DE69635977T2 - Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirkung von Metalloproteinase-Verbindungen, neue Inhibitor-Verbindungen und deren therapeutische Verwendung - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirkung von Metalloproteinase-Verbindungen, neue Inhibitor-Verbindungen und deren therapeutische Verwendung Download PDF

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Description

  • 1. Fachgebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem Informationen über die therapeutische Aktivität einer Klassen von Verbindungen peptidomimetischer Natur, die Inhibitoren von in Schlangengift vorliegenden Metall-Proteinase-Enzymen sind, bei Säugern, einschließlich Menschen, mit großer Genauigkeit bestimmt werden können.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung neue Verbindungen der vorstehend angegebenen Klasse und außerdem ihre therapeutische Verwendung bei einer großen Zahl von Krankheiten des Menschen, umfassend Tumorinvasion, rheumatoide Arthritis, Periodontitis, Hornhautgeschwüre, multiple Sklerose, Aneurysma der Aorta, Osteoporose, Vernarbung von Wunden, Kontaktdermatitis, Arteriosklerose, septischer Schock, Parasiteninvasion, Hypertonie, Allergien, defekte Immunantwort, Alzheimer-Krankheit, chronische Bronchopneumonie, Lungenemphysem, Leberzirrhose, dilatative Kardiomyopathie und Funktionsstörungen des Reproduktionssystems.
  • 2. Beschreibung des Stands der Technik
  • Schlangengifte sind komplexe Gemische, die eine große Vielfalt von proteolytischen Enzymen enthalten, deren Aufgabe es ist, die Beute zu verdauen oder ihre physiologischen Funktionen zu verändern, insbesondere hinsichtlich des Herz-Kreislauf-Systems. Tatsächlich ist bekannt (vgl. z.B. Critical Reviews in Toxicology 21: 171–182, 1991), dass das Gift von Schlangen, die zur Familie der Viperidae gehören, tiefgreifende Effekte auf die hämostatischen und fibrinolytischen Systeme ausübt, wobei es eine gerinnungsfördernde oder alternativ eine gerinnungshemmende Wirkung zeigt. In ähnlicher Weise wurden Faktoren gefunden, die eine kräftige hemmende Wirkung auf die Aggregation von Blutplättchen ausüben, und außerdem wurden noch andere gefunden, welche die Aktivierung von Prothrombin oder Fibrin stören.
  • Eine extrem wichtige Klasse von Enzymen, die in den Giften von Schlangen gefunden wurden, die zur Familie Crotalidae gehören, sind die sogenannten hämorrhagischen Faktoren oder Hämorrhagine. Diese sind für die Schlangen morphologisch von Nutzen, da sie in den Opfern schnell kräftige innere Blutungen induzieren, wodurch ein Kreislaufkollaps ausgelöst wird und wodurch verhindert wird, dass das Opfer seinem Schicksal entkommen kann. Der Mechanismus der hämorrhagischen Wirkung beruht auf der großen Leichtigkeit, mit der die Enzyme in der Lage sind, eine große Zahl von fadenförmigen Proteinen abzubauen, welche die verschiedenen Gefäßendothelzellen normalerweise zwischen sich gebunden halten, wodurch es möglich wird, dass die Elemente des Bluts aus den Gefäßen austreten können. Anhand von kürzlichen Studien (vgl. z.B. Pharmacology and Therapeutics 62: 325–373, 1994) konnte bestätigt werden, dass die hämorrhagischen Faktoren, umfassend eine große Zahl von aus Schlangengiften isolierten Enzymen, im Molekulargewicht extrem variieren (üblicherweise zwischen 20 und 90 KDa) und häufig eine Reihe von funktionellen Untereinheiten enthalten, die für hämorrhagische, Blutplättchen-anti-aggregierende und adhäsive Wirkungen zuständig sind. Obwohl die Hämorrhagine sich in ihren Molekulargewichten stark voneinander unterscheiden, haben sie mehrere unveränderliche Merkmale am katalytischen Zentrum, wobei das Zink an bestimmte Aminosäuren in der Proteinkette bindet und wobei sie die Proteine in der Basalmembran von Blutgefäßen angreifen.
  • Das Vorliegen von Zink im aktiven Zentrum ist nicht nur den Hämorrhaginen vorbehalten, sondern für eine große Zahl von proteolytischen Enzymen charakteristisch, welche im Organismus von Tieren wichtige physiologische und pathologische Funktionen ausüben, und zwar von den kleinsten und einfachsten bis zu den am höchsten entwickelten Tieren. Anhand der Aufklärung der Sequenzen der Reste aus der Proteinkette und der Aminosäuren, die an der Zinkbindung beteiligt sind, konnte eine Art von „Stammbaum" für diese Familie von Proteanen erstellt werden (vgl. z.B. FEBS Letters 312: 110–114, 1992). Daraus war ersichtlich, dass Enzyme, die zu Lebewesen gehören, welche sich stark voneinander unterscheidenen, z.B. Astacin (extrahiert aus einem Flusskrebs); Serratin (erhalten aus einem Mikroorganismus), Matrixine (die im Organismus von Säugern vorliegen, wobei sie wichtige Effekte auf die Migration von Zellen und auf die Rekonstruktion von geschädigtem Gewebe ausüben) und die hämorrhagischen Faktoren von Schlangengiften, sich in Wirklichkeit nur in einer der vier Aminosäuren unterscheiden, welche Zink im aktiven Zentrum binden, und die deshalb in einem bestimmten Sinn als entfernt miteinander verwandt angesehen werden können. Dies bedeutet jedoch nicht, dass die Funktionen, die von diesen Enzymen ausgeübt werden, ähnlich sind. Tatsächlich wurde eindeutig gezeigt, dass die proteolytischen Enzyme von Schlangengiften keine Ähnlichkeit, weder strukturell noch funktionell, mit irgendeinem anderen Protein in der pflanzlichen oder tierischen Welt haben, mit Ausnahme des Zink-Zentrums, wohingegen sie untereinander sehr ähnlich sind und scheinbar alle von einem einzelnen vererbten Gen abstammen, und zwar in dem Ausmaß, dass man eine neue Familie von Proteinasen definieren kann: die Schlangengift-Metall-Proteinasen (vgl. z.B. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 373: 381–385, 1992).
  • EP-A-0 489 579 beschreibt Peptidyl-Derivate, die Metall-Protease-Inhibitoren sind und eine selektive Gelatinasewirkung ausüben und die zum Behandeln von Krebs eingesetzt werden können, um die Entwicklung von Tumormetastasen zu kontrollieren.
  • WO-91/05555 beschreibt Inhibitoren der Zn-Metall-Endopeptidasen, von Enkephalinase, Angiotensin-umwandelndem Enzym und Collagenase. Die Inhibitoren sind Peptid- oder Peptidester-Derivate von N-Acyl-Derivaten von Aminosäuren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In dem Forschungsprogramm, das zur vorliegenden Erfindung führte, wurden anfangs Verbindungen synthetisiert, die eine starke hemmende Wirkung auf Schlangengift-Metall-Proteinasen ausüben. Dies erfolgte mit der offensichtlichen Absicht, Substanzen zu finden, die von großem Nutzen sind, um die toxischen und letalen Effekte bei Personen zu antagonisieren, die von Schlangen gebissen wurden, jedoch außerdem, um die möglichen neuen pharmakologischen Aktivitäten zu untersuchen, die aus den strukturellen Ähnlichkeiten im aktiven Zentrum der hämorrhagischen Faktoren des Schlangengifts und anderer Zink-abhängiger Metall-Proteinasen (zu denen die Matrixine zählen), die in den Zellen von Säugern vorliegen, abgeleitet werden.
  • Der Ausgangspunkt des Forschungsprogramms bestand in der langfristigen Erfahrung des Anmelders über das Vorliegen und die Funktion von zahlreichen, in Schlangengiften gefundenen Komponenten und in dem Hinweis, dass Schlangen, wie in Biomed. Biochim. Acta 50: 769–773, 1991, veröffentlicht, sich selbst vor den toxischen Effekten ihrer eigenen Metall-Proteinasen durch die Produktion von zwei Tripeptiden schützen, welche als kompetitive Inhibitoren auf das Enzym einwirken. Der erste Schritt bestand darin, eine neue Familie von Verbindungen peptidomimetischer Natur zu synthetisieren, welche das Merkmal aufweisen, dass das am Anfang stehende Tripeptid durch chemische Gruppen ersetzt ist, die in der Lage sind, die Affinität zu dem aktiven Zentrum des Enzyms zu verbessern. Anschließend wurde ein Hämorrhagin ausgewählt, das gegenüber dem in vitro verwendeten proteolytischen Test besonders empfindlich ist und das aus dem Gift von Crotalus adamanteus gereinigt wurde. Auf diese Weise wurde ein zufriedenstellendes Modell erhalten, mit dem die Wirksamkeit der synthetisierten Verbindungen getestet werden konnte. Schließlich wurden mehrere der neuen peptidomimetischen Verbindungen in Modellen pharmakologisch getestet, wodurch eine mögliche therapeutische Verwendung der neuen Substanzen vorausgesagt werden konnte.
