DE69433999T2

DE69433999T2 - Entzündungshemmende peptide

Info

Publication number: DE69433999T2
Application number: DE69433999T
Authority: DE
Inventors: David F. Counts; Ronald G. Duff
Original assignee: Curative Technologies Inc
Current assignee: Curative Technologies Inc
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2014-06-18
Also published as: JP3645905B2; DE69433999D1; JPH09501415A; EP0714404A1; EP0714404A4; AU7209594A; WO1995000543A1; CA2568107A1; EP0714404B1; CA2165418C; CA2165418A1; CA2568107C; ATE276272T1

Description

Querverweis auf verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung ist Continuation-in-part der Anmeldung Nr. 08/080,371, eingereicht am 18. Juni 1993, welche eine Continuation-in-part der Anmeldung Nr. 08/037,486, eingereicht am 24. März 1993 ist, welche eine Continuation der Anmeldung mit der Nr. 07/631,823, eingereicht am 21. Dezember 1990, nun fallengelassen, ist, deren Offenbarungen hier vollständig unter Bezugnahme darauf enthalten sind.
1. Einleitung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide und Peptidderivate, die mit Blutplättchenfaktor 4 (SEQ ID NO: 9) verwandt sind, und analoge Peptide, die entzündungshemmende Aktivität besitzen, auf pharmazeutische Mischungen, die besagte Peptide umfassen, und auf Methoden zur Entzündungshemmung durch das Anwenden der Peptide der Erfindung.
2. Hintergrund der Erfindung
2.1 Blutplättchenfaktor 4
Blutplättchenfaktor 4 (PF4) (SEQ. ID NO: 9), ein 70 Aminosäuren langes Heparin-bindendes Protein, wird von den alpha-Granula aktivierter Blutplättchen freigesetzt. Die exakte biologische Funktion von PF4 (SEQ ID NO: 9) ist nicht bekannt, obwohl PF4 (SEQ ID NO: 9) ein Mitglied einer Multigenfamilie ist, die an Chemotaxis, Koagulation, Entzündung und Zellwachstum (Eisman et al., 1990, Blood 76: 336–344) beteiligt ist. Über die genomische Sequenz des PF4-Gens (SEQ ID NO: 9) und ein hoch homologes Gen, PF4 alt, wurde kürzlich berichtet (Eisman et al., supra). Zwischen den berichteten biologischen Aktivitäten von PF4 (SEQ ID NO: 9) sind die Linderung von Concanavalin A-induzierter Immunsuppression in Mäusen (Zucker et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 7571–7574), die Fähigkeit, an Endothelzellen zu binden und in diese einzudringen (Rybak et al., 1989, Blood 73: 1534–1539), das Auslösen der Chemotaxis von Neutrophilen, lysosomale Enzymfreisetzung und gesteigerte Adhärenz (Bebawy et al., 1986, J. Leukozyte Biol. 39: 423–434), Stimulation der Migration von Perizyten, aber weder von glatten Muskelzellen, noch von Endothelzellen (Bernstein et al., 1982, J. Cell. Sci. 56: 71–82) und ein potentieller anti-thrombotischer Effekt (Weerasinghe et al., 1984, Thomb. Res. 33: 625–632). Erhöhte Level von PF4 (SEQ ID NO: 9) wurden in diabetischen Patienten (Guastamacchia et al., 1985, Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 61-499-502; Cortellaro et al., 1990, Thromb. Res. 58: 571–576; Cella et al., 1986, Folia Haematol. 113: 646–654) und in Patienten mit Behçet-Krankheit nachgewiesen (Schmitz-Huebner und Knap, 19484, Thromb. Res. 34: 277–286).
WO 92/11021 bezieht sich auf Peptide und Peptidderivate verwandt mit Blutplättchenfaktor 4, die angiogene Aktivität besitzen, auf pharmazeutische Mischungen die besagte Peptide umfassen, und auf Methoden zum Fördern der Angiogenese durch das Verwenden besagter Peptide. Es offenbart das Peptid mit der Sequenz Thr₁-Thr₂-Ser₃-Gln₄-Va1₅-Arg₆-Pro₇-Arg₈ (Sequenz 1 in 1).
WO 92/11021 stellt nicht die Lösung der Erfindung bereit, welche in dem Entwerfen eines Peptides mit einer bestimmten Sequenz von 8 Aminosäuren für seine Verwendung als ein entzündungshemmendes Medikament besteht. Es gibt keine auf Peptide mit entzündungshemmender Aktivität gerichtete Lehre oder Andeutung.
WO 88/04177 offenbart die Verwendung eines 5 Aminosäurelangen Peptids der Sequenz Asp-Ser-Asp-Pro-Arg für die Behandlung von nicht-IgE-vermittelten entzündlichen Krankheiten und Zusammensetzungen. Die Sequenz teilt höchstens 3 Aminosäurereste (Asp-Pro-Arg, verglichen mit dem Peptid aus Anspruch 7) mit den 8 Aminosäure-langen Peptiden der vorliegenden beanspruchten Erfindung.
US 4,161,522 beschreibt eine Methode zum Blockieren einer allergischen Reaktion eines Säugetiers, die die Verabreichung eines Polypeptides, das neben anderen Asp-Ser-Asp-Pro-Arg sein kann, umfasst. Wie das oben erwähnte Peptid aus WO 88/04177 teilen die Peptide aus US 4,161,522 ebenfalls nur eine relativ niedrige Sequenzidentität (3 von 8 Resten) mit den Sequenzen der vorliegenden Erfindung.
2.2 Entzündung
Hautentzündung wird teilweise über die Umwandlung von Phospholipiden zu entweder Endoperoxiden und somit über die Cyclooxygenase zu Prostaglandinen oder 5-HETEs und somit über die Lipooxygenase zu Leukotrienen vermittelt (Kragball und Voorhees, 1985, Curr. Probl. Derm. 13: 1–10). Die Hemmung eines oder beider dieser Wege ist das Mittel, durch das nicht-steroidale entzündungshemmende Agenzien eine entzündliche Antwort verhindern. Entzündungshemmende Steroide wirken über das Hemmen der Freisetzung von Arachidonsäure, die dann über einen von beiden Stoffwechselwegen zu Entzündungsmediatoren umgewandelt werden kann (Blackwell et al., 1980, Nature 287: 147–149). Es wurde vorgeschlagen, dass Cytokine ebenfalls den entzündlichen Prozess vermitteln und eine bessere, oder zumindest äquivalente Hemmung der entzündlichen Antwort durch das Hemmen entweder der Cytokinproduktion oder der Hemmung der Interaktion von Cytokinen mit ihren Rezeptoren auf der Zelloberfläche des entzündlichen Zellinfiltrats erreicht werden kann. Innerhalb der letzten paar Jahre wurde erkannt, dass verschiedene Domänen von Cytokinen in der Lage sind, verschiedene physiologische Antworten zu induzieren, wie durch das Beispiel der IL-1β Fragmente illustriert. Die schlaffördernden und pyrogenenen Eigenschaften von IL-1β befinden sich in dem Fragment IL-1β (208–240), wohingegen andere verschiedene und gesonderte Fragmente von IL-1β die T-Zell Produktion stimulieren (Obal et al., 1990, Am. J. Physiol. 259: R439–R446).
3. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide und Peptidderivate, die mit Blutplättchenfaktor 4 (PF4) (SEQ. ID NO: 9) verwandt sind, und analoge Peptide, die entzündungshemmende Aktivität besitzen, auf pharmazeutische Mischungen, die besagte Peptide umfassen und auf Methoden zur Entzündungshemmung durch das Anwenden besagter Peptide. Diese Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, dass das Oktapeptid CT-112 (SEQ ID NO: 1) und Derivate und Analoga von CT-112 (SEQ ID NO: 1) entzündungshemmende Aktivität in dem Mausohr/Arachidonsäure Entzündungsmodell haben.
Die Peptide der Erfindung, insbesondere CT-112 (SEQ. ID NO: 1), können besonders nützlich sein, um eine entzündliche Antwort zu hemmen. Zum Beispiel, aber nicht als Beschränkung, können CT-112 (SEQ ID NO: 1) oder Analoga oder Derivate davon verwendet werden, um Entzündungen bei Autoimmunkrankheiten, Abstoßungs(graft versus host)-Erkrankungen, Reperfusion-Gewebeschädigung, Atherosklerose und Asthma zu hemmen.
4. Beschreibung der Figuren
1. Aminosäuresequenzen von den entzündungshemmenden Peptiden CT-112 (SEQ ID NO: 1) und den zuvor als Wohl-2 bis Wohl-8 bezeichneten Peptiden (SEQ ID Nr. 2–8).
2. Aminosäuresequenz von reifem PF4 (SEQ ID NO: 9).
3. Auswirkungen von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) auf neutrophile Zellen. Das Balkendiagramm zeigt die Wirkung von CT-112 (SEQ ID NO: 1) auf die Chemotaxis von Neutrophilen zu f-Met-Leu-Phe, wie über die Fluoreszenz bei 530 nm gemessen. Das Liniendiagramm zeigt die Wirkung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) auf die Zelllebensfähigkeit, wie über das Verwenden des Trypan-Blau-Ausschlusses gemessen. Die Balkendiagrammwerte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei Wells dar.
5. Auswirkungen von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) auf die Chemotaxis von Neutrophilen zu Interleukin-8, wie über die Fluoreszenz bei 530 nm gemessen. Die Werte stellen den Durchschnitt ± Standardabweichung von 3 Wells dar.
6. Auswirkungen von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) auf Carageen-induzierten entzündlichen Zelleinstrom. ☐ normal; ☐, nur Caragen;
Caragen plus CT-112 SEQ. ID NO: 1. * zeigt signifikant unterschiedliche (p ≤ 0,05) von Carageen-behandelten Kontrolltieren an demselben Zeitpunkt an.
7 Entzündungshemmende Aktivität, wie über die Hemmung des AA-induzierten Anstiegs in der Dicke des Mausohres gemessen, von CT-112 (SEQ ID NO: 1), Derivaten von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) und anderen Peptiden. TTSQVRPR (SEQ. ID NO: 1) = CT-112; VTRPTQRS (SEQ. ID NO: 11) = CT-120, ein zufälliges Oktapeptid; TTSGIHPK (SEQ. ID NO: 12) = CT-127, ein Peptid abgeleitet von dem bindegewebsaktivierenden Peptid 3 (CTAP-III); Ac-TTSQVRPR = Derivat von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) mit einer Acetylgruppe, die das aminoterminale Ende blockiert; TTSQVRPR-NH₂ = Derivat von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) mit einer Aminogruppe, die das carboxyterminale Ende blockiert; Ac-TTSQVRPR-NH₂ = Derivat von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) mit einer Acetylgruppe, die das aminoterminale Ende blockiert und eine Aminogruppe, die das carboxyterminale Ende blockiert.
8. Entzündungshemmende Aktivität, wie über die Hemmung des AA-induzierten Anstiegs in der Dicke des Mausohres gemessen, von trunkierten Derivaten (SEQ. ID NO: 3, 4, 6, 24–28) von CT-112 (SEQ. ID NO: 1). TTSQVRPR (SEQ. ID NO: 1); TSQVRPR (SEQ. ID NO: 25); SQVRPR (SEQ. ID NO: 3); QVRPR (SEQ. ID NO: 24); VRPR (SEQ. ID NO: 4); TTSQVRP (SEQ. ID NO: 26); TTSQVR (SEQ. ID NO: 27); TTSQV (SEQ. ID NO: 6); TTSQ (SEQ. ID NO: 28).
9 Entzündungshemmende Aktivität, wie über die Hemmung des AA-induzierten Anstiegs in der Dicke des Mausohres gemessen, von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) Analoga (SEQ. ID NO: 25, 26, 29–73).
10. Auswirkung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) auf den Prozentsatz von Mäusen, der Collagen-induzierte Arthritis entwickelt.
11. Auswirkung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) auf die kumulative Anzahl von betroffenen Pfoten, von Mäusen, die Collagen-induzierte Arthritis entwickeln.
12. Auswirkung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) auf den kumulativen Arthritis-Index in Mäusen, die Collagen-induzierte Arthritis entwickeln.
13. Auswirkung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) auf die Histopathologie von Collagen-induzierter Arthritis in Mäusen.
Die Werte stellen den Durchschnitt ± SEM von 23 Pfoten der Kontrollgruppe, 26 Pfoten der mit 10 mg CT-112/kg behandelten Gruppe und 16 Pfoten der mit 100 mg CT-112/kg behandelten Gruppe dar. * zeigt signifikant unterschiedliche (p ≤ 0,05) von der Kontrollgruppe an.
14. Auswirkung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) auf zirkulierende Anti-Collagen-Antikörper in mit Collagen immunisierten Mäusen, wie über die O. D. bei 405 nm gemessen.
5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zum Zwecke der Klarheit der Offenbarung, und nicht als Beschränkung, wird die detaillierte Beschreibung der Erfindung in den folgenden Untereinheiten dargelegt:

(i) Herstellung von Blutplättchenfaktor 4 (SEQ. ID NO: 9)
(ii) Peptide der Erfindung und ihre Herstellung;
(iii) Identifikation von entzündungshemmenden Peptiden; und
(iv) Die Verwendung von Peptiden der Erfindung als entzündungshemmende Agenzien.

