL2 (Interleukin 2) stimuliert (in Abwesenheit von pepX und PHA). Nach insgesamt 9 Tagen war die Prolifera tionshemmung auf 78% und nach insgesamt 15 Tagen auf 23% gesunken.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird gezeigt, daß auch nach Reversion der Proliferationshemmung nach Beispiel 6 eine dosisab hängige Proliferationshemmung erneut zu beobachten ist nach erneuter Zugabe von pepX. Hierzu wurden PBL's zunächst gemäß Beispiel 6 behandelt. Anschließend wurden 50, 100 oder 200 µg/ml pepX zugegeben. Für diese Mengen wurden Proliferationshemmungen von 30%, 55% und 92%, re spektive, gefunden. Dies zeigt, daß die Zellen auch nach Reversion der Hemmung nicht resistent gegen pepX werden.

Beispiel 8

Mit diesem Vergleichsbeispiel wird gezeigt, daß Substance P oder das Substance P Fragment (L)Phe-(L)Phe-Gly-Leu- Met-NH₂ im Gegensatz zu pepX keine nennenswerte Prolifera tionshemmung bei PBL's bewirken. Hierzu wurden 5 × 10⁵ menschliche PBL's, stimuliert mit 2,5 µg/ml PHA, für 72h mit einem der beiden genannten Peptide inkubiert. Die Er gebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt.

Tabelle 6

Eine Hemmung der Proliferation findet praktisch nicht statt.

Beispiel 9

In diesem abschließenden Beispiel werden besonders beein druckende Rohdaten zur Hemmung antigenspezifischer Prolif eration, verursacht durch verschiedene Antigene, mittels pepX vorgestellt. Es wurden drei Ansätze gefahren, wobei sich zwei Ansätze hinsichtlich der Antigene unterschieden. In allen Ansätzen wurden die Zellen 48h nach Stimulation für 20h mit ³H (0,5 µCi/well) markiert. In allen Ansätzen wurden jeweils pepX oder pepC in einer Menge von 300 µg/ml zugegeben (zusätzlich zu dem jeweiligen Stimulations- Peptid).

Im ersten Ansatz wurden Milzzellen, welche mit dem Masern virus infizierten C3H-Mäusen entnommen wurden, mit einem Peptid, welches ein T-Zell-immundominantes Epitop des Ma sernvirus Nukleokapsidproteins enthält, zur Proliferation stimuliert. Costimulation erfolgte mit durch Bestrahlung inaktivierte autologe Milzzellen, welche das Peptid präsentieren. Das Peptid mit dem T-Zell-immundominanten Epitop des Masernvirus-Nukleokapsidproteins ist ein Haupt antigen für die Masernvirus-spezifische T-Zell-Reaktion. Im Ergebnis proliferieren jene Zellen, die das Epitop erk ennen. Nach Zugabe von pepX wurde eine Radioaktivität von nur 148 cpm gemessen. Nach Zugabe von PepC wurde dem gegenüber eine Radioaktivität von 17363 cpm gemessen. Die sich daraus ergebende Proliferationshemmung durch pepX gegenüber pepC liegt bei 99,992%.

Im zweiten Ansatz wurden aus Milzzellen, welche mit dem Masernvirus infizierten C3H-Mäusen entnommen wurden, T- Zell-Kulturen (CD8+) angelegt. Diese wurden alternierend mit IL2 bzw. mit dem immundominanten Peptid (siehe 1. Ansatz) stimuliert. Nach mehreren Zyklen wurden so T-Zell- Linien etabliert, die entweder durch Stimulation mit IL2 oder durch Stimulation mit dem immundominanten Peptid (An tigen) proliferieren. Nach Zugabe von pepX wurde eine Ra dioaktivität von nur 67 cpm gemessen. Nach Zugabe von PepC wurde demgegenüber eine Radioaktivität von 74524 cpm ge messen. Die sich daraus ergebende Proliferationshemmung durch pepX gegenüber pepC liegt bei 99,999%.