  • Die erhaltenen Ergebnisse, welche die Basis der vorliegenden Erfindung darstellen, sind vollständig innovativ und lassen die Feststellung zu, dass es durch Synthetisieren von Inhibitoren der durch Schlangengift produzierten Enzyme mit einer hämorrhagischen Funktion möglich ist, ein neues Verfahren zu entwickeln, mit dem die letalen Effekte bestimmter Klassen von Schlangengiften antagonisiert werden können, und außerdem ein neues System zu entwickeln, mit dem sehr aussagekräftige Informationen über wichtige therapeutische Wirkungen im Menschen bei einem großen Spektrum von Krankheiten erhalten werden können, bei denen die pathogene Beteiligung von Zink-abhängigen Metall-Proteinasen gezeigt wurde, wobei das Spektrum von einer Tumorinvasion bis zur rheumatoiden Arthritis, Periodontitis, zu Hornhautgeschwüren, multipler Sklerose, Aneurysma der Aorta, Osteoporose, Vernarbung von Wunden, Kontaktdermatitis, Arteriosklerose, septischem Schock, Parasiteninvasion, Hypertonie, Allergien, defekten Immunantworten, Alzheimer-Krankheit, chronischer Bronchopneumonie, Lungenemphysem, Leberzirrhose, dilatativer Kardiomyopathie und Funktionsstörungen des Reproduktionssystems reicht.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zum Bestimmen der therapeutischen Wirkung einer Verbindung vom peptidomimetischen Typ in Säugern, um einen wirksamen Arzneistoff für die Behandlung von Menschen oder Tieren zu finden und zu produzieren, umfassend die Schritte:
    Bestimmen durch einen ersten Enzym-Hemmtest eines ersten Niveaus der Hemmaktivität der Verbindung als ein Inhibitor von Zink-abhängigen Metall-Proteinasen, die aus dem Gift von Schlangen extrahiert sind, die zu den Familien Crotalidae und Viperidae gehören;
    Verifizieren dieses ersten Niveaus hinsichtlich eines Schwellen-Aktivitätsniveaus, das ausreichend ist, um die Verbindung als Inhibitor von Zink-abhängigen Metall-Proteinasen aus Schlangengift zu definieren;
    Bestimmen durch einen zweiten Enzym-Hemmtest eines zweiten Niveaus einer Hemmaktivität der Verbindung als Inhibitor einer Zink-abhängigen Metall-Proteinase, die in einem Säugerorganismus endogen ist und pathologische Zustände in den Säugern induziert;
    Verifizieren des zweiten Niveaus hinsichtlich eines Schwellen-Aktivitätsniveaus, das ausreichend ist, um die Verbindung als Inhibitor der Zink-abhängigen Metall-Proteinase, die in Säugern endogen ist, zu definieren; und
    Verifizieren der Aktivität der Verbindung durch herkömmliche pharmakologische Tests hinsichtlich des pathologischen Zustands.
  • Außerdem besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in Verbindungen, die für die Therapie beim Menschen in einer großen Zahl von pathologischen Zuständen eingesetzt werden können, welche von einer Vergiftung durch einen Schlangenbiss bis zur Invasion durch Tumorzellen, zu rheumatoider Arthritis und anderen Formen der Entzündung, multipler Sklerose, Aneurysmen der Aorta, Osteoporose, Arteriosklerose, septischem Schock, Alzheimer-Krankheit, Allergien usw. reichen; es muss darauf hingewiesen werden, dass in jedem Fall das vorherrschende pathologische Agens eine Zink-abhängige Metall-Proteinase ist, die entweder durch Schlangengift erzeugt oder innerhalb der Zellen von Säugern synthetisiert wird.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Ein charakteristisches Merkmal, das den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen gemeinsam ist, besteht darin, dass sie gute Inhibitoren von Zink-abhängigen Metall-Proteinasen sind, die in großer Zahl von den Schlangen produziert werden, die zu den Arten der Vipern und Klapperschlangen gehören, wobei es sich um einen der wichtigsten tödlichen Faktoren handelt, welche die Folge von Bissen dieser Schlangen sind.
  • Wie aus einer von den Forscherautoren der vorliegenden Erfindung veröffentlichten Arbeit bekannt ist (Biomedica Biochimica Acta 50: 769–773, 1991), produzieren Schlangengifte große Mengen von kleinen Peptiden, die möglicherweise die Aufgabe haben, Metall-Proteinasen zu hemmen, so dass diese die eigenen Gewebe der Schlange nicht schädigen. Jedoch haben diese Inhibitoren eine extrem milde Wirkung, da das Enzym davon befreit werden muss, wenn es in das Opfer injiziert wird. Unser Ziel bestand somit darin, die Synthese von Verbindungen zu erreichen, die zu den Peptiden, die in den Giften gefunden werden, in gewisser Weise ähnlich sind, die jedoch eine viel höhere (in den besten Fällen eine etwa 1000-fache) Hemmaktivität besitzen und die oral verabreicht werden können, wie dies bei normalen Arzneistoffen der Fall ist.
  • Nun wurde erstaunlicherweise gefunden, wobei dies die Grundlage des neuen Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt, dass eine große Übereinstimmung zwischen der Hemmung der in Schlangengift gefundenen Enzyme und den in Tiermodellen erhaltenen pharmakologischen Ergebnissen besteht, bei denen angenommen wurde, dass das pathologische Agens eine Zink-abhängige Metall-Proteinase ist, die durch die Gewebe des Säugers produziert wird, so dass daraus gefolgert werden kann, dass Zink-abhängige Metall-Proteinasen aus Schlangengift ein exzellentes Modell für ein primäres Screening darstellen und dass Inhibitoren dieser Enzyme möglicherweise bei allen pathologischen Zuständen eingesetzt werden können, die durch Zink-abhängige Metall-Proteinasen, welche im Organismus von Säugern vorliegen, induziert werden.
  • Als Zink-abhängige Metall-Proteinasen, die für die Verwendung in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung besonders geeignet sind, sind insbesondere die folgenden angegeben: Crotalus adamanteus-Hämorrhagin, Crotalus atrox-Hämorrhagin, Agkistradon bilineatus-Botropasin und Hämorrhagin und eine Reihe von Echis carinatus-Hämorrhaginen, die aus dem Gift der entsprechenden Schlangen extrahiert sind.
  • Das Verfahren, das verwendet wird, um das Niveau der Hemmwirkung der Inhibitor-Verbindung auf das Metall-Proteinaseenzym zu bestimmen, kann ein Test sein, mit dem die Menge des Inhibitors bestimmt wird, die erforderlich ist (IC50), um die Aktivität des Enzyms zu hemmen.
  • Auf diese Weise kann die Inhibitoraktivität rechnerisch bestimmt werden, so dass eine Auswahl aufgrund des Aktvitätsniveaus getroffen werden kann.
  • Wie vorstehend erwähnt wurde erstaunlicherweise gefunden, dass dieses hohe Niveau der Hemmaktivität ein extrem zuverlässiges Zeichen für die Hemmaktivität der in Frage kommenden Verbindung ist, und zwar sogar hinsichtlich anderer Metall-Proteinasen endogener Natur in Säugern, deren Aktivität für ein großes Spektrum von Störungen und Krankheiten beim Menschen verantwortlich ist.
  • Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung stellt somit ein Instrument zum Herstellen neuer Arzneistoffe mit direkten und nicht-zufälligen Auswahlkriterien bereit, wodurch die Kosten reduziert werden können.
  • Auf der Grundlage des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wurde auch eine Reihe von neuen Inhibitor-Verbindungen entdeckt, die eine therapeutische Aktivität besitzen.
  • Weitere Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, sind nicht neu, sondern die Aufgabe des früheren US Patents Nr. 5 504 071, dieses entspricht PCT WO92/06108 des gleichen Anmelders. Diese bekannten Verbindungen gehören alle zur Klasse von Metall-Proteinase-hemmenden peptidomimetischen Verbindungen, die in Schlangengift gefunden werden. Hinsichtlich dieser Verbindungen ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ihre Verwendung als pharmazeutisch aktive Agenzien aufgrund ihrer Wirksamkeit zum Hemmen von Metall-Proteinasen endogenen Ursprungs, die durch den Organismus der Säuger, umfassend Menschen, hergestellt werden und die eine Reihe von Krankheiten verursachen.
  • Die neuen Verbindungen gemäß der Erfindung können anhand der folgenden allgemeinen Formel beschrieben werden:
    Figure 00060001
    in der:
    E OH, NH2, NHOH, N(CH3)OH oder Ester bedeutet;
    R4 CH-(CH3)2, Indol-2-yl, Phenyl, Cyclohexyl oder (CH2)3-NH-Fmoc darstellt;
    X Xa, 5-Methoxy-1-indanon-3-acetyl, Naphtoyl oder Homoseryl darstellt, wobei Xa einen Rest der Formel
    Figure 00070001
    darstellt, in der
    X1: CH, N oder C-OMe bedeutet,
    A: C oder N bedeutet,
    E1: CH oder N bedeutet,
    Z1: C oder N bedeutet;
    R1: CO, (CH2)2-CO, SO2, CH2-CO oder S-CH2-CO bedeutet,
    R2: OMe, H, NO2, Cl, OEt oder CH3 bedeutet,
    R3: OEt, H, OMe bedeutet,
    und pharmazeutisch verträgliche Salze, Ester und Amide der vorstehend angegebenen Verbindungen.