5.1. Herstellung von Blutplättchenfaktor 4
Blutplättchenfaktor 4 (PF4) (SEQ. ID NO: 9) kann durch das Verwenden jeder im Stand der Technik bekannten Methode gereinigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann PF4 (SEQ. ID NO: 9) aus Thrombin-aktivierten Blutplättchen-Extrakten durch eine Modifikation der durch Medici et al. beschriebenen Methode (1989, Thrombos. Res. 54: 277–287) gereinigt werden. PF4 (SEQ. ID NO: 9) kann durch Heparin-Sepharose Affinitätschromatographie mit der Elution des Faktors bei 1,7 M NaCl isoliert werden, gefolgt von starker Ionenaustauscherchromatographie auf einer Polysulfoethyl-Aspartamidsäure, mit Natriumchlorid in der Anwesenheit von ungefähr 15% Acetonitril eluiert und schließlich durch Auftrennung auf einer Vydac RPC₄ analytischen Reverse-Phase HPLC-Säule mit einem linearen Acetonitril-Gradienten in ungefähr 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser eluiert werden.
5.2. Peptide der Erfindung und ihre Herstellung
Die Peptide der Erfindung schließen jedes Peptid, Peptidderivat oder Peptidanalog ein, welches entweder: (i) ein mindestens vier Aminosäuren langes Stück von PF4 (SEQ. ID NO: 9), die Aminosäuresequenz (SEQ. ID NO: 9), welche in 2 dargestellt ist, oder eine funktional äquivalente Sequenz oder (ii) mindestens eine sechs Aminosäuren lange Sequenz, die mindestens 66% homolog zu einem Abschnitt der PF4-Sequenz (SEQ. ID NO: 9), wie dargestellt in 2, ist oder eine funktional äquivalente Sequenz, umfasst. Homologie wird hierin als auf die Identität zwischen Aminosäureresten von verschiedenen Peptiden bezogen interpretiert. Zum Beispiel teilt ein sechs Aminosäurereste langes Peptid, das 66% homolog zu einem sechs Aminosäure langen Fragment von PF4 ist, vier Aminosäurereste mit dem PF4 (SEQ. ID NO: 9) Fragment, die nicht notwendigerweise miteinander verbunden sind.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Peptid, Peptidderivat oder Peptidanalog die Sequenz Thr-Ser-Gln und/oder Val-Arg-Pro, und mehr bevorzugt Thr-Thr-Ser-Gln (SEQ. ID NO: 10) und/oder Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID No: 4) (zuvor als „Wohl-4" bezeichnet) oder Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID NO: 1). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID NO: 1) (d. h. "CT-112"). In zusätzlichen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Peptid, Peptidderivat oder Peptidanalog die Sequenz Val-Lys-Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID NO: 2) (zuvor „Wohl-2") oder Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID NO: 3) (zuvor „Wohl-3") oder Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr (SEQ. ID NO: 5) (zuvor „Wohl-5") oder Thr-Thr-Ser-Gln-Val (SEQ. ID NO: 6) (zuvor „Wohl-6") oder Thr-Ser-Gln-Val-Arg (SEQ. ID NO: 7) (zuvor „Wohl-7") oder Thr-Thr-Ser-Gly-Ile-His-Pro-Lys (SEQ. ID NO: 8) (zuvor "Wohl-8") (1).
Die Peptide der Erfindung können ebenfalls Teile umfassen, die wenig oder keine Homologie zu PF4 (SEQ. ID NO: 9) tragen (z. B. Carrier-Proteine). Des Weiteren können diese Peptide durch Konjugation an andere Verbindungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kohlenhydrat-, Lipid-, Phosphat-, Stärke-, Antikörper-, Fab-, Fab₂-, Enzym-, Aminosäure-, Peptid- oder Wachstumsfaktor-Verbindungen, derivatisiert werden Die Aminosäuresequenz (SEQ. ID NO: 9) von PF4, wie in 2 dargestellt, oder eine funktional äquivalenten Sequenz sollte interpretiert werden zu meinen, dass die PF4-Sequenz (SEQ. ID NO: 9) (i) die in 2 dargestellte Sequenz (SEQ. ID NO: 9) oder (ii) die Sequenz (SEQ. ID NO: 9), wie dargestellt in 2, in der aber bestimmte Reste durch funktional äquivalente Aminosäuren ersetzt sind, was in einem stummen Austausch resultiert, sein kann. Zum Beispiel können einer oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch andere Aminosäuren einer gleichen Polarität, die als funktionales Äquivalent wirken, ersetzt sein, was in einer stummen Abänderung resultiert. Ersatz für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz kann aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu der Aminosäuren gehören, ausgewählt werden. Zum Beispiel schließen die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Analoga und/oder Derivate von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als entzündungshemmende Agenzien bereit, wie solche, in denen das aminoterminale Ende des Peptids durch die Addition einer R-(C=O)-Gruppe, in der R ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Niedrigalkyl, einem Cykloalkyl, einem Aryl und einem Heteroaryl besteht, wobei das Aryl oder Heteroaryl entweder unsubstituiert oder mit einer Halogen-, Methoxy-, Amino- oder Alkyl-funktionellen Gruppe substituiert ist, oder in denen das carboxyterminale Ende des Peptides durch die Addition von einer R'-Gruppe, wobei R' ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Amid, einem Niedrigalkylester, einem Cykloalkylester, einem Arylester und einem Heteroarylester besteht, wobei der Arylester oder Heteroarylester entweder unsubstituiert oder mit einer Halogen-, Methoxy-, Amino- oder Alkyl-funktionellen Gruppe substituiert ist, oder in denen beide Enden des Peptides so modifiziert sind, vorausgesetzt dass besagte Analoga und/oder Derivate entzündungshemmende Aktivität besitzen, z. B. wie durch die in Abschnitt 5.3 infra dargestellten Assays bestimmt. Die Ausdrücke „Niedrigalkyl" und „Niedrigalkylester" sind, wie hierin verwendet, beabsichtigt, Gruppen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, zu umfassen. Die Begriffe „Aryl" und „Arylester" sind, wie hierin verwendet, beabsichtigt, Gruppen, die eine Ringstruktur aus 6- oder 7-Einheiten enthalten und z. B. Pyridinium, Imidazolium und Chinoxalingruppen einschließen, zu umfassen.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Derivate von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als entzündungshemmende Agenzien bereit, in denen eine oder mehrere beliebige Seitenkettenaminogruppen durch Acylierung oder Arylierung derivatisiert sind oder in denen eine oder mehrere beliebige Seitenkettenhydroxylgruppen durch die Addition eines Alkylesters oder Arylesters derivatisiert sind oder in denen beide, Amino- und Hydroxylseitenkettengruppen, auf diese Weise derivatisiert sind, vorausgesetzt, dass besagte Derivate entzündungshemmende Aktivität besitzen, z. B. wie durch die in Abschnitt 5.3 infra dagestellten Assays bestimmt.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Derivate von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als entzündungshemmende Agenzien bereit, in welchen CT-112 (SEQ. ID NO: 1) oder ein Teil davon durch eine kovalente Verbindung zwischen nicht-benachbarten Resten zyklisiert ist, vorausgesetzt dass besagte Derivate entzündungshemmende Aktivität besitzen, z. B. wie durch die in Abschnitt 5.3 infra dargestellten Assays bestimmt.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Analoga von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als entzündungshemmende Agenzien bereit, in welchen einer oder mehrere beliebige Aminosäurereste von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) mit verschiedenen Aminosäureanaloga oder Aminosäuren-Mimics substituiert sind, z. B. um Carbazate oder tertiäre Zentren zu ergeben, und deren Einfügung dem Verhindern oder Reduzieren der proteolytischen Spaltung des Peptides dient, vorausgesetzt, dass besagte Analoga entzündungshemmende Aktivität besitzen, z. B. wie durch die in Abschnitt 5.3 infra dargestellten Assays bestimmt.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung trunkierte Analoga von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als entzündungshemmende Agenzien bereit, vorausgesetzt dass besagte trunkierte Analoga entzündungshemmende Aktivität besitzen, z. B. wie durch die in Abschnitt 5.3 infra dargestellten Assays bestimmt.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung substituierte Derivate von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als entzündungshemmende Agenzien bereit, in welchen einer oder mehrere Aminosäurereste von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) durch z. B. die D-Aminosäureform des entsprechenden Aminosäurerestes oder durch jeden anderen L-Aminosäurerest ersetzt sind, vorausgesetzt dass die substituierten Derivate von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) entzündungshemmende Aktivität besitzen, wie z. B. durch die in Abschnitt 5.3 infra dargestellten Assays bestimmt. Zum Beispiel stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr₁-Thr₂-Ser₃-Gln₄-Val₅-Arg₆-Pro₇-Arg₈ bereit, wobei einer oder mehrere beliebige der Aminosäurereste an Positionen 1, 2, 5, 6 oder 7 in der D-stereoisomeren Form vorliegen, und das Peptid entzündungshemmende Aktivität besitzt.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-X-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg bereit, wobei X aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Lys, L-Orn, L-Met, L-Arg, L-Ser, L-Trp, L-Tyr, L-Cys und L-His besteht, und das Peptid entzündungshemmende Aktivität besitzt.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-X-Gln-Val-Arg-Pro-Arg bereit, wobei X aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Glu, L-Asp, L-Asn, L-Gln, L-Cys, L-His, L-Lys, L-Orn, L-Thr, L-Trp und L-Tyr besteht, und das Peptid entzündungshemmende Aktivität besitzt.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-X-Val-Arg-Pro-Arg bereit, wobei X aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Lys, L-Orn, L-Arg, L-Asp, L-Cys, L-Glu, L-His, L-Met, L-Ser, L-Thr und L-Tyr besteht, und das Peptid entzündungshemmende Aktivität besitzt.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-X-Val-Arg-Pro-Arg bereit, wobei X aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Lys, L-Orn, L-Arg, L-Asp, L-Cys, L-Glu, L-His, L-Met, L-Ser, L-Thr und L-Tyr besteht, und das Peptid entzündungshemmende Aktivität besitzt.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-X-Arg-Pro-Arg bereit, wobei X aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus allen natürlich vorkommenden L-Aminosäuren außer Valin, und bevorzugt L-Lys besteht, und das Peptid entzündungshemmende Aktivität besitzt.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-Val-X-Pro-Arg bereit, wobei X aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus allen natürlich vorkommenden L-Aminosäuren außer Arg, und bevorzugt L-Ala oder L-Glu besteht, und das Peptid entzündungshemmende Aktivität besitzt.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-X-Arg bereit, wobei X aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus allen natürlich vorkommenden L-Aminosäuren außer Pro besteht, und das Peptid entzündungshemmende Aktivität besitzt.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-X bereit, wobei X aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus L-Lys, L-Orn, L-Asn, L-Asp, L-Cys, L-Glu, L-His, L-Met, L-Ser und L-Tyr besteht, und das Peptid entzündungshemmende Aktivität besitzt.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Analoga von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als entzündungshemmende Agenzien bereit, in welchen einer oder mehrere der Aminosäurereste von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) weggelassen sind, vorausgesetzt, dass besagte Analoga von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) entzündungshemmende Aktivität zeigen, z. B. wie durch die in Abschnitt 5.3 infra dargestellten Assays bestimmt.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der Aminosäuresequenz R-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-R'' bereit, wobei R entweder H oder R'-(C=O)-, ist, wobei R' aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Niederalkyl, einem Cykloalkyl, einem Aryl und einem Heteroaryl besteht, wobei das Aryl oder Heteroaryl entweder unsubstituiert oder mit einer Halogen-, Methoxy-, Amino- oder Alkyl-funktionellen Gruppe substituiert ist. R'' wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus H, einem Amid, einem Niederalkylester, einem Cykloalkylester, einem Arylester und einem Heteroarylester besteht, wobei der Arylester oder Heteroarylester entweder unsubstituiert oder mit einer Halogen-, Methoxy-, Amino- oder Alkyl-funktionellen Gruppe substituiert ist. X₁ ist L-Thr; X₂ wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus L-Thr, L-Lys, L-Orn, L-Met, L-Arg, L-Ser, L-Trp, L-Tyr, L-Cys und L-His besteht. X₃ wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus L-Ser, L-Glu, L-Asp, L-Asn, L-Gln, L-Cys, L-His, L-Lys, L-Orn, L-Thr, L-Trp und L-Tyr besteht. X₄ wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus L-Gln, L-Lys, L-Orn, L-Arg, L-Asp, L-Cys, L-Glu, L-His, L-Met, L-Ser, L-Thr und L-Tyr besteht. X₅, X₆ und X₇ sind natürlich vorkommende L-Aminosäuren und X₈ wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus L-Arg, L-Lys, L-Orn, L-Asn, L-Asp, L-Cys, L-Glu, L-His, L-Met, L-Ser und L-Tyr besteht, vorausgesetzt dass R-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-R'' mindestens vier Aminosäurereste umfasst, und nicht Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID NO: 4) oder Thr-Thr-Ser-Gln-Val (SEQ. ID NO: 6) oder Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID NO: 3) oder Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID NO: 1) ist, wobei das Peptid derivatisiert sein kann oder in welchen von dem Peptid, wie oben beschrieben, Analoga synthetisiert werden können, und das Peptid, Peptidderivat oder Peptidanalog entzündungshemmende Aktivität besitzt, z. B. wie durch die unten in Abschnitt 5.3 dargestellten Assays bestimmt.
In allen Fällen zeigen die Peptide der Erfindung entzündungshemmende Aktivität, wie unten in Abschnitt 5.3 definiert.
Die Peptide der Erfindung können durch jede im Stand der Technik bekannte Methode hergestellt werden. Zum Beispiel, und ohne Beschränkung, können die Peptide (i) durch Spaltung von einem größeren Peptid, wie z. B., aber nicht beschränkt auf, PF4 (SEQ. ID NO: 9); (ii) durch rekombinante DNA-Expressionsmethoden und (iii) durch chemische Synthese einschließlich Festphasentechniken wie durch Barany und Merrifield beschrieben (1980, in "The Peptides" Vol. 2, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, N. Y.) synthetisiert werden.
In einer bevorzugten spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein tryptischer Verdau von PF4 (SEQ. ID NO: 9) durchgeführt werden, um PF4-Peptidfragmente herzustellen. Zum Beispiel kann lyophilisiertes PF4 (SEQ. ID NO: 9), wie in Abschnitt 5.1 beschrieben hergestellt, in 50 μl 0,4 M Na₂CO₃/8 M Harnstoff bei pH = 9 in einem Mikrozentrifugationsröhrchen aufgelöst werden. Das Protein kann dann durch die Zugabe von ungefähr 45 mM Dithiothreitol im Puffer bei pH = 8 für ungefähr 15 Minuten bei 50°C reduziert werden. Dann kann das Protein durch Zugabe von 5 μl Jodessigsäure in 0,5 N NaOH und Inkubieren für ungefähr 15 Minuten in der Dunkelheit bei Raumtemperatur carboxymethyliert werden. Dann können ungefähr 140 μl deionisiertes Wasser und 5 μl einer 1 mM HCl-Lösung Trypsin der Sequenziergüteklasse (mit 200 μg/ml) zugegeben werden und die Probe bei 37°C für ungefähr 24 Stunden inkubiert werden. Der resultierende tryptische Verdau kann dann in eine entsprechende Reverse Phase-Chromatographiesäule, z. B. eine Vydac C18-Säule equilibriert mit 2,7% Acetonitril/0,1% TFA/H₂O, injiziert und bei einer angemessenen Flussrate, z. B. 0,5 ml/Minute chromatographiert und in 1,0 Minuten Fraktionen gesammelt werden. Das Elutionsprogramm kann z. B. 2,7% Puffer B (95% Acetonitril) in Puffer A (0,1% TFA in Wasser) für ungefähr 10 Minuten und ein Gradient von ungefähr 27 bis 95% Puffer B in 123 Minuten sein. Die Elution der Peptide kann spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 210 nm überwacht werden. Bevorzugt kann ein Beckman System Gold HPLC-System für die Chromatographie von sowohl Proteinen als auch Verdau verwendet werden. Unter Verwendung des oben als Beispiel dargelegten Chromatographieprotokolls, wird erwartet, dass das CT-112 Peptid (SEQ. ID NO: 1) als Peptid Nr. 4 eluiert (siehe Abschnitt 6.2 unten). Peptidfragmente von PF4 (SEQ. ID NO: 9) können entsprechend der Erfindung optional chemisch modifiziert werden und können wie in dem nächsten Abschnitt dargestellt auf entzündungshemmende Aktivität getestet werden.