Im dritten Ansatz wurden aus Milzzellen, welche mit dem Influenzavirus infizierten C3H-Mäusen entnommen wurden, T-Zell-Kulturen (CD8+) angelegt. Diese wurden alternierend mit IL2 bzw. mit einem immundominanten Peptid des Influen zavirus stimuliert. Nach mehreren Zyklen wurden so T-Zell- Linien etabliert, die entweder durch Stimulation mit IL2 oder durch Stimulation mit dem immundominanten Peptid (An tigen) proliferieren. Nach Zugabe von pepX wurde eine Ra dioaktivität von nur 90 cpm gemessen. Nach Zugabe von PepC wurde demgegenüber eine Radioaktivität von 57053 cpm ge messen. Die sich daraus ergebende Proliferationshemmung durch pepX liegt bei 99,998%.

Die in allen vorstehenden Beispielen 1 bis 9 genannten Zellinien/Zellen wurden im einzelnen stets in RPMI 1640 Medium (erhältlich von GIBCO/BRL) enthaltend 10% FCS (fe tal calf serum) kultiviert.

Claims

1. Verwendung eines Peptides mit der Sequenz
Z-Phe-X-Gly-Y
oder eines Gemisches solcher Peptide zur Herstellung eines Arzneimittels für eine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure ist und wobei Y Carboxyl-OH oder eine syntheseabspaltungsbedingte C- terminale Gruppe oder ein Oligopeptid aus natürlichen Aminosäuren ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arz neimittels für die Behandlung von Erkrankungen mit ma lignem Wachstum von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft, ins besondere der T-Zellen oder der B-Zellen.

3. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arz neimittels für die Behandlung von Erkrankungen mit an tigenspezifischen Immunreaktionen von Zellen lym phocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die N-terminale Schutzgruppe eine Benzyloxycarbonyl-Gruppe ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei X Phe oder Ala, vorzugsweise Phe mit einer vom N-terminalen Phe verschiedenen stereochemischen Struktur am α-Kohlenstoff, ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Sequenz des Peptides
Z-(D)Phe-(L)Phe-Gly-Y
ist und wobei Z vorzugsweise die Benzyloxycarbonyl Gruppe B und/oder Y vorzugsweise carboxyl-OH ist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Y ein Oligopeptid mit einer syntheseabspaltungsbedingten C-terminalen Gruppe ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe -NH₂ ist.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Y ein Dipeptid mit der Sequenz Leu-Met oder Val-Val ist, ggf. mit -NH₂ als syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe.

10. Ein die Proliferation von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft inhibierendes Peptid mit der Sequenz
Z-Phe-X-Gly-Y,
wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure - nicht jedoch Phe, Tyr, Val oder Ile; im Falle der Sequenz Z-(D)Phe- X-Gly-Y nicht jedoch Phe - ist und wobei Y carboxyl-OH oder eine syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe oder ein Oligopeptid aus natürlichen Ami nosäuren ist.

11. Ein die Proliferation von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft inhibierendes Peptid mit der Sequenz
Z-Phe-X-Gly-Y,
wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe ist, wobei X Phe mit einer vom N-terminalen Phe verschiedenen stereo chemischen Struktur am α-Kohlenstoff ist und wobei Y ein Oligopeptid aus natürlichen Aminosäuren mit maxi mal 10, vorzugsweise maximal 3, Aminosäuren, nicht jedoch -Ala-Val-Ile-Gly-, ist, ggf. mit einer Syntheseabspaltungsbedingten C-terminalen Gruppe, vor zugsweise -NH₂.

12. Peptid nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Sequenz
Z-(D) Phe-X-Gly-Y
ist.

13. Verwendung eines Peptides nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels für eine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tieri schen Körpers, insbesondere für die Behandlung von Erkrankungen mit malignem Wachstum von Zellen lympho cytischer und/oder monocytischer und/oder granulo cytischer Herkunft, beispielsweise der T-Zellen oder der B-Zellen, oder für die Behandlung von Erkrankungen mit antigenspezifischen Immunreaktionen von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granu locytischer Herkunft.