  • Beschreibung der chemischen Synthese der Verbindungen
  • Abkürzungen, die für Reagenzien und Lösungsmittel verwendet werden:
    • HBTU
    = O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat
    TEA
    = Triethylamin
    SOCl2
    = Thionylchlorid
    DCHA
    = Dicyclohexalamin
    DMAP
    = Dimethylaminopyridin
    DMF
    = Dimethylformamid
    DCC
    = Dicycloesylcarbodiimid
    HOBT
    = 1-Hydroxybenzotriazol
    TMSCI
    = Trimethylchlorxylan
    CH2Cl2
    = Dichlormethan
    CH3CN
    = Acetonitril
    Cyt
    ist ein Rest von Cyclotryptophan
    • – Boc-(L)-Leu-OH = N-(tert.-Butoxycarbonyl)-(L)-Leu-OH
    • – Boc-(L)-Trp-OH = N-(tert.-Butoxycarbonyl)-(L)-Trp-OH
    • – Boc-(L)-Phe-OH = N-(tert.-Butoxycarbonyl)-(L)-Phe-OH
    • – Boc-(L)-Cha-OH = N-(tert.-Butoxycarbonyl)-(L)-β-cyclohexyl-Ala-OH
    • – Boc-(L)-Asn-OH = N-(tert.-Butoxycarbonyl)-(L)-Asn-OH
    • – Boc-(L)-Lys(Fmoc)-OH = Na-(tert.-Butoxycarbonyl)-Ne-(9-fluorylmethoxycarbonyl)-(L)-Lys-OH
    • – PIC = Picolinyl
    • – 2-PMTA = (2-Pyrimidylthio)acetyl
    • – 4-PTA = (4-Pyridylthio)acetyl
    • – 3-APZC = (3-Amino-2-pyrazinyl)carbonyl
    • – 7-MBF = 7-Methoxy-2-benzofuroyl
    • – 4-MQC = (4-Methoxy-2-chinolyl)carbonyl
    • – 5-HIC = (5-Hydroxyindol-2-yl)carbonyl
    • – 5-MIC = (5-Methoxyindol-2-yl)carbonyl
    • – 2-FUR = 2-Furoyl
    • – 3-FUR = 3-Furoyl
    • – 2-BZF = 2-Benzofuroyl
    • – 2-QIC = Chinaldyl
    • – 2-PZC = Pyrazinoyl
    • – 2-MPA = 2-Methoxyphenylacetyl
    • – 2-EBZ = 2-Ethoxybenzoyl
    • – 5-MPZ = (5-Methylpyrazin-2-yl)carbonyl
    • – 6-MNC = 6-Methylnicotinoyl
    • – 5-MIA = 5-Methoxy-1-inadon-3-acetyl
    • – 2,4-DMB = 2,4-Dimethoxybenzoyl
    • – 4-MBZ = 4-Methoxybenzoyl
    • – 4-NBZ = 4-Nitrobenzoyl
    • – 4-CBZ = 4-Chlorbenzoyl
    • – 3-NIC = Nicotinoyl
    • – 4-NIC = Isonicotinoyl
    • – 3,4-DMB = 3,4-Dimethoxybenzoyl
    • – HDC = 3-Phenylpropionyl
    • – BZS = Benzolsulfonyl
    • – 4-EBZ = 4-Ethoxybenzoyl
    • – 1-NAF = 1-Naphtoyl
  • Inhibitor-Verbindungen der vorliegenden Erfindung und ihre therapeutische Verwendung werden nachstehend beschrieben, diejenigen, die in dem vorstehend erwähnten US Patent Nr. 5 504 071 beschrieben und veröffentlicht sind, sind:
    Verbindungen der Formel (2): Q-B-T Formel (2)in der Q ein einwertiges Radikal eines Ringmoleküls darstellt, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus:
    Figure 00090001
    in denen
    X4 CH2, S oder CHOH bedeutet,
    n 0, 1 oder 2 ist;
    R11 H oder CH3 bedeutet;
    R10 H, CH3 oder eine Gruppe bedeutet, die in der Peptidsynthese zum Blockieren eines 1'-Stickstoffatoms verwendet wird;
    E4 CH2 oder CO bedeutet; und
    Z4 NH, NCH3, C oder S bedeutet,
    B ein zweiwertiges Radikal einer (L)-alpha-Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Glycin, Leucin, Alanin oder Valin, bedeutet; und
    T ein einwertiges Radikal einer (L)-Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Tryptophan, Phenylalanin, Phenylglycin, darstellt; und
    Figure 00100001
    in denen
    R11 H oder CH3 bedeutet; und
    R12 H, OH, OCH3, ORCH3 darstellt; und
    pharmazeutisch verträgliche Salze, Ester und Amide von allen vorstehend angegebenen Verbindungen.
  • Beispiel 1
  • Allgemeines Verfahren zum Synthetisieren der Verbindungen X-(L)-A(R4)-(S)-Cyt-Y
  • Das allgemeine Syntheseverfahren umfasst einen ersten Schritt, in dem die intermediäre Verbindung (L)-A(R4)-(S)-Cyt-Y erhalten wird. Hieran wird anschließend der Rest X angefügt, wobei drei verschiedene Syntheseverfahren verwendet werden.
  • I. Synthetisieren der intermediären Verbindung (L)-A(R4)-(S)-CytOMe
  • (S)-CytOMe·HCl (1,0 Äqu.) und Boc-A(R4)-OH (1,1 Äqu.) werden in CH3CN solubilisiert und in einem Eisbad gekühlt. Danach wird das Ganze einige wenige Minuten gerührt, HBTU (1,2 Äqu.) und TEA (2,2 Äqu.) werden zugegeben und das Gemisch wird so lange gerührt, bis es Raumtemperatur erreicht.
  • Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf einem Rotationsverdampfer („Rotavapor") eingeengt und mit CH2Cl2 versetzt. Das Waschen erfolgt anhand normaler Säure-Base-Behandlungen. Die organischen Extrakte werden auf wasserfreies Natriumsulfat überführt und danach gekühlt. Sie werden getrocknet und das erhaltene Produkt eine Nacht unter Vakuum auf KOH gehalten.
  • Boc-(L)-A-(R4)-(S)-CytOMe (1,0 Äqu.) wird mit wasserfreiem Dioxan aufgenommen und die Lösung anschließend unter Rühren auf 0°C abgekühlt und in eine Argon-Atmosphäre überführt. Sobald sich die Temperatur stabilisiert hat, wird 4 M HCl (4 Äqu.) in wasserfreiem Dioxan tropfenweise zugegeben, während man die Temperatur des Systems auf Raumtemperatur ansteigen lässt, wobei das Gemisch unter Rühren und in einer Argon-Atmosphäre gehalten wird.
  • Das Produkt wird auf einem Rotationsverdampfer mit wasserfreiem Ethylether ohne Peroxide eingeengt. Der Rückstand wird mit Nethanol aufgenommen und danach mit wasserfreiem Ethylether ohne Peroxide ausgefällt. Danach wird das Ganze unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten und anschließend in einen Kühlraum überführt.
  • Der Niederschlag wird auf G4 filtriert und unter Vakuum auf P2O5 überführt.
    (L)-A-(R4)-(S)-CytOMe wird erhalten.
  • II. Verfahren a) zum Synthetisieren der Verbindungen X-(L)-A(R4)-(S)-CytOH
  • (L)-NH2-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe·HCl (1,0 Äqu.) wird zu der Lösung von X-OH-Säure (1,2 Äqu.) in wasserfreiem CH3CN zugegeben. Die Lösung wird in einem Eisbad unter Rühren gekühlt und danach mit HBTU (1,2 Äqu.) und TE (2,2 Äqu.) versetzt.
  • Die Reaktion lässt man so lange weiterlaufen, bis sie vollständig abgelaufen ist. Das Reaktionsgemisch wird eingeengt, CH2Cl2 zugegeben und das Ganze sodann durch eine normales Säure-Base-Waschen behandelt. Die organischen Extrakte werden auf wasserfreies Natriumsulfat überführt und anschließend gekühlt.
  • Das Produkt X-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe (1,0 Äqu.) wird in CH3CN und H2O aufgenommen. Die Lösung wird in einem Eisbad unter Rühren gekühlt und 0,1 N NaOH (2,0 Äqu.) zugegeben. Die Lösung lässt man mehrere Stunden reagieren, wobei man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen lässt. Das Reaktionsprodukt wird auf SPE C18 gereinigt.
    X-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOH wird erhalten.
  • III. Verfahren b) zum Synthetisieren der Verbindungen X-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOH
  • Pyridin (1,17 Äqu.) und SOCl2 (1,165 Äqu.) werden unter einem Argonstrom und unter Rühren zu der Lösung des DCHA-Salzes der X-OH-Säure (1,0 Äqu.) in wasserfreiem CH2Cl2 zugegeben. Eine Minute nach Zugabe von Thionylchlorid werden (L)-NH2-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe·HCl (0,604 Äqu.) und DMAP (1,202 Äqu.) in wasserfreiem CH2Cl2 zugefügt. Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen war, wird AcOEt zugegeben und die organische Phase mit einer gesättigten Lösung von NaCl und danach mit 10 % Citronensäure und anschließend mit 5 % Bicarbonat gewaschen. Schließlich werden die organischen Extrakte mit einer gesättigten wässrigen NaCl- Lösung so lange gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht ist, und danach auf wasserfreies Natriumsulfat überführt und gekühlt.
  • Die organische Lösung, enthaltend X-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe wird getrocknet und danach hydrolysiert.
  • Der Ester X-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe (1,0 Äqu.) wird in CH3CN und H2O aufgenommen. Die Lösung wird in einem Eisbad unter Rühren gekühlt und mit 0,1 N NaOH (2,0 Äqu.) versetzt. Die Lösung wird mehrere Stunden umgesetzt, wobei man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen lässt.
  • Das Reaktionsprodukt wird auf SPE C18 gereinigt.
    X-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOH wird erhalten.
  • IV. Verfahren c) zum Herstellen der Verbindungen X-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOH
  • (L)-NH2-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe·HCl (1,0 Äqu.) und X-OH (1,1 Äqu.) werden in CH3CN solubilisiert und in einem Eisbad gekühlt. Nach Rühren für einige wenige Minuten werden HBTU (1,2 Äqu.) und TEA (2,2 Äqu.) zugegeben und das Gemisch unter Rühren gehalten, wobei man die Temperatur auf Raumtemperatur steigen lässt.
  • Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen war, wird AcOEt zugegeben und die organische Phase mit einer gesättigten NaCl-Lösung und anschließend mit 10 % Citronensäure und danach mit 5 % Bicarbonat gewaschen. Die organischen Extrakte werden schließlich mit einer wässrigen gesättigten NaCl-Lösung so lange gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht war, danach werden sie auf wasserfreies Natriumsulfat überführt und gekühlt.
  • Die organische Lösung, enthaltend X-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe, wird getrocknet und danach hydrolysiert.
  • Der Ester X-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe (1,0 Äqu.) wird in CH3CN und H2O aufgenommen. Die Lösung wird in einem Eisbad unter Rühren gekühlt und mit 0,1 N NaOH (2,0 Äqu.) versetzt. Die Lösung wird mehrere Stunden umgesetzt, wobei man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen lässt.
  • Das Reaktionsprodukt wird auf SPE C18 gereinigt.
    X-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOH wird erhalten.
  • V. Bestimmte Fälle der Synthese
  • Synthese der Verbindung PIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-NHOH
  • Zu der Lösung von 43 mg Pic-Leu-Cyt-OH (1,0 Äqu.) in 4 ml wasserfreiem Methylenchlorid werden unter Rühren und bei Raumtemperatur 19 mg HOBT (1,25 Äqu.) und 20,5 mg DCC (10 Äqu.) zugegeben.
  • Nach 60 Minuten wird die Lösung filtriert und zu dem Filtrat ein Gemisch aus 8,5 mg Hydroxylamin-hydrochlorid (1,02 Äqu.) und 17 μl Triethylamin (1,02 Äqu.) in Methylenchlorid (3 ml) zugegeben. Dies wird 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend auf einem Rotationsverdampfer eingeengt. Danach werden 20 ml Wasser zugefügt und das Gemisch mit 2 N HCl so lange angesäuert, bis der pH-Wert 2 erreicht ist. 10 ml einer gesättigten NaCl-Lösung werden zugegeben und das Gemisch zweimal mit 20 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit einer gesättigten NaCl-Lösung so lange gewaschen, bis sie neutral sind. Danach wird die organische Phase auf wasserfreies Natriumsulfat überführt und gekühlt. Die organischen Extrakte werden nach Kühlen mit 5 ml Methanol aufgenommen. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird mit 2 N HCl angesäuert, wodurch der Überschuss der Ausgangsverbindung ausgefällt wird. Diese Lösung wird filtriert, getrocknet und anschließend gefriergetrocknet. Das Folgende wird erhalten: Picolinyl-(L)-Leu-(S)-Cyt-NHOH (abgekürzt als PIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-NHOH) (Ausbeute 50 %). (Verbindung mit dem Molekulargewicht 449,49; empirische Formel C24H27N5O4; Schmelzpunkt: 130°C; Zusammensetzung der Elemente: C = 64,23 (theor. 64,13), H = 6,11 (theor. 6.05), N = 15,47 (theor. 15.58).