5.3 Identifizierung von entzündungshemmenden Peptiden
Die entzündungshemmende Aktivität der oben beschriebenen Peptide kann durch das Verwenden jedes im Stand der Technik bekannten in vitro oder in vivo Assay-Systems bestimmt werden, um einen Faktor für die entzündungshemmende Aktivität abzuschätzen. Der Ausdruck „entzündungshemmende Aktivität" sollte hierin bezogen auf die Fähigkeit entzündlichen Zelleinstrom und/oder Aktivitäten verbunden mit der Aktivierung von Immunzellen oder der Immunantwort zu hemmen interpretiert werden. Deswegen ist beabsichtigt, dass der Ausdruck „entzündungshemmend" die Fähigkeit als immun-regulatorisches oder immun-modulatorisches Agens zu wirken umfasst.
Zum Beispiel, aber ohne Beschränkung, kann das Peptid auf seine Fähigkeit die Entzündung in einem Mausohrmodell zu hemmen, in dem Arachidonsäure (AA) benutzt wird um eine entzündliche Reaktion hervorzurufen (Young et al., 1984, J. Invest. Dermatol. 82: 367–371; Doherty et al., 1988, J. Invest. Dermatol. 91: 298–302), getestet werden. Siehe unten Abschnitt 7 für illustrative Zwecke.
5.4. Die Verwendung von Peptiden der Erfindung als entzündungshemmende Agenzien
Peptide der Erfindung können in einem Verfahren zum Hemmen der Entzündung im Gewebe eines Subjekts mit Bedarf für eine solche Behandlung verwendet werden, welches an jeder Krankheit oder Funktionsstörung leidet, in welcher entweder akuter oder chronischer entzündlicher Zelleinstrom auftritt. Das Subjekt kann ein Mensch oder ein nicht-menschliches Subjekt sein. Spezifische Voraussetzungen, unter welchen die Peptide der Erfindung einen therapeutischen Wert haben könnten, würden Situationen einschließen, in denen eine unerwünschte Immunantwort aufgetreten ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Autoimmunkrankheiten wie z. B. Insulin-abhängige Diabetes, Goodpasture's Syndrom, Pemphigus und Pemphigoid, primäre biliäre Zirrhose, ulcerative Colitis, rheumatoide Arthritis, Skleroderma, Mischbindegewebe-Erkrankung und systemischer Lupus Erythematosus, Abstoßungs(Graft Versus Host)-Erkrankung, septischer Schock, Reperfusions-Gewebeschädigung (einschließlich einem myocardialen oder zerebralen Infarkt folgende Gewebsschädigung), Atherosklerose, Asthma und entzündliche Lungenerkrankung. In bevorzugten spezifischen Ausführungsformen der Erfindung ist das Peptid, dass zur Entzündungshemmung verwendet wird CT-112 (Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg) (SEQ. ID NO: 1).
Die Peptide der Erfindung können über jeden geeigneten und allgemein anerkannten Weg zur Arzneimittelverabreichung verabreicht werden, einschließlich intravenös, subkutan, intradermal, intranasal, inhalativ (z. B. Lungenerosol oder Lavage), intramuskulär, intraokular, intraperitoneale Injektion, peritoneale Spülung, Herzpunktur, Herzkatheterinjektion, oral, intrathekale oder intraventrikulare Injektion, Injektion in die Wirbelsäule oder Schädelhöhle, vaginal oder rektal (z. B. durch Zäpfchen), Hautpflaster oder topische Salbe und können in jedem geeigneten pharmazeutischen Träger, einschließlich wässriger Lösung, Mikrokapseln, Liposomen enthalten sein oder über ein verzögertes Freisetzungsimplantat, einschließlich hydrophile oder hydrophobische Träger-basierte Implantate.
Die Peptide der Erfindung können in einer Dosis verabreicht werden, die bei der Entzündungshemmung in dem Subjekt wirksam ist, wie durch Verwenden von Standardtechniken bestimmt. Es ist beabsichtigt, dass sich „entzündungshemmend" auf einen signifikanten Rückgang in den Zeichen und Symptomen der Entzündung bezieht. Die Befreiung von Symptomen, in der ein Patient subjektiv frei von Beschwerden ist, würde zum Beispiel, aber ohne Beschränkung, als eines von vielen befriedigenden Resultaten der Therapie angesehen werden. In bestimmten spezifischen nicht beschränkenden Ausführungsformen könnte das Ausmaß der Entzündung um ungefähr 50% verringert werden. Es wurde geschätzt, dass die ED₅₀ eine Dosis zwischen ungefähr 2,5 und 5,0 mg/kg ist. In spezifischen Ausführungsformen der Erfindung kann CT-112 (SEQ. ID NO: 1) einem menschlichen Patient in einer Dosis von ungefähr 2,5 mg/kg bis ungefähr 500 mg/kg verabreicht werden. In bevorzugten spezifischen, nicht-beschränkenden Ausführungsformen der Erfindung kann die Dosis, die einem menschlichen Patient subkutan verabreicht wird, abhängig davon, ob die zu behandelnde Entzündung mild, moderat oder schwer/persistent ist, entweder ungefähr 5 mg/kg, 50 mg/kg oder 100 mg/kg sein. Die Dosis kann in angemessenen Intervallen verabreicht werden, z. B., aber nicht beschränkt auf, täglich, oder einmal, zweimal oder dreimal in der Woche.
6. Beispiel: Herstellung von entzündungshemmenden Peptiden
6.1. Materialien und Methoden
6.1.1 Herstellung von PF4
PF4 (SEQ. ID NO: 9) wurde aus Thrombin-aktivierten Blutplättchenextrakten durch eine Modifikation der von Medici et al. beschriebenen Methode (1989, Thrombos. Res. 54: 277–287) gereinigt. PF4 (SEQ. ID NO: 9) wurde durch Heparin-Sepharose Affinitätschromatographie mit einer Elution des Faktors bei 1,7 M NaCl isoliert, gefolgt von starker Ionenaustauscherchromatographie auf einer Polysulfoethyl- Aspartamidsäule, mit NaCl in Anwesenheit von 15% Acetonitril eluiert und schließlich durch Trennung auf einer Vydac RPC₄ analytischen reverse-phase HPLC-Säule mit einem linearen Acetonitril-Gradient in 0,1% TFA in Wasser eluiert.
6.1.2 Tryptischer Verdau von PF4
Tryptischer Verdau wurde durch das Auflösen von lyophilisiertem PF4 (SEQ. ID NO: 9) in 50 μl 0,4 M Na₂CO₃/8 M Harnstoff pH 9.0 in einem Mikrozentrifugationsröhrchen durchgeführt. Das Protein wurde dann durch die Zugabe von 5 μl 45 mM DTT in Puffer mit einem pH von 9,0 für 15 Minuten bei 50°C reduziert. Das Protein wurde durch die Zugabe von 5 μl Jodessigsäure in 0,5 N NaOH und Inkubation für 15 Minuten in Dunkelheit bei Raumtemperatur carboxymethyliert. Schließlich wurden 140 μl deionisiertes Wasser und 5 μl 1 mM HCl-Lösung von Trypsin der Sequenziergüteklasse (200 μg/ml) zugegeben und die Probe für 24 Stunden bei 37°C inkubiert.
Der tryptische Verdau wurde auf eine Vydac C₁₈-Säule, mit 2,7% Acetonitril/0,1% TFA/H₂O äquilibriert, injiziert und mit einer Flussrate von 0,5 ml/Min chromatographiert und in 1,0 Min Fraktionen gesammelt. Das Elutionsmuster war wie folgt: 2,7% Puffer B (95% Acetonitril) in Puffer A (0,1% TFA in Wasser) für 10 Minuten, 2,7% bis 95% Puffer B in 123 Minuten. Die Elution der Peptide wurde bei 210 nm kontrolliert. Für die Chromatographie von sowohl Proteinen als auch Verdau wurde eine Beckman System Gold HPLC System verwendet.
6.2 Ergebnisse und Diskussion
CT-112 (SEQ. ID NO: 1) eluierte als das vierte Peptid in der Umkehrphasen-HPLC und wurde in einem Porton 2090e Sequenzierer nach Absorption auf ein Peptidträgermaterial, das von Porton gesetzlich geschützt ist, sequenziert. Die Sequenz des Peptides war Thr-27,5 pm, Thr-23,5 pm, Ser-30,0 pm, Gln-26,5 pm, Val-22,6 pm, Arg-10,5 pm, Pro-9,2 pm, Arg-4,7 pm. Eine Aminosäurenanalyse durch das Verwenden der Beckman Dabsyl Choridmethode bestätigte die Gesamtsequenz des Peptides.
7. Beispiel: CT-112 zeigt entzündungshemmende Aktivität
7.1 Material und Methoden
Die entzündungshemmenden Eigenschaften von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurden durch das Verwenden eines standardisierten Assays für entzündungshemmende Aktivität festgestellt, d. h. einem Mausohrmodell, in dem Archidonsäure (AA) verwendet wird, um eine entzündliche Reaktion hervorzurufen (Young et al., 1984, J. Invest. Dermatol. 82: 367–371; Doherty, et al., 1988, J. Invest. Dermatol. 91: 298–302).
7.1.1 Reagenzien
CT-112 (SEQ. ID NO: 1), entweder das Chlorid oder das Trifluoressigsäuresalz, wurde durch das Verwenden eines Standardsystems für die organische Synthese von Peptiden von Multiple Peptide Systems (San Diego, CA USA) synthetisiert. Phenidon und AA wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO USA) erhalten. Alzet Minipumpen (Model 2001, 7 Tage, eingestellt 1 μl/hr) freizusetzen) zur subkutanen Implantation in Testtieren, wurden von der Alza Corporation (Palo Alto, CA USA) erhalten. AA wurde vor der Anwendung in Aceton von Reagenzqualität mit 200 mg/ml aufgelöst.
7.1.2 Tierbehandlung
Weibliche Mäuse (C57BL/6UAF, Charles River Breeding Laboratories, ungefähr 15–18 g) wurden erhalten und für 2 Wochen vor der Verwendung akklimatisiert. Beim Start der Studie waren die Tiere ungefähr 14 Wochen alt.
Um Minipumpen für die Implantation vorzubereiten, wurde CT-112 (SEQ. ID NO: 1) in PBS aufgelöst. Das Material wurde in Alzet Minipumpen geladen, die eingestellt waren 0,05 (5 Tiere), 0,1 (10 Tiere), 1 (10 Tiere), oder 2,5 (5 Tiere) mg CT-112 (SEQ. ID NO: 1) pro Tier pro Tag abzugeben. Die Minipumpen für die Implantation in Kontrolltiere enthielten nur PBS. Als positive Kontrolle erhielt ein Satz von 10 Mäusen 15 Minuten vor Reizung mit AA 100 mg/kg Phenidon, ein potenter 5-Lipoxygenase-Inhibitor, welcher als entzündungshemmendes Agens wirkt.
Für die subkutane Implantation von Minipumpen wurden die Tiere mit Ketamin/Xylazin anästhesiert. Das Ketamin (Aveco Lot Nr. 440140) wurde mit 80 mg/kg injiziert und das Xylacin (Rugby Laboratories Lot Nr. 26040-B) mit 16 mg/kg und die Alzet-Pumpen wurden subkutan in den dorsothorakalen Bereich implantiert. Den Tieren wurde erlaubt sich zu erholen und dann wurden sie für 5 Tage beherbergt und mit Wasser und Futter ad libitum versorgt.
An dem sechsten Tag nach der Pumpenimplantation, wurden 0,01 ml AA auf die inneren und äußeren Oberflächen des rechten Ohres mittels einer automatischen Mikroliterpipette appliziert. Eine Stunde nach der AA-Verabreichung wurden die Mäuse getötet und die Ohrendicke mit einer Mitutoyo Nr. 7300 Messschieblehre gemessen. Als interne Kontrolle wurden ebenfalls die linken Ohren gemessen.
Als ein Marker für die Anwesenheit oder Abwesenheit von polymorphonukleären Leukozyten (PMNs) wurde die Aktivität der Myeloperoxidase im Ohrengewebe gemessen (Barone et al., 1991, J. Neurosci. Res. 29: 336–345). Nach der Messung der Ohrdicke, wurden die Ohren von den Mäusen abgeschnitten und in 50 mM Tris-HCL, pH 7,4 bei 4°C homogenisiert, um ein 10%-iges (w/v) Homogenisat zu ergeben. Aliquots des Homogenisats wurden verwendet, um mittels des Verwendens von o-Dianisidin (Sigma Chem Co., St. Louis MO) und Wasserstoffperoxid als Substrat und Überwachen der Chromophorerzeugung bei 460 nm (Barone et al., 1991, J. Neurosci. Res. 29: 336–345) die Menge an Myeloperoxidaseaktivität, die in dem Gewebe vorhanden ist, zu bestimmen.
7.2. Ergebnisse und Diskussion
Vorbehandlung von Tieren mit dem 5-Lipoxygenase-Inhibitor Phenidon verhinderte wirksam die entzündliche Antwort auf die topische AA-Verabreichung. Dieses nicht-steroidale entzündungshemmende Agens war dadurch in der Lage, in dieser Studie als positive Kontrolle für die Hemmung von AA-induzierter Hautentzündung zu dienen.
Vorbehandlung von Mäusen mit CT-112 (SEQ. ID NO: 1) hemmte, verglichen mit PBS-Kontrollen, den Entzündungsprozess signifikant. Die Vorbehandlung von Mäusen mit 0,05 mg CT-112 (SEQ. ID NO: 1) pro Tag führte zu einer signifikanten Reduktion (43,1%, p ≤ 0,05) in der Schwellung des Ohres als Antwort auf AA (Tabelle 1). Die maximale Reduktion (95,6%) der Antwort auf AA wurde erreicht, wenn jedem Tier pro Tag 2,5 mg CT-112 (SEQ. ID NO: 1) verabreicht wurden. Diese Hemmung der entzündlichen Antwort war signifikant (p ≤ 0,1) und mit der Antwort auf Phenidon vergleichbar.
Die Vorbehandlung von Mäusen mit 0,05–1 mg CT-112 (SEQ. ID NO: 1) pro Tag verringerte die Myeloperoxidaseaktivität in den AA-behandelten Ohren in einer Dosis-abhängigen Art und Weise. Aufgrund der großen Variabilität in dem Test zeigte nur die Gruppe, welche entweder Phenidon oder 0,1 mg CT-112 (SEQ. ID NO: 1) pro Tag erhielt, einen, im Vergleich zu der Myeloperoxidaseaktivitätskontrolle (Tabelle 2), signifikant unterschiedlichen Aktivitätslevel (p ≤ 0,05).
Diese Daten weisen darauf hin, dass CT-112 (SEQ. ID NO: 1) eine akute entzündlich Hautantwort auf Grund der topischen Anwendung von AA hemmen kann. Dieser Effekt kann ebenfalls zu der Anwesenheit von weniger PMNs in der entzündlichen Antwort führen, wie über die Myeloperoxidaseaktivität bestimmt.
Tabelle I
Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von der Ohrenzahl in Klammern dar.
Tabelle II
Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von der Ohrenzahl in Klammern dar.
8. Beispiel: CT-112 Hemmung der Chemotaxis von Neutrophilen
Die Fähigkeit von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) spezifisch entzündliche Prozesse zu blockieren, wird durch die Hemmung der Aktivität von Neutrophilen nachgewiesen, welche wie unten beschrieben untersucht wurde.
8.1 Material und Methoden
Die Fähigkeit von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als Antwort auf eine Reihe von Agenzien die Chemotaxis von Neutrophilen zu inhibieren, wurde durch das Verwenden von Neuroprobe Chemotaxis-Kammern beurteilt. Für diese Assays wurden Neutrophile in Hanks balanced salt solution mit Ca²⁺ und Mg²⁺ resuspendiert, um eine Suspension mit 5 × 10⁶ Zellen/ml zu ergeben, nachdem die Zellen mit 1',7'-bis(2-carboxyethyl)-5-(6)-carboxyfluorescein markiert wurden. Die Neutrophilen wurden vor der Zugabe zu den Chemotaxis-Kammern für ungefähr 15 Minuten CT-112 (SEQ. ID NO: 1) ausgesetzt. CT-112 (SEQ. ID NO: 1) war in sowohl im Oberteil als auch dem Unterteil der Kammern vorhanden und der Lockstoff, entweder f-Met-Leu-Phe, Leukotrien B₄ oder Interleukin-8, wurde zu dem Unterteil der Kammer zugegeben. Zellen, die durch die Membran gewandert waren, wurden durch Fluoreszenz bei 530 nm eine Stunde nach Initiierung des Assays bestimmt.
8.2. Ergebnisse und Diskussion
CT-112 (SEQ. ID NO: 1) hemmte wirksam die chemotaktische Migration von Neutrophilen sowohl zu f-Met-Leu-Phe als auch zu LTB₄ (3, 4), aber nicht zu Interleukin 8 (5). Zusätzlich war CT-112 (SEQ. ID NO: 1) für Neutrophile nicht cytotoxisch, wie durch das Testen der Lebensfähigkeit durch das Verwenden des Trypan-Blau-Ausschlusses (3) bestimmt wurde. Diese Studie deutet darauf hin, dass mindestens eine mit Neutrophilen verbundene Aktivität, die der chemotaktischen Migration, zumindest teilweise durch CT-112 (SEQ. ID NO: 1) gehemmt wird.
9. Beispiel: Auswirkung der CT-112 Expositionsdauer
9.1. Material und Methoden
Mäuse bekamen Alzet-Minipumpen implantiert, die eingestellt waren 60 mg/kg/Tag für entweder 7, 3 oder 1 Tag abzugeben. Eine gesonderte Gruppe von 5 Mäusen erhielt 3 intraperitoneale Injektionen von CT-112 (60 mg/kg/Injektion) 24, 1 und 0,25 Stunden vor der AA-Reizung. CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurde durch das Auflösen des Präparates in Dulbecco's PBS für die Injektion vorbereitet, um eine endgültige CT-112 (SEQ. ID NO: 1) Konzentration von 5 mg/ml zu ergeben. Die Kontrollmäuse bekamen Alzet-Minipumpen implantiert, die für 7 Tage PBS abgaben. Die AA-Reizung war dieselbe wie oben in Beispiel 7 beschrieben.
9.2. Ergebnisse und Diskussionen
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. In der Entzündungshemmung wurde als Ergebnis der 7, 3 und 1 Tage dauernden Exposition kein Unterschied festgestellt. Alle Laufzeiten hemmten die akute Entzündung, die ansonsten durch die topische Anwendung von AA induziert wird, signifikant. Obwohl die Ergebnisse nicht signifikant von den Kontrollen abwichen hemmten die intraperitonealen Injektionen die Entzündung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die verlängerte CT-112 (SEQ. ID NO: 1) Exposition, d. h. > 1 Tag, nicht notwendig war, um die Entzündung zu hemmen.
Tabelle III
Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
10. Beispiel: Auswirkung der intraperitonealen CT-112-Injektion
10.1. Material und Methoden
Die Verabreichung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) (60 mg/kg/Injektion) über eine Vielzahl intraperitonealer Injektionen wurde zu den folgenden Zeitpunkten vor der Reizung mit AA durchgeführt:

a. 6, 3, 1 und 0,25 Stunden;
b. 3, 1 und 0,25 Stunden; oder
c. 1 und 0,25 Stunden.

Zusätzlich wurde die Auswirkung einer einzelnen Verabreichung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) (60 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion entweder 1 oder 3 Stunden vor der AA-Reizung durchgeführt. Kontrollmäuse hatten Alzet-Minipumpen implantiert, um vor der AA-Reizung für 7 Tage PBS abzugeben. Die AA-Reizung war die gleiche wie oben in Beispiel 7 beschrieben. Die Ergebnisse der vielfältigen Dosierungskuren und der 1 und 3 Stunden Einzeldosierungskuren wurden, unter Verwendung von 5 Tieren pro Behandlung, mit der entzündungshemmenden Aktivität von CT-112 (SEQ. ID NO: 1), das von Alzet-Minipumpen, die eingestellt waren 60 mg/kg/Tag für 7 Tage abzugeben, abgegeben wurde, verglichen.
In einem gesonderten Experiment wurde die Wirkung von vielfältigen intraperitonealen Injektionen von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) entweder 6, 3, 1 und 0,25 Stunden oder 16, 3, 1 und 0,25 Stunden vor AA-Reizung beurteilt. Die Ergebnisse von beiden Multidosierungskuren wurden sowohl mit Phenidon (100 mg/kg verabreicht 15 Minuten vor der Reizung) als auch CT-112 (SEQ. ID NO: 1), das über eine Alzet-Minipumpe (60 mg/kg/Tag für 7 Tage) verabreicht wurde, verglichen. Für die letzte Studie wurde die Anzahl von Tieren, die einzelne Injektionen von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) erhielten, von 5 auf 10 erhöht.
10.2. Ergebnisse und Diskussion
Die Ergebnisse der Mehrfach- und Einzel-(1 Stunden und 3 Stunden)Dosierungsstudien sind in Tabelle IV dargestellt. Alle Multidosierungskuren und die 3 Stunden Einzeldosierungskuren hemmten den entzündlichen Prozess signifikant zu ungefähr 70% (p ≤ 0,01) verglichen mit der 7-Tage-Verabreichung über die Alzet-Minipumpe, welche den entzündlichen Prozess zu 94% inhibierte. Obwohl die Einzeldosis von CT-112 (SEQ. ID NO: 1), die 1 Stunde vor der AA-Reizung verabreicht wurde, den entzündlichen Prozess nicht signifikant hemmte, wurde eine 43%ige Hemmung beobachtet.
Verabreichung von Mehrfach-IP-Injektionen von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) entweder 6, 3, 1 und 0,25 Stunden oder 16, 3, 1 und 0,25 Stunden vor der AA-Reizung führte zu einer signifikanten Verringerung (56–61%) (p ≤ 0,01) der Entzündung (Tabelle V). Jedoch führte sowohl die 7-Tage Alzet-Minipumpe-Verabreichung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als auch die Einzelverabreichung von Phenidon 15 Minuten vor der AA-Reizung zu einer größeren Verringerung der Entzündung.
Diese Ergebnisse weisen daraufhin, dass CT-112 (SEQ. ID NO: 1), über intraperitoneale Injektion verabreicht, akute Hautentzündung signifikant hemmen kann.
Tabelle IV
Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
Tabelle V
Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von der Zahl an Tieren angegeben in Klammern dar.
11. Beispiel: Effekt der subkutanen CT-112-Injektion
Dieses Beispiel zeigt, dass CT-112 (SEQ. ID NO: 1), als eine subkutane Injektion verabreicht, wirksam bei der Hemmung einer entzündlichen Antwort ist.
11.1. Material und Methoden
CT-112 (SEQ. ID NO: 1)-Verabreichung (60 mg/kg/Injektion) an Mäuse über mehrfache subkutane Injektionen vor der AA-Reizung wurde bei:

a) 6, 3, 1 und 0,25 Stunden;
b) 3, 1 und 0,25 Stunden; oder
c) 1 und 0,25 Stunden durchgeführt.

Zusätzlich erhielten andere Mäuse nur eine einzelne subkutane Injektion von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) (60 mg/kg) entweder 3 oder 1 Stunde vor AA-Reizung. Kontrolltiere bekamen 3 Tage vor der AA-Reizung mit PBS gefüllte Alzet-Minipumpen implantiert. Die AA-Reizung war dieselbe wie oben in Beispiel 7 beschrieben. Die Ergebnisse dieser Dosierungskuren wurden mit der entzündungshemmenden Aktivität von CT-112 (SEQ. ID NO: 11, das von einer Alzet-Minipumpe abgegeben wurde, die eingestellt war um 60 mg/kg/Tag für 7 Tage abzugeben, verglichen. Die Dauer der CT-112 (SEQ. ID NO: 1)-Aktivität in Bezug auf akute entzündungshemmende Aktivität wurde nach subkutanen Injektionen von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) ebenfalls beurteilt.
11.2. Ergebnisse und Diskussion
Die Ergebnisse sind in Tabellen VI und VII dargestellt.
Nach der subkutanen Injektion hemmten alle Multidosierungskuren und Einzeldosierungskuren den entzündlichen Prozess signifikant um ungefähr 70% (p ≤ 0,05) verglichen mit der Verabreichung über die Alzet-Minipumpe für 7-Tage, welche den entzündlichen Prozess um 87% hemmte (Tabelle VI).
In der Laufzeitstudie deuten die Resultate darauf hin, dass die Dauer der Aktivität größer als 6 Stunden ist, obwohl nur die Behandlung mit 6 Stunden vor der AA-Reizung subkutan verabreichtem CT-112 (SEQ. ID NO: 1) die AA-induzierte akute Entzündung signifikant inhibierte (p ≤ 0,05) (Tabelle VII). In dieser besonderen Studie versagte die Verabreichung von 60 mg/kg/Tag von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) über die Alzet-Minipumpe, die normalerweise beobachteten 80–90% Entzündungshemmung zu erreichen. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass CT-112 (SEQ. ID NO: 1) beim Hemmen akuter Hautentzündung aktiv war, wenn es über eine subkutane Injektion 6 Stunden vor der Reizung verabreicht wurde.
Tabelle VI
Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
Tabelle VII
Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
12. Beispiel: Auswirkung der oralen CT-112-Verabreichung
12.1. Material und Methoden
In Mäusen wurde die Fähigkeit von oral gegebenem CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wirksam die Entzündung in Mäusen zu hemmen beurteilt. Die Verabreichung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) (200 mg/kg/Magensonde) über mehrere Magensonden wurde zu den folgenden Zeiten vor der AA-Reizung durchgeführt:

a) 6, 3, 1 und 0,25 Stunden;
b) 3, 1 und 0,25 Stunden; oder
c) 1 und 0,25 Stunden.