  • Durch das gleiche Verfahren, das zum Synthetisieren von PIC-(L)-NH-CH(CH2-R4)-CO-(S)-Cyt-NHOH verwendet wurde, wobei -NH-CH(CH2-R4)-CO- (L)-Leu entspricht und PIC Picolinyl entspricht, wurde das folgende Produkt hergestellt:
    PIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-N-(CH3)-OH (Verbindung mit dem Molekulargewicht 463,51, empirische Formel: C25H29N5O4; Schmelzpunkt: 145°C; Zusammensetzung der Elemente: C = 64,81 (theoret. 64,78), H = 6,35 (theoret. 6,31), N = 15,08 (theoret. 15.11)).
  • Beispiel 2
  • Synthese der Verbindung 5-MIC-(L)-Cha-(S)-Cyt-OH
  • I. Synthese der intermediären Verbindung: Methyl-(S)-1,2,3,4-tetrahydro-9H-pyrido[3,4-b]indol-3-carboxylat
  • 10 g (1,0 Äqu.) von (L)-Trp-OH und 6,1 ml von 50 % Formaldehyd (1,8 Äqu.) wurden zu 120 ml eines Gemisches aus Wasser und 0,1 N Schwefelsäure (Vol./Vol. 2:1) zugegeben und das Gemisch unter Rühren 16 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Am Ende dieses Zeitraums wurde das erhaltene Filtrat auf G4 abfiltriert und unter Verwendung von kaltem Wasser gewaschen und sodann eine Nacht unter Vakuum auf P2O5 getrocknet. Das auf diese Weise erhaltene Produkt (S)-1,2,3,4-Tetrahydro-9H-pyrido[3,4-b]indol-3-carbonsäure, abgekürzt als (S)-CytOH·H2SO4 (Ausbeute 80 %) wurde für den folgenden Schritt eingesetzt.
  • (S)-CytOH·H2SO4, äquivalent zu 8 g (1,0 Äqu.), und 18,6 ml Chlortrimethylsilan (abgekürzt als TMSCI, 4,0 Äqu.) wurden zu 90 ml absolutem Methanol zugegeben. Die Reaktion wurde unter Argon bei Raumtemperatur nach der Zugabe von TMSCI 30 Minuten durchgeführt, und danach wurde die Temperatur auf 55°C gebracht und eine Nacht lang der Reflux zugelassen, und zwar wieder unter Argon.
  • Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum dreimal mit Ether, wasserfrei und frei von Peroxiden, eingeengt.
  • Der Rückstand wurde mit 5 ml Methanol aufgenommen und mit wasserfreiem Ether ausgefällt.
  • Die Verbindung wurde gekühlt und auf G4 abfiltriert. Das Produkt wurde eine Nacht auf P2O5 getrocknet. (S)-Cyt-OMe-HCl wurde erhalten (Ausbeute 87 %).
  • II. Synthese des intermedialen Produkts: (L)-Cha-(S)-CytOMe
  • (S)-Cyt-OMe-HCl, äquivalent zu 128 mg (1,0 Äqu.), und 108 mg N-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-β-cyclohexyl-Ala-OH (abgekürzt als Boc-Cha) (1,1 Äqu.) wurden zu 10 ml Acetonitril (CH3CN), gekühlt in einem Eisbad, zugegeben, das Gemisch wurde einige wenige Minuten gerührt, und sodann wurden 181 ml O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (abgekürzt als HBTU) (1,2 Äqu.) und 122 μl Triethylamin (d = 0,726, 2,2 Äqu.) zugegeben und das Ganze unter Rühren vier Stunden belassen, wobei man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen ließ.
  • Am Ende dieses Zeitraums wurde das Reaktionsgemisch auf einem Rotationsverdampfer so lange eingeengt, bis ein Volumen von 8 ml erreicht war, und sodann wurde es mit 90 ml Dichlormethan (CH2Cl2) versetzt.
  • Das Produkt wurde sodann mit 80 ml Kochsalzlösung und zweimal mit 80 ml 4 Kaliumhydrogensulfat gewaschen. Danach wurde es dreimal mit 80 ml Kochsalzlösung gewaschen, bis es neutral war, und dann wurde es zweimal mit 90 ml 5 % Bicarbonat gewaschen. Es wurde so lange mit einer Salz-gesättigten Lösung gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht war. Die organischen Extrakte wurden auf wasserfreies Natriumsulfat überführt und danach gekühlt.
  • Die resultierende Verbindung wurde getrocknet und der erhaltene Schaum eine Nacht unter Vakuum auf KOH gehalten.
  • Der Rückstand Boc-Cha-(S)-CytOMe wurde in 8 ml wasserfreiem Dioxan aufgenommen und die Lösung anschließend unter Rühren auf 0°C gekühlt und in eine Argon-Atmosphäre überführt. Sobald sich die Temperatur stabilisiert hatte, wurden 3,1 ml 4 M HCl in wasserfreiem Dioxan tropfenweise zugegeben, wobei man die Temperatur des Systems auf Raumtemperatur kommen ließ, sodann wurde das Ganze vier Stunden unter Rühren in der Argon-Atmosphäre belassen.
  • Das Produkt wurde auf einem Rotationsverdampfer dreimal mit wasserfreiem Ether ohne Peroxide eingeengt.
  • Der Rückstand wurde in 3 ml Methanol aufgenommen und danach mit 500 ml wasserfreiem Ether ohne Peroxide ausgefällt.
  • Sodann wurde er eine Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren und anschließend drei Stunden in einem Kühlraum stehengelassen.
  • Der Niederschlag wurde auf G4 filtriert und unter Vakuum auf P2O2 überführt.
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens, das zum Synthetisieren von (L)-NH2-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe verwendet wurde, wobei -NH-CH(CH2-R4)-CO- (L)-Cha entspricht, wurden die folgenden Produkte hergestellt:
    HCl·(L)-Trp-(S)-Cyt-OMe
    HCl·(L)-Phe-(S)-Cyt-OMe
    HCl·(L)-Leu-(S)-Cyt-OMe
    HCl·(L)-Asn-(S)-Cyt-OMe
    HCl·(L)-Lys(Fmoc)-(S)-Cyt-OMe
  • III. Synthese der Verbindung 5-MIC-Cha-(S)-Cyt-OH gemäß Verfahren a)
  • Zu der Lösung von 100 mg 5-Methoxy-2-indolcarbonsäure (Aldrich) (1,1 Äqu., abgekürzt 5-MIC) in 15 ml wasserfreiem Acetonitril (CH3CN), gekühlt in einem Eisbad und unter Rühren, wurden 200 mg Cha-(S)-Cyt-OMe·HCl (1,2 Äqu.) zugegeben. Danach wurden 217 mg HBTU (Aldrich) (1,2 Äqu.) und 150 μl Triethylamin (d = 0,726, 2,2 Äqu.) zugefügt.
  • Die Reaktion ließ man drei Stunden ablaufen. Am Ende dieses Zeitraums wurde das Gemisch eingeengt und mit 90 ml Methylenchlorid versetzt, danach wurde es anhand normaler Säure-Base-Waschprozesse behandelt.
  • Die organischen Extrakte wurden auf wasserfreies Natriumsulfat überführt und sodann gekühlt.
  • 250 mg des Produkts 5-MIC-Cha-Cyt-OMe (1,0 Äqu.) wurden in 10 ml Acetonitril und 0,7 ml Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde in einem Eisbad unter Rühren gekühlt und danach mit 9,3 ml 0,1 N NaOH (2,0 Äqu.) versetzt. Die Lösung wurde 12 Stunden gerührt, wobei man sie auf Raumtemperatur kommen ließ. Die Reaktionslösung wurde in folgender Weise behandelt:
  • 1) Reinigen von dem nicht-hydrolysierten Ester
  • Die Reaktionslösung wurde auf eine 1 g C18 SPE-Säule (Backer) aufgetragen, die vorher mit dem Reaktionslösungsmittel gepuffert worden war. Das Eluat, welches nur das Produkt 5-MIC-Cha-(S)-CytOH enthielt, wurde durch Zugabe von 1 N HCl angesäuert und mit Wasser versetzt, bis die Lösung trüb wurde.
  • 2) Reinigen der Säure
  • Die Lösung, welche das Produkt enthielt, wurde anschließend auf zwei SPE-Säulen (Backer) aufgetragen, die mit dem Probensäure-Elutionsmittel konditioniert worden waren. Das Eluat wurde entfernt und die SPE-Säulen mit Methanol eluiert.
  • Die vereinigten organischen Phasen wurden so lange eingeengt, bis ein Volumen von 3 ml erreicht war, und sodann mit 500 ml 0,1 N HCl ausgefällt.
  • Nach Kühlen in einer Kühlkammer wurde der Niederschlag auf G4 filtriert und unter Vakuum auf P2O3 überführt (Ausbeute 60 %).
  • Die Verbindung 5-MIC-Cha-(S)-Cyt-OH (Verbindung 1) wurde erhalten.
  • Beispiel 3
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens, das zum Synthetisieren von 5-MIC-(L)-A-(R4)-(S)-Cyt-OH verwendet wurde, wobei A-(R4) (L)-Cha entspricht und 5-MIC (5-Methoxyindol-2-yl)carbonyl entspricht, wurden die folgenden Produkte hergestellt: 2-PMTA-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 2) 4-PTA-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 3) 3-APZC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 4) 7-MBF-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 5) 4-MQC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 6) 5-HIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 7) 5-MIC-(L)-Phe-(S)-Cyt-OH (Verbindung 8) PIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 9) 2-FUR-(L)-Cha-(S)-Cyt-OH (Verbindung 10) 2-FUR-(L)-Phe-(S)-Cyt-OH (Verbindung 11) L-HomoSer-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 12)
  • Tabelle 1 Chemische und physikalische Merkmale der Verbindungen, die anhand des beschriebenen Verfahrens synthetisiert wurden
    Figure 00160001
  • Beispiel 4
  • Synthese der Verbindung 3-Fur-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH gemäß Verfahren b)
  • Zu der Lösung von 120 mg des DCHA-Salzes der 3-Furancarbonsäure („3-furoic acid") (1,0 Äqu.) in 5 ml wasserfreiem CH2Cl2 wurden 39 μl Pyridin (auf Kaliumhydroxid) (1,17 Äqu.) und 35 μl SOCl2 (1,165 Äqu.) unter einem Argonstrom und unter Rühren zugegeben. Eine Minute nach der Zugabe von Thionylchlorid wurden 100 mg (L)-Leu-(S)-CytOMe·HCl (0,604 Äqu.) und 64 mg DMAP (1,202 Äqu.) in 3 ml wasserfreiem CH2Cl2 zugefügt.
  • Nach einer Stunde wurden 80 ml Essigsäureethylester zugegeben und die organische Phase mit einer gesättigten NaCl-Lösung, danach mit 10 % Citronensäure (80·2 ml) und anschließend mit 5 % Bicarbonat (80·2 ml) gewaschen.
  • Sodann wurden die organischen Extrakte mit einer gesättigten wässrigen Lösung von NaCl (80·3 ml) so lange gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht war, und danach auf wasserfreies Natriumsulfat überführt und gekühlt.
  • Die organische Lösung, die 3-Furoyl-(L)-Leu-(S)-Cyt-OMe enthielt, wurde getrocknet und anschließend hydrolysiert.
  • 118 mg des Produkts 3-Furoyl-Leu-(S)-Cyt-OMe (1,0 Äqu.) wurden in 10 ml CH3CN und 4,8 ml H2O aufgenommen. Die Lösung wurde in einem Eisbad unter Rühren gekühlt und danach mit 5,2 ml 0,1 N NaOH (2,0 Äqu.) versetzt. Die Lösung wurde 12 Stunden gerührt, anschließend ließ man sie auf Raumtemperatur kommen.
  • Die Reaktionslösung wurde wie folgt behandelt:
  • 1) Reinigen von dem nicht-hydrolysierten Ester
  • Die Reaktionslösung wurde auf eine 1 g C18 SPE-Säule (Backer) aufgetragen, die vorher mit dem Reaktionslösungsmittel gepuffert worden war. Das Eluat, welches nur das Produkt 3-Furoyl-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH enthielt, wurde durch Zugabe von 1 N HCl angesäuert und mit Wasser versetzt, bis die Lösung trüb wurde.
  • 2) Reinigen der Säure
  • Die Lösung, welche das Produkt enthielt, wurde anschließend auf zwei SPE-Säulen (Backer) aufgetragen, die mit dem Probensäure-Elutionsmittel konditioniert worden waren. Das Eluat wurde entfernt und die SPE-Säulen mit Methanol eluiert.
  • Die vereinigten organischen Phasen wurden so lange eingeengt, bis ein Volumen von 3 ml erreicht war, und sodann wurden sie mit 500 ml 0,1 N HCl ausgefällt.
  • Nach Kühlen in einer Kühlkammer wurde der Niederschlag auf G4 filtriert und sodann unter Vakuum auf P2O3 überführt.
  • Die Verbindung 3-Furoyl-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH wurde erhalten (abgekürzt als 3-Fur-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH) (Ausbeute 60 %) (Verbindung 13).
  • Beispiel 5
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens, das zum Synthetisieren von 3-FUR-(L)-NH2-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe verwendet wurde, wobei -NH-CH(CH2R4)-CO-(L)-Leu entspricht und 3-FUR 3-Furoyl entspricht, wurden die folgenden Produkte hergestellt: 5-MIC-(L)-Trp-(S)-Cyt-OH (Verbindung 14) 2-BZF-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 15) 2-QIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 16) 5-MIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 17) 2-PZC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 18) 2-MPA-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 19) 2-EBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 20) 5-MPZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 21) 6-MNC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 22) 5-MIA-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 23)
  • Tabelle 2 Chemische und physikalische Merkmale der Verbindungen, die anhand des beschriebenen Verfahrens synthetisiert wurden
    Figure 00180001
  • Beispiel 6
  • Synthese der Verbindung 2,4-DMB-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH gemäß dem Verfahren c)
  • 63,4 mg 2,4-Dimethoxybenzoesäurechlorid (Aldrich) (1,2 Äqu.) wurden zu 15 ml trockenem, oxidfreiem CH2Cl2 zugegeben. Das Gemisch wurde gerührt und mit 100 ml Leu-(S)-Cyt-OMe·HCl (1,0 Äqu.) und mit 81 μl TEA (2,2 Äqu.) versetzt. Danach wurde die Lösung in ein Eisbad überführt und dort 2,5 Stunden gerührt, anschließend wurde sie mit 90 ml CH2Cl2 versetzt. Die Lösung wurde zuerst mit 80 ml gesättigter NaCl-Lösung, danach 50 ml 0,1 N HCl und dann dreimal mit 80 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht war.
  • Die organischen Extrakte wurden auf wasserfreies Natriumsulfat in einem Kühlraum überführt.
  • Die organische Lösung, die 2,4-Dimethoxybenzoyl-Leu-(S)-Cyt-OMe enthielt, wurde getrocknet (Ausbeute 95 %) und danach hydrolysiert.
  • 133 g Ester (1,0 Äqu.) wurden in 19 ml CH3CN und 11,5 ml H2O aufgenommen und die Lösung in einem Eisbad gekühlt, anschließend wurde sie mit 5,23 ml 0,1 N NaOH (2,0 Äqu.) versetzt.
  • Die Lösung wurde sechs Stunden gerührt, wobei man die Temperatur auf Raumtemperatur kommen ließ.
  • Am Ende dieses Zeitraums wurde die Reaktionslösung wie folgt behandelt:
  • 1) Reinigen von dem nicht-hydrolysierten Ester
  • Die Reaktionslösung wurde auf eine 1 g C18 SPE-Säule (Backer) aufgetragen, die vorher mit dem Reaktionslösungsmittel gepuffert worden war. Das Eluat, welches nur das Produkt 2,4-Dimethoxybenzoyl-Leu-(S)-Cyt-OMe enthielt, wurde durch Zugabe von 1 N HCl angesäuert und mit Wasser versetzt, bis die Lösung trüb wurde.
  • 2) Reinigen der Säure
  • Die Lösung, welche das Produkt enthielt, wurde anschließend auf zwei SPE-Säulen (Backer) aufgetragen, die mit dem Probensäure-Elutionsmittel konditioniert worden waren. Das Eluat wurde entfernt und die SPE-Säulen mit Methanol eluiert.
  • Die vereinigten organischen Phasen wurden so lange eingeengt, bis ein Volumen von 3 ml erreicht war, und sodann wurden sie mit 500 ml 0,1 N HCl ausgefällt.
  • Nach Kühlen in einer Kühlkammer wurde der Niederschlag auf G4 filtriert und sodann unter Vakuum auf P2O3 überführt.
  • Die Verbindung 2,4-Dimethoxybenzoyl-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH wurde erhalten (abgekürzt als 2,4-DMB-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH) (Ausbeute 74 %) (Verbindung 24).
  • Beispiel 7
  • Unter Verwendung des gleichen Verfahrens, das zum Synthetisieren von 3-FUR-(L)-NH2-CH(CH2-R4)-CO-(S)-CytOMe verwendet wurde, wobei -NH-CH(CH2R4)-CO- (L)-Leu entspricht und 3-FUR 3-Furoyl entspricht, wurden die folgenden Produkte hergestellt: 4-MBZ-(L)-Trp-(S)-Cyt-OH (Verbindung 25) 4-NBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 26) 4-CBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 27) 3-NIC-(L)-(Leu)-(S)-Cyt-OH (Verbindung 28) 4-NIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 29) 3,4-DMB-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 30) HDC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 31) BZS-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 32) 4-EBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 33) 2-FUR-(L)-Trp-(S)-Cyt-OH (Verbindung 34) 2-FUR-(L)-Asn-(S)-Cyt-OH (Verbindung 35) 2-FUR-(L)-Lys(Fmoc)-(S)-Cyt-OH (Verbindung 36) 1-NAF-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (Verbindung 37)
  • Tabelle 3 Chemische und physikalische Merkmale der Verbindungen, die anhand des beschriebenen Verfahrens synthetisiert wurden
    Figure 00200001
  • Beschreibung der biochemischen Aktivität der Verbindungen
  • Beispiel 8
  • Hemmwirkung von Verbindungen auf Metall-Proteinasen, die aus Schlangengift erzeugt wurden
  • Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung wurden an einer Reihe von Zink-abhängigen Metall-Proteinasen getestet, die aus dem Gift von Schlangen extrahiert wurden, welche zu den Crotalidae und Viperidae gehörten (z.B. Hämorrhagine aus Crotalus atrox, Botropasin, Hämorrhagin aus Agkistrodon bilineatus, verschiedene Hämorrhagine aus Echis carinatus). Im Folgenden wird die Reinigung von Hämorrhagin aus Crotalus adamanteus beschrieben, das aufgrund seiner günstigen Handhabung vorzugsweise in den Screeningtests verwendet wurde.
  • Ein g gefriergetrocknetes Gift (bezogen von der amerikanischen Firma Sigma Chemical) wurde in Tris-HCl-Pufferlösung bei pH 8,0 gelöst und auf eine Chromatographie-Säule aufgetragen, die DEAE-Sephadex (Warenzeichen) A-50-Harz enthielt. Unter Verwendung eines Gradienten des Puffers, enthaltend NaCl in einer Konzentration von 0 bis 1 M, als Elutionsmittel wurden für die proteinartigen Fraktionen, die im Schlangengift vorlagen, vier Hauptpeaks erhalten. Diese wurden eingeengt und entsalzt, und danach wurden sie unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Verfahrens auf das Vorliegen von Metall-Proteinasen getestet. Anschließend wurde die Fraktion I, welche den Großteil der Metall-Proteinase-Aktvität enthielt, auf eine Chromatographie-Säule aufgetragen, die Sephadex (Warenzeichen) G-150-Harz enthielt, und mit Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, eluiert. Zwei Hauptpeaks wurden erhalten, wobei sich die Metall-Proteinase-Aktivität im ersten davon identifizieren lässt. Sodann folgte eine weitere Reinigung, um fremdes Material zu entfernen, wobei ein Sephadex (Warenzeichen) G-75-Harz verwendet wurde. Das auf diese Weise gereinigte Enzym wurde gefriergetrocknet und bis zur Verwendung in einem Gefrierschrank konserviert.