Zusätzlich wurde der Effekt einer einzelnen Sondenfütterung mit CT-112 (SEQ. ID NO: 1) (200 mg/kg), entweder 3 oder 1 Stunde vor AA-Reizung verabreicht, beurteilt. Die AA-Reizung war dieselbe wie oben in Beispiel 7 beschrieben. Die Ergebnisse dieser Multi- oder Einzeldosierungskuren wurden mit der entzündungshemmenden Aktivität von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) verglichen, das über eine Alzet-Minipumpe abgegeben wurde, die eingestellt war 60 mg/kg/Tag für 3 Tage abzugeben.
12.2. Ergebnisse und Diskussion
Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII dargestellt. Alle oral verabreichten, Multidosierungs- und Einzeldosierungskuren hemmten den entzündlichen Prozess signifikant (52–94%) (p ≤ 0,01 oder ≤ 0,05), mit der Ausnahme der Dosierungskur, in der CT-112 (SEQ. ID NO: 1) 3, 1 und 0,25 Stunden vor AA-Reizung verabreicht wurde. Diese Dosierungskur hemmte den entzündlichen Prozess nur mit 44% und verfehlte es statistische Signifikanz zu erreichen. In dieser Studie hemmte die Verabreichung mit der Alzet-Minipumpe über 3-Tage den entzündlichen Prozess bis zu 88%. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CT-112 (SEQ. ID NO: 1), wenn es Mäusen oral mindestens 1 Stunde vor der Reizung verabreicht wird, ebenso aktiv ist wie bis zu 3 Stunden vor der Reizung.
Tabelle VIII
Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
13. Beispiel: Auswirkung von CT-112 auf das Carrageen-induzierte Modell der Peritonitis
Die Fähigkeit von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) Entzündung zu hemmen, wurde in dem Carageen-induzierten Modell der Peritonitis weiter untersucht. Dieses Modell stellt einen strengeren Test der Fähigkeit von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) die Entzündung zu hemmen dar, als das AA-induzierte akute Mausohr Entzündungsmodell (Hanna et al., 1990, Drugs Exp. Clin. Res. 16(4): 137–178; Brown and Leslie, 1976, Surg. Gyenecol. Obstet. 143: 738–740).
13.1. Material und Methoden
Mäuse (C57BL/6UAF, weiblich, 12 Wochen alt) bekamen Alzet-Minipumpen, eingestellt 60 mg CT-112/kg/Tag abzugeben, implantiert. Sechs Tage nach der Implantation wurden die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 0,3 ml Carageen in PBS (10 mg/ml) gereizt. Der Bauchraum wurde mit 15 ml Hanks Balanced Salt Solution (Ca²⁺- und Mg²⁺-frei) 24, 48 und 72 Stunden nach der Reizung gespült. Die Spülflüssigkeit wurde zentrifugiert (500 g, 5 Minuten) mit LeukoStat Fixiermittel fixiert und mit LeukoStat Färbelösung gefärbt. Die Objektträger wurden unter einem Mikroskop auf die verschiedenen Typen von Entzündungszellen, wie z. B. Makrophagen, Lymphocyten und Neutrophile untersucht. Am 48-Stunden-Zeitpunkt wurden ebenfalls 5 Kontrollmäuse gespült.
In einer gesonderten Studie wurde die Peritoneal-Spülflüssigkeit auf den Gesamt-Leukotrien B₄(LTB₄) und -Prostaglandin E₂(PGE₂)-Gehalt 24 Stunden nach Reizung untersucht (Grisworld et al., 1991, Biochem. Pharmacol. 42 (4): 825–831).
13.2. Ergebnisse und Diskussion
Die Ergebnisse sind in Tabelle IX und 6 dargestellt. CT-112 (SEQ. ID NO: 1) erniedrigte den Einstrom von Neutrophilen in das Bauchfell als Antwort auf die Carrageen-Injektion. Diese Abnahme führte 72 Stunden nach der Reizung zu einer statistisch signifikanten Verringerung (p ≤ 0,05) der Zahl von Neutrophilen im Bauchfell. Die Anzahl an Makrophagen schien in dieser Studie als Antwort auf die Verabreichung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) anzusteigen. Ein signifikanter Effekt auf Lymphozyten wurde nicht beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CT-112 die Rekrutierung von Makrophagen zu einem Entzündungsort nicht hemmt.
Die Ergebnisse der Analyse von LTB₄ und PGE₂ sind in Tabelle 10 dargestellt. Nach der Verabreichung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurde eine statistisch signifikante (p ≤ 0,05) Reduktion in der PGE₂-Menge in der peritonealen Spülflüssigkeit bemerkt, während die LTB₄-Menge nicht betroffen war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mindestens ein Teil des, in Entzündung verwickelten, metabolischen AA-Weges gehemmt ist.
Tabelle IX
Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
Tabelle X
Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
14. Beispiel: Strukturaktivitätsbeziehungen
14.1. Vergleich der entzündungshemmenden Aktivitäten von CT-114 und CT-112
14.1.1. Material und Methoden
CT-114 (Thr-Thr-Ser-Gln-Val) (SEQ. ID NO: 6), das ein Analog von CT-112 (SEQ ID NO: 1) ist, wurde als ein potentielles sekundäres Pharmakophor in dem akuten Mausohr Entzündungsmodell gesondert getestet. In dieser Studie wurden beide, CT-114 (SEQ. ID NO: 6) und CT-112 (SEQ. ID NO: 1), separat hergestellt und in verschiedene Alzet-Minipumpen, eingestellt entweder 6 mg oder 60 mg Peptid/kg/Tag abzugeben, geladen. Drei Tage nach der Implantation wurden die Mäuse durch das Aufbringen von AA auf das linke Ohr gereizt. Die AA-Reizung war dieselbe wie oben in Beispiel 7 beschrieben.
14.1.2. Ergebnisse und Diskussion
Die Ergebnisse sind in Tabelle XI dargestellt. Die mit 6 mg/kg/24 Stunden CT-112 (SEQ. ID NO: 1) behandelte Entzündung in Mäusen unterschied sich statistisch nicht von der Kontrolle, Verglichen mit der Kontrolle inhibierte die 6 mg/kg/Tag Dosis von CT-114 (SEQ. ID NO: 6) den entzündlichen Prozess signifikant, was zu einem statistisch signifikanten Unterschied (p ≤ 0,05) zwischen der durch CT-112 (SEQ. ID NO: 1) verursachten Entzündungshemmung und der durch CT-114 (SEQ. ID NO: 6) verursachten führte. Sowohl CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als auch CT-114 (SEQ. ID NO: 6) hemmten den entzündlichen Prozess bei 60 mg/kg/24 Stunden signifikant (p ≤ 0,01 bzw. p ≤ 0,05) und es gab keinen statistischen Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass CT- 112 (SEQ. ID NO: 1) und CT-114 (SEQ. ID NO: 6) beide in der Lage sind, akute Hautentzündung zu hemmen.
Tabelle XI
Die werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
14.2. Entzündungshemmende Aktivität von anderen Peptiden
Da CT-112 (SEQ. ID NO: 1) und CT-114 (SEQ. ID NO: 6) von PF4 (SEQ. ID NO: 9) abgeleitet sind, das ein Mitglied der α-Chemokin-Familie ist, und weil sowohl CT-112 (SEQ. ID NO: 1) als auch CT-114 (SEQ. ID NO: 6) sich zwei Aminosäurereste in Richtung des Carboxy-terminalen Endes des hochkonservierten CXC-Teiles von α-Chemokinen befinden (Edgington, 1993, Bio/Technology 11: 676–678; Broxmeyer et al., 1993 J. Immunol. 150: 3448–3458), wurde eine Reihe von Peptiden, die an derselben Stelle in anderen Mitgliedern der α-Chemokin-Familie gefunden wurden, synthetisiert und auf entzündungshemmende Aktivität in dem akuten Mausohr-Entzündungsmodell getestet.
Zusätzlich wurde eine Reihe von Peptiden, abgeleitet von der gleichen Position (zwei Aminosäurereste in Richtung des carboxyterminalen Endes des CC-Motives) in der β- Chemokinfamilie, ebenfalls getestet (Anmerkung: α-Chemokine haben eine für Neutrophile und T-Zellen spezifische Aktivität und β-Chemokine haben eine für Makrophagen und Monocyten spezifische Aktivität). Ein zufälliges Oktapeptid, CT-120 (Val-Thr-Arg-Pro-Thr-Gln-Arg-Ser) (SEQ. ID NO: 11), nicht verwandte Sequenzen von Wachstumsfaktoren und Albumin wurden ebenfalls getestet.
14.2.1. Material und Methoden
Jedes Peptid wurde für 24 Stunden über eine Alzet-Pumpe verabreicht, die eingestellt war 60 mg/kg/Tag abzugeben. Wegen der großen Anzahl von Tieren in dieser Studie wurden Gruppen von Verbindungen zufällig gestestet und mit Tieren, entweder mit CT-112 (SEQ. ID NO: 1) oder mit PBS alleine behandelt, verglichen und bezüglich ihrer Fähigkeit, Entzündungen zu hemmen, beurteilt. Die AA-Reizung war dieselbe wie oben in Beispiel 7 beschrieben.
14.2.2. Ergebnisse und Diskussion
Die Ergebnisse sind in den Tabellen XII bis XV dargestellt. Obwohl kein einfach erkennbares Aktivitätsmuster identifiziert wurde, wurden die folgenden Ergebnisse beobachtet. Keine Verbindung war wirksamer als CT-112 (SEQ. ID NO: 1) beim Hemmen der AA-induzierten Entzündung. Die wirksamsten Verbindungen (abgesehen von CT-112) waren CT-119 (SEQ. ID NO: 21), CT-164 (SEQ. ID NO: 16) und CT-220 (SEQ. ID No: 23). Von diesen Verbindungen ist nur CT-164 von der α-Chemokinfamilie (hENA78) abgeleitet. Eine zufällige Sequenz von Aminosäureresten, CT-120 (SEQ. ID NO: 11) war bei der Hemmung der AA-induzierten Ohrentzündung unwirksam. Obwohl Albumin eine mäßige Hemmung der Entzündung hervorrief, wurde dieses Phänomen durch andere beobachtet und wird nicht als biologisch signifikant betrachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Reihe von Peptiden, abgeleitet von Sequenzen, die sowohl in α- als auch β-Chemokinen gefunden wurden, akute Hautentzündung inhibieren kann. Von den getesteten Sequenzen waren jedoch keine wirksamer als CT-112 (SEQ. ID NO: 1).
Tabelle XII Vergleich der entzündungshemmenden Aktivität von Peptiden zu CT-112
Tabelle XIII
Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
Tabelle XIV
Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
Tabelle XV
Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
14.3. Entzündungshemmende Wirkung von blockierten, substituierten und trunkierten Versionen von CT-112
Der entzündungshemmende Effekt von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurde mit dem einer Reihe von CT-112 Analoga und Derivaten, welche entweder an ihrem Amino- oder Carboxyterminalem Ende blockiert, oder an beiden Enden blockiert, oder verschieden verkürzt, oder in welchen bestimmte Aminosäurereste entweder ersetzt oder weggelassen waren, verglichen.
14.3.1. Material und Methoden
Ein erster Satz von CT-112 derivatisierten Peptiden wurde chemisch synthetisiert. Diese schlossen das CT-112 (SEQ. ID NO: 1) Oktapeptid mit einer an das amino-terminale Ende des Peptides angefügten Acetylgruppe (Ac-TTSQVRPR), CT-112 (SEQ. ID NO: 1) mit einer an das carboxy-terminale Ende des Peptides angefügten Aminogruppe (TTSQVRPR-NH₂) und auf diese Weise an beiden Enden blockiertes CT-112 (SEQ. ID NO: 1) (Ac-TTSQVRPR-NH₂) ein. Zusätzlich wurde das zufällige Oktapeptid CT-120 (VTRPTQRS) (SEQ. ID NO: 11), wie zuvor in Sektion 14.2 beschrieben verwendet, ebenso getestet wie CT-127 (TTSGIHPK) (SEQ. ID NO: 12), das ein von dem Bindegewebe aktivierenden Peptid III (CTAPIII), einem Mitglied der α-Chemokinfamilie, abgeleitetes Peptid, ist.
Ein zweiter Satz von CT-112 (SEQ. ID NO: 1)-analogen Peptiden (SEQ. ID NO: 3, 4, 6, 24–28), alle verkürzte Versionen von CT-112, wurde chemisch synthetisiert.
Ein dritter Satz von CT-112 (SEQ. ID NO: 1)-analogen Peptiden (SEQ. ID NO: 25, 26, 29–73) wurde chemisch synthetisiert. Hier wurde jeder der acht Aminosäurereste, die CT-112 (SEQ. ID NO: 1) umfasst, sequentiell entweder ersetzt oder weggelassen. In jeder Sorte von Peptid, in welcher ein bestimmter Rest ersetzt war, wurde der Aminosäurerest entweder mit seinem D-Aminosäuregegenstück oder mit einem Alanyl, Glutamyl, Lysyl oder Leucyl-Rest ersetzt.
Peptide in jedem der drei Sätze wurden auf entzündungshemmende Aktivität durch das Verwenden des akuten Mausohr Entzündungsmodells getestet. Die AA-Reizung war dieselbe wie oben in Beispiel 7 beschrieben. Sieben bis 10 Tiere wurden für jedes getestete Peptid verwendet. Alle Tiere erhielten eine einzelne subkutane 6 mg/kg Dosis 4 Stunden vor der Reizung mit AA. Messungen der Ohrdicke wurden 1 Stunde nach der Reizung durchgeführt.
14.3.2. Ergebnisse und Diskussion
Die Ergebnisse sind graphisch in den 7–9 und in tabellarischer Form in den Tabellen XVI und XVII dargestellt. Für den ersten Satz von CT-112-derivatisierten Peptiden führte die Blockierung von einem oder beiden Enden von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) zu einer signifikanten Abnahme der Fähigkeit des Peptides, Entzündungen zu hemmen (7, Tabelle XVI). CT-120 (SEQ. ID NO: 11), ein zufälliges Peptid, welches zuvor geringe Aktivität zeigte, schien in dieser Studie die Entzündung signifikant zu hemmen (7). Zusätzlich war CT-127 (SEQ. ID NO: 12) beim Hemmen der Entzündung signifikant wirksam. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein, von einem anderen α-Chemokin abgeleitetes, Peptid beim Hemmen einer Entzündung aktiv ist.
Für den zweiten Satz von CT-112-analogen Peptiden (SEQ. ID NO: 3, 4, 6, 7, 24–28) reduzierte das Verkürzen eines der beiden Enden von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) um eine oder mehrere Aminosäureresten die Fähigkeit des resultierenden Peptides, die Entzündung zu hemmen (8, Tabelle XVI) signifikant. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die optimale Aktivität von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) am besten mit dem intakten Oktapeptid erreicht wird.
Für den dritten Satz von CT-112-analogen Peptiden (SEQ. ID NO: 25, 26, 29–73) variierte die Auswirkung des Ersetzens von jedem der Aminosäurereste mit seinem D-Aminosäuregegenstück abhängig von dem ersetzten Rest (9, Tabelle XVII). So führte z. B. der Ersetzen von entweder L-Thr₁ oder L-Thr₂ mit D-Thr zu einem Peptid, welches substantielle entzündungshemmende Aktivität beibehielt. Der Ersetzen von Gln₄ oder Arge verringerte jedoch die Aktivität signifikant.
Der Ersetzen von entweder Thr₁ oder Ser₃ mit Ala reduzierte die Wirkung, während der Ersetzen von Arg₆ mit Ala den entzündungshemmenden Effekt leicht erhöhte.
Der Ersetzen von entweder Thr₂ oder Arge mit Glu verringerte die Wirkung, während der Ersetzen von Ser₃ oder Arg₆ mit Glu die entzündungshemmenden Wirkung leicht verstärkte.
Generell scheint das Ersetzen von Aminosäureresten mit Lys einen geringen Effekt zu haben, obwohl das Ersetzen von Thr₁ mit Lys zu einer verringerten Aktivität führte.
Das Ersetzen von entweder Gln₄ oder Arge mit Leu verringerte die Aktivität des resultierenden Peptides dramatisch.
Weglassen von jeder der Aminosäurereste außer Pro₇ verringerte die Aktivität des resultierenden Peptides.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivität, die aufgrund von CT-112 (SEQ. ID NO: 1)-Verabreichung, beobachtet wird nicht auf einem unspezifischen Effekt eines Peptides beruht, sondern die Aktivität vielmehr mit spezifischen strukturellen Eigenschaften des Moleküls zusammenhängt. Die Aktivität kann durch spezifische Änderungen in der Aminosäuresequenz des Peptides entweder verstärkt oder verringert werden.
Tabelle XVI
Tabelle XVII
Tabelle XVII (Fortsetzung)
15. Beispiel: Auswirkung von CT-112 auf Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ
15.1. Material und Methoden
CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurde auf seine Fähigkeit getestet, die Immunantwort in einem Mausmodell von verzögerter Überempfindlichkeit zu modulieren (Filipp et al., 1984, Allergy, 39: 499–507; Diezel et al., 1989 J. Invest. Dermatol. 93: 322–326). Die in dieser Studie verwendeten Mäuse waren 8 Wochen alte haarlose Weibchen (Jackson Laboratories). Durch das zweimal tägliche Anstreichen der dorsothorakalen Region mit 50 μl 0,5% DNCB in 75% Aceton: 25% Pflanzenöl für 5 aufeinanderfolgende Tage wurden die Mäuse gegen ein Kontaktallergen (1-Chloro-2,4-Dinitrobenzen, DNCB) sensibilisiert. Den Tieren wurde erlaubt, sich für 24 Stunden vor der Reizung mit DNCB auszuruhen. Am sechsten Tag nach dem Beginn der Sensibilisierungsbehandlungen wurden die Tiere mit dem Verabreichen von 50 μl DNCB-Lösung auf das linke Ohr gereizt. Nach 24 Stunden wurde die Ohrdicke bestimmt und mit dem ungereizten Ohr verglichen.
Die Behandlungsgruppen waren wie folgt:

a) PBS-Kontrolle;
b) Prednison (intraperitoneale Injektion von 25 mg/kg, 2 Stunden vor der Reizung)
c) 7-Tagespumpe (60 mg CT-112/kg/24 Stunden);
d) CT-112 (intraperitoneale Injektionen von 60 mg/kg/Injektion 3, 1 und 0,25 Stunden vor der Reizung und 3, 6 und 21 Stunden nach der Reizung);
e) DMSO-Kontrolle (topische Anwendung von 50 μl 3, 1 und 0,25 Stunden vor der Reizung); und
f) CT-112 in DMSO (20 mg/ml, topische Anwendung von 50 μl 3, 1 und 0,25 Stunden vor der Reizung und 3, 6 und 21 Stunden nach der Reizung).

15.2. Ergebnisse und Diskussion
Die Ergebnisse sind in Tabelle XVIII dargestellt. CT-112 (SEQ. ID NO: 1) war in seiner Fähigkeit die durch DNCB induzierte Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ zu hemmen mit Prednison vergleichbar. Die Gruppe, die topische Anwendungen von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) in DMSO erhielt, war statistisch von der Gruppe, die topische Anwendungen des Trägers (DMSO) alleine erhielt, verschieden. Wenn mit der PBS-Kontrollgruppe verglichen, die keine topische Anwendung von DMSO allein erhielt, führte die topische Anwendung von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) nicht zu einer statistisch signifikanten Verringerung der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass CT-112 (SEQ. ID NO: 1) bei der Prävention einer Überempfindlichkeitsantwort vom verzögerten Typ wirksam ist, wenn es systemisch verabreicht wird. Das deutet darauf hin, dass die Aktivität von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) nicht grundsätzlich neutrophilspezifisch ist, sondern auch T-Zellen vermittelte Immunantworten betrifft.
Tabelle XVIII
Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 5 Tieren dar.
16. Beispiel: Auswirkung von CT-112 auf durch Typ-II-Collagen Immunisierung induzierte rheumatoide Arthritis
CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurde auf die Wirksamkeit des Hemmen der Entwicklung von Typ-II Collagen induzierter Arthritis (CIA) getestet. CIA ist ein experimentelles Arthritis-Modell mit einer Reihe von, mit rheumatoider Arthritis gemeinsamen, pathologischen, immunologischen und genetischen Eigenschaften (Wooley, 1988 Meth. Enzym. 162: 361–373). CIA wird durch die Immunisierung von empfänglichen Mäusestämmen mit Typ II-Collagen induziert. Nach der Immunisierung entwickelt sich in der Mehrzahl der immunisierten Tiere eine progressive entzündliche Arthritis, welche klinisch durch Erytheme und Ödeme charakterisiert ist. Dieses Modell wurde entworfen, um Krankheiten, in denen eine Immunantwort mit den eigenen Bindegewebsmolekülen des Trägers, d. h. dem Typ II-Collagen, das in Gelenkknorpeln gefunden wird, verbunden ist, zu imitieren (Wooley, 1988, oben).
16.1. Material und Methoden
Mäuse (DBA/1, 10–12 Wochen alt, Jackson Laboratories) wurden zufällig einer von 3 Gruppen von jeweils 12 Tieren zugewiesen. CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurde durch das Auflösen in sterilem PBS für die Injektion vorbereitet. CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurde entsprechend dem folgenden Zeitplan täglich verabreicht:

a) Kontrolltiere (0,1 ml steriles PBS) (7 Mäuse);
b) Niedrige Dosis CT-112 (0,1 ml steriles PBS enthaltend 0,25 mg CT-112 mit 10 mg/kg) (8 Mäuse); und
c) Hohe Dosen CT-112 (0,1 ml steriles PBS enthaltend 2,5 mg CT-112 mit 100 mg/kg) (8 Mäuse).