  • Die Metall-Proteinase-Aktivität wurde auf dem Fluorimeter (Perkin Elmer LS 50 B) getestet, wobei als Substrat die fluorigene Verbindung 2-Aminobenzoyl-Alanyl-Gly-Leucyl-Alanyl-p-Nitrobenzylamid verwendet wurde, die von der Firma Bachem hergestellt wurde. Verschiedene Mengen der synthetisierten Verbindungen wurden in einem mit Thermostat auf 30°C eingestellten System unter Rühren zu 5 mg Enzym zugegeben. Die Bildung von fluoreszierenden Verbindungen wurde 30 Minuten verfolgt (Anregung: 320 nm; Emission: 420 nm), und die Kurve wurde mit der Grundlinie verglichen, die ohne Zugabe der Verbindungen erhalten wurde.
  • Tabelle 4 Hemmaktivität der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung auf das Enzym, das aus dem Gift von Crotalus adamanteus gereinigt wurde
    Figure 00220001
  • Beispiel 9
  • Das gleiche Verfahren wie vorstehend beschrieben wurde eingesetzt, um die chemischen Verbindungen der Formel (2) zu testen, die im US Patent Nr. 5 504 071 beschrieben sind, auf das Bezug genommen wird zum Identifizieren der Verbindungen, die in der folgenden Tabelle 5 angegeben sind. Für alle Verbindungen wurde gefunden, dass sie gute Inhibitoren des Enzyms sind, wobei sie einen IC50 zwischen 1 × 10–5 und 1 × 10–7 M aufweisen.
  • Tabelle 5
  • Aktivität von bestimmten synthetisierten Verbindungen auf verschiedene Metall-Proteinasen, die aus Schlangengift gereinigt wurden
  • Figure 00230001
  • Verbindung 31 ist Z-(L)-Pro-(L)-Ala-(S)-CytOH
  • Verbindung 33 ist Z-(L)-Pro-(L)-Ala-(9)-Me-(S)-CytOMe
  • Die in den Tabellen 4 und 5 angegebenen Ergebnisse zeigen, dass die in der vorliegenden Anmeldung und im US Patent Nr. 5 504 071 beschriebenen Verbindungen alle extrem wirksam sind, das aus dem Gift von Crotalus adamanteus gereinigte Enzym zu hemmen, und dass sie außerdem eine mittlere Hemmaktivität hinsichtlich anderer Metall-Proteinasen aufweisen, die aus dem Gift anderer Crotalidae und Viperidae gereinigt wurden, so dass sie als Inhibitoren der ganzen Klasse von Schlangengift-Metall-Proteinasen angesehen werden können.
  • Die folgenden Beispiele 10, 11 und 12 zeigen die Hemmaktivität von ausgewählten Verbindungen auf einige Metall-Proteinase-Enzyme, die in Menschen und Säugern endogen sind.
  • Beispiel 10
  • In vitro-Wirkung auf rekombinante menschliche Gelatinase A
  • Tests an menschlicher Gelatinase A, einem Enzym, das in hoher Konzentration durch jede Art von Tumorzellen während der Prozesse der Metastasierung freigesetzt wird und das, wie festgestellt wurde, auch ein Produkt von stimulierten Zellen in zahlreichen pathologischen Prozessen ist, wurden durchgeführt, wobei das Protein verwendet wurde, das durch rekombinante Biotechnologie hergestellt worden war (Strangeways Laboratories, Cambridge, UK). Die Enzymaktivität wurde über die Zeit verfolgt, wobei die Menge eines fluoreszierenden Substrats, das durch das Enzym gespalten wurde, in Gegenwart oder in Abwesenheit von synthetischen Verbindungen gemessen wurde (Perkin Elmer L 50 B Fluorimeter).
  • Tabelle 6
    Figure 00240001
  • Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass Verbindungen, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind, und auch solche, die in PCT WO92/06108 beschrieben sind, ziemlich kräftige Inhibitoren von sowohl hämorrhagischen Faktoren aus dem Schlangengift als auch von humaner Gelatinase A sind, einem Enzym, das an pathologischen Störungen entscheidend beteiligt ist.
  • Beispiel 11
  • In vitro-Wirkung auf rekombinante menschliche Gelatinase B
  • Tests an menschlicher Gelatinase B, einem weiteren Enzym, das durch Tumorzellen freigesetzt wird, wurden durchgeführt, wobei auch in diesem Fall das Protein verwendet wurde, das durch rekombinante Biotechnologie hergestellt worden war (Strangeways Laboratories, Cambridge, UK). Wie üblich wurde die Enzymaktivität über die Zeit verfolgt, wobei die Menge eines fluoreszierenden Substrats, das durch das Enzym gespalten wurde, in Gegenwart oder in Abwesenheit von synthetischen Verbindungen gemessen wurde (Perkin Elmer L 50 B Fluorimeter).
  • Tabelle 7
    Figure 00250001
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass auch die Gelatinase B, ein weiteres Enzym, das durch menschliche Zellen während pathologischer Reaktionen produziert wird, durch Moleküle gehemmt werden kann, die in der vorliegenden Anmeldung und in PCT WO92/06108 beschrieben sind.
  • Beispiel 12
  • In vitro-Tests an rekombinanter menschlicher Collagenase
  • Unter Verwendung der gleichen enzymatischen Bestimmungsverfahren (fluorimetrischer Nachweis der Spaltung eines Substratpeptids, das eine fluoreszierende Einheit enthält) wurden einige der Verbindungen an Neutrophilen-Collagenase getestet, einem Enzym, dessen Beteiligung an jeder Art von Entzündungsreaktionen in Körpern von Säugern beschrieben wurde. Auch in diesem Fall wurde das reine Enzym durch rekombinante Biotechnologie hergestellt.
  • Tabelle 8
    Figure 00260001
  • Die Ergebnisse zeigen auch eine gewisse Hemmaktivität gegen eines der wichtigsten Enzyme, die durch menschliche Zellen während Entzündungsreaktionen produziert werden.
  • Beschreibung der pharmakologischen Aktivität der Verbindungen
  • Beispiel 13
  • In vitro-Wirkung auf den Tumornekrosefaktor (TNF)
  • Es ist bekannt, dass der TNF in bestimmten physiologischen Verteidigungsreaktionen eine fundamentale Rolle spielt, dass er jedoch andererseits ernste Schäden verursacht, wenn er in übermäßigen Mengen oder für längere Zeiträume in den Kreislauf freigesetzt wird. Kürzlich wurde gezeigt, dass der TNF in einer aktiven Form an der Zelloberfläche dank einer Zink-abhängigen Metall-Proteinase produziert wird. Deshalb wurde versucht herauszufinden, ob bestimmte Verbindungen, die aus denjenigen ausgewählt wurden, die in der vorliegenden Anmeldung und im US Patent Nr. 5 504 071 beschrieben sind, in der Lage waren, die Freisetzung des aktiven TNF ins Medium einer menschlichen Zellkultur (Jurkat) zu blockieren. Die Zellen wurden in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Metall-Proteinase-Inhibitors 72 Stunden inkubiert; die Freisetzung von TNF wurde sodann unter Verwendung von Aktivatoren (PMA und Ionophor-Calcium) stimuliert, wobei die Dosis des Faktors im Kulturmedium unter Verwendung des ELISA-Tests (Genzyme) bestimmt wurde.
  • Die Verbindungen 9, 10 und 25 der vorliegenden Erfindung zeigten alle eine dosisabhängige Hemmwirkung auf die TNF-Freisetzung durch Zellen, wobei diese jedoch in unterschiedlichem Ausmaß vorlag (Verbindung 9 zeigte einen IC50-Wert von etwa 8 μg/ml; Verbindung 10 von etwa 200 μg/ml; und Verbindung 25 von etwa 0,7 μg/ml). Weiterhin zeigte auch die Verbindung Z-PRO-LEU-Cyt (die in Beispiel 1 von US Patent Nr. 5 504 071 beschrieben ist), dass sie selbst aktiv ist, und zwar mit einem IC50-Wert von etwa 5 μg/ml. Diese Verbindung wurde außerdem einem weiteren Test unterworfen, um die TNF-Freisetzung aus einem anderen Stamm von menschlichen Zellen in Kultur (Clon T) zu testen. Auch in diesem Fall war eine Hemmaktivität zu sehen (IC50 lag unter 1 μg/ml).
  • Diese Ergebnisse machen deutlich, dass Inhibitoren von Schlangengift-Metall-Proteinasen in der Lage sind, die Freisetzung von TNF aus menschlichen Zellen zu blockieren, und dass sie deshalb möglicherweise bei einer Reihe von pathologischen Zuständen zum Behandeln eingesetzt werden können, wobei diese von der rheumatoiden Arthritis (und anderen Formen von Arthritis) bis zum septischen Schock, zur multiplen Sklerose und zu Immunmangelzuständen reichen, die durch virale Infektionen verursacht sind.
  • Beispiel 14
  • In vivo-Wirkung auf TNF
  • Die gleichen Verbindungen, die in den in vitro-Tests verwendet wurden, wurden auch in Tests eingesetzt, bei denen bestimmt werden sollte, ob sie in der Lage waren, die Mortalität zu blockieren, die in Mäusen des Stamms Balb/c durch letale Dosen von LPS (einem bakteriellen Agens, das die Freisetzung von TNF stimuliert) induziert wurde. Dabei zeigte sich, dass alle Verbindungen selbst verhindern konnten, dass die Mäuse verendeten, und zwar mit einem IC50-Wert im Bereich von 0,5 bis 5 μg/Maus (i.p.-Injektion).
  • Diese Ergebnisse bestätigen, dass Inhibitoren von Schlangengift-Metall-Proteinasen möglicherweise bei allen durch TNF verursachten pathologischen Zuständen eingesetzt werden können.
  • Beispiel 15
  • Wirkung auf menschliche Collagenase
  • Die in der vorliegenden Erfindung und im US Patent Nr. 5 504 071 beschriebenen Verbindungen wurden an dem Enzym Collagenase getestet, das aus Neutrophilen des Menschen isoliert worden war. Dabei zeigte sich, dass mehr als die Hälfte der Verbindungen selbst in der Lage war, das Enzym stark zu hemmen, von dem auch bekannt ist, dass es direkt mit der Entzündungsantwort (bei der rheumatoiden Arthritis, Osteoarthritis usw.), mit Tumorinvasion, Vernarbung von Wunden, Periodontitis, Hornhautgeschwüren usw. in Zusammenhang steht.
  • Aus diesem Grund kann festgestellt werden, dass der Hemmtest an Schlangengift-Metall-Proteinasen sehr aussagekräftig für eine Hemmwirkung auf die Collagenase ist, die durch menschliche Zellen produziert wird, und dass er es möglich macht, eine wichtige therapeutische Wirkung in Verbindung mit der Hemmung selbst vorauszusagen.
  • Beispiel 16
  • Hemmung von Blutungen, die durch Schlangengift induziert werden
  • Die Verbindung Fur-LEU-TRP (die als Beispiel 8 im US Patent Nr. 5 504 071 beschrieben ist), ein außerordentlich guter in vitro-Inhibitor der aus dem Gift von Crotafus adamanteus gereinigten Metall-Proteinase, wurde einem in vivo-Test an Mäusen unterworfen, um ihre Fähigkeit zu testen, die durch Schlangengifte induzierten Blutungen und tödlichen Ausgänge zu antagonisieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Verbindung, die zusammen mit den hämorrhagischen Faktoren von verschiedenen Schlangengiften inkubiert wurde, in der Lage ist, die toxischen Effekte dieser Faktoren zu antagonisieren. Weiterhin ist die Verbindung bei einer Dosis von 33 μg/Maus in der Lage, die Mäuse vor dem Verenden durch das Schlangengift zu schützen, auch wenn die Verbindung erst nach dem Gift verabreicht wird (bis zu 30 Minuten).
  • Andere Verbindungen aus dem vorstehend erwähnten US-Patent und aus der vorliegenden Anmeldung sind in der Lage, die toxischen und letalen Effekte von Schlangengiften (Crotalidae und Viperidae) zu antagonisieren, wenn auch nicht so stark.
  • Somit kann festgestellt werden, dass die Inhibitoren von Schlangengift-Metall-Proteinasen eine neue Klasse von synthetischen Anti-Gift-Arzneistoffen darstellen, die im Fall einer Vergiftung durch Schlangen der Familien Crotalidae und Viperidae eingesetzt werden können.
  • Beispiel 17
  • Wirkung auf Histamin-induzierte Mikroblutungen
  • Die Verbindung Z-PRO-LEU-Cyt, die als Beispiel 1 im US Patent Nr. 5 504 071 beschrieben ist, wurde gründlichen Untersuchungen unterworfen, wobei das Modell der Änderung der Kapillarpermeabilität, die in Hamstern durch Verabreichung von Histamin induziert wurde, verwendet wurde.
  • Dieses Modell eignet sich im Allgemeinen dafür, Verbindungen mit einer möglichen Wirkung auf die Mikrozirkulation und auf Atherosklerose-Phänomene zu untersuchen. Da außerdem durch die Verabreichung von Histamin Mikroblutungen auf der Ebene von Arteriolen induziert werden, und zwar in einer Weise, die ähnlich ist wie bei der Verabreichung von hämorrhagischen Faktoren des Schlangengifts, kann man bei Verwendung dieses Modells prüfen, ob die getesteten Verbindungen in der Lage sind, mit den in Säugern endogen vorliegenden Metall-Proteinasen, die für die Effekte von Histamin verantwortlich sind, zu interagieren.
  • Die Ergebnisse unterstrichen die Tatsache, dass die Verbindung extrem wirksam ist, die durch Histamin induzierten Mikroblutungen zu blockieren, sowohl wenn sie intravenös injiziert wird als auch wenn sie oral verabreicht wird. In beiden Fällen lag die Dosis, welche die Wirkung um 50 % blockieren konnte, bei etwa 50 μg/kg.
  • Auch andere Verbindungen, die in der vorliegenden Anmeldung und in dem vorstehend erwähnten US-Patent beschrieben sind, zeigten, dass sie in der Lage sind, die durch Histamin induzierten Mikroblutungen in Hamstern zu hemmen, jedoch bei etwas höheren Konzentrationen.
  • Somit kann man hieraus folgern, dass die Inhibitoren von Schlangengift-Metall-Proteinasen in der Lage sind, die pathologischen Prozesse zu antagonisieren, welche zu inneren Mikroblutungen führen, und dass sie deshalb möglicherweise bei Arteriosklerose und bei einer Reihe von pathologischen Zuständen eingesetzt werden können, die durch Läsionen des Gefäßgewebes zustande kommen.
  • Beispiel 18
  • Wirkung auf Infiltrationen im bronchopulmonalen Gewebe
  • Da die Metall-Proteinasen, die durch die Zellen von Säugern produziert werden, für die Zellen von fundamentaler Wichtigkeit sind, damit sie innerhalb des Organismus von einem bestimmten Gewebe zu einem anderen wandern können, wurden die Verbindungen 9, 18, 25 und 31, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind, und die Verbindungen Z-PRO-LEU-Cyt (Beispiel Nr. 1) und FUR-LEU-Cyt (beschrieben in Beispiel Nr. 8) von US Patent Nr. 5 504 071 auf eine Hypereosinophilie getestet, die in der Ratte durch Sephadex G-200-Harz induziert wurde. Die erhaltenen Ergebnisse machen deutlich, dass alle Verbindungen, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß, die Zahl von Blutzellen, die zu der entzündeten Stelle wandern, beeinträchtigen, wobei sie die Motilität von einer oder mehreren der analysierten Klassen von Zellen hemmen (Lymphocyten, Neutrophile, Eosinophile, Makrophagen).
  • Somit kann hieraus gefolgert werden, dass die Inhibitoren von Schlangengift-Metall-Proteinasen in der Lage sind, auf die Motilität der Zellen zu wirken, die an der Entzündungsreaktion auf bronchopulmonaler Ebene beteiligt sind, und dass sie bei den zahlreichen bronchopulmonalen Leiden, die durch Metall-Proteinasen verursacht werden, von therapeutischen Nutzen sein können, umfassend Lungenemphysem, akutes Atemnotsyndrom ("adult respiratory deficiency syndrome", ARDS), interstitielle Fibrose, Granulomatose, Tumor der Lunge und Pleuritis.
  • Beispiel 19
  • Immunologische Effekte
  • Zahlreiche der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verbindungen wurden in Immunantwort-Tests getestet, um zu prüfen, ob sie in der Lage waren, den Ablauf der Antwort zu beeinflussen. Die erhaltenen Ergebnisse machen deutlich, dass alle Verbindungen in einer mehr oder weniger deutlichen Weise die Immunantwort stimulieren können, die als Proliferation von T-Lymphocyten ausgedrückt wird. Weiterhin zeigte sich, dass zahlreiche der Verbindungen in der Lage sind, die Antwort auf das Influenza-Virus zu steigern, die durch das Vorliegen von gegen das Virus spezifischen Antikörpern bestimmt wurde. Schließlich wurde im Kontakt-Sensibilitätstest (im Zusammenhang mit einer allergischen Antwort) gefunden, dass zahlreiche der Verbindungen kräftige Inhibitoren der Antwort sind.
  • Somit kann hieraus gefolgert werden, dass Inhibitoren von Schlangengift-Metall-Proteinasen in der Lage sind, die Immunantworten von Säugern signifikant zu beeinflussen, wobei sie sowohl die Proliferation von T-Lymphocyten steigern als auch die Produktion von Antikörpern erhöhen. Weiterhin sind sie in der Lage, Antworten vom allergischen Typ zu blockieren.
  • Beispiel 20
  • Hemmung der Invasion von menschlichen Melanomzellen durch Matrigel
  • Um Informationen über die mögliche Beeinträchtigung zu erhalten, welche die synthetisierten Verbindungen auf die Fähigkeit von Tumorzellen, durch den Körper zu wandern (Metastasierung), ausüben, wurde die menschliche Melanomzelllinie VMM-5 in dem Matrigel-basierten Invasionstest verwendet, in welchem Basalmembran-Matrigel (Becton Dickinson) und Gewebekultureinsätze („tissue culture inserts") mit 8 μm Porengröße in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen als Boyden-Kammern verwendet wurden. Die Kammern wurden mit verdünntem Matrigel beschichtet, und man ließ sie über Nacht trocknen; dann wurden sie mit serumfreiem Medium rekonstituiert, und Melanomzellen (400 000/ml) wurden in jedem Einsatz dispergiert. In den unteren Kammern wurde ein chemisch anziehend wirkender Stoff zugegeben. Schließlich wurden die Kammern in einen feuchten CO2-Inkubator bei 37°C gestellt und 20 Stunden inkubiert. Die Einsätze wurden getrocknet und die Zellen auf der oberen Oberfläche entfernt. Die Polycarbonat-Filter wurden mit Methanol fixiert, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und mit einem Mikroskop gezählt. Die Hemmung der Migration aufgrund von Verbindungen wurde als prozentualer Anteil der Gesamtzahl der in den Kontrollkammern gewanderten Zellen ausgedrückt, die lediglich den Puffer enthielten, in dem die Verbindungen gelöst worden waren.
  • Tabelle 9
    Figure 00310001
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass Verbindungen, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind, und solche, die in PCT WO92/06108 beschrieben sind, starke Inhibitoren der Motilität von Krebszellen sind und deshalb als Inhibitoren von Metastasierungsprozessen bei Patienten, die an Tumoren leiden, verwendet werden können.