Drei Tage nach der anfänglichen Dosierung mit CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurde alle Mäuse an der Schwanzwurzel 100 μg von bovinem Typ-II Collagen in Freund's kompletten Adjuvans intradermal injiziert. Die Mäuse wurden täglich auf den Ausbruch der Krankheit hin überwacht und zweimal wöchentlich mit Vermerken des Gesamtgesundheitszustandes gewogen. Von Arthritis betroffene Tieren wurden 5 Mal pro Woche bis 10 Wochen nach der Immunisierung klinisch beurteilt. Pfotenmessungen wurden dreimal pro Woche vorgenommen. Mäuse, denen 10 Wochen nach der Immunisierung Zeichen von Arthritis fehlten, wurden als krankheitsfrei betrachtet.
Allen Mäusen wurde vor dem Beginn der Versuche Blut entnommen, danach 2 und 4 Wochen nach der Immunisierung, erneut beim Ausbruch von CIA und schließlich am Ende der Studie. Die Sera wurden abgetrennt und bei –80°C gelagert. Um die Anti-Kollagen Antikörper-Konzentrationen zu bestimmen, wurden ELISA-Assays durchgeführt. Beim Töten wurden die Milz und Lymphknoten entfernt und davon Einzelzellsuspensionen hergestellt. Die Mitogen-Antworten auf Con A und LPS wurden genauso wie antigenspezifische Antworten auf Typ-II-Collagen bestimmt.
Um den Einfluss von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) sowohl bei niedrigen als auch hohen Dosen auf Inzidenz, Ausbruch, Schwere und Fortschreiten der Collagen-induzierten Arthritis, die Antikörperantwort auf Collagen, T-Zell- und B-Zell-Mitogen-Antworten und T-Zell-spezifische Antworten auf Typ II-Collagen festzustellen, wurden unter Verwenden der SPSS/PC-Software angemessene statistische Vergleiche (Chi Quadrat, Students T-Test und nicht-parametrische Mittelwertvergleiche) durchgeführt.
16.2. Ergebnisse und Diskussion
Die Inzidenz und der Ausbruch von CIA sind in 10 gezeigt. Der Ausbruch der Arthritis wurde, verglichen mit den Kontrollmäusen, durch CT-112 (SEQ. ID NO: 1), sowohl mit niedrigen als auch hohen Dosen, etwas verzögert. Die endgültige Inzidenz von CIA war bei den Kontrollmäusen (87,5%) höher als bei beiden, den hochdosierten Mäusen (50%) oder den niedrig dosierten Mäusen (62,5%). Obwohl keines dieser Ergebnisse sich signifikant von der Kontrolle unterschied, zeigt die Inzidenz der Arthritis in der hochdosierten Gruppe einen klaren Trend zu statistischer Verringerung (p = 0,14).
Arthritis in der niedrig dosierten Gruppe schritt zu signifikant weniger Pfoten fort (p = 0,035) (11) und näherte sich, verglichen mit der Kontrolle, statistischer Signifikanz für reduzierte Krankheitsschwere (p = 0,058). Die Analyse der Arthritisparameter über die Zeit deutet an, dass CT-112 (SEQ. ID NO: 1) sowohl bei niedrigen als auch hohen Dosen das Fortschreiten der Arthritis zu nicht betroffenen Gliedmaßen verzögert und den „Krankheitsfortschritt"-Index, der die Entwicklung von entzündlicher Erkrankung zu erosiven Gelenkschäden (12) charakterisiert, sichtbar beeinflusst.
Interessanterweise wurden 25% der beteiligten Pfoten in der Niedrigdosisgruppe am Ende der Studie als in Remission befindlich charakterisiert, verglichen mit 6,3% von beteiligten Pfoten in der Kontrollgruppe. Dieser Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant. Das maximale Anschwellen der Pfote wurde durch CT-112 (SEQ. ID NO: 1) nicht beeinflusst.
CT-112 (SEQ. ID NO: 1) hatte sowohl bei niedrigen als auch hohen Dosen Auswirkungen auf die Histopathologie von CIA (13), verringerte die krankheitsinduzierte Gelenkerosion und verringerte signifikant (p ≤ 0,05) den krankheitsinduzierten Verlust des Gelenkaufbaus. Die Auswirkungen von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) auf Synovitis und Pannus waren jedoch nicht signifikant. Das mag auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass CT-112 (SEQ. ID NO: 1) nicht alle Typen von entzündlichen Zellen betrifft. Das heißt, Granulocyten, Makrophagen, Fibroblasten und andere mit Entzündung verbundene Zellen können bezüglich ihrer Antwort auf einen entzündlichen Stimulus unverändert sein. Das unterstützt den Schluss, dass CT-112 (SEQ. ID NO: 1) spezifische Aspekte der entzündlichen Antwort hemmt.
CT-112 (SEQ. ID NO: 1) scheint sowohl bei hohen als auch niedrigen Dosen den Anti-Collagen Antikörpertiter im Mausserum zu verringern. In Mäusen der hochdosierten Gruppe war die Verringerung von Antikörpern 4 Wochen nach der Immunisierung statistisch signifikant (p = 0,028) (14). Der Unterschied in dem Anti-Collagen Antikörpertiter war am größten in, beim Ausbruch der Krankheit bewerteten, Mäusen, obwohl zu diesem Zeitpunkt der Unterschied aufgrund der kleinen Probengröße keine statistische Signifikanz erreichte. Beim Abschluss der Versuche wurden in Mäusen von der niedrig dosierten Gruppe signifikant höhere Antikörpertiter beobachtet als in Kontrollmäusen. Der Abfall im Kontrolltiter, der für diesen Unterschied verantwortlich ist, ist typisch für dieses Modell. Deswegen deuten die Daten darauf hin, dass CT-112 (SEQ. ID NO: 1) die serologische Antwort auf Collagen eher verzögert als gehemmt hat.
Zelluläre Antworten auf Mitogene und Antigen (Typ II-Collagen) waren in Lymphknotenzellen von CT-112 (SEQ. ID NO: 1)-behandelten Mäusen und Kontrolltieren gleich. Die Milzzellenantwort auf Con A und auf LPS in Zellen von mit CT-112 (SEQ. ID NO: 1)-behandelten Mäusen deutete weder auf Immunsuppression noch Immunaktivierung hin. Die proliferativen Ergebnisse waren zwischen arthritischen und nicht-arthritischen Mäusen in allen Gruppen gleich.
In den hämatologischen Profilen wurden keine Änderungen beobachtet und alle Tiere gewannen während der Studie mit derselben Rate an Gewicht.
17. Beispiel: Toxizitätsstudien
Das folgende Beispiel fasst die Ergebnisse, die in einer Reihe von Experimenten erhalten wurden, die zum Feststellen der Toxizität von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) durchgeführt wurden, zusammen.
Das mutagene Potential von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurde beurteilt. CT-112 (SEQ. ID NO: 1) verursachte bei Konzentrationen von 100–5000 μg/ml mit oder ohne Rattenlebermikrosomaler Enzymaktivierung keinen Anstieg in der Anzahl von Revertanten (Histidin-unabhängiges Wachstum) in dem Salmonella Rückmutationsassay (Arnes et al., 1975, Mutation Res. 31: 347–364). Bei Konzentrationen von 1260–4990 μg/ml, mit oder ohne Rattenleber-mikrosomaler Enzymaktivierung, induzierte CT-112 (SEQ. ID NO: 1) keine chromosomalen Aberrationen in einem Assay mit Eierstockzellen eines chinesischen Hamsters (Evans, H. J., 1962, Int. Rev. Cyt. 13: 221–321).
CT-112 (SEQ. ID NO: 1) verursachte bei Konzentrationen von 500–5000 μg/ml, mit oder ohne Rattenleber-mikrosomaler Enzymaktivierung, keine vorwärts gerichteten Mutationen in Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase positiven (HGPRT) Eierstockzellen eines chinesischen Hamsters. Vorwärtsmutationen dieser Zellen würden den Verlust der Fähigkeit HGPRT zu exprimieren verursachen und die Zellen würden gegenüber toxischen Purinanalogen unempfindlich werden (Hsie et al., 1975, Somat. Cell Genet. 1: 247–261).
Nach 24, 48 oder 72 Stunden induzierte CT-112 (SEQ. ID NO: 1) bei Konzentrationen von 62,5, 125 und 250 mg/kg keinen signifikanten Micronuclei-Anstieg in einem polychromatischen Erythrocytenassay in Mausknochenmark (Heddle et al., 1983, Mut. Res. 123: 61–118).
Die akute Toxizität von CT-112 (SEQ. ID NO: 1) wurde in Mäusen und Ratten beurteilt. Mäuse wurden über intravenöse Injektion mit 100, 500 oder 1000 mg/kg CT-112 (SEQ. ID NO: 1) dosiert. Minimale vorübergehende klinische Effekte (Hypoaktivität und Überempfindlichkeit) wurden an dem Tag der Behandlung in einer mit 500 mg/kg behandelten Maus und zwei mit 1000 mg/kg behandelten Mäusen beobachtet, am Tag nach der Behandlung kehrten die Mäuse zur normalen Erscheinungsform zurück. Im mittleren Körpergewicht oder in der mittleren Körpergewichtszunahme gab es keine statistischen Unterschiede zwischen Kontroll- und behandelten Gruppen. Bei keiner der Mäuse waren bei der Leichenbeschau Läsionen sichtbar.
Ratten wurden mit 100, 500 oder 1000 mg/kg CT-112 (SEQ. ID NO: 1) dosiert. Am Tag der Behandlung wurden bei mehreren mit 500 mg/kg und 1000 mg/kg behandelten Ratten vorübergehende klinische Auswirkungen (Hypoaktivität, Überempfindlichkeit, taumelnder Gang, Cyanose und Abwesenheit des Aufrichtungsreflexes) festgestellt. Am Tag nach der Behandlung kehrten alle Ratten zum normalen Erscheinungsbild zurück. Im mittleren Körpergewicht oder in der mittleren Körpergewichtszunahme gab es keine statistischen Unterschiede zwischen Kontroll- und behandelten Gruppen. Bei der Leichenschau waren bei keiner der Ratten Läsionen sichtbar.
Die vorliegende Erfindung wurde mit besonderer Bezugnahme auf die obigen Ausführungsformen detailliert beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass die vorliegende Erfindung in ihrem Umfang nicht durch die offenbarten Ausführungsformen, welche als Illustrationen von Aspekten der Erfindung beabsichtigt sind, beschränkt ist.
Aus der vorhergehenden Beschreibung werden dem Durchschnittsfachmann in der Tat, zusätzlich zu denen hierin gezeigten und beschriebenen, verschiedene Modifikationen der Erfindung offensichtlich. Es ist beabsichtigt, dass solche Modifikationen in den Umfang der angefügten Ansprüche fallen.
Hierin wurden verschiedene Literaturnachweise zitiert, die in ihrer Gesamtheit unter Bezugnahme enthalten sind.

Claims

Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr₁-Thr₂-Ser₃-Gln₄-Val₅-Arg₆-Pro₇-Arg₈, wobei irgendeines oder mehrere der Aminosäurereste an den Positionen 1, 2, 5, 6 oder 7 in der D-stereoisomeren Form vorliegt, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-X-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Nichts, L-Lys, L-Orn, L-Met, L-Arg, L-Ser, L-Trp, L-Tyr, L-Cys und L-His besteht, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-X-Gln-Val-Arg-Pro-Arg, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Nichts, L-Glu, L-Asp, L-Asn, L-Gln, L-Cys, L-His, L-Lys, L-Orn, L-Thr, L-Trp und L-Tyr besteht, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-X-Val-Arg-Pro-Arg, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Nichts, L-Lys, L-Orn, L-Arg, L-Asp, L-Cys, L-Glu, L-His, L-Met, L-Ser, L-Thr und L-Tyr besteht, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-X-Arg-Pro-Arg, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Nichts und allen natürlich vorkommenden L-Aminosäuren außer Val besteht, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Peptid gemäß Anspruch 5, wobei X L-Lys ist.
Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-Val-X-Pro-Arg, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Nichts und allen natürlich vorkommenden L-Aminosäuren außer Arg besteht, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Peptid gemäß Anspruch 7, wobei X L-Ala oder L-Glu ist.
Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-X-Arg, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Nichts und allen natürlich vorkommenden L-Aminosäuren außer Pro besteht, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Peptid mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-X, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Nichts, L-Lys, L-Orn, L-Asn, L-Asp, L-Cys, L-Glu, L-His, L-Met, L-Ser und L-Tyr besteht, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Derivat eines Peptids mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID NO: 1), wobei mindestens eine Seitenketten-Aminogruppe acyliert oder aryliert ist oder eine Seitenketten-Hydroxylgruppe mit einer Alkylgruppe oder einer Arylgruppe verestert ist, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Analogon eines Peptids mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID NO: 1), wobei das Analogon mindestens eine Nachahmungs-Aminosäure enthält, wobei die Nachahmung zur Verlängerung der proteolytischen Spaltung des Analogon im Vergleich zu dem Peptid dient, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Cyklisiertes Derivat des Peptids mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg (SEQ. ID NO: 1), wobei eine Aminogruppe eines ersten Aminosäurerests des Derivats mit einer Carboxylgruppe eines zweiten, nicht benachbarten Aminosäurerests des Derivats kovalent verknüpft ist, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Peptidderivat mit Aminosäuresequenz R-(C=O)-Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg, wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Niedrigalkyl, einem Cykloalkyl, einem Aryl und einem Heteroaryl besteht, wobei das Aryl oder Heteroaryl entweder unsubstituiert oder mit einer Halogen-, Methoxy-, Amino- oder Alkyl-funktionellen Gruppe substituiert ist, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Peptidderivat mit der Aminosäuresequenz Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-R', wobei R' ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Amid, einem Niedrigalkylester, einem Cykloalkylester, einem Arylester und einem Heteroarylester besteht, wobei der Arylester oder Heteroarylester entweder unsubstituiert oder mit einer Halogen-, Methoxy-, Amino- oder Alkyl-funktionellen Gruppe substituiert ist, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Peptidderivat mit der Aminosäuresequenz R-(C=O)-Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-R', wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Niedrigalkyl, einem Cykloalkyl, einem Aryl und einem Heteroaryl besteht, wobei das Aryl oder Heteroaryl entweder unsubstituiert oder mit einer Halogen-, Methoxy-, Amino- oder Alkyl-funktionellen Gruppe substituiert ist, und wobei R' ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Amid, einem Niedrigalkylester, einem Cykloalkylester, einem Arylester und einem Heteroarylester besteht, wobei der Arylester oder Heteroarylester entweder unsubstituiert oder mit einer Halogen-, Methoxy-, Amino- oder Alkyl-funktionellen Gruppe substituiert ist, für dessen Verwendung als einem entzündungshemmenden Wirkstoff.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Peptid, das Peptidderivat oder das Peptidanalogon von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, sowie einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Peptid, Peptidderivat oder Peptidanalogon von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16 für dessen weitere Verwendung zur Hemmung einer Immunantwort.
Peptid von Anspruch 18 für dessen weiterer Verwendung für die Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
Peptid von Anspruch 19, bei dem die Autoimmunerkrankung ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Insulin-abhängiger Diabetes, ulcerativer Colitis, rheumatoider Arthritis, Scleroderma, Mischbindegewebe-Erkrankung und systemische Lupus-Erythematose besteht.
Peptid von Anspruch 18 für dessen weitere Verwendung für die Behandlung einer Reperfusions-Gewebeschädigung, einer entzündlichen Lungenerkrankung oder einer Abstoßungs(Graft Versus Host)-Erkrankung.