  • Beispiel 21
  • Resistenz gegenüber der proteolytischen Aktivität in Magensäften
    • A. Um zu untersuchen, ob die beschriebenen Verbindungen gegenüber der proteolytischen Aktivität in Magensäften resistent sind und deshalb über die orale Route verabreicht werden könnten, wurde die Mägen von nüchternen Ratten in physiologischen Lösungen (1:1) homogenisiert. 300 μl von Lösungen der Verbindungen (1 mg/ml Kochsalzlösung) wurden mit 0,5 ml Magenhomogenisat inkubiert (37°C). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1,5 ml Methanol blockiert, und nach einer Zentrifugation wurden 10 μl in eine HPLC-Apparatur injiziert und mit den Standardlösungen der Verbindungen verglichen, wobei die Menge der restlichen Verbindung gemessen wurde. Ergebnisse: Tabelle 10
      Figure 00310002
    • B. Um zu testen, ob die Verbindungen der Formel 2 in der Lage waren, dem Abbau durch Salzsäure und durch die proteolytischen Enzyme im Magen zu widerstehen, wurden einige Ratten etwa 18 Stunden nüchtern gehalten und danach getötet, und ihre Mägen wurden in physiologischer Lösung (1:1) homogenisiert. Die Verbindungen wurden in physiologischer Lösung solubilisiert (1 mg/ml), und 300 μl einer Verbindung wurden sodann mit 0,5 ml Homogenisat bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde zu festgelegten Zeitpunkten durch Zugabe von 1,5 ml Methanol blockiert. Nach 15-minütigem Abzentrifugieren (Sorvall Zentrifuge, Rotor SS-34, 10 000 UpM) wurde eine kleine Menge (10 μl) entnommen und in eine HPLC-Apparatur injiziert, um die Menge der restlichen vollständigen Verbindung zu messen.
  • Die Verbindung-Nr. und die Beispiel-Nr. des Präparats beziehen sich auf PCT WO92/06108.
  • Tabelle 11
    Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Legende:
  • CytOH ist die freie Säureform des Cyclotryptophanrests, der für die Gruppe C in Anspruch 12 steht.
  • Hyp ist ein Hydroxyprolinrest, der für die Gruppe A steht.
  • Wie aus dieser letzten Tabelle deutlich ersichtlich ist, ist die neue Reihe von Verbindungen extrem resistent gegenüber dem Abbau im Magen und kann somit für die orale Verabreichung eingesetzt werden. Eine geeignete tägliche Dosierung für Menschen, per os, liegt im Bereich von 10 bis 200 mg Verbindung.

Claims (24)

  1. Peptidomimetische Verbindungen der Formel
    Figure 00360001
    in der E OH, NH2, NHOH, N(CH3)OH oder Ester bedeutet, R4 CH-(CH3)2, Indol-2-yl, Phenyl, Cyclohexyl oder (CH2)3-NH-Fmoc darstellt, Cyt- einen Cyclotryptophanrest bedeutet, X Xa, 5-Methoxy-1-indanon-3-acetyl, Naphtoyl oder Homoseryl darstellt, wobei Xa einen Rest der Formel
    Figure 00360002
    darstellt, in der X1: CH, N oder C-OMe bedeutet, A: C oder N bedeutet, E1: CH oder N bedeutet, Z1: C oder N bedeutet, R1: CO, (CN2)2-CO, SO2, CH2-CO oder S-CH2-CO bedeutet, R2: OMe, H, NO2, Cl, OEt oder CH3 bedeutet, R3: OEt, H, OMe bedeutet, und pharmazeutisch verträgliche Salze, Ester und Amide von allen vorstehend angegebenen Verbindungen.
  2. Verfahren zum Bestimmen des therapeutischen Potentials einer peptidomimetischen Verbindung als Inhibitor einer Zink-abhängigen Metall-Proteinase-Aktivität, die mit pathologischen Zuständen von Menschen und Tieren assoziiert ist, umfassend die Schritte: (a) Durchführen eines ersten Enzym-Hemmtests und Bestimmen eines ersten Niveaus einer Hemmaktivität von peptidomimetischen Verbindungen als Inhibitoren einer Zink-abhängigen Metall-Proteinase, die aus dem Gift von Schlangen extrahiert ist, die zu den Familien Crotalidae und Viperidae gehören; (b) Screening der Verbindungen auf der Basis des ersten Niveaus der Hemmaktivität durch Ermitteln, ob jede der Verbindungen eine Hemmwirkung auf die Zink-abhängige Metall-Proteinase aus Schlangengift ausübt, (c) Durchführen eines zweiten Enzym-Hemmtests und Bestimmen eines zweiten Niveaus einer Hemmaktivität der Verbindungen als Inhibitoren einer Zink-abhängigen Metall-Proteinase, die in einem Säuger endogen ist, wobei die Aktivität der Zink-abhängigen Metall-Proteinase mit mindestens einem pathologischen Zustand in dem Säuger assoziiert ist; (d) Screening der Verbindungen auf der Basis des zweiten Niveaus der Hemmaktivität durch Ermitteln, ob jede der Verbindungen eine Hemmwirkung auf die Zink-abhängige Metall-Proteinase, die in Säugern endogen ist, ausübt; wodurch Schritt (a) und Schritt (b) eine erste Selektion der getesteten Verbindungen als Inhibitoren der Zink-abhängigen Metall-Proteinase aus Schlangengift und somit als mögliche Inhibitoren von Zink-abhängigen Metall-Proteinasen in Säugern durchführen; Schritt (c) und Schritt (d) die Fähigkeit der ausgewählten Verbindungen testen, die Zink-abhängigen Metall-Proteinasen, die mit mindestens einem pathologischen Zustand bei Säugern assoziiert sind, zu hemmen, dadurch gekennzeichnet, dass die peptidomimetischen Verbindungen die Formel
    Figure 00370001
    aufweisen, in der X, Cyt, E und R4 die gleiche Bedeutung gemäß der Definition in Anspruch 1 haben.
  3. Therapeutisch wirksames Mittel der Formel
    Figure 00370002
    in der X, Cyt, E und R4 die gleiche Bedeutung gemäß der Definition in Anspruch 1 haben, und pharmazeutisch verträgliche Salze, Ester und Amide davon zum Behandeln von pathologischen Zuständen, die mit der Aktivierung von mindestens einer Zn-Metall-Proteinase aus der Klasse von Zn-abhängigen Metall-Proteinasen, die in Säugergeweben endogen sind, zusammenhängen.
  4. Mittel nach Anspruch 3, wobei die Metall-Proteinase, die in Säugern endogen ist, aus Gelatinase oder Collagenase ausgewählt ist.
  5. Mittel nach Anspruch 4, wobei die pathologischen Zustände, die mit der Aktivierung von Gelatinase assoziiert sind, Metastasierungsprozesse sind.
  6. Mittel nach Anspruch 4, wobei die pathologischen Zustände, die mit der Aktivierung von Collagenase assoziiert sind, Entzündungsreaktionen, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Tumorinvasion, Wundheilung, Periodontitis und Hornhautgeschwüre sind.
  7. Therapeutisch wirksames Mittel nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus PIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 2,4-DMB-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 5-MIC-(L)-Cha-(S)-Cyt-OH 5-MIC-(L)-Trp-(S)-Cyt-OH 2-QIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 6-MNC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 5-MIA-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH HDC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH BZS-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 4-MBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 4-CBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH.
  8. Therapeutisch wirksames Mittel nach Anspruch 3 zum Behandeln von pathologischen Zuständen, die mit der Freisetzung des Tumornekrosefaktors durch Zellen von Säugern, einschließlich Menschen, zusammenhängen.
  9. Wirksames Mittel nach Anspruch 8, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus PIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH oder 4-MBZ-(L)-Trp-(S)-Cyt-OH.
  10. Wirksames Mittel nach Anspruch 8 oder 9, wobei die pathologischen Zustände septischer Schock, multiple Sklerose und Immundefizienz, verursacht durch eine Virusinfektion, sind.
  11. Therapeutisch wirksames Mittel nach Anspruch 1 zum Behandeln von pathologischen Zuständen, die mit den toxischen und letalen Effekten von Schlangengift zusammenhängen.
  12. Wirksames Mittel nach Anspruch 11, wobei die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus 5-MIC-Cha-(S)-Cyt-OH 2-PMTA-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 4-PTA-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 3-APZC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 7-MBF-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 4-MQC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 5-HIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 5-MIC-(L)-Phe-(S)-Cyt-OH PIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH (L)-HomoSer-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 5-MIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 2-BZF-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 2-QIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 5-MIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 2-PZC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 2-MPA-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 2-EBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 5-MPZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 6-MNC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 5-MIA-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 2,4-DMB-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 4-MBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 4-NBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 4-CBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 3-NIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 3-NIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 3,4-DMB-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH HDC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH BZS-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 4-EBZ-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH 1-NAF-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH.
  13. Mittel nach Anspruch 11 oder 12, wobei die pathologischen Zustände durch Schlangengift induzierte Blutungen sind.
  14. Mittel nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Gift zu Schlangen der Familien Crotalidae und Viperidae gehört.
  15. Therapeutisch wirksames Mittel nach Anspruch 3 zum Behandeln von pathologischen Zuständen, die zu inneren Blutungen des Gefäßgewebes führen.
  16. Mittel nach Anspruch 15, wobei die pathologischen Zustände innere Mikroblutungen oder Arteriosklerose und andere pathologische Zustände sind, die von Verletzungen des Gefäßgewebes ausgehen.
  17. Therapeutisch wirksames Mittel nach Anspruch 3 zum Behandeln von pathologischen Zuständen, die mit der Motilität der Zellen zusammenhängen, die an der Entzündungsreaktion auf bronchopulmonaler Ebene beteiligt sind.
  18. Wirksames Mittel nach Anspruch 17, wobei die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus 4-MBZ-(L)-Trp-(S)-Cyt-OH, HDC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH, 2-PZC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH oder 2-PZC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH.
  19. Wirksames Mittel nach Anspruch 17 oder 18, wobei der pathologische Zustand Lungenemphysem, Schocklunge, interstitielle Fibrose, Granulomatose, Lungentumor und Pleuritis ist.
  20. Therapeutisch wirksames Mittel nach Anspruch 3 zum Behandeln von pathologischen Zuständen, die mit der Immunreaktion von Säugern zusammenhängen.
  21. Wirksames Mittel nach Anspruch 20, wobei der pathologische Zustand eine Virusinfluenza oder eine allergische Reaktion ist.
  22. Therapeutisch wirksames Mittel nach Anspruch 3 zum Behandeln von pathologischen Zuständen, die mit der Motilität von Krebszellen zusammenhängen.
  23. Wirksames Mittel nach Anspruch 22, wobei die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus PIC-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH oder 2,4-DMB-(L)-Leu-(S)-Cyt-OH besteht.
  24. Wirksames Mittel nach Anspruch 22 oder 23, wobei der pathologische Zustand ein Metastasierungsprozess in Patienten ist, die an einem Tumor leiden.
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